علاج لصق نقطة الوخز Kechuanting يخفف من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 في الفئران المصابة بالربو التحسسي عن طريق تنظيم عدد الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 (ILC2s)

Qiu Yue Zhao; Yong Lin Chen; Jing Jing Yang; Shao Bo Guo; Wan Qi Shao; Zhong Yi Wang; Yi Lu; Shu Mei Zhao; Xiao Yan Gong; Meng Cao; Lan Ying Liu

doi:10.3791/71749

مقالة بحثية

علاج لصق نقطة الوخز Kechuanting يخفف من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 في الفئران المصابة بالربو التحسسي عن طريق تنظيم عدد الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 (ILC2s)

3 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71749

⸱

سبتمبر 1, 2026

Qiu Yue Zhao^*¹^,² , Yong Lin Chen^*¹^,² , Jing Jing Yang¹^,² , Shao Bo Guo¹^,² , Wan Qi Shao¹^,² , Zhong Yi Wang¹^,² , Yi Lu¹^,² , Shu Mei Zhao¹ , Xiao Yan Gong¹^,³ , Meng Cao⁴ , Lan Ying Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of the Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, ³First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, ⁴Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي (AA) المستحث بالأوفالبومين (OVA) لتقييم الآليات العلاجية لعلاج لصقات نقاط الوخز Kechuanting (KAST) على التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 عن طريق تعديل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) الرئوية عبر مسار الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP)/البروتين المعدل لنشاط المستقبل 1 (RAMP1).

الملخص

لقد ثبت أن العلاج باللاصق في نقطة Kechuanting الوخزية (KAST) يحسن بشكل فعال التهاب المجاري التنفسية لدى المرضى المصابين بالربو التحسسي (AA)؛ ومع ذلك، لا تزال الآليات الكامنة وراء ذلك غير واضحة. هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء الآليات العلاجية لـ KAST في نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي من منظور عصبي مناعي. تم إنشاء نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي مستحث بواسطة الأوبالبومين (OVA)، وعولجت الفئران باستخدام KAST. تم تقييم تأثيرات KAST على الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) الرئوية والتهاب المجاري التنفسية من النوع 2 باستخدام قياس التدفق الخلوي، وتلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE)، والكيمياء النسيجية المناعية. استُخدمت طريقة لطخة ويسترن (WB) ومقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتقدير مستويات بروتين الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) في أنسجة الرئة. تم إجراء إعطاء أنفي لـ CGRP أو مثبط مستقبل CGRP وهو BIBN-4096 في الفئران المصابة بالربو التحسسي لبحث الدور التنظيمي لمسار CGRP/البروتين المعدل لنشاط المستقبل 1 (RAMP1) على ILC2s والتهاب المجاري التنفسية من النوع 2. أدى KAST إلى تقليل عدد ILC2s وتخفيف التهاب المجاري التنفسية من النوع 2، وصاحب ذلك انخفاض في تعبير CGRP في أنسجة الرئة. أدى الإعطاء الأنفي لـ CGRP إلى زيادة RAMP1⁺ILC2s وإجمالي ILC2s في الرئتين وتفاقم التهاب المجاري التنفسية من النوع 2. وعلى العكس من ذلك، أدى الإعطاء الأنفي لـ BIBN-4096 إلى تقليل ILC2s الرئوية وتخفيف التهاب المجاري التنفسية من النوع 2. يقلل KAST من التهاب المجاري التنفسية في الربو التحسسي، وهو أمر مرتبط ارتباطاً وثيقاً بتنظيم خافض لمسار CGRP/RAMP1 وما يتبع ذلك من تثبيط لـ ILC2s الرئوية، كما يدعم ذلك التثبيط الدوائي.

المقدمة

يُعد الربو التحسسي (AA) النمط الظاهري الأكثر شيوعاً للربو، حيث يمثل 60-80% من جميع حالات الربو في الصين¹. ويتميز بانتشاره المرتفع وعدم السيطرة المثلى على المرض، مما يؤدي إلى تدهور شديد في جودة حياة المرضى ويفرض أعباءً اقتصادية كبيرة²^,³^,⁴^,⁵. وعلى الرغم من أن الكورتيكوستيرويدات المستنشقة (ICS) لا تزال هي الركيزة الأساسية للعلاج السريري⁶، إلا أن بعض المرضى يظهرون استجابة محدودة، وغالباً ما يرتبط الاستخدام طويل الأمد بآثار جانبية وعدم القدرة على وقف تطور المرض⁷. لذا، يظل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة آمنة وفعالة أولوية في كل من المجالات السريرية والبحثية. يعمل علاج لصق نقاط الوخز Kechuanting (KAST)، وهو تطبيق خارجي من الطب الصيني التقليدي، على إيصال المركبات النشطة عبر الجلد، مما قد يتجنب تأثير المرور الأول الكبدي ويقلل من التفاعلات الضارة الجهازية⁸^,⁹. وقد أثبتت الدراسات السريرية أن KAST يمكن أن يخفف من أعراض الربو، ويستعيد جزءاً من وظائف الرئة، ويعزز جودة حياة المرضى¹⁰^,¹¹^,¹². وبالتزامن مع ذلك، تشير دراسات الأيض في المصل (serum metabolomics)، وعلم الصيدلة الشبكي، والدراسات الحيوانية باستخدام نماذج الربو، إلى أن KAST يقلل من التهاب المجاري التنفسية عن طريق خفض مستويات الوسائط الالتهابية في المصل وسوائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)، بما في ذلك تثبيط تعبير IgE وIL-4 وIL-13⁹^,¹³^,¹⁴. وبشكل جماعي، توفر هذه النتائج أدلة داعمة للفعالية العلاجية لـ KAST في علاج الربو، ومع ذلك، لا تزال آليات عمله الدقيقة غير واضحة.

تتمثل إحدى الآليات المرضية الأساسية التي تؤدي إلى تكرار الإصابة بالربو التحسسي (AA) في التهاب الممرات الهوائية من النوع 2، حيث تلعب الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) دوراً محورياً¹⁵. فعند التحفيز بمسببات الحساسية، تفرز خلايا ILC2s سيتوكينات مثل IL-5 وIL-13، مما يؤدي بدوره إلى تحفيز التهاب الممرات الهوائية¹⁶^,¹⁷. وقد أظهرت الدراسات أن استنفاد خلايا ILC2s يخفف بشكل كبير من التهاب الممرات الهوائية في الفئران المصابة بالربو، مما يؤكد دورها المركزي في تطور المرض¹⁸. ومن الملاحظ أن تنشيط ووظيفة خلايا ILC2s يتم تنظيمهما بدقة عبر آليات متعددة، وقد حظيت التفاعلات العصبية المناعية باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. وتشير الأدلة الناشئة إلى أن الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) يمكن أن يرتبط بالبروتين المعدل لنشاط المستقبل 1 (RAMP1) الموجود على سطح خلايا ILC2s، مما يحفز تنشيطها والإفراز اللاحق لسيتوكينات النوع 2، وهو ما يفاقم التهاب الممرات الهوائية في حالات الربو التحسسي (AA)¹⁹^,²⁰^,²¹. وفي الدراسة الحالية، حدد فحصنا باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-seq) أن CGRP هو ببتيد عصبي استجابي بشكل حاسم يتم تعديله بقوة بواسطة تدخل KAST. وبناءً على ذلك، وبالتركيز على مسار CGRP/RAMP1، استخدمنا KAST كتدخل في الفئران المصابة بالربو التحسسي (AA) لاستقصاء آلياته المحتملة في تعديل نشاط خلايا ILC2s وتخفيف التهاب الممرات الهوائية من النوع 2.

البروتوكول

أُجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقًا لدليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر الصادر عن الأكاديميات الوطنية للعلوم. وقد تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني (رقم الموافقة 2023DW-059-01). وتوجد قائمة شاملة بجميع المواد والكواشف والأدوات والبرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة بالتفصيل في جدول المواد.

الحيوانات التجريبية وتوزيع المجموعات

تم الحصول على إناث فئران BALB/c سليمة (من درجة SPF، بعمر 8–10 أسابيع) من مركز الحيوانات التجريبية في جامعة نانجينغ للطب الصيني (ترخيص رقم SYXK (Su) 2018-0049). وُضعت الحيوانات في ظروف قياسية مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 h عند درجة حرارة 24–26 °C. تم توفير الغذاء والماء المعقمين بحرية، واستُبدلت الفرشة بانتظام، ونُظفت الأقفاص بشكل روتيني. وبعد 7 أيام من التكيف، قُسمت الفئران عشوائياً إلى ست مجموعات (n = 7/group): المجموعة الطبيعية، ومجموعة النموذج، ومجموعة CGRP، ومجموعة BIBN-4096، ومجموعة KAST، ومجموعة KAST + CGRP. خُصصت الحيوانات للمجموعات عشوائياً باستخدام جدول أرقام عشوائية تم إنشاؤه بواسطة الكمبيوتر. وقد تم إخفاء توزيع المجموعات عن الباحثين حتى تم تحديد التدخلات. ولتحسين الاستفادة من الأنسجة، وُزعت عينات الرئة من المجموعة العشوائية (n = 7 لكل مجموعة) بشكل منهجي على مسارات معالجة مختلفة، مع الإشارة بوضوح في تسميات الأشكال المعنية إلى أحجام العينات التي تم تحليلها بدقة (n = 5، أو 4، أو 3) للفحوصات النسيجية والجزيئية المحددة. لم يتم استبعاد أي بيانات من التحليل.

تحضير تركيبة KAST

تم تحضير التركيبة من قبل قسم الصيدلة في المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني²². استخدمت تسع أعشاب طبية صينية تقليدية وهي: Semen Brassicae (جزءان)، وRhizoma Corydalis (جزءان)، وRadix Kansui المعالج بالخل (جزء واحد)، وAsarum (جزء واحد)، وEphedra (جزء واحد)، وSemen Lepidii (جزء واحد)، والقرنفل (جزء واحد)، ولحاء القرفة (جزء واحد)، وGleditsia sinensis (جزء واحد). طُحنت كل عشبة لتتحول إلى مسحوق ناعم ومُررت عبر منخل بفتحات قياس 80-mesh. ولكل 100 g من المسحوق المخلوط، أُضيف 70 mL من عصير الزنجبيل الطازج و30 mL من البارافين السائل، ومُزجت المكونات جيداً، ثم صُنعت منها لصقات بوزن 0.3 g ± 5% وقطر 0.5 cm. وتحديداً، قام كبير الصيادلة Lin-gang Zhao بمصادقة جميع المكونات العشبية والزنجبيل الطازج، وخُزنت عند 4 °C في بيئة مظلمة وجافة قبل الاستخدام⁹. ولضمان إمكانية تكرار التدخل والاستقرار بين الدفعات، تم تطبيق معيار صارم لمراقبة الجودة بناءً على طرق UPLC-Q-TOF-MS وHPLC المعتمدة من قبل فريقنا، مما أكد الوجود المتسق للمؤشرات النشطة الرئيسية مثل sinapine thiocyanate²³. ومن الناحية العملية، تم تثبيت اللصقات ذات قطر 0.5 cm باستخدام شريط لاصق طبي مسامي ومضاد للحساسية بمقاس 2.5 cm × 5.5 cm لضمان التوصيل الأمثل عبر الجلد.

إنشاء نموذج فأر AA

تم تحفيز نموذج AA وفقاً لبروتوكول معتمد من الأدبيات العلمية باستخدام التحسيس بـ OVA والتحدي عبر الأنف²⁴. وباستثناء المجموعة الطبيعية (Normal group)، تم تحسيس جميع الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق بـ 200 µL من المحلول الملحي المحتوي على 100 µg من OVA و 2 mg من هيدروكسيد الألمنيوم في اليومين 0 و 12. ومن اليوم 18 إلى 23، خضعت الفئران لتحدٍ عبر الأنف مرة واحدة يومياً بـ 50 µg من OVA في 50 µL من المحلول الملحي. ومن اليوم 24 إلى 53، تم إعطاء OVA عبر الأنف يوماً بعد يوم. وفي اليوم 54، بعد وزن الفئران، تم إجراء القتل الرحيم عن طريق خلع الفقرات العنقية، ثم جُمعت الأنسجة. لاحقاً، تم تحديد معامل الرئة عن طريق قسمة الوزن الكلي للرئة على وزن الجسم.

التدخلات

من اليوم 40 إلى 53، تم حلاقة منطقة ظهرية بمساحة 3 cm × 6 cm للفئران في مجموعة KAST ومجموعة KAST + CGRP. وُضعت لصاقات فوق نقاط الوخز الإبرية الثنائية Feishu (BL13)، وGeshu (BL17)، وPishu (BL20)، وShenshu (BL23)، وثُبّتت بشريط لاصق لمدة 1.5 h مرة واحدة يوميًا لمدة 14 يومًا متتاليًا. وتلقت الفئران في مجموعتي CGRP وKAST + CGRP إعطاءً عن طريق الأنف لـ 10 µL من محلول Calcitonin/CALCA بتركيز (1 pg/µL) يومًا بعد يوم من اليوم 40 إلى 53. أما الفئران في مجموعة BIBN-4096 فقد تلقت إعطاءً عن طريق الأنف لـ 10 µL من محلول BIBN-4096 بتركيز (0.3 mg/mL، وهو مضاد لمستقبلات CGRP) يومًا بعد يوم. وتلقت المجموعتان الطبيعية ومجموعة النموذج تغذية قياسية دون أي تدخل. تم تطبيق KAST من اليوم 40 إلى اليوم 53، بعد حدوث التهاب الممرات الهوائية التحسسي (بدءًا من اليوم 40، وهو ما يمثل 22 يومًا بعد أول تحدٍ بـ OVA في اليوم 18). وبناءً على ذلك، كان KAST في هذه الدراسة بمثابة تدخل علاجي وليس وقائيًا.

لتحضير الجلد، تمت إزالة الشعر من المنطقة الظهرية المحددة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. وقد التزم تحديد نقاط الوخع بدقة بـ "تسمية ومواقع نقاط الوخع للحيوانات المختبرية - الجزء 3: الفئران (T/CAAM 0002-2020)" الصادر عن الجمعية الصينية للوخز بالإبر والكي. تم تحديد أربعة أزواج من المواقع الظهرية الثنائية بدقة كما يلي: Feishu (BL13: بين الأضلاع أسفل النتوء الشوكي للفقرة الصدرية الثالثة، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف الخلفي)، و Geshu (BL17: أسفل النتوء الشوكي للفقرة الصدرية السابعة، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف)، و Pishu (BL20: أسفل النتوء الشوكي للفقرة الصدرية الثانية عشرة، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف)، و Shenshu (BL23: أسفل النتوء الشوكي للفقرة القطنية الثانية، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف). لُف شريط 3M بإحكام لتحقيق التصاق مستقر، مما يضمن عدم تحرك الرقعة أو حدوث تآكل ثانوي في الجلد خلال فترة التثبيت التي استمرت 1.5 h.

تم اختيار جرعات CGRP/CALCA (بتركيز 1 pg/µL، وبمقدار 10 µL لكل فأر) و BIBN-4096 (بتركيز 0.3 mg/mL، وبمقدار 10 µL لكل فأر) بناءً على دراسات منشورة²⁵. وبالتحديد، بالنسبة لتدخل CGRP، تم تحضير محلول BSA بتركيز 0.1% عن طريق إذابة 1 mg من BSA في 1 mL من ddH₂O، متبوعاً بالرج باستخدام جهاز الفورتكس (vortexing) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 mg/mL. وقبل إعادة التكوين، تم طرد مسحوق بروتين Calcitonin/CALCA المجفف بالتجميد مركزياً عند 12,000 × g لمدة 30 s عند 4 °C. بعد ذلك، تمت إضافة 20 µL من محلول BSA 0.1% المُحضّر للحصول على محلول مخزون بتركيز 1 µg/µL. قُلبت القارورة بلطف عدة مرات (دون استخدام الفورتكس)، ثم دُوّرت لثوانٍ قليلة، وتُركت في درجة حرارة الغرفة لعدة دقائق لضمان إعادة تكوين البروتين بشكل كامل. ولتحضير محلول العمل بتركيز 1 pg/µL دون إنتاج حجم كبير غير قابل للإدارة في خطوة واحدة، تم تنفيذ تخفيف تسلسلي قياسي من خطوتين: أولاً، تم تخفيف 1 µL من المحلول المخزون (1 µg/µL) في 999 µL من المحلول الملح sterile saline لتحضير محلول وسيط بتركيز 1 ng/µL، ثم خُلط 1 µL من هذا المحلول الوسيط مع 999 µL أخرى من المحلول الملح sterile saline للوصول إلى محلول العمل النهائي بتركيز 1 pg/µL. حُفظ محلول العمل عند 4 °C، بينما خُزنت الحصص المتبقية عند -20 °C لمدة تصل إلى 2–3 أشهر. وبالنسبة لمجموعة BIBN-4096، أُذيب 1 mg من مسحوق BIBN-4096 في 333 µL من ddH₂O للحصول على محلول مخزون بتركيز 3 mg/mL، والذي وُزع في حصص مقدار كل منها 50 µL لكل قارورة وخُزنت عند -80 °C. ولتحضير محلول العمل بتركيز 0.3 mg/mL، خُلطت كل حصة من المحلول المخزون (50 µL) جيداً مع 450 µL من المحلول الملح sterile saline. ومن اليوم 40 إلى 53، تم إعطاء حجم 10 µL إما من محلول CGRP بتركيز 1 pg/µL أو محلول BIBN-4096 بتركيز 0.3 mg/mL عن طريق الأنف لكل فأر يوماً بعد يوم تحت تقييد لطيف وبدون تخدير.

مقاييس النتائج وطرق الكشف

الاختبارات السلوكية

في اليوم 53، وبعد التحدي الأخير عن طريق الأنف، تمت مراقبة وتسجيل تكرار نوبات فرك الأنف والعطس باستخدام نظام فيديو رقمي لمدة 10 min. قام باحثان بحساب تكرارات السلوك في مقاطع الفيديو بشكل مستقل وبطريقة التعمية المزدوجة. وفي حالات وجود تباين ملحوظ بين حساباتهما، قام باحث ثالث بإعادة تقييم الفيديو، وفي النهاية تم اختيار البيانات ذات الاتساق الأعلى للتحليل الإحصائي.

اختبار تحفيز القصبات

في غضون 24 h بعد التحدي النهائي، تم تقييم استجابة الممرات الهوائية باستخدام الأسيتيل كولين (ACh) المرذذ بتركيزات 0، 5، 10، 20، و40 mg/mL (بواقع 300 µL لكل تركيز، يتم رذذه لمدة 1 min). تم تسجيل قيم التوقف المعزز (Penh)، وهي مؤشر عديم الأبعاد يُستخدم للإشارة تجريبياً إلى تضيق الممرات الهوائية وتقييم فرط استجابة الممرات الهوائية (AHR)، لمدة 5 min بعد كل عملية رذذ باستخدام جهاز قياس حجم التنفس لكامل الجسم غير الباضع. تم تأقلم الفئران مع الغرفة لمدة 10 min قبل التسجيل. تم حساب Penh تلقائياً باستخدام برنامج نظام التخزين/البث اليدوي المتكامل وفقاً للمعادلة التجريبية التي توازن بين زمن الزفير/الشهيق وذروة التدفقات.

الفحص النسيجي المرضي (صبغة HE)

تم تجفيف أنسجة الرئة المثبتة في 4% paraformaldehyde عبر سلسلة متدرجة من الكحول، ثم تصفيتها في xylene، وطمرها في قوالب من البارافين باستخدام جهاز معالجة آلي. قُطعت القوالب بسماكة 4 µm، ووُضعت في حمام مائي عند 42 °C، ثم ثُبتت على شرائح زجاجية. خضعت الشرائح للتجفيف بالحرارة عند 80 °C لمدة 2 h وجُففت طوال الليل قبل تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. ولغرض الصبغ، أزيل البارافين من المقاطع باستخدام xylene (مرتان I و II، لمدة 20 min لكل منهما)، وأعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (100% I/II و 75%، لمدة 5 min لكل منهما)، ثم شُطفت بماء الصنبور. صُبغت الشرائح بـ hematoxylin لمدة 3–5 min، وفُصلت باستخدام 1% acid alcohol، ثم عولجت بمحلول التزريق. وبعد الغسيل، جُففت المقاطع باستخدام إيثانول بتركيز 85% و 95% (لمدة 5 min لكل منهما) وصُبغت صبغاً مضاداً بـ eosin لمدة 5 min. وأخيراً، جُففت الشرائح في إيثانول مطلق (ثلاث مرات I و II و III، لمدة 5 min لكل منها)، وصُفيت في xylene (مرتان I و II، لمدة 5 min لكل منهما)، وثُبتت باستخدام balsam متعادل، ثم جُففت في الهواء. التُقطت الصور من حقول عشوائية بتكبير 200× باستخدام مجهر ضوئي ونظام CaseViewer. تم تقييم التهاب الرئة وتثخن الظهارة بشكل أعمى على مقياس من 0–4: 0، لا يوجد التهاب؛ 1، خلايا التهابية متفرقة؛ 2، بؤر التهابية قليلة (<3)؛ 3، بؤر التهابية متعددة (≥3)؛ 4، ارتشاح منتشر في جميع أنحاء الرئة. وقُيم تثخن الظهارة كما يلي: 0، طبيعي؛ 1، تثخن مرئي؛ 2، تثخن جزئي في الممرات الهوائية؛ 3، انسداد شبه كامل؛ 4، غياب البنية الطبيعية. ولكل مجموعة تجريبية، تم تصوير وتقييم ما مجموعه 20 حقلاً مجهرياً عشوائياً للحصول على درجات الفحص النسيجي المرضي الخام. وحُسب متوسط البيانات من كل أربعة حقول لإنتاج نقطة بيانات مستقلة واحدة، مما أدى إلى حجم عينة نهائي قدره n = 5 مكررات لكل مجموعة للتحليل الإحصائي. وقد أُجري التقييم بطريقة تعمية.

تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)

تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من أنسجة الرئة الفأرية باستخدام كاشف TRIzol وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وتم تقييم نقاء وتركيز وسلامة الـ RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي ومنصة قائمة على الموائع الدقيقة. كما تم بناء مكتبات الترانسكريبتوم باستخدام طقم تحضير مكتبات تجاري، وأُجري لها التسلسل على منصة تسلسل عالية الإنتاجية لتوليد قراءات مزدوجة النهاية بطول 150 bp. خضعت البيانات الخام لمراقبة الجودة باستخدام برنامج تصفية مناسب للحصول على قراءات نظيفة، والتي تم تعيينها على الجينوم المرجعي باستخدام أداة محاذاة تراعي مواقع الربط (splice-aware alignment tool). وحُسبت مستويات التعبير الجيني كـ FPKM، كما تم تجميع أعداد القراءات عبر أداة عد القراءات. وأُجري تحليل التعبير التفاضلي باستخدام حزمة إحصائية متخصصة، مع تحديد عتبات عند |log2 Fold Change| ≥ 1 وقيمة p معدلة < 0.05.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم وزن أنسجة رئة فئران طازجة بدقة وتجنيسها في محلول PBS المنظم بنسبة صارمة تبلغ 20 mg من النسيج إلى 200 µL من المحلول المنظم. تم طرد المجانسات مركزياً عند 13,400 × g تقريباً لمدة 10 min عند 4 °C لجمع الرواسب البروتينية العلوية. ولأغراض التنميط، تم معايرة محتوى البروتين الخام في الرواسب العلوية باستخدام طريقة BCA. أُجري إجراء ELISA في ثلاث مكررات تقنية باستخدام أطقم تجارية وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وباختصار، تمت إضافة 50 µL من التخفيفات القياسية أو 50 µL من العينات المخففة مسبقاً (10 µL من عينة البروتين ممزوجة مع 40 µL من مخفف العينة، لتحقيق تخفيف نهائي بمقدار 5 أضعاف) إلى أطباق ذات 96 بئراً مغلفة بالأجسام المضادة. تم إغلاق الأطباق وتحضينها عند 37 °C لمدة 30 min. وبعد الغسل خمس مرات بمحلول غسيل منظم مخفف بنسبة 1:30، تمت إضافة 50 µL من كاشف الاقتران المرتبط بالإنزيم إلى كل بئر (باستثناء الآبار الفارغة)، وحُضن الخليط عند 37 °C لمدة 30 min. وبعد خمس غسلات أخرى، تمت إضافة 50 µL من محلول الكروموجين A و50 µL من محلول الكروموجين B إلى كل بئر، وحُضن الطبق في الظلام عند 37 °C لمدة 10 min. تم إيقاف التفاعل بإضافة 50 µL من محلول الإيقاف، مما أدى إلى تحول اللون من الأزرق إلى الأصفر. تم قياس الامتصاصية (قيمة OD) لكل بئر عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة خلال 15 min. رُسمت المنحنيات القياسية باستخدام نموذج لوجستي رباعي المعلمات أو نموذج انحدار خطي (مع ضمان أن R² > 0.99)، ومن خلالها تم حساب تركيزات البروتين المستهدف في مجانسات أنسجة الرئة.

قياس التدفق الخلوي

تم استئصال أنسجة الرئة، وتقطيعها، وهضمها في 5 mL من وسط RPMI-1640 المحتوي على 10% FBS، و50 µL من Liberase TM، و5 µL من DNase I عند درجة حرارة 37 °C لمدة 45 min مع الرج بسرعة 80 rpm. مرر المعلق المهضوم عبر مصفاة خلايا ذات مسامية 400-mesh ثم تم طرده مركزياً عند 300 × g لمدة 10 min عند درجة حرارة 4 °C. أُعيد تعليق الراسب في 2 mL من محلول تحلل كريات الدم الحمراء لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وبعد الغسل، أُعيد تعليق الخلايا وصُبغت بصبغة Ghost Dye Red 780 (بمقدار 1.25 µL لكل عينة) لمدة 20 min عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لاستبعاد الخلايا الميتة. وعقب الغسل، تم حجب الخلايا باستخدام 10 µL من كاشف FcR Blocking Reagent لمدة 10 min عند درجة حرارة 4 °C. ثم أجري صبغ سطحي للخلايا باستخدام الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم التالية لمدة 30 min عند درجة حرارة 4 °C: FITC anti-mouse CD45 (بمقدار 0.5 µL)، وPE anti-mouse/human KLRG1 (بمقدار 1.25 µL)، وBB700 rat anti-mouse CD90.2 (بمقدار 0.5 µL)، ومزيج سلالة مرتبط بالبيوتين يحتوي على anti-mouse CD3ε وCD4 وCD8a وCD11b وCD11c وCD49b وTER-119 وLy-6G/Ly-6C (Gr-1) (بمقدار 0.5 µL لكل منها)، وanti-mouse CD19 (بمقدار 2 µL). وبعد الغسل، حُضنت الخلايا مع Brilliant Violet 605 Streptavidin (بمقدار 2 µL) لمدة 30 min عند درجة حرارة 4 °C. جُمعت البيانات باستخدام منصة قياس التدفق الخلوي BD وحُللت باستخدام برنامج FlowJo. وتمت مراقبة مصفوفات تعويض تداخل الفلورة وضبطها تلقائياً بواسطة برنامج الاستحواذ المعاير للجهاز. نُفذت استراتيجية البوابات الهرمية لتحديد خلايا ILC2 الرئوية بالتتابع كما يلي: عُزلت أولاً الخلايا اللمفاوية الكلية عبر مورفولوجيا التشتت الأمامي/الجانبي (FSC-A/SSC-A)، تلا ذلك تمييز الخلايا المزدوجة من خلال بوابات الخلايا المفردة (FSC-H/FSC-A). بعد ذلك، تم تحديد الخلايا الحية عن طريق استبعاد الخلايا الميتة (Ghost Dye^-)، ثم طُبقت بوابات قياسية تدريجياً لاختيار مجموعات CD45⁺ وLineage^-. وضمن نافذة بوابات CD45⁺Lineage^-للخلايا الحية، تم تعريف وقياس خلايا ILC2 الرئوية بدقة بناءً على بوابات التسلسل الشلالي الإيجابية اللاحقة لعناقيد CD90.2⁺ وKLRG1⁺.

التألق المناعي (IF)

أُذيبت قطاعات الرئة المجمدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–30 min، ثم غُسلت ثلاث مرات باستخدام PBST (محلول PBS يحتوي على 0.05% Tween-20) لمدة 6 min في كل مرة لإزالة مركب OCT. وبعد تجفيف السوائل الزائدة، رُسم حاجز كاره للماء حول النسيج باستخدام قلم الكيمياء النسيجية المناعية. حُضنت القطاعات في محلول منظم للحجب والنفاذية يحتوي على 0.3% Triton X-100 و 5% مصل ماعز عند 37 °C لمدة 100 min، تلا ذلك تحضين ليلة كاملة (16–20 h) عند 4 °C مع الجسم المضاد الأولي. وفي اليوم التالي، تُرِكت القطاعات لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min، ثم غُسلت ثلاث مرات بـ PBST، وحُضنت مع جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور ومتوافق مع النوع عند 37 °C في الظلام لمدة 60–90 min. وبعد ثلاث غسلات إضافية بـ PBST، صُبغت النوى صبغة تباينية باستخدام DAPI (مخفف بنسبة 1:1 أو 2:1 في PBS) لمدة 8 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وعقب جولة أخيرة من الغسيل بـ PBST (3 × 6 min)، ثُبتت القطاعات باستخدام وسط تثبيت مانع للتلاشي، وأُغلقت لمنع تكون الفقاعات، وخُزنت في الظلام. التُقطت الصور باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) بتكبير 400×. وحُسب عدد الخلايا الموجبة لكل حقل يدويًا باستخدام برنامج Leica LAS X. وبالنسبة لكل مجموعة تجريبية، صُوِّرت 15 حقول مجهرية عشوائية إجمالاً للحصول على أعداد الخلايا الخام. وتم حساب متوسط البيانات من كل ثلاثة حقول لإنتاج نقطة بيانات مستقلة واحدة، مما أدى إلى حجم عينة نهائي قدره n = 5 مكررات لكل مجموعة للتحليل الإحصائي. وقد أُجريت عملية العد بطريقة التعمية.

الكيمياء النسيجية المناعية (IHC)

تمت إزالة البارافين من المقاطع في ثلاثة تغييرات من الزيلين (15 min لكل منها)، ثم أُعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (100% مرتين، 85%، و75%؛ 5 min لكل منها)، وشطفت بالماء المقطر. أُجري استرجاع المستضد في محلول منظم من السترات (pH 6.0) باستخدام قدر ضغط (3 min تحت ضغط عالٍ بعد الغليان)، تلا ذلك التبريد وثلاث غسلات لمدة 5 min في PBS (pH 7.4). تم حجب بيروكسيداز الداخلي باستخدام 3% H₂O₂ لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد الغسل، أُحيطت المقاطع بقلم كاره للماء وحُجبت باستخدام 3% مصل ماعز لمدة 30 min. ثم حُضنت المقاطع طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية مخففة في PBS: anti-IL-4 (1:400)، أو anti-IL-5 (1:300)، أو anti-IL-13 (1:150). وفي اليوم التالي، غُسلت المقاطع وحُضنت مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ HRP (anti-mouse لـ IL-4؛ و anti-rabbit لـ IL-5 و IL-13) لمدة 50 min في درجة حرارة الغرفة. تم إظهار الإشارات باستخدام محلول DAB مُحضر حديثاً تحت تحكم مجهري، وأُنهيت العملية باستخدام ماء الصنبور. وأخيراً، صُبغت المقاطع صبغة تباينية بالهيماتوكسيلين، ثم جرت عملية التمايز، والتزريق، وإزالة الماء عبر كحوليات متدرجة وزيلين، وثُبتت باستخدام البلسم المتعادل للفحص المجهري. تم قياس متوسط الكثافة الضوئية (IOD/Area) باستخدام منصة برمجية لتحليل الصور عند تكبير 200×. ولكل مجموعة تجريبية، تم تصوير ما مجموعه 15 حقلاً مجهرياً عشوائياً للحصول على القيم الخام. وحُسب متوسط البيانات من كل ثلاثة حقول لإنتاج نقطة بيانات مستقلة واحدة، مما أدى إلى حجم عينة نهائي قدره n = 5 مكررات لكل مجموعة للتحليل الإحصائي. وقد تم التقييم بواسطة مراقبين اثنين بصيغة التعمية.

لطخة ويسترن (WB)

لتحضير العينات، تم تقطيع أنسجة الرئة الفأرية (حوالي 30 mg) تقطيعاً دقيقاً ثم تم تجنيسها في 300 µL من منظم تحليل RIPA المبرد مسبقاً والمضاف إليه 1% من مزيج مثبطات البروتياز والفوسفاتاز. أُجري التجنيس باستخدام مجنس الأنسجة بتردد 60 Hz لأربع دورات (60 s لكل دورة). بعد ذلك، تم طرد المحللات مركزياً عند حوالي 13,400 × g لمدة 15 min عند 4 °C لجمع المادة الطافية. تم تحديد تركيزات البروتين الكلية عبر طقم مقايسة BCA البروتينية القياسي. ثم تم توحيد العينات، وخلطها مع منظم تحميل 5x بنسبة حجمية 4:1، ومسخها حرارياً عند 95 °C لمدة 7 min. وبالنسبة لتقنية SDS-PAGE، تم تحميل عينات البروتين (20 µg لكل مسار) جنباً إلى جنب مع مؤشر الوزن الجزيئي للبروتين المصبوغ مسبقاً، وفصلها بجهد ثابت قدره 80 V لمدة 20 min، ثم ضبط الجهد إلى 120 V لمدة 70 min. بعد ذلك، نُقلت البروتينات بنقل رطب إلى أغشية PVDF بمسامية 0.22 µm تحت تيار ثابت قدره 300 mA لمدة 120 min في حمام ثلجي. تم حجب الأغشية باستخدام 5% BSA في TBST لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، ثم حُضنت طوال الليل (حتى 18 h) عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد CGRP (1:500) و GAPDH (1:2000). وبعد الغسل بـ TBST ثلاث مرات (10 min لكل مرة)، حُضنت الأغشية مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة ببيروكسيداز الفجل (1:10000) لمدة 1–2 h في درجة حرارة الغرفة. وعقب ثلاث غسلات أخرى، تم تصوير حزم البروتين باستخدام ركيزة التألق الكيميائي المحسنة (ECL) ضمن نظام التصوير VILBER Fusion FX. تم قياس كثافة الحزم باستخدام برنامج ImageJ 1.8، وتم توحيد تعبير البروتين المستهدف بالنسبة إلى التحكم الداخلي GAPDH.

التحليل الإحصائي

تُعرض جميع البيانات التجريبية على شكل المتوسط ± الانحراف المعياري (SD). وقد أُجري تحليل البيانات والرسم الإحصائي باستخدام منصة برمجيات إحصائية متخصصة. وقبل إجراء المقارنات بين المجموعات، خضعت مجموعات البيانات بشكل منهجي لاختبارات التوزيع الطبيعي. وبالنسبة للبيانات ذات التوزيع الطبيعي والتباينات المتجانسة، تم تطبيق تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه العادي، يليه اختبارات Tukey أو Šídák أو Holm-Šídák أو Fisher's LSD البعدية لإجراء مقارنات زوجية متعددة. وعند مقارنة مجموعات متعددة بمجموعة ضابطة واحدة، تم تطبيق اختبار Dunnett. أما بالنسبة لمجموعات البيانات ذات التباينات غير المتجانسة، فقد استُخدم تحليل التباين Brown-Forsythe ANOVA، يليه اختبار Dunnett's T3 البعدي. وبالنسبة لمجموعات البيانات التي لم تتوافق مع التوزيع الطبيعي، استُخدم اختبار Kruskal-Wallis غير المعلمي، يليه اختبار Dunn البعدي للمقارنات المتعددة. واعتُبرت القيمة P < 0.05 مؤشراً على وجود فروق ذات دلالة إحصائية. ويُشار إلى مستويات الدلالة المختلفة ديناميكيًا بـ *p < 0.05، و **p < 0.01، و ***p < 0.001، و ****p < 0.0001. كما أُجريت جميع تقييمات النتائج التجريبية، بما في ذلك التقييم النسيجي وتحليل قياس التدفق الخلوي والتقدير الكمي للصور، بطريقة التعمية الصارمة.

النتائج

يقلل KAST من خلايا ILC2 الرئوية ويخفف من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2

لبحث التأثيرات العلاجية لـ KAST، تم إنشاء نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي (AA) مستحث بواسطة OVA، وعولج باستخدام لصقات وضعت على نقاط الوخز الإبري Feishu (BL13)، وGeshu (BL17)، وPishu (BL20)، وShenshu (BL23) (الشكل 1A). بعد نمذجة المرض، أظهرت فئران AA انخفاضاً في وزن الجسم، بينما أظهرت فئران KAST زيادة ملحوظة في وزن الجسم مقارنة بمجموعة النموذج (الشكل 1B). وكان معامل الرئة، وهو مؤشر على الالتهاب الرئوي، مرتفعاً في فئران AA ولكنه انخفض بشكل ملحوظ بعد العلاج بـ KAST (الشكل 1C). وكشفت التقييمات السلوكية عن زيادة في حك الأنف والعطس لدى فئران AA، والتي خفت بشكل ملحوظ بواسطة KAST (الشكل 1D–E). وأظهر قياس تذبذب الهواء للجسم بالكامل أن قيم Penh، التي تشير إلى فرط استجابة الممرات الهوائية، كانت مرتفعة في فئران AA ولكنها انخفضت بعد العلاج، مما يشير إلى تحسن في وظائف الرئة (الشكل 1F). وكشف التحليل النسيجي المرضي باستخدام صبغ HE عن ارتشاح للخلايا الالتهابية حول القصيبات وحول الحويصلات الهوائية في مجموعة النموذج مقارنة بالمجموعات الضابطة الطبيعية. وفي المقابل، انخفض الارتشاح الالتهابي في مجموعة KAST (الشكل 2A–B). وأظهر الكيمياء النسيجية المناعية أن IL-4 وIL-5 وIL-13 كانت متمركزة بشكل أساسي في سيتوبلازم الخلايا الالتهابية المرتشحة وبعض الخلايا الطلائية، مع احتمال تراكمها في المساحات الخلالية. ومقارنة بالمجموعات الضابطة الطبيعية، أظهرت مجموعة النموذج زيادة ملحوظة في الإشارات الإيجابية وقيم الكثافة الضوئية المتوسطة، والتي انخفضت بشكل ملحوظ في مجموعة KAST (الشكل 2C–H). علاوة على ذلك، أظهر قياس التدفق الخلوي أن أعداد ILC2 زادت بشكل ملحوظ في رئتي فئران AA مقارنة بالمجموعات الضابطة الطبيعية، بينما خفض KAST أعداد ILC2 بشكل ملحوظ (الشكل 2I–J).

يخفف KAST من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 عن طريق تثبيط محور CGRP/RAMP1

يتم تنظيم الفرط في تنشيط ILC2 بواسطة عوامل متعددة. وقد كشف تحليل RNA-seq أن تعبير CGRP قد ارتفع بشكل ملحوظ في فئران AA، بينما خفض KAST مستويات CGRP الرئوية بشكل ملحوظ (الشكل 3A). كما أكدت تحاليل Western blot وELISA ارتفاع مستويات بروتين CGRP في مجموعة النموذج مقارنة بمجموعات الضبط، والتي انخفضت بفعل KAST (الشكل 3B–D). تشير هذه النتائج إلى أن KAST يقلل من تعبير CGRP في رئتي فئران AA، وبالتالي يعمل على تعديل الاستجابات المناعية لـ ILC2. وتدل هذه التباينات في التسلسل عالي الإنتاجية وفحص البروتين مجتمعة على وجود ارتباط قوي بين التدخل العلاجي بـ KAST وخفض مستويات CGRP الرئوية في فئران AA.

ولمزيد من استكشاف دور CGRP، عولجت فئران AA بـ CGRP خارجي المنشأ، أو مضاد مستقبل CGRP وهو BIBN-4096، أو KAST مع CGRP. أظهرت نتائج ELISA انخفاضاً ملحوظاً في مستويات بروتين CGRP في مجموعتي KAST و BIBN-4096، وارتفاعاً في مستوياته في مجموعة CGRP، ومستويات أعلى في مجموعة KAST + CGRP مقارنة بمجموعة KAST وحدها (الشكل 4A). وكشف قياس التدفق الخلوي أن أعداد ILC2 قد انخفضت في مجموعتي KAST و BIBN-4096 ولكنها زادت في مجموعتي CGRP و KAST + CGRP بالنسبة لمجموعة النموذج (الشكل 4B–C). وأظهر صبغ HE انخفاضاً في ارتشاح الخلايا الالتهابية حول الممرات الهوائية والحويصلات الهوائية في مجموعتي KAST و BIBN-4096، بينما تفاقم الارتشاح في مجموعتي CGRP و KAST + CGRP (الشكل 4D–E). كما أكد تحليل ELISA انخفاض مستويات IL-4 و IL-5 و IL-13 في مجموعتي KAST و BIBN-4096، ولكنها زادت في مجموعتي CGRP و KAST + CGRP (الشكل 4F–H).

تم تقييم عدد خلايا RAMP1⁺ILC2s الرئوية عبر المجموعات المختلفة باستخدام صبغ المناعة الفلوري متعدد الألوان. وأظهرت النتائج أنه مقارنة بمجموعة التحكم الطبيعية، زاد عدد إجمالي خلايا RAMP1⁺ILC2s في الأنسجة الرئوية لمجموعة النموذج بشكل ملحوظ. ومقارنة بمجموعة النموذج، ارتفع عدد خلايا RAMP1⁺ILC2s الرئوية بشكل ملحوظ إضافياً في مجموعة CGRP، بينما انخفضت بشكل بارز في كل من مجموعة BIBN-4096 ومجموعة KAST. والجدير بالذكر أنه مقارنة بمجموعة KAST، أظهرت مجموعة KAST + CGRP ارتفاعاً ملحوظاً في أعداد خلايا RAMP1⁺ILC2s الرئوية، مما يشير إلى أن تعويض CGRP الخارجي نجح في عكس التأثيرات المثبطة لـ KAST على مجموعات إجمالي خلايا RAMP1⁺ILC2s (الشكل 5A–B).

توافر البيانات:

تم إيداع مجموعات البيانات الخام الكاملة التي تم إنشاؤها وتحليلها خلال هذه الدراسة في مستودع متاح للعامة. وتحديداً، تشمل هذه المواد الشاملة جميع عمليات مسح الأغشية الأصلية والكاملة لاختبارات Western blot (WB)، وجميع الصور المجهرية الخام والكاملة وعالية الدقة لاختبارات النسيج المرضي (HE و IHC) واختبارات التألق المناعي (IF)، بالإضافة إلى مجموعات بيانات التكرارات الفردية وجداول Excel الخاصة بالتقدير الكمي. جميع البيانات الخام متاحة بشكل مفتوح عبر معرف الكائن الرقمي (DOI) الدائم التالي: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. تم توفير ترتيب بوابات التحليل (gating order) لقياس التدفق الخلوي في الشكل التكميلي 1. كما تم تقديم صورتين كاملتين لعمليات المسح كـ الشكلين التكميليين 2-3، وتم تقديم البيانات الكمية في الجدول التكميلي 1.

figure-results-1
الشكل 1: تأثيرات KAST على الأعراض ووظائف الرئة في فئران AA. (A) بروتوكول تحفيز الربو التحسسي باستخدام OVA. (B) إحصائيات وزن الجسم للفئران في كل مجموعة، n = 5. (C) معامل الرئة للفئران في كل مجموعة، n = 5. (D) عدد مرات فرك الأنف خلال 10 min بعد التحدي الأخير، n = 5. (E) تكرار العطس خلال 10 min بعد التحدي الأخير، n = 5. (F) قيم Penh للفئران في كل مجموعة بعد التحفيز بتركيزات مختلفة من acetylcholine، n = 5. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام either one-way ANOVA أو two-way ANOVA، متبوعة باختبار مقارنات متعددة post hoc حيثما كان ذلك مناسباً. n = المكررات البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تنظيم أعداد ILC2 والتهاب الممرات الهوائية من النوع 2 بواسطة KAST في فئران AA. (A) التغيرات المورفولوجية للرئتين التي تم فحصها بواسطة صبغة HE. شريط المقياس = 50 µm. التكبير: 200×. تم تقييم درجة الالتهاب بطريقة التعمية. (B) التحليل الإحصائي لدرجات الالتهاب بين المجموعات المختلفة، n = 5. (C–H) صور IHC ممثلة وقيم متوسط الكثافة البصرية للتعبير البروتيني لـ IL-4 (C, D)، و IL-5 (E, F)، و IL-13 (G, H) في أنسجة الرئة لمجموعات مختلفة، n = 5. شريط المقياس = 50 µm. التكبير: 200×. (I) مخططات تدفق خلوي ممثلة توضح تحديد البوابات النهائي لخلايا ILC2 الرئوية عبر مجموعات Normal و Model و KAST. تم تحديد الخلايا الحية المنفردة بالتسلسل كخلايا CD45⁺ Lineage^- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19)، متبوعة بـ CD90.2⁺، وفي النهاية تم تحديد ILC2 الرئوية من خلال التعبير الإيجابي لـ KLRG1⁺. تم الحصول على البيانات باستخدام منصة تدفق خلوي عالية الأداء وحُللت باستخدام حزمة برمجيات متخصصة لتحليل التدفق الخلوي. (J) تحليل ILC2 مشار إليه بنسبة خلايا CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ من بين الخلايا الحية، n = 5. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. أجريت المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعاً باختبارات مقارنة متعددة مناسبة بعد الاختبار (post hoc). n = مكررات بيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: يقوم KAST بتثبيط تعبير CGRP في أنسجة الرئة لفئران AA. (A) خريطة حرارية لتعبير الجينات بين المجموعات المختلفة، n = 4. (B) صور ممثلة لـ WB لتعبير CGRP (10 kDa) وGAPDH (37 kDa) في أنسجة الرئة من كل مجموعة. (C) تحليل WB لتعبير بروتين CGRP في أنسجة الرئة، معروضاً كتعبير نسبي لـ CGRP (نسبة CGRP/GAPDH)، n = 3. (D) تحليل ELISA لتعبير بروتين CGRP في أنسجة الرئة، n = 4. البيانات معروضة كـ mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. تم إجراء المقارنات الإحصائية باستخدام one-way ANOVA متبوعة باختبار post hoc للمقارنات المتعددة. n = المكررات البيولوجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تأثيرات KAST على أعداد خلايا ILC2 والتهاب الممرات الهوائية من النوع 2 عبر CGRP في فئران مصابة بـ AA. (A) تحليل ELISA للتعبير البروتيني لـ CGRP في أنسجة الرئة من مجموعات مختلفة، n = 4. (B) مخططات تدفق خلوي تمثيلية لخلايا ILC2s (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) في كل مجموعة. (C) تحليل خلايا ILC2s موضحة بنسبة خلايا CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ من بين الخلايا الحية، n = 5. (D) التغيرات المورفولوجية للرئتين التي تم فحصها بواسطة صبغ HE. شريط المقياس = 50 µm. التكبير: 200×. (E) التحليل الإحصائي لدرجات الالتهاب بين المجموعات المختلفة، n = 5. (F–H) تحليل ELISA للتعبير البروتيني لـ IL-4 (F)، و IL-5 (G)، و IL-13 (H) في أنسجة الرئة من مجموعات مختلفة، n = 4. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. أجريت المقارنات الإحصائية باستخدام one-way ANOVA متبوعاً باختبارات post hoc للمقارنات المتعددة المناسبة. n = المكررات البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تأثيرات KAST على أعداد ILC2 في أنسجة الرئة عبر مسار CGRP/RAMP1. (A) تعداد خلايا RAMP1⁺ ILC2s (المُعرفة بأنها خلايا ثلاثية الإيجابية KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) لكل مجال تكبير 400× في أنسجة الرئة، n = 5. (B) صبغ فلوري تمثيلي لأنسجة الرئة. صُبغت النوى بـ DAPI (الأزرق)، وأُجري الصبغ المناعي لـ KLRG1 (الأرجواني)، و GATA3 (الأحمر)، و RAMP1 (الأخضر). شريط المقياس = 50 µm. القياس الكمي: عد يدوي لخلايا RAMP1⁺ ILC2s (خلايا KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) بطريقة تعمية باستخدام منصة متخصصة لتحليل الصور. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام one-way ANOVA متبوعة باختبار post hoc للمقارنات المتعددة. n = المكررات البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: مخططات تمثيلية لقياس التدفق الخلوي توضح استراتيجية البوابة التسلسلية لعزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع الثاني (ILC2s) الرئوية. أولاً، تم تحديد البوابة للأحداث الكلية باستخدام التشتت الأمامي (FSC-A) والتشتت الجانبي (SSC-A). وتم استبعاد الخلايا المزدوجة عبر مقارنة FSC-A مقابل FSC-H للحصول على خلايا مفردة. كما تم تحديد الخلايا الحية على أنها Ghost Dye Red 780⁻ للتخلص من مجموعات الخلايا الميتة. بعد ذلك، تم تحديد بوابة الكريات البيضاء بناءً على CD45⁺، متبوعة باختيار الخلايا سلبية السلالة (Lin⁻). وضمن المجموعة الفرعية CD45⁺ Lin⁻، تم تحديد بوابة الخلايا بناءً على CD90.2⁺، وفي النهاية تم تعريف الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع الثاني (ILC2s) الرئوية من خلال التعبير الإيجابي لـ KLRG1 (KLRG1⁺).يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: صورة تمثيلية لـ Western blot للمرجع الداخلي GAPDH (37 kDa) من عينات أنسجة رئة الفأر. تم قياس الكثافة الضوئية المتكاملة للنطاقات باستخدام برنامج ImageJ من أجل عملية التسوية اللاحقة.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: صورة ممثلة لطريقة لطخة ويسترن للبروتين المستهدف CGRP (10 kDa) من عينات أنسجة الرئة للفئران. تم حساب التعبير النسبي لبروتين CGRP عن طريق قسمة الكثافة الضوئية المتكاملة لنطاقات CGRP على قيم الكثافة الضوئية المتكاملة المقابلة لبروتين GAPDH.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: قيم البيانات الخام. قيم البيانات الخام التي استُخدمت في رسم الرسوم البيانية.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يواجه علاج الربو التحسسي (AA) عدة قيود، بما في ذلك الآثار الجانبية المرتبطة باستخدام الأدوية لفترات طويلة، وعدم السيطرة الكاملة على الأعراض، والانتكاسات المتكررة. وعلى الرغم من فعالية العلاج الدوائي التقليدي، إلا أنه غالباً ما يصاحبه نتائج سلبية مثل الاعتماد على الستيرويدات²⁶^,²⁷. وفي المقابل، يوفر العلاج بـ KAST بديلاً آمناً واقتصادياً ومريحاً لإدارة الربو التحسسي. وقد أظهرت الأدلة السريرية أن KAST يمكن أن يخفف بشكل فعال من أعراض الربو عن طريق تعديل الوظيفة المناعية الرئوية²⁸. وفي هذه الدراسة، أثبتنا أيضاً أن KAST يقلل من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 في الفئران المصابة بالربو التحسسي عن طريق تثبيط مسار CGRP/RAMP1 وتقليل عدد خلايا ILC2s.

تلعب المناعة الفطرية، وخاصة الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s)، دوراً لا غنى عنه في بدء وتضخيم واستدامة التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 في حالات الربو التحسسي (AA)²⁹. فعند التعرض للمواد المسببة للحساسية، تستجيب ILC2s بسرعة للمنبهات (alarmins) المشتقة من الخلايا الظهارية، حيث تفرز كميات كبيرة من IL-5 وIL-13 في غضون ساعات، مما يؤدي إلى تحفيز الاستجابات الالتهابية من النوع 2³⁰^,³¹. علاوة على ذلك، تعزز ILC2s تمايز خلايا Th2 وتخليق IgE، مما يزيد من تضخيم الاستجابات المناعية التكيفية وتفاقم التهاب الممرات الهوائية³². وقد أظهرت الدراسات أن الاستئصال الجيني لـ ILC2s يقلل بشكل كبير من مدة التهاب الممرات الهوائية في نماذج الربو التحسسي، مما يبرز دورها المركزي في استدامة الالتهاب من النوع 2¹⁸. يتم تنظيم ILC2s بواسطة السيتوكينات (مثل IL-25 وIL-33 وTSLP)، والوسائط الالتهابية (مثل الليوكوتريينات)، والببتيدات العصبية (مثل CGRP وVIP وNMU)³³. ومن بين هذه العوامل، تؤدي الببتيدات العصبية أدواراً محورية في تنظيم المناعة الفطرية؛ حيث يعمل Neuromedin U (NMU) بشكل مباشر على تعزيز نشاط ILC2s، مما يحفز بسرعة إطلاق IL-5 وIL-13³⁴. كما يساهم الببتيد المعوي النشط وعائياً (VIP) في تناول العناصر الغذائية والتنظيم اليوماوي، مما يعزز إنتاج IL-5 بواسطة ILC2s ويحافظ على التوازن الداخلي للخلايا الحمضية (eosinophil homeostasis)³³. أما CGRP فيزيد بشكل ملحوظ من إطلاق IL-5 من ILC2s، مما يعزز التهاب الممرات الهوائية في الربو التحسسي. والجدير بالذكر أن RAMP1، وهو الوحدة الفرعية لمستقبل CGRP، يتم التعبير عنه بمستويات أعلى بكثير في ILC2s مقارنة بمستقبلات الببتيدات العصبية الأخرى، مما يشير إلى أن CGRP هو الربيطة الأكثر قوة لتنشيط ILC2s³⁵. في هذه الدراسة، حدد تحليل الترانسكريبتوم CGRP كأحد أكثر الببتيدات العصبية تعبيراً تباينياً في فئران الربو التحسسي، وأكدت المقايسات على مستوى البروتين ارتفاع تنظيمه في أنسجة الرئة. كما أدى الإعطاء الخارجي لـ CGRP إلى زيادة أعداد ILC2s وإطلاق سيتوكينات النوع 2، مما أدى إلى تفاقم التهاب الممرات الهوائية.

من الناحية الميكانيكية، يرتبط CGRP بـ RAMP1 الموجود على خلايا ILC2s لتنظيم استجاباتها المناعية اللاحقة. وبينما تصف بعض الدراسات الحالية CGRP بأنه منظم سلبي يحد من تمدد ILC2 للحماية من الالتهاب المفرط²⁰^,²¹، تشير أدلة مضادة إلى أن CGRP يمكن أن يتآزر مع الإنذاريات (alarmins) لتحفيز المناعة الفطرية من المجموعة 2 بقوة ضمن بيئات دقيقة مرضية محددة. وتتماشى نقاط النهاية التجريبية لدينا تحديداً مع الشلال الأخير، حيث أظهرت زيادة في ارتشاح ILC2 الرئوي مدفوعة بـ CGRP في البيئة الدقيقة للحساسية المستحثة بـ OVA. وعلى العكس من ذلك، فإن غلق مسار CGRP باستخدام مضاد المستقبل BIBN-4096 يقلل بشكل كبير من التهاب الممرات الهوائية الذي تتوسطه ILC2. وبدلاً من تقديم دليل مباشر على الاستئصال الجيني، تستفيد نتائجنا من التباينات الترانسكريبتومية الارتباطية وتجارب التدخل الدوائي الموازية (باستخدام CGRP خارجي ومضاد BIBN-4096) لإثبات أن الحماية العلاجية لـ KAST ترتبط ارتباطاً وثيقاً بتثبيط مجموعات إشارات CGRP/RAMP1 على خلايا ILC2s.

على الرغم من هذه النتائج الواعدة، يجب الإقرار بوجود عدة قيود متأصلة. أولاً، بينما يوفر نموذج الفئران المستحث بـ OVA رؤى ميكانيكية قيمة، فإنه قد لا يجسد بشكل كامل المشهد الفيزيولوجي المرضي والمناعي المعقد للربو التحسسي البشري بسبب الاختلافات بين الأنواع. ثانياً، يفرض حجم العينة الصغير نسبياً في بعض المقاييس الاستكشافية الحاجة إلى مجموعات أكبر لتحقيق تعميم إحصائي أوسع. ثالثاً، أعطت هذه الدراسة الأولوية بشكل أساسي لمحور إشارات CGRP/RAMP1/ILC2، مما يعني أن مسارات التفاعل العصبي المناعي الأخرى ذات الصلة المحتملة وشبكات السيتوكينات المتداخلة تستدعي استكشافاً أعمق في المستقبل. والأهم من ذلك، يتمثل القيد التقني الرئيسي في غياب مجموعة ضابطة مخصصة لوخز نقاط الوخز الإبري الوهمية باستخدام لصقات غير دوائية أو مواقع غير مخصصة للوخز الإبري. وبناءً على ذلك، لا يمكن عزل العوامل المربكة غير النوعية المحتملة تماماً — مثل الإجهاد الميكانيكي الناتج عن الحلاقة، والتعامل التجريبي، والتحفيز اللاصق للصقة نفسها — عن الخصائص العلاجية المحددة لـ KAST. ولمعالجة هذه التحفظات، ستتضمن خطط أبحاثنا المستقبلية بدقة مجموعات ضابطة وهمية مصممة بصرامة وعمليات تحقق من مسارات متعددة لتعزيز خصوصية هذه النتائج وقابلية تكرارها. فيما يتعلق بالانخفاض الملحوظ في مستويات بروتين CGRP بعد التدخل بـ BIBN-4096، فمن الضروري توضيح أنه بينما يعمل BIBN-4096 أساساً كخصم تنافسي يستهدف معقد مستقبلات RAMP1/CRLR بدلاً من كونه مثبطاً مباشراً لتخليق CGRP، فإن إعطاءه داخل الجسم يمكن أن يقلل من تراكم الربيطة الموضعي في الأنسجة. ومن المرجح أن هذه الظاهرة الثانوية تتم بوساطة تعطيل حلقة التغذية الراجعة الإيجابية العصبية المناعية. فمن خلال حظر RAMP1 في الخلايا المناعية المستهدفة مثل ILC2s، يعمل BIBN-4096 على تثبيط إفراز السيتوكينات المؤثرة في المصب، مما يؤدي بدوره إلى تقليل التنشيط الالتهابي الرجعي للنهايات العصبية الحسية والخلايا العصبية الصماوية الرئوية (PNECs)، وبالتالي تخفيف تخليق CGRP واحتباسه في الأنسجة بشكل غير مباشر.

باختصار، تُثبت نتائجنا التجريبية أن KAST يعيد تشكيل البيئة المجهرية للمناعة الفطرية الرئوية بفعالية من خلال استهداف محور CGRP/RAMP1 العصبي. وبينما ندرك أن التعميم السريري المباشر يتطلب تحسيناً حذراً نظراً للاختلافات البيولوجية بين القوارض والبشر، فإن هذه النقاط النهائية توفر أساساً ميكانيكياً حاسماً كان مفقوداً سابقاً، مما يدعم نظرية "Fei Wai He Pi Mao" التقليدية (الرئة التي تتحد مع الجلد والشعر). ومن خلال تقديم منظور عصبي-مناعي دقيق، يضع هذا البروتوكول خط أساس علمياً موثوقاً لتوجيه ودعم الترجمات السريرية المستقبلية الاستشرافية ومتعددة المراكز لعلاجات لصق نقاط الوخز العشبية التقليدية لإدارة الربو التحسسي.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82274632)، ومشروع تنمية المواهب الرائدة في مقاطعة جيانغسو للطب الصيني التقليدي (رقم SLJ0309)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (رقم BK20231381)، ومشروع خطة تطوير العلوم والتكنولوجيا للطب الصيني التقليدي بمقاطعة جيانغسو (رقم ZT202205)، والمختبر الرئيسي لأبحاث الوخز بالإبر والطب التابع لوزارة التربية والتعليم في جامعة نانجينغ للطب الصيني (رقم AML202304).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
شريط 3M الطبي المسامي	3M، الولايات المتحدة الأمريكية	1530C	تثبيت الرقعة
كلوريد الأسيتيل كولين	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	A6625	استثارة القصبات الهوائية
جهاز Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies، الولايات المتحدة الأمريكية	G2939BA	تقييم جودة وسلامة الحمض الريبي النووي (RNA)
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية	(طلب مخصص)	التألق المناعي (الثانوي)
هيدروكسيد الألومنيوم	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	239186	مادة مساعدة
جسم مضاد لـ CGRP (أرنب)	Abcam، المملكة المتحدة	ab81887	لطخة ويسترن / التألق المناعي
فأر من سلالة BALB/c (أنثى، خالية من الممرضات المحددة SPF، 8–١٠ أسابيع، ١٨–٢٢ جم)	شركة Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd.	B202407260106	نموذج حيواني
BB700 مضاد للفأر CD90.2 من الجرذ (النسيلة 53-2.1)	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	566465	قياس التدفق الخلوي
جهاز قياس التدفق الخلوي BD FACSCanto II	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	FACSCanto II	قياس التدفق الخلوي
BIBN-4096 (هيدروكلوريد أولسيجيبانت)	MedChemExpress LLC، الولايات المتحدة الأمريكية	HY-10095A	مضاد مستقبل الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP)
مزيج البيوتين لتحديد السلالة الخلوية	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	(مخصصة، مستنسخات كما هو موصوف)	قياس التدفق الخلوي
ستربتافيدين بصبغة Brilliant Violet 605	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	563260	قياس التدفق الخلوي
ألبومين مصل البقر (BSA) الجزء الخامس (Fraction V)	BioFroxx (neoFroxx GmbH)، ألمانيا	4240GR100	الحجب
بروتين الكالسيتونين/CALCA	MedChemExpress LLC، الولايات المتحدة الأمريكية	HY-P77587	التدخل باستخدام الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP)
جسم مضاد CD11c/ITGAX (أرنب)	Abmart، شنغهاي، الصين	MU115408S	التألق المناعي
محلول استعادة المستضد بالسترات	بوستر، الصين	AR0024	الكيمياء النسيجية المناعية
محلول صبغ DAPI	Beyotime، شنغهاي، الصين	C1006	تلوين النواة
ماء مقطر مرتين (ddH2O)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	10977015	إعادة تشكيل البروتين وإذابة المسحوق
DESeq2	Bioconductor (حزمة R)	الإصدار 1.42.0	برمجيات تحليل التعبير التفاضلي
دي إن ايس 1 (DNase I)	روتش دياغنوستيكس (Roche Diagnostics)، ألمانيا	10104159001	هضم أنسجة الرئة
جسم مضاد من الحمار ضد IgG للفأر H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam، المملكة المتحدة	ab150106	التألق المناعي (الثانوي)
ركيزة التلألؤ الكيميائي الكهربائي (Super Femto)	شركة Nanjing Lanken Biotech، الصين	–	التألق الكيميائي في لطخة ويسترن
طقم مقايسة بروتين BCA المُحسّنة	Beyotime، شنغهاي، الصين	P0010	تقدير كمية البروتين
محلول صبغة الإيوسين Y	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	HT110216	علم الأنسجة (صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين)
إيثانول (مطلق، درجة تحليلية)	Sinopharm Chemical Reagent، الصين	10009218	تجفيف الأنسجة وعلم الأنسجة
جسم مضاد F4/80 (فأر، مستنسخ C-7)	Santa Cruz Biotechnology، الولايات المتحدة الأمريكية	sc-377009	التألق المناعي
fastp	مفتوح المصدر (GitHub)	الإصدار 0.23.4	برمجيات مراقبة جودة البيانات الخام لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)
FITC anti-mouse CD45 (النسيلة 30-F11)	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	553080	قياس التدفق الخلوي
FlowJo	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	10	تحليل قياس التدفق الخلوي
جسم مضاد أحادي النسيلة لـ GAPDH (فأر)	Proteintech، ووهان، الصين	60004-1-Ig	لطخة وسترن
جسم مضاد GATA3 (فأر، مستنسخ L50-823)	Santa Cruz Biotechnology، الولايات المتحدة الأمريكية	sc-268	التألق المناعي
صبغة Ghost Dye Red 780	Tonbo Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	13-0865-T100	استبعاد الخلايا الميتة
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب (H+L) ممتز متبادلاً	Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية	A11008	التألق المناعي (الثانوي)
GraphPad Prism	GraphPad Software، الولايات المتحدة الأمريكية	10.1.2	التحليل الإحصائي
محلول الهيماتوكسيلين (هاريس)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	HHS16	علم الأنسجة (صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين)
HISAT2	جامعة جونز هوبكنز (مفتوح المصدر)	الإصدار 2.2.1	برمجيات محاذاة الجينوم المرجعي لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)
جسم مضاد من الماعز ضد IgG الفأري (H+L) مقترن بـ HRP	Proteintech، ووهان، الصين	SA00001-1	لطخة ويسترن (ثانوية)
جسم مضاد من الماعز ضد IgG للأرانب (H+L) مقترن بـ HRP	Proteintech، ووهان، الصين	SA00001-2	لطخة ويسترن (ثانوية)
HTSeq-count	EMBL (أداة مساعدة بلغة Python)	الإصدار 2.0.3	أداة عد القراءات للميزات الجينومية في تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)
بيروكسيد الهيدروجين (محلول H2O2 بتركيز 3%)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	H1009	حجب البيروكسيداز الداخلي
iFluor™ جسم مضاد IgG من الماعز مضاد للأرنب مقترن بـ 488	Huabio، الصين	HA1121	التألق المناعي (الثانوي)
جسم مضاد أحادي النسيلة لـ IL-4	Proteintech، ووهان، الصين	66142-1-Ig	لطخة وسترن
جسم مضاد لـ IL13	Affinity Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	DF6813	لطخة ويسترن
جسم مضاد لـ IL5	Affinity Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	AF5123	لطخة ويسترن
Illumina Novaseq 6000	Illumina، الولايات المتحدة الأمريكية	–	تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing)
ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية	1.8	القياس الكمي لطريقة لطخة ويسترن
Image-Pro Plus	Media Cybernetics، الولايات المتحدة الأمريكية	الإصدار 6.0	تحديد كمية الكثافة الضوئية للصور
تركيبة KAST العشبية	قسم الصيدلة، المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني	–	التدخل
جسم مضاد أحادي النسيلة KLRG1 (2F1)	Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية	58-5893-82	التألق المناعي
Leica LAS X	Leica Microsystems، ألمانيا	4.5	التقدير الكمي للتألق المناعي
المجهر البؤري Leica STELLARIS 8 DIVE	Leica Microsystems، ألمانيا	STELLARIS 8	التصوير المناعي الفلوري
Liberase TM	Roche Diagnostics، ألمانيا	5401119001	هضم أنسجة الرئة
مؤشر (سلم بروتيني مسبق الصبغ)	شركة NCM Biotech، سوجو، الصين	P9001	لطخة وسترن
طقم مقايسة الممتز المكون من الإنزيم المرتبط (ELISA) لـ CGRP في الفئران	شركة Aifang Biotechnology، هونان، الصين	AF2491-A	مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
طقم مقايسة الممتز الموحد للإنزيم (ELISA) لـ IL-13 في الفئران	شركة Aifang Biotechnology، هونان، الصين	AF-02456M1	مقايسة الممتز المربوط بالإنزيم (ELISA)
طقم مقايسة الممتز المائي الإنزيمي (ELISA) لـ IL-4 في الفئران	شركة Aifang Biotechnology، هونان، الصين	AF-02448M1	مقايسة الممتز المربوط بالإنزيم (ELISA)
طقم مقايسة الممتز المائي المرتبط بالإنزيم لـ IL-5 في الفأر	شركة Aifang Biotechnology، هونان، الصين	AF-11729M1	مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
وسط تثبيت بلسمي متعادل	Sinopharm Chemical Reagent، الصين	10014061	تثبيت شرائح علم الأنسجة
مصل ماعز طبيعي (للحجب)	Abcam، المملكة المتحدة	ab7481	حجب الارتباط في الكيمياء النسيجية المناعية/التألق المناعي
مركب التضمين OCT	ساكورا، الولايات المتحدة الأمريكية	4583	تضمين المقاطع التجميدية
طقم التحضير السريع لهلام PAGE بنظام الخطوة الواحدة	Vazyme، نانجينغ، الصين	E303-01	تحضير هلام الفصل الكهربائي للبروتينات باستخدام SDS-PAGE
أوفالبومين (OVA)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	A5503	التحسيس/التحدي
بارافورمالدهيد (4% في المحلول الملحي المنظم بالفوسفات PBS)	Biosharp، الصين	BL539A	تثبيت الأنسجة
PE anti-mouse/human KLRG1 (clone 2F1)	BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية	564022	قياس التدفق الخلوي
مزيج مثبطات الفوسفاتيز (50×)	بيوتيم (Beyotime)، شنغهاي، الصين	P1092	استخلاص البروتين
محلول بولي-إل-لايسين	بوستر، الصين	AR0003	طلاء شرائح علم الأنسجة
مثبط البروتيناز والفوسفاتاز	إن سي إم بيوتك (NCM Biotech)، سوتشو، الصين	P002	استخلاص البروتين
غشاء PVDF (0.22 μm)	Merck Millipore، الولايات المتحدة الأمريكية	ISEQ00010	لطخة ويسترن
جسم مضاد متعدد النسائل لـ RAMP1 (أرنب)	Proteintech، ووهان، الصين	10327-1-AP	التألق المناعي
محلول تحليل كرات الدم الحمراء (RBC lysis buffer)	Beyotime، شنغهاي، الصين	C3702	تحضير عينات قياس التدفق الخلوي
محلول RIPA المنحل (قوي)	Beyotime، شنغهاي، الصين	P0013B	استخلاص البروتين
وسط RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية	11875093	قاعدة هضم خلايا الأنسجة
سوبر كاين (SuperKine)™ وسط تثبيت مُعزز مضاد للتلاشي	شركة ووهان ياكيبين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd.)	BMU104	تثبيت العينات للفحص المناعي الفلوري
Triton X-100 (منظف)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	T8787	نفاذية الغشاء في التألق المناعي
كاشف TRIzol	Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية	15596026	استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)
طقم تحضير مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي VAHTS Universal V10 RNA-seq	Vazyme، نانجينغ، الصين	NR605-01	بناء مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)
نظام قياس حجم التنفس لكامل الجسم	غوانغيواندا، بكين، الصين	WBP-4	وظائف الرئة (Penh)
زايلين (درجة تحليلية)	Sinopharm Chemical Reagent، الصين	10023418	إزالة البارافين والترويق

المراجع

Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

2 ILC2 CGRP RAMP1 ELISA