يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

علاج لصق نقطة الوخز Kechuanting يخفف من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 في الفئران المصابة بالربو التحسسي عن طريق تنظيم عدد الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 (ILC2s)

108 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71749

⸱

سبتمبر 1, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of the Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 3First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي (AA) المستحث بالأوفالبومين (OVA) لتقييم الآليات العلاجية لعلاج لصقات نقاط الوخز Kechuanting (KAST) على التهاب الممرات الهوائية من النوع 2 عن طريق تعديل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) الرئوية عبر مسار الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP)/البروتين المعدل لنشاط المستقبل 1 (RAMP1).

الملخص

لقد ثبت أن العلاج باللاصق في نقطة Kechuanting الوخزية (KAST) يحسن بشكل فعال التهاب المجاري التنفسية لدى المرضى المصابين بالربو التحسسي (AA)؛ ومع ذلك، لا تزال الآليات الكامنة وراء ذلك غير واضحة. هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء الآليات العلاجية لـ KAST في نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي من منظور عصبي مناعي. تم إنشاء نموذج فأر مصاب بالربو التحسسي مستحث بواسطة الأوبالبومين (OVA)، وعولجت الفئران باستخدام KAST. تم تقييم تأثيرات KAST على الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) الرئوية والتهاب المجاري التنفسية من النوع 2 باستخدام قياس التدفق الخلوي، وتلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE)، والكيمياء النسيجية المناعية. استُخدمت طريقة لطخة ويسترن (WB) ومقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتقدير مستويات بروتين الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) في أنسجة الرئة. تم إجراء إعطاء أنفي لـ CGRP أو مثبط مستقبل CGRP وهو BIBN-4096 في الفئران المصابة بالربو التحسسي لبحث الدور التنظيمي لمسار CGRP/البروتين المعدل لنشاط المستقبل 1 (RAMP1) على ILC2s والتهاب المجاري التنفسية من النوع 2. أدى KAST إلى تقليل عدد ILC2s وتخفيف التهاب المجاري التنفسية من النوع 2، وصاحب ذلك انخفاض في تعبير CGRP في أنسجة الرئة. أدى الإعطاء الأنفي لـ CGRP إلى زيادة RAMP1+ILC2s وإجمالي ILC2s في الرئتين وتفاقم التهاب المجاري التنفسية من النوع 2. وعلى العكس من ذلك، أدى الإعطاء الأنفي لـ BIBN-4096 إلى تقليل ILC2s الرئوية وتخفيف التهاب المجاري التنفسية من النوع 2. يقلل KAST من التهاب المجاري التنفسية في الربو التحسسي، وهو أمر مرتبط ارتباطاً وثيقاً بتنظيم خافض لمسار CGRP/RAMP1 وما يتبع ذلك من تثبيط لـ ILC2s الرئوية، كما يدعم ذلك التثبيط الدوائي.

المقدمة

يُعد الربو التحسسي (AA) النمط الظاهري الأكثر شيوعاً للربو، حيث يمثل 60-80% من جميع حالات الربو في الصين1. ويتميز بانتشاره المرتفع وعدم السيطرة المثلى على المرض، مما يؤدي إلى تدهور شديد في جودة حياة المرضى ويفرض أعباءً اقتصادية كبيرة2,3,4,5. وعلى الرغم من أن الكورتيكوستيرويدات المستنشقة (ICS) لا تزال هي الركيزة الأساسية للعلاج السريري6، إلا أن بعض المرضى يظهرون استجابة محدودة، وغالباً ما يرتبط الاستخدام طويل الأمد بآثار جانبية وعدم القدرة على وقف تطور المرض7. لذا، يظل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة آمنة وفعالة أولوية في كل من المجالات السريرية والبحثية. يعمل علاج لصق نقاط الوخز Kechuanting (KAST)، وهو تطبيق خارجي من الطب الصيني التقليدي، على إيصال المركبات النشطة عبر الجلد، مما قد يتجنب تأثير المرور الأول الكبدي ويقلل من التفاعلات الضارة الجهازية8,9. وقد أثبتت الدراسات السريرية أن KAST يمكن أن يخفف من أعراض الربو، ويستعيد جزءاً من وظائف الرئة، ويعزز جودة حياة المرضى10,11,12. وبالتزامن مع ذلك، تشير دراسات الأيض في المصل (serum metabolomics)، وعلم الصيدلة الشبكي، والدراسات الحيوانية باستخدام نماذج الربو، إلى أن KAST يقلل من التهاب المجاري التنفسية عن طريق خفض مستويات الوسائط الالتهابية في المصل وسوائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)، بما في ذلك تثبيط تعبير IgE وIL-4 وIL-139,13,14. وبشكل جماعي، توفر هذه النتائج أدلة داعمة للفعالية العلاجية لـ KAST في علاج الربو، ومع ذلك، لا تزال آليات عمله الدقيقة غير واضحة.

تتمثل إحدى الآليات المرضية الأساسية التي تؤدي إلى تكرار الإصابة بالربو التحسسي (AA) في التهاب الممرات الهوائية من النوع 2، حيث تلعب الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) دوراً محورياً15. فعند التحفيز بمسببات الحساسية، تفرز خلايا ILC2s سيتوكينات مثل IL-5 وIL-13، مما يؤدي بدوره إلى تحفيز التهاب الممرات الهوائية16,17. وقد أظهرت الدراسات أن استنفاد خلايا ILC2s يخفف بشكل كبير من التهاب الممرات الهوائية في الفئران المصابة بالربو، مما يؤكد دورها المركزي في تطور المرض18. ومن الملاحظ أن تنشيط ووظيفة خلايا ILC2s يتم تنظيمهما بدقة عبر آليات متعددة، وقد حظيت التفاعلات العصبية المناعية باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. وتشير الأدلة الناشئة إلى أن الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) يمكن أن يرتبط بالبروتين المعدل لنشاط المستقبل 1 (RAMP1) الموجود على سطح خلايا ILC2s، مما يحفز تنشيطها والإفراز اللاحق لسيتوكينات النوع 2، وهو ما يفاقم التهاب الممرات الهوائية في حالات الربو التحسسي (AA)19,20,21. وفي الدراسة الحالية، حدد فحصنا باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-seq) أن CGRP هو ببتيد عصبي استجابي بشكل حاسم يتم تعديله بقوة بواسطة تدخل KAST. وبناءً على ذلك، وبالتركيز على مسار CGRP/RAMP1، استخدمنا KAST كتدخل في الفئران المصابة بالربو التحسسي (AA) لاستقصاء آلياته المحتملة في تعديل نشاط خلايا ILC2s وتخفيف التهاب الممرات الهوائية من النوع 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أُجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقًا لدليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر الصادر عن الأكاديميات الوطنية للعلوم. وقد تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني (رقم الموافقة 2023DW-059-01). وتوجد قائمة شاملة بجميع المواد والكواشف والأدوات والبرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة بالتفصيل في جدول المواد.

الحيوانات التجريبية وتوزيع المجموعات

تم الحصول على إناث فئران BALB/c سليمة (من درجة SPF، بعمر 8–10 أسابيع) من مركز الحيوانات التجريبية في جامعة نانجينغ للطب الصيني (ترخيص رقم SYXK (Su) 2018-0049). وُضعت الحيوانات في ظروف قياسية مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 h عند درجة حرارة 24–26 °C. تم توفير الغذاء والماء المعقمين بحرية، واستُبدلت الفرشة بانتظام، ونُظفت الأقفاص بشكل روتيني. وبعد 7 أيام من التكيف، قُسمت الفئران عشوائياً إلى ست مجموعات (n = 7/group): المجموعة الطبيعية، ومجموعة النموذج، ومجموعة CGRP، ومجموعة BIBN-4096، ومجموعة KAST، ومجموعة KAST + CGRP. خُصصت الحيوانات للمجموعات عشوائياً باستخدام جدول أرقام عشوائية تم إنشاؤه بواسطة الكمبيوتر. وقد تم إخفاء توزيع المجموعات عن الباحثين حتى تم تحديد التدخلات. ولتحسين الاستفادة من الأنسجة، وُزعت عينات الرئة من المجموعة العشوائية (n = 7 لكل مجموعة) بشكل منهجي على مسارات معالجة مختلفة، مع الإشارة بوضوح في تسميات الأشكال المعنية إلى أحجام العينات التي تم تحليلها بدقة (n = 5، أو 4، أو 3) للفحوصات النسيجية والجزيئية المحددة. لم يتم استبعاد أي بيانات من التحليل.

تحضير تركيبة KAST

تم تحضير التركيبة من قبل قسم الصيدلة في المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني22. استخدمت تسع أعشاب طبية صينية تقليدية وهي: Semen Brassicae (جزءان)، وRhizoma Corydalis (جزءان)، وRadix Kansui المعالج بالخل (جزء واحد)، وAsarum (جزء واحد)، وEphedra (جزء واحد)، وSemen Lepidii (جزء واحد)، والقرنفل (جزء واحد)، ولحاء القرفة (جزء واحد)، وGleditsia sinensis (جزء واحد). طُحنت كل عشبة لتتحول إلى مسحوق ناعم ومُررت عبر منخل بفتحات قياس 80-mesh. ولكل 100 g من المسحوق المخلوط، أُضيف 70 mL من عصير الزنجبيل الطازج و30 mL من البارافين السائل، ومُزجت المكونات جيداً، ثم صُنعت منها لصقات بوزن 0.3 g ± 5% وقطر 0.5 cm. وتحديداً، قام كبير الصيادلة Lin-gang Zhao بمصادقة جميع المكونات العشبية والزنجبيل الطازج، وخُزنت عند 4 °C في بيئة مظلمة وجافة قبل الاستخدام9. ولضمان إمكانية تكرار التدخل والاستقرار بين الدفعات، تم تطبيق معيار صارم لمراقبة الجودة بناءً على طرق UPLC-Q-TOF-MS وHPLC المعتمدة من قبل فريقنا، مما أكد الوجود المتسق للمؤشرات النشطة الرئيسية مثل sinapine thiocyanate23. ومن الناحية العملية، تم تثبيت اللصقات ذات قطر 0.5 cm باستخدام شريط لاصق طبي مسامي ومضاد للحساسية بمقاس 2.5 cm × 5.5 cm لضمان التوصيل الأمثل عبر الجلد.

إنشاء نموذج فأر AA

تم تحفيز نموذج AA وفقاً لبروتوكول معتمد من الأدبيات العلمية باستخدام التحسيس بـ OVA والتحدي عبر الأنف24. وباستثناء المجموعة الطبيعية (Normal group)، تم تحسيس جميع الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق بـ 200 µL من المحلول الملحي المحتوي على 100 µg من OVA و 2 mg من هيدروكسيد الألمنيوم في اليومين 0 و 12. ومن اليوم 18 إلى 23، خضعت الفئران لتحدٍ عبر الأنف مرة واحدة يومياً بـ 50 µg من OVA في 50 µL من المحلول الملحي. ومن اليوم 24 إلى 53، تم إعطاء OVA عبر الأنف يوماً بعد يوم. وفي اليوم 54، بعد وزن الفئران، تم إجراء القتل الرحيم عن طريق خلع الفقرات العنقية، ثم جُمعت الأنسجة. لاحقاً، تم تحديد معامل الرئة عن طريق قسمة الوزن الكلي للرئة على وزن الجسم.

التدخلات

من اليوم 40 إلى 53، تم حلاقة منطقة ظهرية بمساحة 3 cm × 6 cm للفئران في مجموعة KAST ومجموعة KAST + CGRP. وُضعت لصاقات فوق نقاط الوخز الإبرية الثنائية Feishu (BL13)، وGeshu (BL17)، وPishu (BL20)، وShenshu (BL23)، وثُبّتت بشريط لاصق لمدة 1.5 h مرة واحدة يوميًا لمدة 14 يومًا متتاليًا. وتلقت الفئران في مجموعتي CGRP وKAST + CGRP إعطاءً عن طريق الأنف لـ 10 µL من محلول Calcitonin/CALCA بتركيز (1 pg/µL) يومًا بعد يوم من اليوم 40 إلى 53. أما الفئران في مجموعة BIBN-4096 فقد تلقت إعطاءً عن طريق الأنف لـ 10 µL من محلول BIBN-4096 بتركيز (0.3 mg/mL، وهو مضاد لمستقبلات CGRP) يومًا بعد يوم. وتلقت المجموعتان الطبيعية ومجموعة النموذج تغذية قياسية دون أي تدخل. تم تطبيق KAST من اليوم 40 إلى اليوم 53، بعد حدوث التهاب الممرات الهوائية التحسسي (بدءًا من اليوم 40، وهو ما يمثل 22 يومًا بعد أول تحدٍ بـ OVA في اليوم 18). وبناءً على ذلك، كان KAST في هذه الدراسة بمثابة تدخل علاجي وليس وقائيًا.

لتحضير الجلد، تمت إزالة الشعر من المنطقة الظهرية المحددة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. وقد التزم تحديد نقاط الوخع بدقة بـ "تسمية ومواقع نقاط الوخع للحيوانات المختبرية - الجزء 3: الفئران (T/CAAM 0002-2020)" الصادر عن الجمعية الصينية للوخز بالإبر والكي. تم تحديد أربعة أزواج من المواقع الظهرية الثنائية بدقة كما يلي: Feishu (BL13: بين الأضلاع أسفل النتوء الشوكي للفقرة الصدرية الثالثة، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف الخلفي)، و Geshu (BL17: أسفل النتوء الشوكي للفقرة الصدرية السابعة، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف)، و Pishu (BL20: أسفل النتوء الشوكي للفقرة الصدرية الثانية عشرة، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف)، و Shenshu (BL23: أسفل النتوء الشوكي للفقرة القطنية الثانية، على بُعد 3 mm جانبيًا من الخط الناصف). لُف شريط 3M بإحكام لتحقيق التصاق مستقر، مما يضمن عدم تحرك الرقعة أو حدوث تآكل ثانوي في الجلد خلال فترة التثبيت التي استمرت 1.5 h.

تم اختيار جرعات CGRP/CALCA (بتركيز 1 pg/µL، وبمقدار 10 µL لكل فأر) و BIBN-4096 (بتركيز 0.3 mg/mL، وبمقدار 10 µL لكل فأر) بناءً على دراسات منشورة25. وبالتحديد، بالنسبة لتدخل CGRP، تم تحضير محلول BSA بتركيز 0.1% عن طريق إذابة 1 mg من BSA في 1 mL من ddH2O، متبوعاً بالرج باستخدام جهاز الفورتكس (vortexing) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 mg/mL. وقبل إعادة التكوين، تم طرد مسحوق بروتين Calcitonin/CALCA المجفف بالتجميد مركزياً عند 12,000 × g لمدة 30 s عند 4 °C. بعد ذلك، تمت إضافة 20 µL من محلول BSA 0.1% المُحضّر للحصول على محلول مخزون بتركيز 1 µg/µL. قُلبت القارورة بلطف عدة مرات (دون استخدام الفورتكس)، ثم دُوّرت لثوانٍ قليلة، وتُركت في درجة حرارة الغرفة لعدة دقائق لضمان إعادة تكوين البروتين بشكل كامل. ولتحضير محلول العمل بتركيز 1 pg/µL دون إنتاج حجم كبير غير قابل للإدارة في خطوة واحدة، تم تنفيذ تخفيف تسلسلي قياسي من خطوتين: أولاً، تم تخفيف 1 µL من المحلول المخزون (1 µg/µL) في 999 µL من المحلول الملح sterile saline لتحضير محلول وسيط بتركيز 1 ng/µL، ثم خُلط 1 µL من هذا المحلول الوسيط مع 999 µL أخرى من المحلول الملح sterile saline للوصول إلى محلول العمل النهائي بتركيز 1 pg/µL. حُفظ محلول العمل عند 4 °C، بينما خُزنت الحصص المتبقية عند -20 °C لمدة تصل إلى 2–3 أشهر. وبالنسبة لمجموعة BIBN-4096، أُذيب 1 mg من مسحوق BIBN-4096 في 333 µL من ddH2O للحصول على محلول مخزون بتركيز 3 mg/mL، والذي وُزع في حصص مقدار كل منها 50 µL لكل قارورة وخُزنت عند -80 °C. ولتحضير محلول العمل بتركيز 0.3 mg/mL، خُلطت كل حصة من المحلول المخزون (50 µL) جيداً مع 450 µL من المحلول الملح sterile saline. ومن اليوم 40 إلى 53، تم إعطاء حجم 10 µL إما من محلول CGRP بتركيز 1 pg/µL أو محلول BIBN-4096 بتركيز 0.3 mg/mL عن طريق الأنف لكل فأر يوماً بعد يوم تحت تقييد لطيف وبدون تخدير.

مقاييس النتائج وطرق الكشف

الاختبارات السلوكية

في اليوم 53، وبعد التحدي الأخير عن طريق الأنف، تمت مراقبة وتسجيل تكرار نوبات فرك الأنف والعطس باستخدام نظام فيديو رقمي لمدة 10 min. قام باحثان بحساب تكرارات السلوك في مقاطع الفيديو بشكل مستقل وبطريقة التعمية المزدوجة. وفي حالات وجود تباين ملحوظ بين حساباتهما، قام باحث ثالث بإعادة تقييم الفيديو، وفي النهاية تم اختيار البيانات ذات الاتساق الأعلى للتحليل الإحصائي.

اختبار تحفيز القصبات

في غضون 24 h بعد التحدي النهائي، تم تقييم استجابة الممرات الهوائية باستخدام الأسيتيل كولين (ACh) المرذذ بتركيزات 0، 5، 10، 20، و40 mg/mL (بواقع 300 µL لكل تركيز، يتم رذذه لمدة 1 min). تم تسجيل قيم التوقف المعزز (Penh)، وهي مؤشر عديم الأبعاد يُستخدم للإشارة تجريبياً إلى تضيق الممرات الهوائية وتقييم فرط استجابة الممرات الهوائية (AHR)، لمدة 5 min بعد كل عملية رذذ باستخدام جهاز قياس حجم التنفس لكامل الجسم غير الباضع. تم تأقلم الفئران مع الغرفة لمدة 10 min قبل التسجيل. تم حساب Penh تلقائياً باستخدام برنامج نظام التخزين/البث اليدوي المتكامل وفقاً للمعادلة التجريبية التي توازن بين زمن الزفير/الشهيق وذروة التدفقات.

الفحص النسيجي المرضي (صبغة HE)

تم تجفيف أنسجة الرئة المثبتة في 4% paraformaldehyde عبر سلسلة متدرجة من الكحول، ثم تصفيتها في xylene، وطمرها في قوالب من البارافين باستخدام جهاز معالجة آلي. قُطعت القوالب بسماكة 4 µm، ووُضعت في حمام مائي عند 42 °C، ثم ثُبتت على شرائح زجاجية. خضعت الشرائح للتجفيف بالحرارة عند 80 °C لمدة 2 h وجُففت طوال الليل قبل تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. ولغرض الصبغ، أزيل البارافين من المقاطع باستخدام xylene (مرتان I و II، لمدة 20 min لكل منهما)، وأعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (100% I/II و 75%، لمدة 5 min لكل منهما)، ثم شُطفت بماء الصنبور. صُبغت الشرائح بـ hematoxylin لمدة 3–5 min، وفُصلت باستخدام 1% acid alcohol، ثم عولجت بمحلول التزريق. وبعد الغسيل، جُففت المقاطع باستخدام إيثانول بتركيز 85% و 95% (لمدة 5 min لكل منهما) وصُبغت صبغاً مضاداً بـ eosin لمدة 5 min. وأخيراً، جُففت الشرائح في إيثانول مطلق (ثلاث مرات I و II و III، لمدة 5 min لكل منها)، وصُفيت في xylene (مرتان I و II، لمدة 5 min لكل منهما)، وثُبتت باستخدام balsam متعادل، ثم جُففت في الهواء. التُقطت الصور من حقول عشوائية بتكبير 200× باستخدام مجهر ضوئي ونظام CaseViewer. تم تقييم التهاب الرئة وتثخن الظهارة بشكل أعمى على مقياس من 0–4: 0، لا يوجد التهاب؛ 1، خلايا التهابية متفرقة؛ 2، بؤر التهابية قليلة (<3)؛ 3، بؤر التهابية متعددة (≥3)؛ 4، ارتشاح منتشر في جميع أنحاء الرئة. وقُيم تثخن الظهارة كما يلي: 0، طبيعي؛ 1، تثخن مرئي؛ 2، تثخن جزئي في الممرات الهوائية؛ 3، انسداد شبه كامل؛ 4، غياب البنية الطبيعية. ولكل مجموعة تجريبية، تم تصوير وتقييم ما مجموعه 20 حقلاً مجهرياً عشوائياً للحصول على درجات الفحص النسيجي المرضي الخام. وحُسب متوسط البيانات من كل أربعة حقول لإنتاج نقطة بيانات مستقلة واحدة، مما أدى إلى حجم عينة نهائي قدره n = 5 مكررات لكل مجموعة للتحليل الإحصائي. وقد أُجري التقييم بطريقة تعمية.

تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)

تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من أنسجة الرئة الفأرية باستخدام كاشف TRIzol وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وتم تقييم نقاء وتركيز وسلامة الـ RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي ومنصة قائمة على الموائع الدقيقة. كما تم بناء مكتبات الترانسكريبتوم باستخدام طقم تحضير مكتبات تجاري، وأُجري لها التسلسل على منصة تسلسل عالية الإنتاجية لتوليد قراءات مزدوجة النهاية بطول 150 bp. خضعت البيانات الخام لمراقبة الجودة باستخدام برنامج تصفية مناسب للحصول على قراءات نظيفة، والتي تم تعيينها على الجينوم المرجعي باستخدام أداة محاذاة تراعي مواقع الربط (splice-aware alignment tool). وحُسبت مستويات التعبير الجيني كـ FPKM، كما تم تجميع أعداد القراءات عبر أداة عد القراءات. وأُجري تحليل التعبير التفاضلي باستخدام حزمة إحصائية متخصصة، مع تحديد عتبات عند |log2 Fold Change| ≥ 1 وقيمة p معدلة < 0.05.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم وزن أنسجة رئة فئران طازجة بدقة وتجنيسها في محلول PBS المنظم بنسبة صارمة تبلغ 20 mg من النسيج إلى 200 µL من المحلول المنظم. تم طرد المجانسات مركزياً عند 13,400 × g تقريباً لمدة 10 min عند 4 °C لجمع الرواسب البروتينية العلوية. ولأغراض التنميط، تم معايرة محتوى البروتين الخام في الرواسب العلوية باستخدام طريقة BCA. أُجري إجراء ELISA في ثلاث مكررات تقنية باستخدام أطقم تجارية وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وباختصار، تمت إضافة 50 µL من التخفيفات القياسية أو 50 µL من العينات المخففة مسبقاً (10 µL من عينة البروتين ممزوجة مع 40 µL من مخفف العينة، لتحقيق تخفيف نهائي بمقدار 5 أضعاف) إلى أطباق ذات 96 بئراً مغلفة بالأجسام المضادة. تم إغلاق الأطباق وتحضينها عند 37 °C لمدة 30 min. وبعد الغسل خمس مرات بمحلول غسيل منظم مخفف بنسبة 1:30، تمت إضافة 50 µL من كاشف الاقتران المرتبط بالإنزيم إلى كل بئر (باستثناء الآبار الفارغة)، وحُضن الخليط عند 37 °C لمدة 30 min. وبعد خمس غسلات أخرى، تمت إضافة 50 µL من محلول الكروموجين A و50 µL من محلول الكروموجين B إلى كل بئر، وحُضن الطبق في الظلام عند 37 °C لمدة 10 min. تم إيقاف التفاعل بإضافة 50 µL من محلول الإيقاف، مما أدى إلى تحول اللون من الأزرق إلى الأصفر. تم قياس الامتصاصية (قيمة OD) لكل بئر عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة خلال 15 min. رُسمت المنحنيات القياسية باستخدام نموذج لوجستي رباعي المعلمات أو نموذج انحدار خطي (مع ضمان أن R2 > 0.99)، ومن خلالها تم حساب تركيزات البروتين المستهدف في مجانسات أنسجة الرئة.

قياس التدفق الخلوي

تم استئصال أنسجة الرئة، وتقطيعها، وهضمها في 5 mL من وسط RPMI-1640 المحتوي على 10% FBS، و50 µL من Liberase TM، و5 µL من DNase I عند درجة حرارة 37 °C لمدة 45 min مع الرج بسرعة 80 rpm. مرر المعلق المهضوم عبر مصفاة خلايا ذات مسامية 400-mesh ثم تم طرده مركزياً عند 300 × g لمدة 10 min عند درجة حرارة 4 °C. أُعيد تعليق الراسب في 2 mL من محلول تحلل كريات الدم الحمراء لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وبعد الغسل، أُعيد تعليق الخلايا وصُبغت بصبغة Ghost Dye Red 780 (بمقدار 1.25 µL لكل عينة) لمدة 20 min عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لاستبعاد الخلايا الميتة. وعقب الغسل، تم حجب الخلايا باستخدام 10 µL من كاشف FcR Blocking Reagent لمدة 10 min عند درجة حرارة 4 °C. ثم أجري صبغ سطحي للخلايا باستخدام الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم التالية لمدة 30 min عند درجة حرارة 4 °C: FITC anti-mouse CD45 (بمقدار 0.5 µL)، وPE anti-mouse/human KLRG1 (بمقدار 1.25 µL)، وBB700 rat anti-mouse CD90.2 (بمقدار 0.5 µL)، ومزيج سلالة مرتبط بالبيوتين يحتوي على anti-mouse CD3ε وCD4 وCD8a وCD11b وCD11c وCD49b وTER-119 وLy-6G/Ly-6C (Gr-1) (بمقدار 0.5 µL لكل منها)، وanti-mouse CD19 (بمقدار 2 µL). وبعد الغسل، حُضنت الخلايا مع Brilliant Violet 605 Streptavidin (بمقدار 2 µL) لمدة 30 min عند درجة حرارة 4 °C. جُمعت البيانات باستخدام منصة قياس التدفق الخلوي BD وحُللت باستخدام برنامج FlowJo. وتمت مراقبة مصفوفات تعويض تداخل الفلورة وضبطها تلقائياً بواسطة برنامج الاستحواذ المعاير للجهاز. نُفذت استراتيجية البوابات الهرمية لتحديد خلايا ILC2 الرئوية بالتتابع كما يلي: عُزلت أولاً الخلايا اللمفاوية الكلية عبر مورفولوجيا التشتت الأمامي/الجانبي (FSC-A/SSC-A)، تلا ذلك تمييز الخلايا المزدوجة من خلال بوابات الخلايا المفردة (FSC-H/FSC-A). بعد ذلك، تم تحديد الخلايا الحية عن طريق استبعاد الخلايا الميتة (Ghost Dye-)، ثم طُبقت بوابات قياسية تدريجياً لاختيار مجموعات CD45+ وLineage-. وضمن نافذة بوابات CD45+ Lineage- للخلايا الحية، تم تعريف وقياس خلايا ILC2 الرئوية بدقة بناءً على بوابات التسلسل الشلالي الإيجابية اللاحقة لعناقيد CD90.2+ وKLRG1+.

التألق المناعي (IF)

أُذيبت قطاعات الرئة المجمدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–30 min، ثم غُسلت ثلاث مرات باستخدام PBST (محلول PBS يحتوي على 0.05% Tween-20) لمدة 6 min في كل مرة لإزالة مركب OCT. وبعد تجفيف السوائل الزائدة، رُسم حاجز كاره للماء حول النسيج باستخدام قلم الكيمياء النسيجية المناعية. حُضنت القطاعات في محلول منظم للحجب والنفاذية يحتوي على 0.3% Triton X-100 و 5% مصل ماعز عند 37 °C لمدة 100 min، تلا ذلك تحضين ليلة كاملة (16–20 h) عند 4 °C مع الجسم المضاد الأولي. وفي اليوم التالي، تُرِكت القطاعات لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min، ثم غُسلت ثلاث مرات بـ PBST، وحُضنت مع جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور ومتوافق مع النوع عند 37 °C في الظلام لمدة 60–90 min. وبعد ثلاث غسلات إضافية بـ PBST، صُبغت النوى صبغة تباينية باستخدام DAPI (مخفف بنسبة 1:1 أو 2:1 في PBS) لمدة 8 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وعقب جولة أخيرة من الغسيل بـ PBST (3 × 6 min)، ثُبتت القطاعات باستخدام وسط تثبيت مانع للتلاشي، وأُغلقت لمنع تكون الفقاعات، وخُزنت في الظلام. التُقطت الصور باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) بتكبير 400×. وحُسب عدد الخلايا الموجبة لكل حقل يدويًا باستخدام برنامج Leica LAS X. وبالنسبة لكل مجموعة تجريبية، صُوِّرت 15 حقول مجهرية عشوائية إجمالاً للحصول على أعداد الخلايا الخام. وتم حساب متوسط البيانات من كل ثلاثة حقول لإنتاج نقطة بيانات مستقلة واحدة، مما أدى إلى حجم عينة نهائي قدره n = 5 مكررات لكل مجموعة للتحليل الإحصائي. وقد أُجريت عملية العد بطريقة التعمية.

الكيمياء النسيجية المناعية (IHC)

تمت إزالة البارافين من المقاطع في ثلاثة تغييرات من الزيلين (15 min لكل منها)، ثم أُعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (100% مرتين، 85%، و75%؛ 5 min لكل منها)، وشطفت بالماء المقطر. أُجري استرجاع المستضد في محلول منظم من السترات (pH 6.0) باستخدام قدر ضغط (3 min تحت ضغط عالٍ بعد الغليان)، تلا ذلك التبريد وثلاث غسلات لمدة 5 min في PBS (pH 7.4). تم حجب بيروكسيداز الداخلي باستخدام 3% H2O2 لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد الغسل، أُحيطت المقاطع بقلم كاره للماء وحُجبت باستخدام 3% مصل ماعز لمدة 30 min. ثم حُضنت المقاطع طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية مخففة في PBS: anti-IL-4 (1:400)، أو anti-IL-5 (1:300)، أو anti-IL-13 (1:150). وفي اليوم التالي، غُسلت المقاطع وحُضنت مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ HRP (anti-mouse لـ IL-4؛ و anti-rabbit لـ IL-5 و IL-13) لمدة 50 min في درجة حرارة الغرفة. تم إظهار الإشارات باستخدام محلول DAB مُحضر حديثاً تحت تحكم مجهري، وأُنهيت العملية باستخدام ماء الصنبور. وأخيراً، صُبغت المقاطع صبغة تباينية بالهيماتوكسيلين، ثم جرت عملية التمايز، والتزريق، وإزالة الماء عبر كحوليات متدرجة وزيلين، وثُبتت باستخدام البلسم المتعادل للفحص المجهري. تم قياس متوسط الكثافة الضوئية (IOD/Area) باستخدام منصة برمجية لتحليل الصور عند تكبير 200×. ولكل مجموعة تجريبية، تم تصوير ما مجموعه 15 حقلاً مجهرياً عشوائياً للحصول على القيم الخام. وحُسب متوسط البيانات من كل ثلاثة حقول لإنتاج نقطة بيانات مستقلة واحدة، مما أدى إلى حجم عينة نهائي قدره n = 5 مكررات لكل مجموعة للتحليل الإحصائي. وقد تم التقييم بواسطة مراقبين اثنين بصيغة التعمية.

لطخة ويسترن (WB)

لتحضير العينات، تم تقطيع أنسجة الرئة الفأرية (حوالي 30 mg) تقطيعاً دقيقاً ثم تم تجنيسها في 300 µL من منظم تحليل RIPA المبرد مسبقاً والمضاف إليه 1% من مزيج مثبطات البروتياز والفوسفاتاز. أُجري التجنيس باستخدام مجنس الأنسجة بتردد 60 Hz لأربع دورات (60 s لكل دورة). بعد ذلك، تم طرد المحللات مركزياً عند حوالي 13,400 × g لمدة 15 min عند 4 °C لجمع المادة الطافية. تم تحديد تركيزات البروتين الكلية عبر طقم مقايسة BCA البروتينية القياسي. ثم تم توحيد العينات، وخلطها مع منظم تحميل 5x بنسبة حجمية 4:1، ومسخها حرارياً عند 95 °C لمدة 7 min. وبالنسبة لتقنية SDS-PAGE، تم تحميل عينات البروتين (20 µg لكل مسار) جنباً إلى جنب مع مؤشر الوزن الجزيئي للبروتين المصبوغ مسبقاً، وفصلها بجهد ثابت قدره 80 V لمدة 20 min، ثم ضبط الجهد إلى 120 V لمدة 70 min. بعد ذلك، نُقلت البروتينات بنقل رطب إلى أغشية PVDF بمسامية 0.22 µm تحت تيار ثابت قدره 300 mA لمدة 120 min في حمام ثلجي. تم حجب الأغشية باستخدام 5% BSA في TBST لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، ثم حُضنت طوال الليل (حتى 18 h) عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد CGRP (1:500) و GAPDH (1:2000). وبعد الغسل بـ TBST ثلاث مرات (10 min لكل مرة)، حُضنت الأغشية مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة ببيروكسيداز الفجل (1:10000) لمدة 1–2 h في درجة حرارة الغرفة. وعقب ثلاث غسلات أخرى، تم تصوير حزم البروتين باستخدام ركيزة التألق الكيميائي المحسنة (ECL) ضمن نظام التصوير VILBER Fusion FX. تم قياس كثافة الحزم باستخدام برنامج ImageJ 1.8، وتم توحيد تعبير البروتين المستهدف بالنسبة إلى التحكم الداخلي GAPDH.

التحليل الإحصائي

تُعرض جميع البيانات التجريبية على شكل المتوسط ± الانحراف المعياري (SD). وقد أُجري تحليل البيانات والرسم الإحصائي باستخدام منصة برمجيات إحصائية متخصصة. وقبل إجراء المقارنات بين المجموعات، خضعت مجموعات البيانات بشكل منهجي لاختبارات التوزيع الطبيعي. وبالنسبة للبيانات ذات التوزيع الطبيعي والتباينات المتجانسة، تم تطبيق تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه العادي، يليه اختبارات Tukey أو Šídák أو Holm-Šídák أو Fisher's LSD البعدية لإجراء مقارنات زوجية متعددة. وعند مقارنة مجموعات متعددة بمجموعة ضابطة واحدة، تم تطبيق اختبار Dunnett. أما بالنسبة لمجموعات البيانات ذات التباينات غير المتجانسة، فقد استُخدم تحليل التباين Brown-Forsythe ANOVA، يليه اختبار Dunnett's T3 البعدي. وبالنسبة لمجموعات البيانات التي لم تتوافق مع التوزيع الطبيعي، استُخدم اختبار Kruskal-Wallis غير المعلمي، يليه اختبار Dunn البعدي للمقارنات المتعددة. واعتُبرت القيمة P < 0.05 مؤشراً على وجود فروق ذات دلالة إحصائية. ويُشار إلى مستويات الدلالة المختلفة ديناميكيًا بـ *p < 0.05، و **p < 0.01، و ***p < 0.001، و ****p < 0.0001. كما أُجريت جميع تقييمات النتائج التجريبية، بما في ذلك التقييم النسيجي وتحليل قياس التدفق الخلوي والتقدير الكمي للصور، بطريقة التعمية الصارمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يقلل KAST من الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 (ILC2s) الرئوية ويخفف من التهاب الممرات الهوائية من النوع 2

لبحث التأثيرات العلاجية لـ KAST، تم إنشاء نموذج فئران مصابة بالربو التحسسي (AA) المستحث بواسطة OVA، وعولجت باستخدام لصقات وضعت على نقاط الوخز الإبري Feishu (BL13)، وGeshu (BL17)، وPishu (BL20)، وShenshu (BL23) (الشكل 1A). بعد إنشاء النموذج، أظهرت فئران AA انخفاضاً في وزن الجسم، بينما أظهرت فئران KAST زيادة ملحوظة في وزن الجسم مقارنة بمجموع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يواجه علاج الربو التحسسي (AA) عدة قيود، بما في ذلك الآثار الجانبية المرتبطة باستخدام الأدوية لفترات طويلة، وعدم السيطرة الكاملة على الأعراض، والانتكاسات المتكررة. وعلى الرغم من فعالية العلاج الدوائي التقليدي، إلا أنه غالباً ما يصاحبه نتائج سلبية مثل الاعتماد على الستيرويدات26,27. وفي المقابل، يوفر العلاج بـ KAST بديلاً آمناً واقتصادياً ومريحاً لإدارة الربو التحسسي. وقد أظهرت الأدلة السريرية أن KAST يمكن أن يخفف بشكل فعال من أعراض الربو عن طريق تعديل الوظيفة المنا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82274632)، ومشروع تنمية المواهب الرائدة في مقاطعة جيانغسو للطب الصيني التقليدي (رقم SLJ0309)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (رقم BK20231381)، ومشروع خطة تطوير العلوم والتكنولوجيا للطب الصيني التقليدي بمقاطعة جيانغسو (رقم ZT202205)، والمختبر الرئيسي لأبحاث الوخز بالإبر والطب التابع لوزارة التربية والتعليم في جامعة نانجينغ للطب الصيني (رقم AML202304).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريط 3M الطبي المسامي3M، الولايات المتحدة الأمريكية1530Cتثبيت الرقعة
كلوريد الأسيتيل كولينSigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةA6625استثارة القصبات الهوائية
جهاز Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies، الولايات المتحدة الأمريكيةG2939BAتقييم جودة وسلامة الحمض الريبي النووي (RNA)
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية(طلب مخصص)التألق المناعي (الثانوي)
هيدروكسيد الألومنيومSigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية239186مادة مساعدة
جسم مضاد لـ CGRP (أرنب)Abcam، المملكة المتحدةab81887لطخة ويسترن / التألق المناعي
فأر من سلالة BALB/c (أنثى، خالية من الممرضات المحددة SPF، 8–١٠ أسابيع، ١٨–٢٢ جم)شركة Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd.B202407260106نموذج حيواني
BB700 مضاد للفأر CD90.2 من الجرذ (النسيلة 53-2.1)BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية566465قياس التدفق الخلوي
جهاز قياس التدفق الخلوي BD FACSCanto IIBD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكيةFACSCanto IIقياس التدفق الخلوي
BIBN-4096 (هيدروكلوريد أولسيجيبانت)MedChemExpress LLC، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-10095Aمضاد مستقبل الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP)
مزيج البيوتين لتحديد السلالة الخلويةBD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية(مخصصة، مستنسخات كما هو موصوف)قياس التدفق الخلوي
ستربتافيدين بصبغة Brilliant Violet 605BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية563260قياس التدفق الخلوي
ألبومين مصل البقر (BSA) الجزء الخامس (Fraction V)BioFroxx (neoFroxx GmbH)، ألمانيا4240GR100الحجب
بروتين الكالسيتونين/CALCAMedChemExpress LLC، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-P77587التدخل باستخدام الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP)
جسم مضاد CD11c/ITGAX (أرنب)Abmart، شنغهاي، الصينMU115408Sالتألق المناعي
محلول استعادة المستضد بالستراتبوستر، الصينAR0024الكيمياء النسيجية المناعية
محلول صبغ DAPIBeyotime، شنغهاي، الصينC1006تلوين النواة
ماء مقطر مرتين (ddH2O)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية10977015إعادة تشكيل البروتين وإذابة المسحوق
DESeq2Bioconductor (حزمة R)الإصدار 1.42.0برمجيات تحليل التعبير التفاضلي
دي إن ايس 1 (DNase I)روتش دياغنوستيكس (Roche Diagnostics)، ألمانيا10104159001هضم أنسجة الرئة
جسم مضاد من الحمار ضد IgG للفأر H&L (Alexa Fluor 555)Abcam، المملكة المتحدةab150106التألق المناعي (الثانوي)
ركيزة التلألؤ الكيميائي الكهربائي (Super Femto)شركة Nanjing Lanken Biotech، الصين–التألق الكيميائي في لطخة ويسترن
طقم مقايسة بروتين BCA المُحسّنةBeyotime، شنغهاي، الصينP0010تقدير كمية البروتين
محلول صبغة الإيوسين YSigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةHT110216علم الأنسجة (صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين)
إيثانول (مطلق، درجة تحليلية)Sinopharm Chemical Reagent، الصين10009218تجفيف الأنسجة وعلم الأنسجة
جسم مضاد F4/80 (فأر، مستنسخ C-7)Santa Cruz Biotechnology، الولايات المتحدة الأمريكيةsc-377009التألق المناعي
fastpمفتوح المصدر (GitHub)الإصدار 0.23.4برمجيات مراقبة جودة البيانات الخام لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)
FITC anti-mouse CD45 (النسيلة 30-F11)BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية553080قياس التدفق الخلوي
FlowJoBD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية10تحليل قياس التدفق الخلوي
جسم مضاد أحادي النسيلة لـ GAPDH (فأر)Proteintech، ووهان، الصين60004-1-Igلطخة وسترن
جسم مضاد GATA3 (فأر، مستنسخ L50-823)Santa Cruz Biotechnology، الولايات المتحدة الأمريكيةsc-268التألق المناعي
صبغة Ghost Dye Red 780Tonbo Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية13-0865-T100استبعاد الخلايا الميتة
جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب (H+L) ممتز متبادلاًThermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكيةA11008التألق المناعي (الثانوي)
GraphPad PrismGraphPad Software، الولايات المتحدة الأمريكية10.1.2التحليل الإحصائي
محلول الهيماتوكسيلين (هاريس)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةHHS16علم الأنسجة (صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين)
HISAT2جامعة جونز هوبكنز (مفتوح المصدر)الإصدار 2.2.1برمجيات محاذاة الجينوم المرجعي لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)
جسم مضاد من الماعز ضد IgG الفأري (H+L) مقترن بـ HRPProteintech، ووهان، الصينSA00001-1لطخة ويسترن (ثانوية)
جسم مضاد من الماعز ضد IgG للأرانب (H+L) مقترن بـ HRPProteintech، ووهان، الصينSA00001-2لطخة ويسترن (ثانوية)
HTSeq-countEMBL (أداة مساعدة بلغة Python)الإصدار 2.0.3أداة عد القراءات للميزات الجينومية في تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)
بيروكسيد الهيدروجين (محلول H2O2 بتركيز 3%)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةH1009حجب البيروكسيداز الداخلي
iFluor™ جسم مضاد IgG من الماعز مضاد للأرنب مقترن بـ 488Huabio، الصينHA1121التألق المناعي (الثانوي)
جسم مضاد أحادي النسيلة لـ IL-4Proteintech، ووهان، الصين66142-1-Igلطخة وسترن
جسم مضاد لـ IL13Affinity Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكيةDF6813لطخة ويسترن
جسم مضاد لـ IL5Affinity Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكيةAF5123لطخة ويسترن
Illumina Novaseq 6000Illumina، الولايات المتحدة الأمريكية–تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing)
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية1.8القياس الكمي لطريقة لطخة ويسترن
Image-Pro PlusMedia Cybernetics، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار 6.0تحديد كمية الكثافة الضوئية للصور
تركيبة KAST العشبيةقسم الصيدلة، المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني–التدخل
جسم مضاد أحادي النسيلة KLRG1 (2F1)Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية58-5893-82التألق المناعي
Leica LAS XLeica Microsystems، ألمانيا4.5التقدير الكمي للتألق المناعي
المجهر البؤري Leica STELLARIS 8 DIVELeica Microsystems، ألمانياSTELLARIS 8التصوير المناعي الفلوري
Liberase TMRoche Diagnostics، ألمانيا5401119001هضم أنسجة الرئة
مؤشر (سلم بروتيني مسبق الصبغ)شركة NCM Biotech، سوجو، الصينP9001لطخة وسترن
طقم مقايسة الممتز المكون من الإنزيم المرتبط (ELISA) لـ CGRP في الفئرانشركة Aifang Biotechnology، هونان، الصينAF2491-Aمقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
طقم مقايسة الممتز الموحد للإنزيم (ELISA) لـ IL-13 في الفئرانشركة Aifang Biotechnology، هونان، الصينAF-02456M1مقايسة الممتز المربوط بالإنزيم (ELISA)
طقم مقايسة الممتز المائي الإنزيمي (ELISA) لـ IL-4 في الفئرانشركة Aifang Biotechnology، هونان، الصينAF-02448M1مقايسة الممتز المربوط بالإنزيم (ELISA)
طقم مقايسة الممتز المائي المرتبط بالإنزيم لـ IL-5 في الفأرشركة Aifang Biotechnology، هونان، الصينAF-11729M1مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
وسط تثبيت بلسمي متعادلSinopharm Chemical Reagent، الصين10014061تثبيت شرائح علم الأنسجة
مصل ماعز طبيعي (للحجب)Abcam، المملكة المتحدةab7481حجب الارتباط في الكيمياء النسيجية المناعية/التألق المناعي
مركب التضمين OCTساكورا، الولايات المتحدة الأمريكية4583تضمين المقاطع التجميدية
طقم التحضير السريع لهلام PAGE بنظام الخطوة الواحدةVazyme، نانجينغ، الصينE303-01تحضير هلام الفصل الكهربائي للبروتينات باستخدام SDS-PAGE
أوفالبومين (OVA)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةA5503التحسيس/التحدي
بارافورمالدهيد (4% في المحلول الملحي المنظم بالفوسفات PBS)Biosharp، الصينBL539Aتثبيت الأنسجة
PE anti-mouse/human KLRG1 (clone 2F1)BD Biosciences، الولايات المتحدة الأمريكية564022قياس التدفق الخلوي
مزيج مثبطات الفوسفاتيز (50×)بيوتيم (Beyotime)، شنغهاي، الصينP1092استخلاص البروتين
محلول بولي-إل-لايسينبوستر، الصينAR0003طلاء شرائح علم الأنسجة
مثبط البروتيناز والفوسفاتازإن سي إم بيوتك (NCM Biotech)، سوتشو، الصينP002استخلاص البروتين
غشاء PVDF (0.22 μm)Merck Millipore، الولايات المتحدة الأمريكيةISEQ00010لطخة ويسترن
جسم مضاد متعدد النسائل لـ RAMP1 (أرنب)Proteintech، ووهان، الصين10327-1-APالتألق المناعي
محلول تحليل كرات الدم الحمراء (RBC lysis buffer)Beyotime، شنغهاي، الصينC3702تحضير عينات قياس التدفق الخلوي
محلول RIPA المنحل (قوي)Beyotime، شنغهاي، الصينP0013Bاستخلاص البروتين
وسط RPMI-1640Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية11875093قاعدة هضم خلايا الأنسجة
سوبر كاين (SuperKine)™ وسط تثبيت مُعزز مضاد للتلاشيشركة ووهان ياكيبين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd.)BMU104تثبيت العينات للفحص المناعي الفلوري
Triton X-100 (منظف)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةT8787نفاذية الغشاء في التألق المناعي
كاشف TRIzolThermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية15596026استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)
طقم تحضير مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي VAHTS Universal V10 RNA-seqVazyme، نانجينغ، الصينNR605-01بناء مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)
نظام قياس حجم التنفس لكامل الجسمغوانغيواندا، بكين، الصينWBP-4وظائف الرئة (Penh)
زايلين (درجة تحليلية)Sinopharm Chemical Reagent، الصين10023418إزالة البارافين والترويق

المراجع

  1. Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
  2. Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
  3. Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
  4. Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
  5. Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
  6. Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
  7. Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
  8. Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
  9. Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
  10. Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
  11. Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
  12. Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
  13. Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
  14. Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
  15. Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
  16. Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
  17. Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
  18. Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
  19. Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
  20. Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
  21. Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
  22. Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
  23. Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
  24. Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
  25. Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
  26. Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
  27. Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
  28. Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
  29. van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
  30. Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
  31. Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
  32. Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
  33. Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
  34. Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
  35. Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الالتهاب من النوع 2خلايا ILC2مسار CGRPبروتين RAMP1قياس التدفق الخلويالكيمياء النسيجية المناعيةلطخة ويسترنمقايسة ELISA
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.