مقالة منهجية

ليبوزومات مُنشَّطة بالضوء والأشعة السينية للتحرير الجيني المنضبط وإيصال الأدوية

86 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71788

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طرق تصنيع جسيمات نانوية دهنية مدمجة بـ verteporfin، يتم تنشيطها بواسطة الضوء المرئي أو أشعة X، وذلك من أجل التوصيل المتحكم فيه مكانياً وزمانياً لبروتينات ribonucleoproteins CRISPR-Cas9 والعوامل الكيميائية العلاجية، مع أهمية انتقالية محتملة للتطبيقات الرمدية والأورام.

الملخص

يعتمد العلاج الديناميكي الضوئي (PDT) على تنشيط المواد المحسسة للضوء لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، وبشكل أساسي الأكسجين المفرد. وبالإضافة إلى السُمية الخلوية المباشرة، يمكن إعادة توظيف هذه الكيمياء الضوئية لتحرير حمولات محددة عند الطلب من أنظمة النواقل النانوية الدهنية، مما يسمح بالتحكم الزماني والمكاني في إيصال العلاج، وهو أمر غير ممكن تحقيقه باستخدام الجسيمات النانوية الدهنية التقليدية. يقدم هذا البروتوكول طرقاً لتصنيع وتوصيف تركيبتين متميزتين من الجسيمات النانوية الدهنية المدمجة بمادة الفيرتيبورفين (VP): (1) ليبوزومات تُحفز بالضوء وتتكون من DOTAP وDOPE والكوليسترول وVP لإيصال معقدات البروتينات النووية الريبوزية (RNP) الخاصة بـ CRISPR-Cas9؛ و(2) ليبوزومات تُحفز بالأشعة السينية وتتكون من DOTAP وDOPC وVP وجسيمات الذهب النانوية لتحرير أدوية العلاج الكيميائي بشكل محكوم. عند التنشيط بطول موجي 690 nm (الضوء المرئي) أو بواسطة إشعاع الأشعة السينية السريري (6 MeV)، يولد VP أكسجيناً مفرداً يعمل على أكسدة المكونات الدهنية غير المشبعة، مما يؤدي إلى زعزعة استقرار غشاء الجسيمات النانوية وتحرير الحمولات المغلفة. تم توفير بروتوكولات لصياغة الليبوزومات عن طريق ترطيب الغشاء الرقيق وبثق الغشاء، والتوصيف الفيزيائي والكيميائي، وتقييم تحرير الحمولات المحفز بالضوء والأشعة السينية، وتعطيل الجينات في المختبر (in vitro) في الخلايا البشرية، والتحقق في الجسم الحي (in vivo) باستخدام نظام مراسل بصري كمي في أسماك الزيبرا ونموذج ورم مزروع في الفئران. تظهر النتائج التمثيلية تعطيل ما يصل إلى حوالي 326 ليفاً عضلياً بطيئاً لكل جنين سمكة زيبرا عبر التنشيط الضوئي، وتثبيطاً ملحوظاً لنمو الورم عبر تحرير الدوكسوروبيسين المحفز بالأشعة السينية. إن السابقة السريرية لتنشيط الفيرتيبورفين عند 689–690 nm في العين تدفع نحو تقييم هذه المنصة للإيصال العيني، على الرغم من أن التوزيع الحيوي في الشبكية والحركية الدوائية والسلامة في الحيوانات الكبيرة لا تزال بحاجة إلى تحديد. توفر هذه الطرق نهجاً تجريبياً ذا إمكانات ترجمية لتحرير الحمولات العلاجية التي يتم التحكم فيها خارجياً. 

المقدمة

برزت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) كأكثر منصات التوصيل غير الفيروسية التحقق منها سريرياً لعلاجات الحمض النووي، كما ظهر جلياً في استخدامها في لقاحات mRNA المضادة لـ COVID-191. ومع ذلك، تقوم الجسيمات النانوية الدهنية التقليدية بتحرير حمولتها عند الامتصاص الخلوي من خلال الهروب الإندوسومي، مما لا يتيح أي تحكم خارجي في توقيت أو موقع أو مدى توصيل الحمولة2. ويحد هذا الغياب للتحكم الزمكاني من فائدتها في التطبيقات التي يكون فيها التحرير الدقيق عند الطلب ميزة علاجية، بما في ذلك تحرير الجينات في مواقع محددة، والعلاج الكيميائي الموجه في الأورام غير المتجانسة، وإسكات الجينات الموزون في الأعضاء التي يمكن الوصول إليها تشريحياً مثل العين3,4.

يوفر العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) آلية مثبتة لتحفيز تأثيرات بيولوجية خارجيًا. فعند تفعيلها بأطوال موجية محددة، تولد المواد الحساسة للضوء أكسجين أحادي (1O2) وأنواعًا أخرى من الجذور الحرة للأكسجين (ROS) التي يمكنها أكسدة الجزيئات الحيوية المجاورة5. ويعد الفيرتيبورفين (VP)، وهو مشتق من البنزوبورفيرين معتمد سريريًا تحت الاسم التجاري Visudyne للعلاج الضوئي الديناميكي لتشكل الأوعية الدموية المشيمية تحت النقرة في التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، مناسبًا بشكل خاص كعنصر حساس للضوء في الجسيمات النانوية6. يتم تفعيل VP سريريًا عند 689 nm للعلاج الضوئي الديناميكي للعين، مما يوفر سابقة معتمدة لإيصال الضوء إلى العين6,7,8. كما أن VP أكثر نشاطًا من الناحية الضوئية الديناميكية بنحو أربعة أضعاف مقارنة بمشتقات الهيماتوبورفيرين من الجيل الأول عند الأطوال الموجية النافذة للأنسجة6.

تشكل هذه الوظيفة المزدوجة، حيث يعمل VP في آن واحد كمحسس ضوئي معتمد سريرياً وكمحفز مستجيب للضوء لتحرير حمولة الجسيمات النانوية، الأساس الميكانيكي للبروتوكولات الموصوفة هنا. فعندما يتم دمجه في الطبقة الدهنية المزدوجة بنسب مولية منخفضة، ينتج VP 1O2 عند الإضاءة، وهو ما يُقترح، تماشياً مع الدراسات السابقة، أنه يؤكسد سلاسل الأسيل للفوسفوليبيدات غير المشبعة، مما يؤدي إلى زعزعة استقرار الغشاء وتحرير الحمولات المغلفة9. ويحصر نصف قطر الانتشار القصير لـ 1O2 (حوالي 20 nm في البيئات البيولوجية) زعزعة استقرار الغشاء في المنطقة المجاورة مباشرة للمحسس الضوئي، مما يقلل من تلف الحمولة مع تعطيل الطبقة المزدوجة بكفاءة9,10. علاوة على ذلك، تتجاوز وسيلة التنشيط بالأشعة السينية قيد عمق اختراق الأنسجة للضوء المرئي. فعندما يتم دمج جسيمات الذهب النانوية (3–5 nm) بشكل مشترك في الطبقة الدهنية المزدوجة، تعزز الأشعة السينية السريرية (6 MeV) تنشيط VP من خلال نقل الطاقة بوساطة إلكترونات أوجيه (Auger electrons)، مما يوسع نطاق التطبيق ليشمل الأورام العميقة11,12. وتؤكد قياسات الأكسجين المفرد المباشرة باستخدام مستشعر الأكسجين المفرد الأخضر (SOSG) أن توليد 1O2 يزداد مع جرعة الأشعة السينية، كما يتم تعزيزه بنحو 1.4 ضعف عند التحميل المشترك لجسيمات الذهب النانوية مقارنة بـ VP وحده11.

تمتلك هذه المنصة أهمية ترجمية خاصة بالعلاج الجيني لأمراض العيون. تتطلب العلاجات الحالية المضادة لـ VEGF لعلاج التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) حديث التوعية حقنًا متكررة في الجسم الزجاجي، مع تراجع النتائج في الواقع العملي عند نقص العلاج المزمن13,14، بينما تقلل علاجات AAV الجينية الناشئة من هذا العبء ولكنها تعبر عن مضادات VEGF بشكل مستمر15,16، وبالتالي لا يمكن معايرتها أو سحبها، وهو أمر يثير القلق نظرًا للارتباط بين التثبيط المستمر لـ VEGF والضمور الجغرافي، ونقص تروية الشبكية، والتليف17,18. وبدلاً من ذلك، يمكن لنهج قائم على CRISPR يتم تحفيزه بالضوء باستخدام الليبوزومات ذات القابلية للتغيير (VP-liposomes) أن يسمح بتعطيل VEGF-A مكانياً ومتحكماً به من قبل الطبيب، مما يوفر تحكماً سريرياً في البوابة المكانية والزمانية لحدث التحرير الأولي مع الحفاظ على ديمومة التحرير الجيني. ويمتد مبدأ التحرير المحفز نفسه ليشمل ضمور الشبكية الناتج عن جينات كبيرة مثل مرض ستارجاردت (ABCA4)19,20، وإلى الميلانوما العنبية، حيث تتوافق آليات VP التقاربية بشكل جيد مع بيولوجيا الورم21,22.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طرق شاملة وقابلة للتكرار لتصنيع جسيمات دهنية نانوية مدمجة بـ VP باستخدام تركيبتين مختلفتين، إحداهما يتم تنشيطها بواسطة الضوء المرئي (690 nm) والأخرى بواسطة أشعة X-ray، ولتقييم كفاءة التوصيل في كل من أنظمة النماذج المختبرية (in vitro) والحية (in vivo). ونظراً لاختلاف هاتين التركيبتين في تكوين الدهون، واستراتيجية تحميل الحمولة، وطريقة التنشيط، فقد تم تقديمهما كبروتوكولات منفصلة. هذا البروتوكول مخصص للباحثين الذين يدرسون منصات الجسيمات النانوية ذات التحرر المحفز، أو استراتيجيات التوصيل القائمة على PDT، أو تحرير الجينات المتحكم به مكانياً وزمانياً، أو توصيل الأدوية المنشط بالضوء للأمراض العينية والأورام.

البروتوكول

أُجريت جميع التجارب الحيوانية التي شملت سمك الزيبرا تحت ظروف قياسية وفقاً للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية في جامعة ماكواري (ARA: 2015-034). كما أُجريت تجارب الطعوم الغريبة في الفئران وفقاً لمتطلبات لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة ماكواري (موافقة رقم 2017/001). وقد نُفذت جميع الإجراءات وفقاً لقانون البحوث الحيوانية لعام 1985 ولائحة البحوث الحيوانية لعام 2010.

الجزء أ: ليبوزومات VP المحفزة بالضوء لتوصيل CRISPR-Cas9 (بناءً على Aksoy et al.9)

1. تحضير ليبوزومات VP المحفزة بالضوء والمغلفة بمركب CRISPR-Cas9 RNP

  1. قم بإذابة DOTAP و DOPE والكوليسترول (Chol) و VP في 500 µL من الكلوروفورم بنسبة مولية 1:0.94:1:0.06 في دورق زجاجي مستدير القاع9.
    تنبيه: الكلوروفورم مادة سامة ومتطايرة. يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن الكلوروفورم داخل خزانة استخلاص كيميائية مع استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك قفازات النيتريل ونظارات السلامة.
  2. قم بتبخير الكلوروفورم تحت تيار من غاز الأرجون حتى يتكون غشاء دهني رقيق على جدار الدورق.
  3. ضع الدورق تحت تفريغ هوائي (على سبيل المثال، في مجفف بالتجميد أو مجفف متصل بمضخة تفريغ) طوال الليل (≥12 h) لإزالة المذيب المتبقي تماماً.
  4. قم بتحضير محلول الترطيب عن طريق دمج sgRNA (بتركيز نهائي 0.01 µM) وبروتين Cas9 (بتركيز نهائي 0.1 mg/mL) في 500 µL من الماء الخالي من النوكلييز. قم بتحضين sgRNA و Cas9 مسبقاً في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min للسماح بتكوين معقد البروتين النووي الريبوزي (RNP) قبل عملية الترطيب.
    ملاحظة: يتم تحميل معقد RNP أثناء خطوة الترطيب، ولا يتم إضافته بعد التكوين، وهذا يضمن تغليفه داخل النواة المائية لليبوزوم.
  5. قم بترطيب الغشاء الدهني المجفف عن طريق إضافة 500 µL من محلول RNP مباشرة فوق الغشاء والمزج حتى يتجانس المعلق. اترك معلق الدهون المُرطب لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة للسماح بالترطيب الكامل للدهون.
  6. قم ببثق المعلق متعدد الطبقات الناتج 11 مرة عبر غشاء بولي كربونات بمسام 200 nm باستخدام مبثق صغير لإنتاج ليبوزومات أحادية الطبقة ذات حجم موحد9.
    ملاحظة: البثق، وليس الموجات فوق الصوتية، هو طريقة تقليل الحجم لهذه الصيغة. مرر المعلق عدداً فردياً من المرات (11) للتأكد من أن المنتج النهائي في الجانب المقابل من الغشاء بالنسبة للمادة الأولية، مما يقلل من التلوث بالحويصلات غير المبثوقة.
  7. تُحفظ ليبوزومات VP عند درجة حرارة 4°C، محمية من الضوء. تُستخدم خلال 48 h من التحضير للحصول على أفضل نشاط. هذا الحد التشغيلي البالغ 48 h هو تقدير تحفظي، حيث يظل تحرر VP أقل من 3% على مدار 96 h في 10% FBS9.
    ملاحظة: بالنسبة للتطبيقات في المختبر (in vitro) وفي الجسم الحي (in vivo)، قم بتحضير الليبوزومات وتداولها باستخدام تقنية التعقيم القياسية، وقم بتعقيم المعلق النهائي بتمريره عبر مرشح 0.22 µm قبل الاستخدام.

2. التوصيف الفيزيائية-كيميائي لليبوزومات VP

  1. خفف معلق الليبوزوم بنسبة 1:100 في ماء خالٍ من النوكلياز. قم بقياس القطر الهيدروديناميكي، ومؤشر تشتت الحجم (PDI)، وجهد زيتا عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS). أجْرِ جميع قياسات DLS في ثلاث مكررات (n = 3 مكررات تقنية) لكل عينة، وسجل القيم كمتوسط ± الانحراف المعياري.
    ملاحظة: الخصائص المتوقعة لتركيبة ناجحة في الجزء أ هي قطر هيدروديناميكي يبلغ 167.5 ± 1.9 nm، وPDI < 0.3، وجهد زيتا يبلغ +28 ± 1.1 mV، وكفاءة تغليف Cas9 تبلغ حوالي 75.09%. تم تلخيص الخصائص الفيزيوكيميائية التمثيلية للتركيبات الناجحة في الجدول 1.9
  2. بالنسبة للمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، ضع 10 µL من معلق الليبوزوم المخفف على شبكة نحاسية مطلية بالكربون. صبغ العينة بأسيتات اليورانيل بتركيز 2% لمدة 20 s. يتم التصوير عند 100 kV9، مع الحصول على 10 صور تمثيلية على الأقل لكل دفعة.
المَعلمةالجزء أ: ليبوسوم VP
(مُحفَّز بالضوء)		الجزء ب: ليبوسوم VP/AuNP
(مُحفَّز بالأشعة السينية)
القطر الهيدروديناميكي167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
مؤشر التشتت المتعدد (PDI)<0.3< 0.3 (نموذجي)
جهد زيتا+28 ± 1.1 mVموجب (قائم على DOTAP)
كفاءة التغليفCas9 RNP: 75.09%دوكسوروبيسين: تحميل عن بُعد باستخدام كبريتات الأمونيوم؛ تم التقدير الكمي بعد التحلل بواسطة 0.1% Triton X-100
تحميل جزيئات الذهب النانويةغير قابل للتطبيق156 ± 24 AuNPs لكل ليبوسوم (ICP-MS)
استقرار تحرير الحمولة<3% من تحرير VP على مدى 96 h في 10% FBSمستقر على مدى 48 h عبر 0% و10% و25% و50% FBS وعند pH 7.4 و6.0 و5.0
شرط التنشيطإشعاع LED بطول موجي 690 nm وكثافة 0.15 mW/cm²إشعاع سريري بالأشعة السينية بقدرة 6 MeV
الحمولة الأساسيةمعقد CRISPR-Cas9 RNPدوكسوروبيسين
طريقة التنشيطالضوء المرئيإشعاع الأشعة السينية
التطبيق المقصودتحرير جيني مُحفَّزتحرير مُحفَّز لأدوية العلاج الكيميائي

الجدول 1: معايير التوصيف الفيزيائي والكيميائي وملفات الاستقرار لصيغتي ليبوزومات الفيرتيبورفين (VP). خصائص الصيغة التمثيلية، ومعايير التحميل، وملفات الاستقرار، وظروف التنشيط لصيغة ليبوزومات VP المحفزة بالضوء (الجزء A) وصيغة ليبوزومات VP/AuNP المحفزة بالأشعة السينية (الجزء B). توفر هذه القيم معايير مراقبة الجودة المتوقعة لتحضير الصيغة وتوصيفها بنجاح، ويمكن استخدامها كمعايير مرجعية عند إعادة تطبيق البروتوكولات الموضحة هنا.

3. تحرير الحمولة المحفز بالضوء وقياس الأكسجين الأحادي

  1. بالنسبة لاختبارات التحرر المحفز بالضوء، قم بتحضير ليبوزومات VP باستخدام نفس تركيبة الدهون وبروتوكول التميؤ/البثق. وزع 100 µL من معلق الليبوزومات في PBS داخل جهاز ديلزة معلق في 12 mL من PBS مع التقليب بسرعة 80 rpm.
  2. قم بتسليط الضوء على العينات باستخدام مصدر ضوء LED بطول موجي 690 nm وبكثافة 0.15 mW/cm2 لفترات زمنية محددة (2 و4 و6 دقائق)9.
  3. خذ عينات من سائل الديلزة الخارجي عند الساعات 0 و1 و3 و6 و24، وقم بقياس كمية VP المتحررة عن طريق الفلورة؛ واحصل على إجمالي VP عن طريق تحليل جزء مكافئ باستخدام 0.1% Triton X-100.
  4. احسب نسبة تحرر VP وفقاً للمعادلة Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100، حيث تمثل Ft وF0 وFmax قيم الفلورة عند الزمن t، والقيمة المرجعية، وبعد التحليل بـ Triton على التوالي (n = 3).
  5. أكد زعزعة استقرار الغشاء عن طريق قياس التغير في القطر الهيدروديناميكي بواسطة DLS قبل وبعد التسليط الضوئي.
    ملاحظة: يجب حماية جميع العينات التي تحتوي على VP من الضوء المحيط طوال فترة التحضير والتخزين. استخدم أنابيب كهرمانية أو غلافاً من رقائق الألومنيوم.

4. مقايسة ترنسفكشن (transfection) في المختبر وتعطيل الجين

  1. قم بزراعة خلايا HEK293-GFP (أو خط مراسل مكافئ) في أطباق ذات 96 بئراً بكثافة مناسبة للوصول إلى درجة تلاقي تبلغ ~70% عند وقت المعالجة. قم باستنبات الخلايا في وسط كامل (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin–streptomycin) عند 37°C و 5% CO2.
  2. أضف جزيئات الـ VP-liposomes التي تغلف anti-GFP sgRNA/Cas9 RNP إلى الآبار بتركيز 50 ug/mL. للتحليل بواسطة المجهر الفلوري، يتم التحضين لمدة 2 h؛ وللتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي، يتم التحضين لمدة 1 h.
  3. استبدل الوسط بوسط كامل جديد. قم بتسليط ضوء LED بطول موجي 690 nm على الآبار المعالجة بكثافة 0.15 mW/cm2. للتحليل بواسطة المجهر الفلوري، يتم التسليط لمدة 2 أو 4 أو 6 min؛ وللتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي، يتم التسليط لمدة 4 min. يجب تضمين ضوابط مظلمة (الليبوزومات بدون تسليط ضوئي) وضوابط ضوئية فقط (تسليط ضوئي بدون ليبوزومات).
  4. قم بتقييم تعطيل GFP بعد 48 h من المعالجة بواسطة المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يجب التحقق من صحة الحمض النووي الريبوزي الموجه (Guide RNAs) قبل الاستخدام. في الدراسة الأصلية، تم فحص الأدلة المرشحة لـ eGFP من حيث كفاءة القطع عن طريق تحليل تعدد أشكال طول قطع التقييد (RFLP)، وحقق الدليل المختار (sg_eGFP_06) نسبة قطع بلغت 88.24%. تم تقليل مخاطر التأثيرات خارج الهدف حاسوبياً (in silico) من خلال تأكيد تفرد الدليل (BLASTN مقابل الجينوم المرجعي باستخدام Bowtie/Bowtie2، مع عدم التسامح مع أي عدم تطابق في أول عشر قواعد 3’). لم يتم إجراء تسلسل خارج الهدف على مستوى الجينوم بالكامل، وهي خطوة موصى بها للتطبيقات العلاجية9.
  5. لقياس كفاءة التغليف، قم بطرد مركزي لعينة من الليبوزومات  بسرعة 15,000 rpm لمدة 1 h عند 4 °C، يليه ترشيح السائل الطافي عبر مرشح حقنة Whatman Anotop 10 بمسام 20 nm.
  6. قم بتحديد كمية Cas9 الحر (غير المغلف) في الراشح باستخدام مقايسة البروتين BCA.
  7. احسب كفاءة التغليف وفقاً للمعادلة: EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100، حيث تمثل Ctot إجمالي Cas9 المضاف و Csup هي كمية Cas9 غير المغلف المسترجعة في السائل الطافي. راجع Table 1 لمعرفة مقاييس أداء الصيغة التمثيلية وكفاءات التغليف المتوقعة.

5. التحقق في الجسم الحي: مقايسة المراسل البصري في سمك الزيبرفيش

  1. قم بتحضير المزيج الرئيسي (MasterMix) للحقن عن طريق دمج الـ VP-liposomes التي تغلف sgRNA المستهدف لـ eGFP وبروتين Cas9 بالنسب المحددة في البروتوكول الأصلي9. يحتوي المزيج الرئيسي النهائي بحجم 8 uL على 3.5 uL من sgRNA (بتركيز 75 ng/uL)، و1.0 uL من بروتين Cas9 (بتركيز 500 ng/uL)، و2.5 uL من VP-liposomes، و1.0 uL من الفينول الأحمر. بالنسبة للمزيج الرئيسي الضابط، استبدل الـ liposomes بـ 2.5 uL من الماء الخالي من النوكلياز.
  2. قم بحقن 2 nL من المزيج الرئيسي مجهرياً في الخلية (وليس المح) لأجنة سمك الزبرا في مرحلة الخلية الواحدة باستخدام نظام حقن مجهري معاير9.
    تنبيه: يجب تنفيذ جميع الأعمال على سمك الزبرا وفقاً لبروتوكولات أخلاقيات الحيوان المعتمدة. تعامل مع الأجنة برفق لتقليل التلف الميكانيكي أثناء الحقن.
  3. بعد مرور ساعتين من الإخصاب (hpf)، قم بتعريض الأجنة المحقونة لضوء LED بطول موجي 690 nm وبقدرة 0.15 mW/cm2 لفترات زمنية محددة (مثلاً: 0، 1، 2، و5 دقائق) لتنشيط تحرير الشحنة9.
  4. عند 72 hpf، قم بتخدير الأجنة في Tricaine وتثبيتها في أغاروز منخفض درجة الانصهار بتركيز 1%. باستخدام خط التقرير المعدل وراثياً smyhc1:eGFP، قم بقياس تعطيل ألياف العضلات البطيئة كفقدان لفلورية eGFP باستخدام مجهر فلوري مقلوب ومجهر كونفوكالي.
  5. قم بالحصول على صور مكدسة البؤرة (focus-stacked) وعد ألياف العضلات البطيئة السالبة لـ eGFP (المعطلة) لكل جنين، مع تحليل 16 جنيناً عادةً لكل مجموعة (مثلاً باستخدام برنامج Imaris)9.
    ملاحظة: يوفر هذا المقايسة قراءة بصرية كمية لكفاءة تعطيل الجين. في خط التقرير smyhc1:eGFP، تكون ألياف العضلات البطيئة إيجابية لـ eGFP عادةً؛ ويُسجل التعطيل الناجح كفقدان لفلورية eGFP في هذه الألياف9.

الجزء ب: ليبوزومات VP المحفزة بالأشعة السينية لإيصال أدوية العلاج الكيميائي (بناءً على Deng et al.11)

6. تحضير ليبوزومات VP/AuNP المحملة بدوكسوروبيسين والمحفزة بالأشعة السينية

  1. امزج 350 µL من DOTAP (بتركيز 100 mg/mL في الكلوروفورم) و370 µL من DOPC (بتركيز 100 mg/mL في الكلوروفورم) في دورق زجاجي مستدير القاعدة، وأكمل الحجم الإجمالي إلى 1.0 mL باستخدام الكلوروفورم11.
    ملاحظة: يستخدم الجزء B مادة DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)، وليس DOPE. تختلف التركيبتان في الدهون المساعدة المستخدمة، وهذا التمييز ضروري لضمان قابلية تكرار النتائج.
  2. أضف 50 µL من VP (بتركيز 2.3 mg/mL في DMSO) و40 µL من معلق جسيمات الذهب النانوية (بقطر 3–5 nm) إلى خليط الدهون. ينتج عن ذلك ما يقرب من 156 ± 24 جسيماً نانوياً ذهبياً لكل ليبوسوم، وفقاً لما تم قياسه بواسطة ICP-MS11.
    ملاحظة: يجب أن يكون قطر جسيمات الذهب النانوية 3–5 nm لتتمكن من الانغماس داخل الطبقة الدهنية المزدوجة. الجسيمات الأكبر (مثل 50 nm) لن تندمج في الغشاء ولن تتوسط نقل طاقة إلكترونات Auger المطلوبة للتنشيط بالأشعة السينية11.
    ملاحظة: التركيبة الأساسية الموصوفة هنا غير مستهدفة. في الدراسة المصدر، تم تقديم تعديل اختياري للاستهداف النشط عن طريق الإدراج اللاحق لـ DSPE-PEG2000-Folate لتوجيه الليبوسومات إلى الخلايا الورمية التي تعبر عن مستقبلات الفولات؛ يمكن إضافة هذه الخطوة دون تغيير آلية تحرير VP/AuNP الأساسية11.
  3. بخر الكلوروفورم تحت غاز الأرجون وجفف تحت الفراغ طوال الليل كما هو موضح في الخطوتين 1.2-1.3.
  4. قم بترطيب الغشاء الدهني باستخدام 1.0 mL من محلول كبريتات الأمونيوم المنظم بتركيز 250 mM (pH 5.5). استخدم جهاز المرج (Vortex)، واترك المعلق المُرطب طوال الليل، ثم قم بالبثق 11 مرة عبر غشاء بولي كربونات بمسامية 200 nm11.
  5. أزل كبريتات الأمونيوم الحرة عن طريق الديلزة مقابل PBS (pH 7.4) عند درجة حرارة 4 C مع إجراء أربعة تبديلات للمحلول المنظم، وذلك لإنشاء تدرج لكبريتات الأمونيوم عبر الغشاء.
  6. قم بتحميل الدوكسوروبيسين (Dox) عن طريق تحضين الليبوسومات التي خضعت للديلزة بنسبة وزن الدواء إلى الدهون 1:10 عند درجة حرارة 60°C لمدة 1 h11. يعمل تدرج كبريتات الأمونيوم على دفع تراكم Dox داخل الليبوسوم.
  7. أزل Dox غير المغلف عن طريق الديلزة مقابل PBS عند 4 C مع إجراء أربعة تبديلات للمحلول المنظم.
  8. قم بتوصيف الليبوسومات المحملة بواسطة DLS (الحجم المتوقع: ~100–150 nm) وقس كفاءة التغليف عن طريق تحلل الليبوسومات باستخدام 0.1% Triton X-100 وتحديد كمية فلورسنت Dox (إثارة 485 nm، انبعاث 590 nm).
    ملاحظة: عادةً ما تظهر تركيبات الجزء B الناجحة قطراً هيدروديناميكياً يتراوح تقريباً بين 100–150 nm، ومؤشر تشتت متعدد (PDI) < 0.3، واندماج ما يقرب من 156 ± 24 جسيماً نانوياً ذهبياً لكل ليبوسوم. تم تلخيص الخصائص الفيزيائية والكيميائية النموذجية في الجدول 1.11

7. تحرير الدواء المحفز بالأشعة السينية والسمية الخلوية في المختبر

  1. قم بتسليط الإشعاع على الليبوزومات VP/AuNP المحملة بالكالسئين باستخدام معجل خطي سريري (حزمة فوتونات 6 MeV) بجرعات محددة (1 و2 و4 Gy)11. قم بقياس كمية الحمولة المنطلقة من خلال قياس فلورة الكالسئين (طول موجة الإثارة 485 nm، وطول موجة الانبعاث 510 nm)، واحصل على إجمالي الانطلاق بعد التفكيك باستخدام 0.1% Triton X-100."
  2. بالنسبة لمقايسات السمية الخلوية، ازرع خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية HCT116 في أطباق ذات 96 بئراً (على سبيل المثال، 2 × 104 خلية/mL في 10% FBS).
  3. عالج الخلايا بالليبوزومات VP/AuNP المحملة بـ Dox وسلط عليها الأشعة السينية كما هو موضح أعلاه، بما في ذلك مجموعات الضبط التي تشمل LipoDox فقط، والأشعة السينية فقط، وخلايا غير معالجة. قم بتقييم حيوية الخلايا باستخدام مقايسة MTS عند الساعات 0 و2 و4 و24 بعد التعرض لإشعاع 4 Gy11.

8. التحقق من الصلاحية داخل الجسم الحي: نموذج الورم المزروع غريبًا في الفئران

  1. يتم تلقيح إناث فئران BALB/c العارية (nude mice) التي تتراوح أعمارها بين 6 و7 أسابيع عن طريق الحقن تحت الجلد في الخاصرة بـ 5 × 106 من خلايا HCT116 في 100 µL من وسط McCoy’s 5A الخالي من المصل11.
  2. عندما تصل أحجام الأورام إلى ~100 mm3، تُحقن ليبوزومات VP/AuNP المحملة بـ Dox (ما يعادل 10 mg/kg من Dox) داخل الورم بحجم 20 µL11.
  3. بعد 24 ساعة من الحقن، تُعرض الأورام لإشعاع X-ray بجرعة 4 Gy (بقدرة 6 MeV) باستخدام معجل خطي سريري مع توفير الحماية المناسبة للأنسجة غير المستهدفة.
  4. يتم مراقبة حجم الورم كل يومين باستخدام الفرجار الرقمي. ويُحسب حجم الورم وفق المعادلة V = (π/6) × L × W2، حيث تمثل L البعد الأطول وW العرض العمودي11.
  5. عند نقطة النهاية التجريبية، تُستأصل الأورام وتُثبت في فورمالين منظم متعادل بتركيز 10%، ثم يتم تحضير مقاطع تجميدية (cryosections) بسمك 6 µm للتحليل النسيجي (صبغة H&E)11.

9. التحليل الإحصائي

  1. تُعرض البيانات الكمية في صورة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ما لم يُنص على خلاف ذلك.
  2. أُجريت التحليلات الإحصائية لدراسات تعطيل الجينات في سمك الزيبرا باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA)، بينما حُللت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار تي (Student's t-test) ذو الذيلين، كما ورد في الدراسات المصدرية. وقد حُددت الدلالة الإحصائية عندما تكون قيمة p < 0.05.
  3. بالنسبة لدراسات الليبوزومات التي يتم تحفيزها بالأشعة السينية، حُللت مجموعات بيانات نمو الورم، ووزن الجسم، وإطلاق الحمولة، والبيانات النسيجية باستخدام اختبارات تي (Student's t-tests) كما هو موضح في النشر الأصلي.
  4. يتم توضيح تعريف n لكل تجربة في تسميات الأشكال المقابلة.
  5. أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 7.0 (GraphPad Software).
    ملاحظة: يعيد هذا البروتوكول إنتاج سير العمل التجريبي ومجموعات البيانات التمثيلية من دراسات منشورة سابقاً. يجب على القراء الرجوع إلى المنشورات الأصلية للحصول على التفاصيل الكاملة للتحليل الإحصائي حيثما كان ذلك متاحاً9,11.

النتائج

تحرير الجينات المحفز بالضوء (الجزء أ):

بعد اتباع بروتوكول الجزء (أ)، أظهرت ليبوزومات VP التي تغلف CRISPR-Cas9 RNP تحرراً للشحنة يعتمد على الضوء. لوحظ حد أدنى من التحرر في الظروف المظلمة، بينما أدى التشعيع عند 690 nm (بقدرة 0.15 mW/cm2) إلى تحرر يعتمد على الجرعة ويزداد مع وقت الإضاءة (الشكل 1A)9. ووفر مقايسة مراسل eGFP في سمك الزيبرا قراءة بصرية كمية لكفاءة تعطيل الجين. أظهرت الأجنة المنشطة بالضوء تعطيل لـ 308.37 ± 40.21 من ألياف العضلات البطيئة الموجبة لـ eGFP لكل جنين، مقارنة بـ 53.15 ± 35.38 ليفاً في الضوابط المظلمة (n = 80)، لترتفع إلى 326.12 ± 36.55 ليفاً بعد 5 min من التشعيع (n = 60) (الشكل 1B،C)9. وفي المختبر، حققت ليبوزومات VP المنشطة بالضوء خفضاً لبروتين GFP يضاهي ذلك الذي حققه Lipofectamine 2000 (خفض بنسبة 53% تقريباً مقابل 50%)، بينما وفرت بشكل فريد تحكماً زمانياً ومكانياً يتم التحكم فيه عبر الضوء (الشكل 1C)9. وتثبت هذه النتائج وجود تحكم زماني ومكاني، حيث أنتجت نفس تركيبة الجسيمات النانوية كفاءات تعطيل مختلفة بشكل ملحوظ اعتماداً على التعرض للضوء (الشكل 1A–C).

طريقة تحرير الجينات الكيميائية الضوئية؛ CRISPR-Cas9، المحفزة بـ LED، المجهر الفلوري، النتائج التجريبية، قياس الشدة.
الشكل 1. توصيل CRISPR-Cas9 المحفز بالضوء وتعطيل الجينات زمانياً ومكانياً في أجنة سمك الزيبرا. (A) رسم تخطيطي لليبوزومات الفيرتيبورفين (VP-liposomes) (بنسبة DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06) التي تغلف معقدات البروتين النووي الريبوزي (RNP) لـ Cas9/sgRNA. عند التشعيع بضوء بطول موجي 690 nm، يقوم VP بتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية التي تؤدي إلى زعزعة استقرار الغشاء الليبوزومي وتحفيز الإطلاق داخل الخلايا لحمولة CRISPR-Cas9. (B) صور فلورية ممثلة لأجنة سمك الزيبرا smyhc1:eGFP بعد 72 ساعة من الإخصاب (hpf) عقب المعالجة بليبوزومات VP وفترات تعريض ضوئي متزايدة (0 و1 و2 و5 دقائق؛ 690 nm، 0.15 mW/cm2). يشير فقدان فلورة eGFP إلى تعطيل ألياف العضلات البطيئة. وتظهر الصور المدرجة مناظر مكبرة للمناطق المحددة بمربعات. (C) قياس كمي لشدة الفلورة وعدد ألياف العضلات البطيئة المعطلة لكل جنين، مما يوضح تنشيط CRISPR-Cas9 وتعطيل الجينات المعتمد على الضوء. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. تم تحليل تجارب سمك الزيبرا باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (n = 80 جنيناً لقياسات شدة الفلورة وn = 60 جنيناً لتحليل عدد الألياف؛ p < 0.0001). تم تحليل تجارب التحقق من خلايا HEK293-GFP باستخدام اختبار t ذا ذيلين (n = 4). أشرطة المقياس = 500 µm (الصور العامة) و100 µm (الصور المكبرة). تم الاقتباس بإذن من Aksoy et al.9 حقوق الطبع والنشر © 2020 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

قد تشمل النتائج غير المثالية في مقايسة سمكة الزيبرا ما يلي: (أ) وجود أقل من 50 ليفاً ممزقاً في كل جنين، مما يشير إلى رداءة جودة الليبوزومات، أو عدم كفاية نشاط Cas9، أو استخدام جرعة ضوئية غير مثالية؛ (ب) تجاوز معدل نفوق الأجنة نسبة 20%، مما يشير إلى حدوث ضرر ميكانيكي أثناء الحقن المجهري أو سمية ضوئية مفرطة لـ VP؛ أو (ج) تمزق الألياف في عينات التحكم غير المعرضة للإشعاع، مما يشير إلى تسرب مبكر للمواد المحملة من تركيبة الليبوزومات.

توصيل الدواء المحفز بالأشعة السينية (الجزء ب):

أظهرت ليبوزومات VP/AuNP المحضرة وفقاً لبروتوكول الجزء B تحرراً للكالسئين يعتمد على الجرعة في نطاق 1–4 Gy (الشكل 2A،B)11. وفي نموذج زراعة الخلايا الغريبة HCT116، أظهرت الفئران التي تلقت ليبوزومات VP/AuNP المحملة بـ Dox متبوعة بتشعيع بالأشعة السينية بمقدار 4 Gy تثبيطاً ملحوظاً في نمو الورم مقارنة بـ Dox الحر، والأشعة السينية وحدها، ومجموعات التحكم التي تلقت الليبوزومات دون تشعيع (الشكل 2C)11. وكشف التحليل النسيجي لمقاطع الورم عن وجود مناطق نخر أكبر في مجموعة العلاج المشترك، كما تم تقييمه بواسطة صبغ H&E (الشكل 2D).

علاج السرطان باستخدام الليبوزومات المستهدفة بالأشعة السينية؛ رسوم بيانية عن تحرر الكالسين، وحجم الورم، وتحليل التنخر.
الشكل 2. تحرر الدوكسوروبيسين المحفز بالأشعة السينية وتثبيط نمو الورم. (A) رسم تخطيطي لليبوزومات مدمجة بـ verteporfin (VP) وجسيمات الذهب النانوية (AuNP) وتحتوي على الدوكسوروبيسين (Dox). يؤدي التعرض لإشعاع الأشعة السينية إلى تنشيط VP من خلال نقل الطاقة بوساطة AuNP، مما يولد أكسجين أحادي يزعزع استقرار الطبقة lipid bilayer ويحفز تحرر الشحنة. (B) ملفات تحرر الكالسين من الليبوزومات المعرضة لجرعات متزايدة من الأشعة السينية (0–4 Gy)، مما يظهر تحرر الشحنة المعتمد على الجرعة من ليبوزومات VP/AuNP. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من أربعة قياسات. (C) قياسات حجم الورم (يساراً) ووزن الجسم (يميناً) في فئران تحمل طعوم HCT116 الغريبة والمعالجة بـ PBS، أو LipoDox، أو الأشعة السينية وحدها، أو LipoDox المحفز بالأشعة السينية. البيانات معروضة كمتوسط ± SD (n = 4 فئران لكل مجموعة). تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام t-test (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001). (D) مقاطع ممثلة للأورام مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) والتحليل المورفومتري لمتوسط منطقة التنخر في الورم. تشير الأسهم إلى مناطق التنخر الممثلة. توضح المخططات الصندوقية الوسيط والمدى الربيعي، مع امتداد الشعيرات إلى 1.5 × IQR. حُللت البيانات باستخدام t-test (n = 5). شريط المقياس = 50 µm. مقتبس من Deng et al.11 بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي Attribution 4.0 International License. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

قد تشمل النتائج غير المثالية في نموذج الطعم الغريب ما يلي: (أ) عدم وجود فرق في نمو الورم بين مجموعات الليبوزومات التي تعرضت للإشعاع وتلك التي لم تتعرض له، مما يشير إلى عدم كفاية الإطلاق بوساطة VP أو عدم كفاية دمج الجسيمات النانوية الذهبية؛ أو (ب) تسمم جهازي (فقدان الوزن > 15%)، مما يشير إلى تسرب Dox من الليبوزومات قبل التنشيط بالأشعة السينية.

المناقشة

تعتبر عدة خطوات في هذه البروتوكولات حاسمة لضمان النجاح. ففي الجزء (أ)، يجب الحفاظ بدقة على النسبة المولية للدهون (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06)، حيث يحدد تركيز VP بشكل مباشر مقدار توليد 1O2، وبالتالي كفاءة تحرير الشحنة9. كما أن تحميل معقد RNP المكون من Cas9/sgRNA أثناء خطوة التميؤ، بدلاً من التجميع بعد التكوين، ضروري للتغليف داخل القلب المائي. وينتج عن البثق عبر غشاء من البولي كربونيت بقطر 200 nm (11 تمريرة) حويصلات أحادية الطبقة متجانسة؛ ولا ينبغي استبدال ذلك بالسونيكة (المعالجة بالموجات فوق الصوتية)، لأنها قد تؤدي إلى مسخ بروتين Cas9. أما بالنسبة للجزء (ب)، فإن حجم جسيمات الذهب النانوية (3–5 nm) يعد أمراً حاسماً، إذ يجب أن تكون الجسيمات صغيرة بما يكفي لتنغرس داخل الطبقة الدهنية المزدوجة لضمان نقل الطاقة الفعال عبر إلكترونات Auger إلى VP تحت تأثير الإشعاع بالأشعة السينية11. وتتطلب طريقة تدرج كبريتات الأمونيوم المستخدمة لتحميل Dox إجراء دياليز (ديلزة) كامل لكبريتات الأمونيوم الخارجية قبل إضافة الدواء؛ حيث سيؤدي الدياليز غير المكتمل إلى تقليل كفاءة التحميل.

يمكن تكييف تركيبة الدهون لتناسب تطبيقات مختلفة مع الحفاظ على آلية التحرير بوساطة VP. فعلى سبيل المثال، قد يؤدي استبدال جزء من DOTAP بدهون مبيجلة (مثل DSPE-PEG2000 بنسبة 5 mol%) إلى تحسين وقت الدوران عند الإعطاء الجهازي، رغم أن هذا سيقلل من الشحنة السطحية الموجبة وقد يخفض الامتصاص الخلوي في المختبر2. إذا أظهرت قياسات DLS أن PDI > 0.3، فقم بزيادة عدد دورات البثق أو تحقق من سلامة الغشاء. وإذا كان توليد الأكسجين الأحادي منخفضاً رغم دمج VP بشكل صحيح، فتحقق من الطول الموجي وكثافة القدرة لمصدر ضوء LED باستخدام مقياس قدرة معاير، حيث أن تنشيط VP يعتمد على طول موجي محدد (ذروة الإثارة عند 425 nm لنطاق Soret والتنشيط العلاجي عند 689–690 nm لنطاق Q)9. وبالنسبة لمقاييس سمك الزيبرا، إذا تجاوزت معدلات نفوق الأجنة 20% في المجموعات المعالجة، فقم بتقليل حجم الحقن أو تركيز الليبوزومات لتقليل السمية الضوئية المرتبطة بـ VP. وفيما يلي إطار عمل منظم لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، مرتبط بالمعايير المحددة في الجدول 1: إذا كان PDI > 0.3، قم بزيادة عدد دورات البثق وتحقق من سلامة الغشاء. في حالة التحرير المحفز المنخفض أو الغائب رغم دمج VP بشكل صحيح: تأكد من مخرجات 690 nm باستخدام مقياس قدرة معاير وتحقق من النسبة المولية لـ VP. إذا كان عدد ألياف العضلات البطيئة المعطلة أقل من ~50 ليفة لكل جنين: أعد تحضير الليبوزومات، أو تأكد من نشاط RNP، أو زد من وقت التشعيع. في حالة فقدان إشارة eGFP في عينات التحكم غير المشععة: تحقق من ظروف التخزين عن طريق استخدام الليبوزومات خلال 48 h من التحضير وتخزينها عند 4°C في الظلام، وتأكد من استقرار الغشاء. أما في نموذج الطعم الغريب (xenograft)، فإن عدم وجود فرق بين مجموعات الليبوزومات المشععة وغير المشععة يشير إلى الحاجة للتأكد من دمج جزيئات الذهب النانوية بحجم 3–5 nm والتحقق من جرعة الأشعة السينية المسلطة.

يتمثل القيد الأساسي في نمط التنشيط الضوئي (الجزء A) في عمق اختراق الضوء بطول موجي 690 nm، وهو ما يقصر التنشيط المباشر على الأنسجة السطحية التي يمكن الوصول إليها أو تلك التي يمكن إيصال الضوء إليها عبر الألياف البصرية5. أما نمط التنشيط بالأشعة السينية (الجزء B) فيتجاوز هذا القيد المتعلق بالعمق، ولكنه يتطلب الوصول إلى معجل خطي سريري ويعرض الأنسجة المحيطة للإشعاع المؤين، وإن كان ذلك بجرعات علاجية11,12. وتعتمد كلتا التركيبتين حالياً على DOTAP، وهو ليبيد كاتيوني يرتبط بسمية خلوية تعتمد على الجرعة، مما قد يحد من النافذة العلاجية عند الإعطاء الجهازي2. وتعتبر الطبيعة العابرة لتحرير الجينات بوساطة RNP ميزة من حيث السلامة، ولكنها تعني أن التعطيل الجيني غير المكتمل في مجموعة الخلايا المستهدفة لا يمكن تعزيزه عن طريق تكرار الجرعات في الموقع نفسه دون إعادة إعطاء الجسيمات النانوية. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من هذه البروتوكولات في خطوط خلوية ونماذج حيوانية صغيرة؛ وسيتطلب الانتقال إلى نماذج حيوانية أكبر، وفي نهاية المطاف، إلى التطبيق السريري البشري، تحسين التركيبة، وإجراء دراسات الحركية الدوائية، وتقييم رسمي للسموم تحت ظروف GLP. وبشكل خاص، لا يتضمن هذا البروتوكول بيانات حول الحركية الدوائية، أو التوزيع الحيوي، أو اختراق الشبكية. ورغم أن اختراق الضوء من خلال أنسجة العين والأنسجة الأخرى موصف جيداً في الأدبيات العلمية بأنه يعتمد على الطول الموجي، والتصبغ، ونوع النسيج (ويمكن تعزيزه باستخدام عوامل التصفية البصرية)، إلا أن الدراسات الكمية للحركية الدوائية، والتوزيع الحيوي، وإيصال الدواء إلى الشبكية تظل خطوات تالية مهمة قبل إثبات الادعاءات الانتقالية.

تطلق أنظمة الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) التقليدية، بما في ذلك تلك المستخدمة في لقاحات mRNA، حمولتها بشكل سلبي عند الامتصاص الخلوي من خلال الهروب الإندوزومي، ولا توفر أي تحكم زمني أو مكاني في عملية التوصيل1,2. وتوفر النواقل الفيروسية مثل AAV توصيلاً فعالاً للجينات، ولكنها محدودة بسعة التعبئة (~4.7 kb)، والاستجابة المناعية عند إعادة إعطاء الجرعات، والتعبير الجيني المستمر الذي لا يمكن تعديله بعد الإعطاء3. وتعالج منصة VP-liposome هذه القيود من خلال توفير آلية تحرير يمكن التحكم فيها خارجيًا وتكون مستقلة عن نوع الحمولة، ومتوافقة مع الحمولات الكبيرة (البروتينات، ومعقدات RNP، والجزيئات الصغيرة)، وغير فيروسية وربما تكون متوافقة مع الإعطاء المتكرر، بشرط إجراء دراسات السمية والاستجابة المناعية للجرعات المتكررة. وبخلاف الأنظمة المعتمدة على علم البصريات الوراثي أو الأنظمة المستجيبة للحرارة، يعتمد النهج القائم على VP على محسس ضوئي معتمد سريريًا مع بيانات سلامة مثبتة وبنية تحتية قائمة لليزر السريري، لا سيما في طب العيون، حيث يعد ليزر Visudyne بطول موجي 689 nm معدات قياسية بالفعل6. كما أثبت Sang وآخرون أن الجسيمات النانوية الهجينة (دهنية-بوليمرية) التي تحتوي على VP تعزز فعالية العلاج الإشعاعي الديناميكي في نماذج سرطان القولون والمستقيم، مما يؤكد قابلية تكيف توليد ROS بوساطة VP عبر مختلف بنيات الجسيمات النانوية12.

تتمتع الطرق الموصوفة هنا بأهمية خاصة لثلاث حالات عينية. ففي حالة التنكس البقعي المرتبط بالعمر من النوع الرطب (neovascular AMD)، لا يزال عبء حقن مضادات VEGF يشكل عائقاً حرجاً أمام تحقيق أفضل النتائج. وتظهر بيانات السجلات الواقعية نقصاً ملحوظاً في العلاج مقارنة ببروتوكولات التجارب السريرية (بمتوسط 7.3 حقنة مقابل 12 حقنة في السنة الأولى، مع توقف 38.8% من المرضى عن العلاج وتحقيق مكاسب طفيفة في حدة البصر)14، فضلاً عن تدهور البصر على المدى الطويل رغم الجرعات المتكررة23. وبالرغم من تطوير علاجات جينية تعتمد على AAV لتقليل هذا العبء — مثل ixoberogene soroparvovec15 وABBV-RGX-31416 و4D-150 المصنف كعلاج تجديدي سريع (RMAT) والذي يحقق خفضاً في الحقن بنسبة 83%24 — إلا أنها تعبر عن الجينات المنقولة لمضادات VEGF بشكل مستمر ولا يمكن معايرتها أو سحبها. وهذا يمثل مصدر قلق محتمل نظراً للأدلة التي تربط التثبيط المستمر لـ VEGF بالضمور الجغرافي (دراسة CATT17؛ وتحليل شمولي لـ 4,609 عين18؛ وارتفاع انتشار الضمور إلى 78.3% على مدى ثماني سنوات25). وبدلاً من ذلك، يمكن لنظام VP-liposome المحفز بالضوء والذي يحمل CRISPR-Cas9 الذي يستهدف VEGF-A أن يتيح تعطيل الجينات في نطاق مكاني محدد، مما يوفر تحكماً سريرياً في البوابة المكانية والزمانية لحدث التحرير الأولي مع الحفاظ على ديمومة التحرير الجيني. وتدعم الدراسات قبل السريرية جدوى هذا النهج. حيث أدى التوصيل المشترك لـ Cas9 mRNA وsgRNA المستهدف لـ VEGFA بواسطة LNP إلى تقليل التوعي الشعيري المشيخي (CNV) المستحث بالليزر في الفئران26، وحققت LNPs من نوع PEG-variant تحريراً جينياً في الظهارة الصباغية للشبكية (RPE)27، وقامت LNPs الموجهة بالببتيد بتوصيل mRNA إلى المستقبلات الضوئية في الرئيسيات غير البشرية28. ومع ذلك، لم يدخل أي علاج جيني للشبكية يعتمد على LNP في التجارب السريرية حتى أوائل عام 202629، مما يؤكد وجود فرصة ترجمية. وفي مرض ستارجاردت، يتجاوز التسلسل المشفر لـ ABCA4 الذي يبلغ طوله حوالي 6.8 kb سعة التعبئة الخاصة بـ AAV، مما يستلزم استراتيجيات النواقل المزدوجة التي تعاني من انخفاض كفاءة ترنسدكشن19. وتشمل المرشحات السريرية منصات AAV المزدوجة SB-007 وVG80130، إلى جانب العلاج المعدل غير المرتبط بالجين OCU410ST31. ويمكن لتوصيل الأحماض النووية غير الفيروسي أن يتجاوز قيود تعبئة AAV. فقد قللت جسيمات PEG-ECO النانوية التي تحمل بلازميد ABCA4 من تراكم A2E في فئران Abca4-/-20، بينما أظهرت دراسات منفصلة إمكانية توصيل بنيات DNA شبكية كبيرة32 وتعبير mRNA بوساطة LNP في الأنسجة العينية33. ونظراً لأن العلاج الموضعي للبقعة والنقرة كافٍ للحفاظ على الرؤية المركزية، فإن VP-liposomes مناسبة تماماً لتوصيل تركيزات عالية من حمولة العلاج الجيني بدقة إلى هذه المناطق. وبالنسبة للميلانوما العنبية، يعمل verteporfin من خلال ثلاث آليات متكاملة: السمية الخلوية بوساطة PDT، وتثبيط مسار YAP/TAZ (حيث يرتبط تعبير YAP1 بأقوى المؤشرات النقيلية، وهي أحادية الصبغي 3 وفقدان BAP1)21، وموت الخلايا المناعي من خلال تنشيط cGAS-STING. وقد أدى دمج تثبيط YAP بوساطة VP وPDT مع علاج anti-PD-L1 إلى تحويل الأورام "الباردة" مناعياً إلى أورام نشطة مناعياً، مما أدى إلى تثبيط نمو الورم بشكل ملحوظ وإطالة مدة البقاء في النماذج الموضعية22. وتتوافق هذه النتائج مع معدل الاستجابة المبلغ عنه بنسبة 80% لـ PDT القائم على verteporfin كعلاج أولي للميلانوما المشيكية34. إن إمكانية الوصول البصري للعين لتنشيط بطول موجي 689 nm، إلى جانب الموقع المحدد لمعظم حالات الميلانوما العنبية، يجعل VP-liposomes منصة واعدة لتوصيل العلاج الموضعي مع احتمال تقليل المراضة المرتبطة بأساليب العلاج الإشعاعي القريب (brachytherapy) وحزم البروتونات الحالية.

بالإضافة إلى التطبيقات العينية والأورام التي نوقشت أعلاه، يمكن تطبيق منصة VP-liposome في أي سياق علاجي يتطلب إطلاقاً للحمولات يتم التحكم فيه خارجياً وعند الطلب. وتشمل التطبيقات المحتملة تحرير الجينات المحفز بالضوء في الحالات الجلدية التي يمكن الوصول إليها عبر الإضاءة عبر الجلد، وإطلاق العلاج الكيميائي المحفز بالأشعة السينية بالتزامن مع جداول تجزئة العلاج الإشعاعي السريري، وتعطيل الجينات بنمط مكاني للدراسات في البيولوجيا التطورية. وقد تم إثبات عدة أنظمة لتحرير الجينات قابلة للتنشيط الضوئي في أنسجة غير شبكية، بما في ذلك محرّر القواعد القابل للتنشيط الضوئي Mag-ABE لتحرير الجينوم الذي يتم التحكم فيه مكانياً وزمانياً في الجسم الحي35 ونظام جسيمات نانوية محولة للأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) لتحرير CRISPR-Cas9 والعلاج الديناميكي الضوئي الذي يتم التحكم فيه مكانياً وزمانياً36. وفي طب العيون، فإن الاهتمام المتزايد باستراتيجيات تثبيط VEGF المستدامة يسلط الضوء بشكل أكبر على الحاجة إلى أنظمة توصيل تجمع بين الفعالية العلاجية طويلة المدى والتحكم الخارجي في توقيت وموقع النشاط البيولوجي37. ويمثل دمج طرق التصنيع هذه مع تقنيات توصيل LNP الشبكية الناشئة وأنظمة تحرير الجينات القابلة للتنشيط الضوئي تقارباً لمكونات تم التحقق من صحتها بشكل فردي، بينما يظل تطبيقها المشترك في العين جبهة بحثية مفتوحة وذات تأثير محتمل عالٍ. ويتجه العمل الجاري في مجموعتنا نحو تحسين الصيغ لمسارات التوصيل تحت الشبكية وفي الجسم الزجاجي، وتقييم ملفات السلامة في نماذج عينية للحيوانات الكبيرة، وتكييف نمط التحفيز بالأشعة السينية للاستخدام المتزامن مع بروتوكولات العلاج الإشعاعي القياسية في علم الأورام السريري.

الإفصاحات

يشغل Y.A.A. منصب مدير ومؤسس مشارك لشركة EosGene Therapeutics Pty Ltd، التي تمتلك براءات اختراع متعلقة بتقنية الجسيمات النانوية الدهنية المنشطة بالضوء الموصوفة هنا. كما أن E.M.G. وW.D. مؤسسان مشاركان في شركة EosGene Therapeutics.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بالتسهيلات والمساعدة التقنية المقدمة من مرفق سمك الزيبرا بجامعة ماكواري (عمل سمك الزيبرا) ولجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة ماكواري. تم دعم هذا العمل جزئيًا من قبل مركز التميز التابع لمجلس البحوث الأسترالية (ARC) للمناطق النانوية للبيوفوتونيات (CE140100003). كما يقر المؤلفون بالدعم المقدم من شركة EosGene Therapeutics Pty Ltd.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غشاء ترشيح بمسامية 20 نانومتر (Anotop 10 أو ما يعادله)Whatman (Cytiva)نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير المهنية المحددة.تُستخدم لفصل بروتين Cas9 الحر أثناء قياسات كفاءة التغليف
مصدر ضوء LED بطول موجي 690 نانومترThorlabsM690L4مصدر ضوئي لتحفيز تحرر حمولة الليبوزومات بوساطة بروتين فيلوسين (VP)؛ كثافة قدرة قابلة للضبط
مضاد حيوي–مضاد للفطريات (100X)Thermo Fisher Scientific15240062مكمل استزراع الخلايا؛ تركيز نهائي 1%
أسطوانة غاز الأرجون ومنظم الضغطنظرًا لعدم توفر نص مصدر، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته.لا ينطبقتُستخدم لتبخير المذيب أثناء تحضير الغشاء الدهني
جهاز البثق المصغر Avanti (Avanti Mini Extruder)Avanti Polar Lipids610000نظام بثق يدوي يستخدم مع أغشية بولي كربونات بمسامية 200 نانومتر لتوحيد حجم الليبوزومات
فئران BALB/c عارية الشعر (إناث، 5–٦ أسابيع)مركز الموارد الحيوانيةيرجى تقديم النص المصدر المراد ترجمته.فئران تعاني من نقص المناعة مستخدمة في نموذج زراعة الورم الغريب HCT116
طقم مقايسة بروتين BCAThermo Fisher Scientificبما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقاً للمعايير والتعليمات المذكورة أعلاه، وسأقوم بتنفيذه بدقة أكاديمية وعلمية متخصصة.تُستخدم لتقدير كمية Cas9 الحر وقياس كفاءة التغليف
نظام التصوير Bio-Rad ChemiDoc MPBio-Rad Laboratories12003154نظام تصوير لطخة ويسترن والرحلان الكهربائي الهلامي
كالسئينSigma-AldrichC0875صبغة فلورية لمقايسات التحرير؛ إخماد ذاتي عند التركيزات العالية
مقياس الطيف الضوئي Cary 5000 UV-Vis-NIRAgilent Technologiesنظرًا لعدم وجود نص مصدر متاح للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي أو التعليمي المراد ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقاً للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة.مطيافية امتصاص الأشعة فوق البنفسجية والمرئية لليبوزومات والفيرتيبورفين
خلايا CCD841 CoN (خلايا طلائية طبيعية من القولون البشري)ATCCCRL-1790سلالة خلايا ظهارية طبيعية من القولون؛ تُستخدم كضابط غير سرطاني
كلوروفورمSigma-Aldrich288306مذيب عضوي لتحضير الغشاء الدهني
الكوليسترولSigma-AldrichC8667مكون غشاء الليبوزوم المستخدم في التركيبة التي يتم تحفيزها بالضوء
معجل خطي سريري (حزمة فوتونية بقدرة 6 ميجا إلكترون فولت)Varian Medical Systemsنظرًا لعدم توفر نص مصدري للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة.مصدر الأشعة السينية السريري لدراسات التشعيع
القدمة ذات الورنية الرقميةنظرًا لعدم وجود نص مصدر متاح للترجمة، يرجى تزويدنا بالمحتوى العلمي الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير المحددة.يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته. أنا جاهز لبدء العمل وفقاً للمعايير المهنية والعلمية المحددة.تُستخدم لقياس حجم أورام الطعوم الغريبة
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-Aldrich472301المذيب لتحضير المخزون من الفيرتيبورفين
DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850375Pالمكون الدهني المستخدم في التركيبة التي يتم تحفيزها بالأشعة السينية
DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)Sigma-AldrichP1223الدهون المساعدة المستخدمة في التركيبة التي يتم تفعيلها بالضوء
DOTAP (1,2-دي-أوليويل-3-تريميثيل-أمونيم-بروبان)Avanti Polar Lipids890890Pدهن كاتيوني مستخدم في كلا التركيبتين
هيدروكلوريد الدوكسوروبيسينSigma-AldrichD1515عقار علاج كيميائي مُحمّل في ليبوسومات يتم تحفيزها بالأشعة السينية
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120Pدهون مُبيلجلة (PEGylated lipid) مستخدمة في تركيبة مُحفزة بالأشعة السينية
وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092وسط زراعة الخلايا لخلايا HEK293 وخلايا PC12
محلول ديلبيكو الملح المتوازن بالفوسفات (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144محلول غسيل منظم
مصل جنين البقر (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141مكمل زراعة الخلايا؛ تركيز نهائي 10%
مقياس الطيف الفلوري Fluorolog-Tau3HORIBA Scientificنظرًا لعدم توفر نص مصدر، يرجى تقديم النص الإنجليزي المراد ترجمته للبدء في العمل وفقاً للمعايير المهنية والعلمية المحددة.مطيافية الفلورة لتوصيف الفيرتيبورفين
برمجيات دمج التركيز (مثل Zerene Stacker)بما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير المذكورة.بما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية لكي أتمكن من البدء في العمل وفقاً للمعايير المهنية المحددة.تُستخدم لتوليد الصور ذات التكديس البؤري في تصوير سمكة الزيبرفيش (zebrafish)
مجفف بالتجميد (Alpha 1-4 LDplus)مارتن كريست / جون موريس ساينتيفيكنظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي الذي ترغب في ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقًا للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة.تُستخدم للتجفيف بالتفريغ وإزالة المذيبات
حمض نووي ريبوزي موجه مفرد لبروتين GFPThermo Fisher ScientificA35943رنا دليل مفرد يستهدف البروتين الفلوري الأخضر المحسن (eGFP)؛ يُستخدم للتحقق من عملية التعطيل الجيني
جسيمات الذهب النانوية (3–٥ نانومتر، مثبتة بالسترات)NanoComposixيرجى تزويد النص المراد ترجمته.مُحسِّس إشعاعي مستخدم في تركيبة يتم تحفيزها بالأشعة السينية
GraphPad Prismبرمجيات GraphPad7.0التحليل الإحصائي وتصور البيانات
خلايا HCT116 (سرطان القولون والمستقيم البشري)ATCCCCL-247خط خلوي لسرطان القول والمستقيم مستخدم في الدراسات المخبرية والدراسات الحيوية
خلايا HEK293/GFPGenTargetSC001خط خلوي مستقر يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) مستخدم للتحقق من صحة عملية التعطيل الجيني بتقنية كريسبر (CRISPR)
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570صبغة نووية؛ 5 µتركيز التشغيل بـ غ/ملل
برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال، Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)لم يتم توفير نص للترجمة. يرجى تزويد النص الإنجليزي المراد ترجمته.تُستخدم للتقدير الكمي لألياف العضلات البطيئة المعطلة جينياً
ImageJ/Fijiالمعاهد الوطنية للصحة (NIH)مفتوح المصدربرمجيات تحليل الصور
مجهر الفلورة المقلوبLeica MicrosystemsDMi3000تُستخدم في تصوير المراسل في سمك الزيبرفيش وتقييم الفلورة لبروتين GFP
نظام التصوير الحي IVIS SpectrumCTPerkinElmer128201نظام التصوير الفلوري في الجسم الحي
مجهر جهول JEM-1400 الإلكتروني النافذJEOLJEM-1400تصوير الليبوزومات باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)
المجهر البؤري Leica SP2Leica Microsystemsيرجى تقديم النص الذي ترغب في ترجمته. بمجرد تزويدي بالمحتوى الإنجليزي، سأقوم بترجمته إلى اللغة العربية بدقة علمية وأسلوب أكاديمي رصين، مع الالتزام بكافة المعايير والضوابط التي ذكرتها في التعليمات.التصوير البؤري المجهري للالتقاط الخلوي
أجاروز منخفض درجة الانصهارنظرًا لعدم وجود نص مصدر، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة.لم يتم توفير نص لترجمته. يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية.تُستخدم لتثبيت أجنة سمك الزيبرفيش أثناء التصوير
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019كاشف عفن (transfection reagent) مُستخدم كضابط موجب
برنامج Living ImagePerkinElmerبما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة.برمجيات الحصول على الصور وتحليلها
وسط مكوي 5أ (McCoy's 5A Medium)Thermo Fisher Scientific16600082وسط زراعة الخلايا لخلايا HCT116
نظام الحقن المجهرييرجى تقديم النص المصدر الذي ترغب في ترجمته.نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بصياغته وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.تُستخدم للحقن المجهري لأجنة أسماك الزيبرا في مرحلة الخلية الواحدة
مقايسة MTS لتكاثر الخلاياPromegaG3582اختبار حيوية الخلايا
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000قياسات نقاوة وتركيز الحمض النووي الريبوزي (RNA)
ماء خالٍ من النوكليازThermo Fisher ScientificR0582تستخدم لتحضير البروتين النووي الريبوزي (RNP) الخاص بـ CRISPR-Cas9
وسط Opti-MEM منخفض المصلThermo Fisher Scientific31985070وسط ترنسفكشن (وسط نقل الجينات)
بارافورمالدهيد (4%)Sigma-AldrichP6148مثبت للتحليل النسيجي
خلايا PC12 (ورم pheochromocytoma لدى الجرذان)ATCCCRL-1721خط خلوي شبيه بالخلايا العصبية يستخدم في دراسات الامتصاص
مرشحات غشاء البوليكربونات (200 نانومتر)Avanti Polar Lipids610006أغشية البثق لتحديد حجم الليبوزومات
طقم RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134طقم استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA)
مستشعر الأكسجين الأحادي الأخضر (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002مسبار فلوري للكشف عن الأكسجين الأحادي
أجهزة الديلزة Slide-A-Lyzer MINI (بحد قطع للوزن الجزيئي 10 كيلودالتون)Thermo Fisher Scientific69570أجهزة الديالزة لتحضير الليبوزومات وتحميل الأدوية
صبغة SYBR Gold لهلام الأحماض النوويةThermo Fisher ScientificS11494صبغة هلام الأحماض النووية
أسماك الزيبرا Tg(ubi:EGFP)المركز الدولي لموارد سمك الزيبراZDB-GENO-080606-2أسماك الزيبرا المعدلة وراثياً المستخدمة للتحقق من نظام CRISPR داخل الجسم الحي
عامل نخر الورم-α (بشري مؤتلف)Life TechnologiesRTNFAIالسيتوكين المستخدم في دراسات تحفيز TNFAIP3
حمض نووي ريبوزي موجه مفرد (sgRNA) لـ TNFAIP3Thermo Fisher Scientificبما أنه لا يوجد نص مصدر مقدم للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير المهنية المذكورة.حمض نووي ريبوزي موجه أحادي (sgRNA) يستهدف TNFAIP3
ميثان سلفونات التريكايين (MS-222)لا ينطبقبما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة في التعليمات.المخدر المستخدم لأسماك zebrafish قبل التصوير
Triton X-100Sigma-AldrichT8787المنظف المستخدم في فحوصات تحلل الليبوزومات وتحرير المحتويات
بروتين TrueCut Cas9 الإصدار الثاني (v2)Thermo Fisher ScientificA36498نوكلياز Cas9 المستخدم لتحضير معقد البروتين النووي الريبوزي CRISPR-Cas9 RNP
تريpsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200056كاشف تفكيك الخلايا
أسيتات اليورانيل (2%)علوم المجهر الإلكتروني22400صبغ سلبي للتصوير بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)
فيرتيبورفينSigma-AldrichSML0534-5MGدمج المحسس الضوئي في تركيبات الليبوزومات
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600قياسات تشتت الضوء الديناميكي وجهد زيتا

المراجع

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
  2. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
  3. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
  4. Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
  5. Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
  6. Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
  7. Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
  8. Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
  9. Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
  10. Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
  11. Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
  12. Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
  13. Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
  14. Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
  15. Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
  16. Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
  17. Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
  18. Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
  19. Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
  20. Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
  21. Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
  22. Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
  23. Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
  24. Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
  25. Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
  26. Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
  27. Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
  28. Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  29. Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
  30. Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
  31. Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
  32. Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
  33. Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
  34. Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
  35. Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
  36. Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
  37. Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CRISPR Cas9

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.