يظهر دمج سورافينيب مع جيمسيتابين أدلة أولية على تثبيط تضافري لتكاثر خلايا HepG2، ويظهر تغيرات ارتباطية في تعبير p-ERK وVEGF، كما يعمل على تثبيط نمو أورام الكبد في فئران NOD/SCID.
مقالة بحثية
تقييم العلاج المشترك بسورافينيب وجيمسيتابين في خلايا HepG2 ونموذج طعم غريب في فئران NOD/SCID: دراسة استطلاعية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا يزال سرطان الكبد سببًا رئيسيًا للوفيات المرتبطة بالسرطان نظرًا لمقاومة الأدوية ومحدودية خيارات العلاج. وهناك حاجة ملحة لاستكشاف استراتيجيات علاجية لتحسين النتائج. تقدم هذه الدراسة الاسترشادية بروتوكولاً لتقييم التأثيرات المحتملة والآليات الكامنة وراء الجمع بين عقاري sorafenib وgemcitabine في علاج سرطان الكبد. تم استخدام الخط الخلوي لسرطان الكبد HepG2، كما تم إنشاء نموذج طعم خارجي في فئران من سلالة NOD/SCID (المصابة بالسكري وغير البدينة/ذات النقص المناعي الشديد المشترك). يتم توضيح الخطوات الإجرائية الرئيسية بما في ذلك: (1) زراعة خلايا HepG2 ومعالجتها بالأدوية؛ (2) إعداد مقايسة MTT، والتحضين، وقراءة الامتصاصية؛ (3) استخلاص البروتين، والترحيل الكهربائي SDS-PAGE، والنقل، واللطخة المناعية لبروتيني ERK وp-ERK؛ (4) إنشاء طعم خارجي تحت الجلد في فئران NOD/SCID؛ (5) قياس الورم وحساب حجمه؛ (6) الكيمياء النسيجية المناعية لـ VEGF في مقاطع الورم. كما تم توفير الخطوات الحرجة، ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ومواصفات المعدات. حقق الجمع بين sorafenib (3 µmol/L) وgemcitabine (10 µmol/L) معدل تثبيط قدره 71.23% ± 6.76% عند 72 h، مع قيمة q تبلغ 1.35، مما يشير إلى تأثير تآزري عند هذا الزوج المحدد من الجرعات في ظل الظروف المختبرة. وبالمقارنة مع مجموعة الضبط، ارتبط العلاج المشترك بانخفاض تعبير p-ERK، وتناقص حجم الورم، وانخفاض نوعي في صبغية VEGF المناعية. تظهر هذه البيانات ارتباطاً ترابطياً بين انخفاض تعبير p-ERK والتأثير المضاد للتكاثر الملاحظ، دون إثبات وجود علاقة سببية. في خلايا HepG2 ونموذج الطعم الخارجي في فئران NOD/SCID، يظهر الجمع بين sorafenib وgemcitabine أدلة أولية على القدرة المضادة للتكاثر ويرتبط بانخفاض تعبير VEGF؛ ومع ذلك، فإن هذه النتيجة لا تشكل دليلاً مباشراً على النشاط المضاد لتكون الأوعية الدموية، حيث لم يتم إجراء تحليلات لكثافة الأوعية الدقيقة أو التحليلات الوعائية الوظيفية. يوفر هذا البروتوكول القابل للتكرار إطاراً مفيداً لتقييم مجموعات الأدوية في نماذج HCC ويمكن تكييفه لأنظمة علاجية أخرى تجمع بين العلاج الموجه والعلاج الكيميائي، على الرغم من الحاجة إلى مزيد من الدراسات الميكانيكية ودراسات التحقق من الجرعة قبل استخلاص أي استنتاجات سريرية.
المقدمة
يُعد سرطان الكبد أحد أكثر أنواع السرطان شيوعاً وفتكاً، كما أنه من أسرع الأورام الخبيثة نمواً1,2. وعلى الرغم من انخفاض معدل الإصابة بسرطان الكبد، إلا أن العبء الإجمالي للمرض استمر في التزايد. وكشفت البيانات الوبائية العالمية لعام 2022 أن معدل الإصابة الموحد حسب العمر لسرطان الكبد في قاعدة البيانات الإلكترونية للمرصد العالمي للسرطان (GLOBOCAN) لعام 2022 بلغ 15.0 حالة لكل 100,000 نسمة، بينما بلغ معدل الوفيات الموحد حسب العمر 26.7 حالة لكل 100,000 نسمة، مما يجعله السبب الثاني الرئيسي للوفيات الناجمة عن السرطان3. وفي الوقت الحالي، وبسبب غياب العلاج الفعال لسرطان الكبد، إلى جانب بدايته الخفية، يتوفى معظم المرضى في غضون عام واحد من التشخيص. ويُعد السورافينيب (Sorafenib) أول مثبط متعدد لإنزيم الكيناز تمت الموافقة على استخدامه سريرياً، حيث يستهدف مستقبلات تيروزين كيناز مثل مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)، ومستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGFR)، وإنزيمات سيرين/ثرونين كيناز4,5. ويعمل السورافينيب، وهو مثبط متعدد للكيناز يؤخذ عن طريق الفم، على إحداث تأثيرات مضادة للتكاثر ومضادة لتكون الأوعية الدموية في سرطان الكبد من خلال استهداف مسارات متعددة لعوامل النمو. وتاريخياً، كان السورافينيب أول علاج جهازي من الخط الأول معتمد من إدارة الغذاء والدواء (FDA) للمرضى الذين يعانون من سرطان كبد متقدم أو غير قابل للاستئصال6. ومع ذلك، فقد توسع مشهد علاج الخط الأول الحالي لسرطان الخلايا الكبدية (HCC) المتقدم بشكل كبير؛ حيث تشمل الخيارات الموصى بها الآن مزيج مثبطات نقاط التفتيش المناعية أتيزوليزوماب (atezolizumab) مع بيفاسيزوماب (bevacizumab)، ولينفاتينيب (lenvatinib)، ومزيج العلاج المناعي المزدوج دورفالوماب (durvalumab) مع تريميليموماب (tremelimumab)، من بين خيارات أخرى. ورغم هذه التطورات، لا يزال السورافينيب خياراً مهماً من الخط الأول، لا سيما في المناطق التي لا تتوفر فيها توليفات العلاج المناعي بسهولة أو تكون مضادّة للاستطباب. ونظراً لاستخدامه الواسع في علاج سرطان الكبد، كانت الأحداث الضائرة المرتبطة بالدواء مثار قلق7. ففي تحليل قاعدة بيانات نظام الإبلاغ عن الأحداث الضائرة التابع لإدارة الغذاء والدواء (FAERS) من عام 2006 إلى 2023، شملت الأحداث الضائرة للسورافينيب بشكل أساسي الجهاز الهضمي، والجلد، والأنسجة تحت الجلد، بالإضافة إلى انزعاج جسدي غير محدد مثل العدوى والإصابات7. وبينما قد يستفيد بعض المرضى المصابين بسرطان الكبد المتقدم من العلاج بالسورافينيب، فإن معظم المرضى يطورون في النهاية مقاومة أو فشلاً علاجياً، مما يؤدي إلى إنذار سيئ8,9,10. وعلى الرغم من استخدامه، فإن السورافينيب يفيد حوالي 30% فقط من مرضى سرطان الخلايا الكبدية؛ علاوة على ذلك، غالباً ما يطور المستجيبون مقاومة للدواء في غضون 6 أشهر11. وتشمل المسارات الجزيئية المتضمنة في مقاومة السورافينيب كيناز منظم الإشارات خارج الخلية (ERK)/الـ ERK المفسفر (p-ERK)، وبروتين كيناز ب (Akt)، وفسفوإينوزيتيد 3-كيناز (PI3K)/AKT/هدف الثدييات من الراباميسين (mTOR)، والعامل 1 ألفا المحفز بنقص الأكسجة (HIF-1α)/HIF-2α، والمسارات المرتبطة بالالتهام الذاتي، مع تسليط الضوء بشكل خاص على ERK/p-ERK واختياره في هذا البحث11. أما الجيمسيتابين (Gemcitabine) فهو نظير للسيتيدين يدخل الجسم لينتج ثنائي فوسفات ثنائي فلورو سيتيدين وثلاثي فوسفات ثنائي فلورو سيتيدين، واللذين يمتلكان تأثيرات تثبيطية مختلفة على تخليق DNA12. وفي الأورام الخبيثة في الكبد والقنوات المرارية، تم تقييم الجيمسيتابين كجزء من العلاج الكيميائي المدمج. ومع ذلك، أُبلغ سريرياً أيضاً عن إظهار الجيمسيتابين مقاومة دوائية أكبر، مما يحد من فعاليته12,13. لذلك، يمثل تحديد النظام الدوائي الأمثل بفعالية وكفاءة تحدياً كبيراً. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الجيمسيتابين مدمجاً مع السورافينيب قد يكون له فعالية علاجية معززة بناءً على تنبؤ جديد بالمؤشرات الحيوية لجذعية الورم14. ومع ذلك، وعلى حد علمنا، لا توجد دراسة فحصت هذا المزيج تحديداً في سرطان الكبد باستخدام خلايا HepG2 ونموذج طعم غريب من سرطان الخلايا الكبدية في فئران مصابة بمرض السكري غير البدينة/ناقصة المناعة الشديدة المركبة (NOD/SCID). وبناءً على ذلك، لا تزال الأدلة التجريبية التي تثبت مباشرة التأثيرات الإضافية للسورافينيب والجيمسيتابين في سرطان الكبد مفقودة.
تُستخدم الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة على نطاق واسع، ولكن نادراً ما تُعرض بتنسيق مرئي وتفصيلي خطوة بخطوة يكون مناسباً للتكرار من قبل الباحثين في بداية مسيرتهم المهنية. لقد افترضنا أن الجمع بين sorafenib وgemcitabine سيثبط بشكل تآزري تكاثر خلايا سرطان الكبد ونمو الورم، وأن هذا التأثير سيكون مرتبطاً بتثبيط مسار ERK/p-ERK وتقليل تكوين الأوعية الدموية بوساطة عامل نمو البطانة الوعائية (VEGF). تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف أولي للتأثير المثبط لـ sorafenib المقترن بـ gemcitabine على تكاثر خط خلايا سرطان الكبد HepG2 in vitro وin vivo وآلية عمله (Supplementary Figure 1). تكمن جدة هذه الدراسة في ثلاثة جوانب: (1) أنها الأولى التي تختبر دمج sorafenib-gemcitabine تحديداً في سرطان الكبد باستخدام خط خلايا HepG2 المستخدم على نطاق واسع ونموذج فأر NOD/SCID المقابل؛ (2) أنها تبحث في مسار ERK/p-ERK الذي لم ينل قسطاً كافياً من الدراسة كآلية محتملة؛ (3) أنها تقدم دليلاً تجريبياً مباشراً — بدلاً من التنبؤات الحسابية — للتأثير التآزري لهذا المزيج في سرطان الكبد. وتميز هذه الخصائص هذا العمل عن التقارير السابقة للعلاجات المركبة التي أجريت على أنواع أخرى من الأورام أو باستخدام نماذج تجريبية مختلفة، لا سيما في سياق الأنظمة القائمة على sorafenib.
البروتوكول
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من لجنة مراجعة رعاية وأخلاقيات حيوانات التجارب بجامعة Zhejiang (رقم الموافقة ZJU20250049).
الحيوانات والتقسيم إلى مجموعات
تم شراء ما مجموعه 40 فأراً أنثى من سلالة NOD/SCID، تتراوح أعمارها بين 4 و5 أسابيع، وتزن 18–20 g، من مورد تجاري مرخص (ترخيص رقم SCXK (Shanghai) 2013-0006)، وتم إيواؤها في غرف حيوانات من درجة خالية من مسببات الأمراض النوعية (SPF). اتبعت جميع بروتوكولات الحيوانات الإرشادات القياسية. وخلال التجربة، سُمح للحيوانات بالأكل والشرب بحرية، وأُويت في مجموعات (5 فئران/قفص) في غرفة SPF خاضعة لرقابة جيدة، مع الحفاظ على درجة حرارة الغرفة عند 22 ± 2 °C، ورطوبة بنسبة 50%–60%، ودورة ضوء/ظلام مدتها 12/12 h. تم توفير الطعام والماء للحيوانات حسب الرغبة، وتمت مراقبة وزن أجسامها كل أسبوعين. وعندما أظهرت الفئران ألماً مستمراً، أو دنفاً، أو تقرحات ورمية، أو عندما وصل حجم الورم إلى أقصى بُعد قدره 2 cm، أو ظهرت مشاكل صحية أخرى غير قابلة للعلاج، تم إجراء القتل الرحيم عن طريق الحقن داخل الصفاق بـ 0.45% pentobarbital sodium بجرعة ≥150 mg/kg من وزن الجسم، يليه التأكد من توقف التنفس وضربات القلب، أو فقدان منعكس القرنية، أو تطبيق طريقة فيزيائية ثانوية إذا لزم الأمر، وفقاً لمعايير الإنهاء الرحيم المعتمدة من لجنة أخلاقيات الحيوان. تم تحديد حجم العينة (n = 10 لكل مجموعة) بناءً على تحليل القوة بافتراض حجم تأثير قدره 1.2 (مستمد من تجارب استطلاعية)، و α = 0.05، و β = 0.20 (قوة 80%)، بالإضافة إلى سماحية بنسبة 20% للفقد. أُجريت إجراءات زرع الورم قبل توزيع العلاج (انظر أدناه لإنشاء الطعم الغريب).
تم تقسيم الفئران عشوائياً إلى 4 مجموعات باستخدام طريقة جدول الأرقام العشوائية بعد زراعة الورم والتأكد من نموه: مجموعة ضابطة، ومجموعة سورافينيب (sorafenib)، ومجموعة جيمسيتابين (gemcitabine)، ومجموعة السورافينيب مدمجاً مع الجيمسيتابين، بحيث ضمت كل مجموعة 10 فئران (5 فئران/قفص)، وذلك لإنشاء نموذج ورم مزروع في فئران NOD/SCID. ونظراً لأن الأنسجة الورمية أثناء عملية النمذجة قد تؤدي إلى تدهور الحالة العامة أو حتى الوفاة في فئران NOD/SCID، ومع مراعاة أن التحليل الإحصائي يتطلب عموماً حجماً فعالاً للعينة، فقد تم إدراج 10 فئران على الأقل في كل مجموعة. قام فنيون مستقلون بإجراء التقسيم العشوائي وتم وضع علامات على الأقفاص؛ ولم يتم تطبيق التعمية أثناء إعطاء الدواء أو قياس الورم، وهو ما يعد قصوراً ملحوظاً. أما عمليات أخذ عينات الأنسجة المتبقية، والتقييمات البيوكيميائية والباثولوجية، فقد أجراها جميعاً موظفون مختبريون معماون. كما تم تحليل البيانات بشكل معماى من قبل إحصائيين لم يكن لديهم وصول إلا إلى ملفات مشفرة حتى اكتملت الإحصائيات وكُشف عن البيانات. شمل التحليل النهائي جميع الحيوانات. تم اختيار الطريق داخل الصفاق لكلا الدواءين لضمان الامتصاص الجهازى والتوافر الحيوي المتسق؛ واستند تحديد الجرعة مرة واحدة يومياً إلى دراسات حركية دوائية سابقة أظهرت تركيزات بلازمية مستمرة بهذا النظام. حُقنت المجموعة الضابطة (الناقلة) داخل الصفاق بـ 0.2 mL من المحلول الملحي العادي المعقم. وفي مجموعة السورافينيب، حُقن 0.2 mL من سورافينيب بجرعة 40 mg/kg داخل الصفاق. وفي مجموعة الجيمسيتابين، حُقن 0.2 mL من جيمسيتابين بجرعة 100 mg/kg داخل الصفاق. أما مجموعة العلاج المدمج، فقد أُعطيت 0.2 mL من كل من سورافينيب بجرعة 40 mg/kg وجيمسيتابين بجرعة 100 mg/kg داخل الصفاق. أُعطيت كل مجموعة الجرعات مرة واحدة يومياً لمدة 20 يوماً متتالية. شمل التحليل النهائي جميع الحيوانات، ولم يتم استبعاد أي من الفئران من الدراسة. ولم تُلاحظ أي وفيات في أي مجموعة خلال فترة العلاج التي استمرت 20 يوماً. تم اختيار الجدول الزمني والجرعات بناءً على دراسات منشورة في نماذج سرطان القنوات الصفراوية والكبد. وتجدر الإشارة إلى أن الإعطاء اليومي للجيمسيتابين داخل الصفاق قد يسبب سُمية. تم قياس طول وعرض الأورام المزروعة يومياً، وحُسب حجم الأورام المزروعة. وبعد 20 يوماً، تم قتل الحيوانات رحيماً عن طريق خلع الفقرات العنقية تحت تخدير عميق، وثُبتت أنسجة الورم المزروعة في الفورمالين. تم قياس وزن الجسم كل يومين طوال فترة الدراسة. كما خضعت الفئران للمراقبة اليومية لرصد العلامات السريرية للسُمية، بما في ذلك وقوف شعر الجلد، واتخاذ وضعية الانحناء، وانخفاض الحركة، والإسهال، والخمول. ومع ذلك، لم يتم إجراء تحليل بيوكيميائي للمصل (مثل ناقلة أمين الألانين، وناقلة أمين الأسبارتات، والكرياتينين) أو فحص نسيجي باثولوجي للأعضاء الرئيسية. وبناءً على ذلك، لا يمكن استبعاد السُمية تحت السريرية.
العقاقير والكواشف
تم إذابة Sorafenib في dimethyl sulfoxide (DMSO) بتركيز 10% وحفظه عند -20 °C. وقبل الاستخدام، تم إذابة المحلول وتخفيفه ليصل تركيز DMSO النهائي إلى أقل من 0.5%، وهو تركيز لم يؤثر على نمو الخلايا. تم الحصول على Gemcitabine من مصدر تجاري. كما تم الحصول على محلول RIPA lysis buffer، وthiazolyl blue، والأجسام المضادة الأولية ضد glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)، وERK، وp-ERK، وVEGF، والأجسام المضادة الثانوية، ووسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) عالي الغلوكوز، ومصل جنين البقر، وخط خلايا HepG2 من مصادر تجارية.
يُعد كل من Sorafenib وgemcitabine من العوامل السامة للخلايا. يجب إجراء جميع إجراءات تحضير الأدوية والتعامل معها في كابينة سلامة بيولوجية مخصصة مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، وقفازات النيتريل، ونظارات السلامة). تُعتبر مادة DMSO والميثانول والزايلين والمذيبات العضوية الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول مواد خطرة، ويجب التعامل معها داخل خزانة استنشاق الأدخنة لتجنب الاستنشاق أو ملامسة الجلد. كما يجب مراجعة صحائف بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع الكواشف قبل الاستخدام.
زراعة الخلايا
تم إحياء الخط الخلوي HepG2 وتلقيحه في زجاجات استزراع الخلايا التي تحتوي على 10 mL من وسط DMEM عالي الجلوكوز (مُدعم بـ 10% مصل جنين البقر، و100 U/mL بنسلين-ستربتومايسين، و4 mmol/L جلوتامين). حُضنت الخلايا عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂. استُبدل وسط الاستزراع كل يومين، وتم تمرير الخلايا كل 4 أيام للحفاظ على النمو اللوغاريتمي. تم الحصول على الخط الخلوي HepG2 من مصدر تجاري؛ ومع ذلك، لم يتم إجراء توثيق مستقل للخط الخلوي (مثل تحليل تكرار الترادف القصير) واختبار الميكوبلازما في هذه الدراسة.
طريقة MTT للكشف عن معدل تثبيط التكاثر
استُخدمت طريقة بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) لتحديد معدل تثبيط التكاثر لعقاري sorafenib وgemcitabine على الخط الخلوي HepG2. هُضمت الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي باستخدام trypsin بنسبة 0.25% لمدة 2 min، وأُنهيت عملية الهضم بإضافة حجم مساوٍ من الوسط الكامل. وبعد الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 10 min، أُعيد تعليق الخلايا في الوسط الكامل. ضُبطت كثافة الخلايا لتصبح 1 × 105 cells/mL، وزُرع 200 µL من معلق الخلايا في كل بئر من أطباق 96-well plate. تم اختيار كثافة الزرع هذه بناءً على تجارب تحسين أولية اختُبرت فيها كثافات خلوية تتراوح بين 5 × 103 إلى 5 × 104 cells/well. وأدت الكثافة البالغة 2 × 104 cells/well إلى زيادة خطية في الامتصاصية على مدار 96 h مع الحفاظ على درجة تلاقي (confluence) أقل من 80% عند نقطة النهاية، وهو ما تم تأكيده عبر الفحص البصري باستخدام مجهر مقلوب. ولضمان بقاء قياسات MTT ضمن النطاق الخطي، أُجريت تجارب استطلاعية عند كل نقطة زمنية باستخدام آبار تحكم عولجت بالمادة الحاملة (vehicle). استُبدل الوسط كل 48 h لمنع استنفاد العناصر الغذائية وتراكم النواتج الأيضية الثانوية. وتمت مراقبة درجة التلاقي يومياً باستخدام مجهر مقلوب. وعند 96 h، وصلت آبار التحكم إلى درجة تلاقي تقريبية تتراوح بين 75%–80%، ولم تُلاحظ أي علامات واضحة على استنفاد العناصر الغذائية. وبعد التصاق الخلايا، تم التخلص من الوسط وإضافة الوسط المحتوي على الدواء. وأُضيف وسط خالٍ من الدواء إلى مجموعة التحكم غير المعالجة (التحكم بالمادة الحاملة لتجارب in vivo). قُسمت التجربة إلى مجموعة تحكم غير معالجة، ومجموعة sorafenib، ومجموعة gemcitabine، ومجموعة علاج مشتركة. كانت جرعات sorafenib هي 1.5 µmol/L و3 µmol/L و4.5 µmol/L و6 µmol/L، وكانت جرعات gemcitabine هي 5 µmol/L و10 µmol/L و15 µmol/L و20 µmol/L. أما جرعات sorafenib المدمجة مع gemcitabine فكانت 1.5 µmol/L + 5 µmol/L و3 µmol/L + 10 µmol/L و4.5 µmol/L + 15 µmol/L و6 µmol/L + 20 µmol/L. استُزرعت الخلايا في كل مجموعة لمدة 24 h و48 h و72 h و96 h. وبعد الاستزراع، أُضيف 20 µL من MTT بتركيز 5 mg/mL إلى كل بئر، وحُضنت الخلايا في حضانة خلوية لمدة 4 h. تم التخلص من الطافي بعناية، ثم أُضيف 150 µL من DMSO إلى كل بئر، ورُج الطبق لمدة 10 min لإذابة الفورمازان تماماً، وقِيست قيمة الكثافة الضوئية (OD) لكل بئر عند 490 nm باستخدام قارئ أطباق ميكروي متعدد الوظائف. كُررت التجربة ثلاث مرات، واحتوت كل مجموعة على خمس آبار مكررة. عُرضت البيانات كمتوسط ± SD لثلاث مكررات بيولوجية. معدل تثبيط نمو الخلايا (%) =(1 - OD experimental group /OD untreated group）× 100%. تم الحكم على التفاعل بين الدوائين بواسطة قيمة q، والتي حُسبت بالمعادلة: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). هنا، تمثل EA وEB معدلات تثبيط الدواءين A وB عند استخدامهما منفردين، بينما يمثل EAB معدل التثبيط عند استخدام الدوائين معاً. عندما تكون q أكبر من 1.15، فإن ذلك يشير إلى تأثير تآزري بين الدوائين؛ والقيمة من 0.85–1.15 تشير إلى تأثير إضافي؛ وقيمة q أقل من 0.85 تشير إلى تأثير تضادي. تعد طريقة قيمة q أداة فحص بسيطة ولا تعوض تحليلات التآزر الأكثر دقة. وقد اختُبرت بضع أزواج من الجرعات ذات النسب الثابتة فقط، مما يحد من قوة ادعاء التآزر. لذا، فإن مصطلح "التآزر" في هذه الدراسة يشير إلى q > 1.15 عند أزواج جرعات ونقاط زمنية محددة، وليس إلى تفاعل إضافي تم التحقق منه عبر مصفوفة الاستجابة للجرعة الكاملة.
تحليل لطخة ويسترن للتعبير البروتيني لـ ERK و p-ERK
تم إجراء زراعة الخلايا والتقسيم التجريبي كما هو موضح أعلاه. ولكشف بروتيني ERK و p-ERK باستخدام تقنية Western Blotting، كانت جرعة sorafenib هي 3 µmol/L؛ وجرعة gemcitabine هي 10 µmol/L؛ والجرعة المشتركة هي 3 µmol/L + 10 µmol/L. وبعد 72 h من المعالجة، تم تحلل الخلايا باستخدام RIPA lysis buffer، واستُخلص البروتين الكلي من كل مجموعة تجريبية. وتم تحديد تركيز البروتين بطريقة bicinchoninic acid (BCA). حُمِّلت كميات متساوية من البروتين (30 µg لكل مسار) وفُصلت بواسطة 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) عند 120 V لمدة 90 min. ونُقلت البروتينات إلى أغشية polyvinylidene difluoride (PVDF) (بحجم مسام 0.45 µm) عند 300 mA لمدة 90 min عند 4 °C. وبعد الحجب باستخدام 5% non-fat milk في Tris-buffered saline مع 0.1% Tween-20 (TBST) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، حُضنت الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 °C مع الرج الخفيف. وبعد ثلاث غسلات بـ TBST (مدة كل منها 10 min)، حُضنت الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. وتم تصوير حزم البروتين باستخدام ركيزة enhanced chemiluminescence (ECL) وتم التقاط الصور باستخدام نظام تصوير الجل الرقمي. وحُسِّنَت أوقات التعريض لكل جسم مضاد لتجنب التشبع. وأُجري القياس الكمي للكثافة باستخدام برنامج ImageJ عبر أداة تحليل الجل. وتم تطبيع شدة حزم جميع البروتينات المستهدفة بالنسبة إلى GAPDH كضابط تحميل، كما تم تطبيع تعبير p-ERK بشكل إضافي بالنسبة إلى تعبير ERK الكلي. ولم تُجرَ أي خطوات حجب إضافية بخلاف استخدام 5% non-fat milk. وعُرِضت نتائج القياس الكمي كنسبة تغير (fold change) بالنسبة للمجموعة الضابطة، التي حُددت بقيمة 1.0. كُررت كل تجربة ثلاث مرات بشكل مستقل. وتظهر الصور الممثلة للبصمات المناعية (immunoblots) في الشكل.
الكشف الكيميائي النسيجي المناعي عن تعبير VEGF في أورام HepG2 المزروعة غريبة النوع في فئران NOD/SCID
لتأسيس الطعم الغريب: تم حصاد خلايا HepG2 في مرحلة النمو اللوغاريتمي عن طريق التريبسين، ثم غُسلت مرتين بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم، وأعيد تعليقها في وسط DMEM خالي من المصل. تم حقن إجمالي 2 × 106 خلية في 0.2 mL من وسط DMEM الخالي من المصل (بدون Matrigel) تحت الجلد في المنطقة الإبطية اليمنى (منطقة غنية بالإمداد الدموي) لكل فأر من سلالة NOD/SCID باستخدام حقنة سعة 1 mL لتأسيس نموذج طعم غريب تحت جلدي لخلايا HepG2 في فئران NOD/SCID. تمت مراقبة نمو الورم كل يومين. قيست حجم الورم كل يومين، وعندما وصل قطر الورم إلى 0.3–0.5 cm (بعد حوالي 7–10 أيام من الحقن، وهي النقطة المحددة لبدء العلاج)، تم تقسيم الفئران عشوائياً إلى 4 مجموعات للتجربة. قيست طول (L) وعرض (W) الطعم الغريب تحت الجلدي يومياً باستخدام الفرجار الرقمي، وحُسب حجم الورم (V) وفقاً للمعادلة: V = (L × W2) / 2. أجريت جميع القياسات بواسطة باحث لا يعلم توزيع المجموعات. بعد 20 يوماً، تم القضاء على الحيوانات عن طريق الخلع العنقي تحت تخدير عميق، وثُبت نسيج الطعم الغريب في فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% لمدة 24 h في درجة حرارة الغرفة، ثم طُمر في البارافين. قُطعت مقاطع نسيجية (بسمك 5 µm) باستخدام الميكروتوم الدوار وثُبتت على شرائح زجاجية مطلية بـ poly-L-lysine. ولإجراء الكيمياء النسيجية المناعية، أزيل البارافين من المقاطع باستخدام الزايلين (ثلاث مرات، 5 min لكل مرة) وأعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (100%، 95%، 70%، 50%؛ 3 min لكل تركيز). أجري استرجاع المستضد عن طريق تسخين المقاطع في محلول منظم من سترات الصوديوم بتركيز 10 mM في الميكروويف لمدة 15 min، يليه تبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 min. تم حجب نشاط البيروكسيديز الداخلي باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3% في الميثانول لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة. وحُجب الارتباط غير النوعي باستخدام مصل ماعز طبيعي بتركيز 5% في PBS لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، حُضنت المقاطع مع جسم مضاد أولي مضاد لـ VEGF (تخفيف 1 : 200) طوال الليل عند 4 °C في غرفة رطبة. بعد الغسل بـ PBS (ثلاث مرات، 5 min لكل مرة)، حُضنت المقاطع مع جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للأرنب مقترن ببيروكسيديز الفجل (HRP) (تخفيف 1 : 500) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن الإشارة باستخدام ركيزة 3,3′-diaminobenzidine (DAB). صُبغت المقاطع صبغة تباينية باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة 30 s، ثم جُففت ونُقيت وثُبتت بأغطية زجاجية باستخدام وسط تثبيت دائم. أجري التصوير باستخدام مجهر فلوري مقلوب بإعدادات المجال المضيء عند تكبير ×100. وتظهر الصور التمثيلية للتوضيح النوعي.
جُمِعت جميع الرؤوس الملوثة، والأنابيب، ونفايات المزارع الخلوية كنفايات ذات خطر بيولوجي وعُقمت بالموصدة (autoclaved) قبل التخلص منها. أما النفايات الكيميائية، بما في ذلك المحاليل التي تحتوي على عقاقير، وDMSO، والزيلين، والميثانول، فقد جُمِعت في حاويات نفايات منفصلة وموسومة، وتُم التخلص منها وفقاً للوائح المؤسسية المحلية الخاصة بالنفايات الكيميائية الخطرة.
التحليل الإحصائي
تَمَّ استخدام برنامج SPSS 19.0 لإجراء التحليل الإحصائي. عُبِّر عن البيانات التجريبية في صورة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة للتجارب التي أُجريت in vitro، وفي صورة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) من n = 10 فئران لكل مجموعة للتجارب التي أُجريت in vivo. وللمقارنات بين مجموعتين، استُخدمت اختبارات t غير المزدوجة ذات الذيلين. أما للمقارنات بين عدة مجموعات، فقد استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات البعدية. وتم تسجيل قيم p < 0.05، وp < 0.01، وp < 0.001.
النتائج
التأثير المثبط لسورافينيب وجيمسيتابين على تكاثر خلايا HepG2
ثبط عقارا سورافينيب وجيمسيتابين تكاثر خلايا HepG2 بطريقة تعتمد على الجرعة، كما هو موضح في الجدول 1. وقد أظهر العلاج المدمج معدلات تثبيط أعلى بكثير في جميع النقاط الزمنية مقارنة بالعلاج الأحادي. يقيس اختبار MTT النشاط الأيضي، والذي يرتبط بعدد الخلايا ولكنه لا يقيس التكاثر أو السمية الخلوية بشكل مباشر. لذا، يجب تفسير مصطلح "تثبيط التكاثر" على أنه انخفاض في تحويل MTT. ومن الملاحظ أن الجمع بين سورافينيب بتركيز 3 µmol/L وجيمسيتابين بتركيز 10 µmol/L حقق التأثير التثبيطي الأكثر وضوحاً، مما يسلط الضوء على إمكاناته كنظام علاجي فعال ضد سرطان الكبد. وأظهرت المزيد من الاستقصاءات وجود تأثير تراكمي لسورافينيب وجيمسيتابين على خلايا HepG2. يعرض الجدول 2 قيم q، التي تشير إلى تفاعلات تآزرية محتملة بين العقارين. ومن الملاحظ أن الدمج بتركيز 3 µmol/L من سورافينيب زائد 10 µmol/L من جيمسيتابين أظهر قيم q أعلى من 1.15 في نقاط زمنية متعددة، مما يشير إلى وجود ارتباط بين انخفاض تعبير p-ERK والتأثير المضاد للتكاثر الملاحظ، على الرغم من أن هذه البيانات لا تثبت العلاقة السببية. وتشير هذه النتائج إلى أنما إجراء مزيد من البحث في نماذج إضافية لسرطان الكبد قبل التوصل إلى استنتاجات بشأن الإمكانات العلاجية. لم يُلاحظ التآزر في جميع أزواج الجرعات؛ بل كان مقتصرًا على تركيبة تركيز واحدة محددة.
الشكل 1 يوضح أن معدل تثبيط تكاثر الخلايا في مجموعة سورافينيب (sorafenib) ومجموعة العلاج المشترك قد وصل إلى ذروته عند 72 h. وقد أدى العلاج المشترك، لا سيما عند جرعة 3 µmol/L من سورافينيب و 10 µmol/L من جيمسيتابين (gemcitabine)، إلى معدل تثبيط أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالعلاجات أحادية العامل.
تأثير سورافينيب وجيمسيتابين على تعبير ERK و p-ERK
الشكل 2A لا يظهر أي تغيير معنوي في تعبير بروتين ERK عبر جميع المجموعات. ومع ذلك، انخفض تعبير p-ERK بشكل ملحوظ في مجموعة سورافينيب ومجموعة العلاج المشترك، حيث لوحظ أكبر انخفاض في مجموعة العلاج المشترك. وتوضح هذه البيانات وجود ارتباط بين انخفاض مستويات p-ERK والعلاج المشترك، لكنها لا تثبت أن انخفاض p-ERK يتوسط بشكل مباشر التأثير المضاد للتكاثر. لم يتم إجراء التكميم بالكثافة الضوئية، أو تسوية p-ERK بالنسبة إلى ERK الكلي و GAPDH، أو تقديم معلومات عن المكررات البيولوجية، أو إجراء المقارنات الإحصائية. وبناءً على ذلك، فإن لطخات المناعة المعروضة هي ممثلة ونوعية فقط.
تأثير سورافينيب وجيمسيتابين على حجم الطعوم الغريبة تحت الجلد في سرطان الكبد المزروع في فئران NOD/SCID
لم يكن هناك فرق معنوي في حجم الطعوم الغريبة تحت الجلد بين المجموعات قبل العلاج (p = 0.367). وبعد العلاج، انخفض حجم الورم بشكل معنوي مقارنة بمجموعة الضبط، وكانت مجموعة العلاج المشترك أصغر بشكل معنوي من المجموعات التي تلقت السورافينيب والجيمسيتابين (p < 0.01)، كما هو موضح في الشكل 2B. ويجب تفسير هذه النتائج بحذر لأنه لم يتم جمع بيانات حول السمية أو الحركية الدوائية للتأكد من أن الاختلافات الملحوظة لم تتأثر بمراضة مرتبطة بالدواء أو اختلافات في التعرض الجهازي.
تأثير السورافينيب والجيمسيتابين على تعبير VEGF في سرطان الكبد المزروع في فئران NOD/SCID
الشكل 2C يوضح التحليل الكيميائي النسيجي المناعي للتعبير عن VEGF في الأنسجة الورمية. أظهرت مجموعات السورافينيب والمجموعات المركبة انخفاضاً في التلوين المناعي باللون البني المصفر وضعفاً في التعبير عن VEGF من خلال الكيمياء النسيجية المناعية النوعية. تشير هذه النتيجة إلى انخفاض القدرة على تكوين الأوعية الدموية، ولكنها لا تثبت تكوين الأوعية الدموية بشكل مباشر، حيث لم يتم إجراء تحليلات لعلامات الخلايا البطانية أو كثافة الأوعية الدقيقة. وأظهرت مجموعات الجيمسيتابين والمجموعات الضابطة تعبيراً عن VEGF أقوى نوعياً. وتعتبر هذه النتائج النوعية لـ VEGF ارتباطية وتساهم فقط في وضع الفرضيات. وفي غياب التحليل الكمي أو علامات وعائية مباشرة، لا يمكن استخلاص أي استنتاج حول تكوين الأوعية الدموية أو التآزر في تكوين الأوعية الدموية.
توافر البيانات
البيانات الخام التي تم إنشاؤها وتحليلها خلال هذه الدراسة مدرجة في المواد التكميلية (الملف التكميلي 1).
الشكل 1: تأثيرات التدخلات المختلفة على معدل تثبيط تكاثر خلايا HepG2. (A(معدل التثبيط (%) للسورافينيب عند نقاط زمنية مختلفة على خلايا HepG2. (Bمعدل التثبيط (%) لجيمسيتابين (gemcitabine) في نقاط زمنية مختلفة على خلايا HepG2.سي) معدل التثبيط (%) للسورافينيب مدمجاً مع الجمسيتابين على خلايا HepG2. (دمعدل التثبيط (%) لعقار sorafenib3 µmol/L) وجيمسيتابين (10 µmol/Lبمفرده، وبالاشتراك بعد 72 ساعة من المعالجة على خلايا HepG2. *p < 0.05, **p < 0.01 مقابل مجموعة الضبط. تم الحصول على جميع بيانات معدل التثبيط باستخدام مقايسة MTT كما هو موضح في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2تعبير ERK/p-ERK، وحجم الورم، وتعبير VEGF في المجموعات المعالجة. (A) تعبير ERK وp-ERK في خلايا HepG2 معالجات مختلفة؛ (Bالحجم (مم³)3لأورام في أربع مجموعات قبل العلاج وبعده (العدد = 10 لكل مجموعة).p < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة بعد العلاج. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) على أحجام نقاط النهاية. (كربون) صور ممثلة للكيمياء النسيجية المناعية (شريط القياس = 100 µmلتعبير VEGF في الأنسجة الورمية من كل مجموعة (العدد = 10 لكل مجموعة). تُعرض هذه الصور للتوضيح النوعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مجموعة (μmol/L） | وقت المعالجة (ساعة) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| سورافينيب | 1.5 | 12.41 ± 3.37 | 22.74 ± 4.57 | 29.76 ± 3.48 | 15.77 ± 3.18 |
| 3 | 26.37 ± 6.14 | 33.10 ± 4.39 | 44.71 ± 5.49 | 38.63 ± 5.68 | |
| 4.5 | 34.42 ± 5.26 | 58.91 ± 4.67 | 67.85 ± 5.20 | 54.26 ± 6.07 | |
| 6 | 46.88 ± 6.61 | 67.48 ± 5.70 | 73.57 ± 7.07 | 61.73 ± 6.10 | |
| جيمسيتابين | 5 | 3.56 ± 1.41 | 6.17 ± 1.73 | 9.31 ± 1.76 | 11.35 ± 1.95 |
| 10 | 5.89 ± 2.47 | 9.62 ± 2.15 | 14.57 ± 1.94 | 16.58 ± 2.31 | |
| 15 | 14.57 ± 3.38 | 19.53 ± 2.27 | 22.43 ± 2.13 | 24.75 ± 3.25 | |
| 20 | 22.36 ± 4.46 | 28.76 ± 3.92 | 33.18 ± 3.19 | 38.49 ± 4.28 | |
| سورافينيب + جيمسيتابين | 1.5 + 5 | 14.13 ± 2.16 | 26.41 ± 3.43 | 37.75 ± 4.75 | 22.04 ± 2.84 |
| 3 + 10 | 38.69 ± 3.94 | 46.26 ± 4.06 | 71.23 ± 6.76 | 62.47 ± 7.20 | |
| 4.5 + 15 | 40.89 ± 4.21 | 74.30 ± 6.98 | 84.82 ± 9.17 | 66.89 ± 7.16 | |
| 6 + 20 | 64.05 ± 6.54 | 80.67 ± 9.79 | 92.22 ± 10.24 | 81.05 ± 9.87 | |
الجدول 1: معدل التثبيط (%) للسورافينيب والجمسيترابين على خلايا HepG2. يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب مستقلة.
| مجموعة (μmol/L） | وقت المعالجة (ساعة) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| سورافينيب+جيمسيتابين | 1.5 + 5 | 0.91 | 0.96 | 1.04 | 0.87 |
| 3 + 10 | 1.26 | 1.17 | 1.35 | 1.28 | |
| 4.5 + 15 | 0.93 | 1.11 | 1.13 | 1.02 | |
| 6 + 20 | 1.09 | 1.05 | 1.12 | 1.06 | |
الجدول 2: q-قيمة التأثير التآزري لسورافينيب وجيمسيتابين على خلايا HepG2. q > 1.15 تشير إلى التآزر؛ 0.85–1.15 تشير إلى التأثير الإضافي؛ q < 0.85 تشير إلى التضاد. البيانات مستمدة من ثلاث تجارب مستقلة.
الشكل التكميلي 1: أُجريت الدراسة على مرحلتين رئيستين: تجارب in vitro باستخدام الخط الخلوي HepG2 وتجارب in vivo باستخدام نموذج طعم غريب في فئران NOD/SCID. وفي تجارب in vitro، عولجت خلايا HepG2 بعقار sorafenib، أو gemcitabine، أو مزيج منهما بتركيزات مختلفة. وقُيم تكاثر الخلايا باستخدام مقايسة MTT، كما حُلل تعبير ERK وp-ERK عن طريق لطخة ويسترن. أما في تجارب in vivo، فقد تم إنشاء نموذج طعم غريب عن طريق الحقن تحت الجلد لخلايا HepG2 في فئران NOD/SCID. وقُسمت الفئران إلى أربع مجموعات علاجية وتلقت حقناً يومية داخل الصفاق. وقيس حجم الورم طوال فترة العلاج. وبعد القتل الرحيم، جُمعت أنسجة الورم وأُخضعت لصبغ كيميائي نسيجي مناعي لبروتين VEGF. وحُللت جميع البيانات إحصائياً باستخدام برنامج SPSS 19.0.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: Raw data.rar.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
يتسم سرطان الكبد بمعدل وفيات مرتفع نظراً لبدايته الخفية، وتطوره السريع، وقلة العلاجات الفعالة3,15. وغالباً ما يظهر سرطان الكبد المتقدم مقاومة للعلاج الكيميائي والإشعاعي، وتظل الخيارات الحالية، بما في ذلك الاستئصال الجراحي وزراعة الكبد، غير كافية15,16. وقد تم تطوير دمج عقارين أو أكثر من أدوية العلاج الكيميائي ذات آليات عمل مختلفة بشكل جيد، وكان يُعتقد أنه يزيد من الكفاءة بشكل كبير، مما قد يمثل استراتيجية بديلة لعلاجه15,16. وتشمل الأدوية الموجهة لأبحاث سرطان الكبد الأجسام المضادة أحادية النسيلة (anti-VEGF و anti-EGFR)، ومثبطات تيروسين كيناز، ومثبطات mTOR، ويتمثل التحدي الرئيسي في التكامل الأمثل للأدوية الموجودة لتحقيق تحسينات في البقاء على قيد الحياة بشكل عام وفي جودة الحياة17. وإذا تم استكشاف مزيج من الأدوية الفعالة ومنخفضة السمية، فقد يساعد ذلك في التغلب على القيود الحالية في علاج سرطان الكبد. وقد أشار نموذج خلوي حديث أظهر مقاومة كيميائية لعقار gemcitabine إلى إمكانية إعادة تحسيسه لـ gemcitabine/sorafenib (مثبطات EGFR)14. وتثير هذه النتيجة اهتمامنا الكبير لأنها موضوع علمي لم يتم استكشافه بعد. وقد حدد تصميم عاملي جزئي المزيج الأمثل من ثلاثة أدوية وهو gemcitabine (1.4 mmol/L)، و sorafenib (0.03 mmol/L)، و S-1 (0.185 mmol/L)، والذي يثبط بشكل كبير تكاثر سرطان القنوات الصفراوية (CCA) ونمو الورم عن طريق كبح مسار AKT/mTOR وتحفيز الموت الخلوي المبرمج18. وأظهر Awasthi وزملاؤه أن sorafenib ثبط فسفرة بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MEK)، و ERK1/2، وبروتين S6 كيناز الريبوسومي 70 kDa (p70S6K)، والبروتين المرتبط بـ 4E رقم 1 (4EBP-1) في خلايا سرطان القنوات البنكرياسية الغدي (PDAC)، بالإضافة إلى تثبيط تكاثر الخلايا؛ وعند دمجه مع gemcitabine، أظهر تأثيرات تآزرية مضادة للتكاثر ومحفزة للموت الخلوي المبرمج في خلايا مختلفة، مما أدى إلى إطالة فترة بقاء الحيوانات الحاملة للأورام بشكل كبير19. كما يعمل العلاج المشترك بـ gemcitabine و sorafenib على تثبيط عملية التحول الظهاري الميزنكيمي، بالإضافة إلى كبح تكاثر وهجرة وغزو خلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، وتحفيز توقف الدورة الخلوية والموت الخلوي المبرمج20. ومع ذلك، وبحدود علمنا، تعد هذه الدراسة الأولى التي تختبر هذا المزيج تحديداً في نموذج in vitro ونموذج طعم أجنبي تحت الجلد من سرطان الخلايا الكبدية القائم على خلايا HepG2.
هدفت هذه الدراسة إلى سد هذه الفجوة من خلال استقصاء تأثيرات الجمع بين السورافينيب (sorafenib)، وهو مثبط كيناز متعدد الأهداف، والجمسيتابين (gemcitabine)، وهو نظير للسيتيدين، على سرطان الكبد in vitro و in vivo. في هذه الدراسة، أظهر كل من السورافينيب والجمسيتابين بمفردهما تأثيرات مثبطة على تكاثر خلايا HepG2، وكان التأثير المثبط للجمع بين الدوائين أقوى بكثير من تأثير الدواء الواحد، مما يشير إلى تأثير تراكمي. ومع ذلك، لا يمكن لاختبار MTT بمفرده التمييز بين التأثيرات الموقفة للخلايا (توقف النمو) والتأثيرات السامة للخلايا (موت الخلايا)، كما أنه لا يوفر دليلاً مباشراً على آليات مضادة للتكاثر. ومن بينها، كانت قيمة q- لمجموعة الجمع بين السورافينيب 3 µmol/L + الجمسيتابين 10 µmol/L أكبر من 1.15 عند كل نقطة زمنية، مما يظهر تأثيراً تآزرياً. لم يؤدِّ السورافينيب والجمسيتابين، سواء بمفردهما أو في توليفة، إلى تغيير ملحوظ في تعبير ERK في خلايا HepG2، ولكن السورافينيب بمفرده وفي التوليفة ثبط بشكل ملحوظ تعبير p-ERK. وقد ثبط الجمع بين الدوائين فسفرة ERK في خلايا HepG2 بشكل تراكمي. وتشير هذه البيانات إلى وجود ارتباط بين انخفاض p-ERK والتأثير المضاد للتكاثر للتوليفة، على الرغم من عدم إثبات العلاقة السببية. لم يكن التآزر خاصية عامة للتوليفة عبر جميع الظروف المختبرة، بل لوحظ فقط عند نسبة تركيز محددة واحدة. وأظهرت نتائج الكيمياء النسيجية المناعية من نموذج طعم سرطان الكبد الغريب في فئران NOD/SCID أن الجمع بين السورافينيب والجمسيتابين يمكن أن يقلل بشكل ملحوظ من تعبير VEGF ويقلص حجم الورم. ومع ذلك، ونظراً لعدم جمع بيانات السمية أو وزن الجسم بشكل منهجي، لا يمكننا استبعاد احتمال أن يكون تقليل حجم الورم ناتجاً جزئياً عن المراضة الناجمة عن الدواء بدلاً من التأثيرات النوعية المضادة للأورام. ارتبط الجمع بين السورافينيب والجمسيتابين أيضاً بانخفاض تعبير VEGF في أنسجة الورم، كما ظهر من خلال الكيمياء النسيجية المناعية. تشير هذه الملاحظة إلى تأثير محتمل مضاد لتكون الأوعية الدموية، ولكن تفتقر الدراسة إلى دليل مباشر على انخفاض التوعية الدموية (على سبيل المثال، تحليل كثافة الأوعية الدقيقة). لذلك، تظل مساهمة تثبيط VEGF في التأثير المضاد للتكاثر الملحوظ مجرد علاقة ارتباطية. يشير هذا التأثير التآزري إلى أن العلاج المركب قد يتغلب على قيود العلاجات أحادية العامل، والتي غالباً ما تؤدي إلى مقاومة الدواء وفشل العلاج. ويعد تحديد الجرعة المثالية من التوليفة بين السورافينيب والجمسيتابين خطوة حاسمة نحو التطبيق السريري لنظام العلاج هذا.
قد تكون الآليات الجزيئية الكامنة وراء التأثير التآزري لكل من سورافينيب وجيمسيتابين مرتبطة بتثبيط مسار ERK، كما يشير الانخفاض الملحوظ في تعبير p-ERK في مجموعة العلاج المشترك. ومن المعروف أن مسار ERK يلعب دوراً حاسماً في تكاثر الخلايا وبقائها وتكون الأوعية الدموية، مما يجعله هدفاً رئيسياً لعلاج السرطان. وتشير النتائج إلى أن العلاج المشترك قد يعطل مسار ERK بشكل أكثر فعالية من العلاجات أحادية الدواء، وهو ما يرتبط بانخفاض أكبر في تعبير p-ERK مقارنة بالعلاج الأحادي. كما تعزز الدراسات التي أجريت In vivo على نموذج فئران NOD/SCID الفوائد العلاجية المحتملة للعلاج المشترك؛ حيث لاحظنا انخفاضاً معنوياً في حجم الورم وانخفاض تعبير VEGF في مجموعة العلاج المشترك. ويعد VEGF محركاً رئيسياً لتكون الأوعية الدموية في سرطان الخلايا الكبدية (HCC)، ويرتبط تثبيطه بتقليل نمو الورم وانتشاره. ويتوافق انخفاض تنظيم VEGF استجابةً للعلاج المشترك مع الفرضية القائلة بأن هذا النظام العلاجي قد يعدل عمليات تكون الأوعية الدموية؛ ومع ذلك، لم يتم تقييم الدليل المباشر على نشاط مضاد لتكون الأوعية الدموية في هذه الدراسة. إن الارتباط الملاحظ بين انخفاض تعبير p-ERK والتأثير المضاد للتكاثر الناتج عن العلاج المشترك يعد مؤشراً ولكنه لا يثبت وجود آلية سببية. وبما أن تحليل Western blot قد أُجري فقط في نقطة زمنية واحدة بعد تعريض طويل للأدوية، فإنه لا يمكنه رصد التغيرات الديناميكية المبكرة في فسفرة ERK. علاوة على ذلك، فإن غياب القياس الكمي للكثافة الضوئية، والإحصائيات على مستوى المكررات، والمعايرة بالنسبة إلى إجمالي ERK وضوابط التحميل، يحد من إمكانية التفسير. وبالتالي، في حين يرتبط انخفاض p-ERK بالعلاج المشترك، فإن مسألة ما إذا كان تثبيط مسار ERK يتوسط بشكل مباشر التأثير التآزري تظل غير مثبتة بالبيانات الحالية. وتتوافق هذه الرؤية الآلية مع الاستراتيجيات الناشئة التي تستهدف المسارات المتوازية أو التعويضية للتغلب على المقاومة في سرطان الخلايا الكبدية (HCC).
بينما تقدم هذه الدراسة رؤى قيمة حول التأثيرات الإضافية المحتملة لعقاري sorafenib وgemcitabine على سرطان الكبد، يجب الإقرار بعدة قيود في هذه الدراسة. أولاً، حجم العينة في هذه الدراسة صغير نسبياً، مما قد يحد من إمكانية تعميم النتائج. لذا، ستكون هناك حاجة إلى دراسة أترابية أكبر لتأكيد فعالية وسلامة العلاج المركب عبر مجموعة أكثر تنوعاً من المرضى. ثانياً، استخدمت هذه الدراسة خط خلايا HepG2، وهو نموذج معتمد جيداً لأبحاث سرطان الكبد ولكن قد لا يعكس بشكل كامل التغاير الموجود في سرطان الكبد لدى المرضى. فقد تستجيب الأنواع الفرعية المختلفة لسرطان الكبد والخلفيات الجينية المختلفة بشكل متفاوت للعلاج المركب. وبناءً على ذلك، قد لا تكون النتائج المذكورة هنا قابلة للتعميم على جميع أنواع سرطان الكبد، ويصبح التحقق باستخدام خطوط خلايا إضافية (مثل Huh7 [خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشري] و PLC/PRF/5 [خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشري، والمعروف أيضاً بخلايا Alexander]، أو الطعوم الغريبة المشتقة من المرضى) ضرورياً قبل استخلاص استنتاجات أوسع. ثالثاً، أُجريت تجارب in vivo باستخدام نموذج فئران NOD/SCID، والتي تفتقر إلى جهاز مناعي، وبالتالي لا تمثل بشكل كامل البيئة الدقيقة المعقدة للتفاعل بين الورم والجهاز المناعي في سرطان الكبد البشري. لذا، يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية نماذج فئران ذات كفاءة مناعية أو أنظمة بشرية لفهم الجوانب المناعية للعلاج بشكل أفضل. رابعاً، لم تقيم هذه الدراسة ملف السمية أو السلامة للمزيج بين sorafenib وgemcitabine؛ حيث لم يتم جمع بيانات حول تغيرات وزن الجسم، أو سمية الأعضاء (مثل اختبارات وظائف الكبد والكلى)، أو الأعراض الجانبية في فئران NOD/SCID. وبالتالي، لا يمكن استخلاص استنتاجات بشأن سلامة أو تحمل هذا المزيج من البيانات الحالية. خامساً، يُعد الادعاء بشأن التأثير المضاد لتكون الأوعية الدموية أولياً ولا ينبغي المبالغة في تفسيره. ورغم انخفاض تعبير VEGF بشكل نوعي، إلا أننا لم نجرِ أي تحليل كمي للكيمياء النسيجية المناعية (IHC) (مثل H-score، أو النسبة المئوية للمساحة الموجبة، أو كثافة التلوين، أو تحليل الصور الرقمية المعمى عبر حقول متعددة لكل ورم). علاوة على ذلك، لم نقيم كثافة الأوعية الدقيقة باستخدام علامات بطانية مثل Cluster of Differentiation 31 (CD31) أو endomucin، كما لم نجرِ فحوصات وعائية وظيفية. لذا، فإن بيانات VEGF الحالية لا تثبت بشكل مباشر انخفاض تكون الأوعية الدموية؛ بل تظهر فقط انخفاضاً ارتباطياً في مستويات بروتين VEGF. سادساً، يعاني التحليل الإحصائي من عدة قيود؛ فقد تم قياس حجم الورم بشكل متكرر في نفس الفئران على مدار 20 يوماً، ولكننا استخدمنا اختبار one-way ANOVA فقط على أحجام نقطة النهاية بدلاً من استخدام repeated-measures ANOVA أو نموذج mixed-effects الذي يأخذ في الاعتبار الارتباط الزمني. كما لم يتم اختبار التوزيع الطبيعي وتجانس التباين بشكل رسمي. علاوة على ذلك، بينما حددت هذه الدراسة ارتباطاً بين انخفاض تعبير p-ERK والتأثير الإضافي المضاد للتكاثر لـ sorafenib وgemcitabine، لا يمكن استنتاج السببية من هذه البيانات. ويواجه تحليل Western blot عدة قيود إضافية: (1) تم فحص نقطة زمنية واحدة متأخرة فقط (72 h)، في حين أن فسفرة ERK هي حدث تأشيري مبكر وعابر؛ (2) عُرضت لطخات ممثلة دون قياس كثي أو تحليل إحصائي عبر مكررات بيولوجية مستقلة؛ (3) لم يتم تطبيع p-ERK بالنسبة لـ ERK الكلي، كما لم يتم تطبيع ERK الكلي باستمرار بالنسبة لضابط تحميل بطريقة كمية. وبناءً على ذلك، فإن هذه البيانات وصفية في المقام الأول وتعمل على توليد الفرضيات. إن التحقق الميكانيكي الحاسم يتطلب تجارب إنقاذ (مثل التنشيط التأسيسي لـ ERK عبر MEK طافر أو استخدام منشطات ERK) لاختبار ما إذا كان استعادة مستويات p-ERK يقلل من التأثير المضاد للتكاثر للمزيج. ويتمثل القيد الرئيسي في غياب التحقق الجزيئي العميق؛ إذ لم نفحص p-VEGFR، أو p-AKT، أو علامات الموت الخلوي المبرمج. كما أن بيانات مسار ERK وصفية ولا تثبت السببية. لذا، فإن الدراسات المصممة خصيصاً لتوضيح الآلية الكامنة مطلوبة قبل استخلاص أي استنتاجات ميكانيكية. وبالمثل، يمكن أن يساعد تثبيط ERK بوساطة siRNA أو المثبطات الدوائية التي تستهدف المنظمات العلوية (مثل مثبطات MEK) في تحديد ما إذا كان التأثير الملحوظ يعتمد بالفعل على ERK. كانت تجارب التحقق هذه خارج نطاق هذه الدراسة الأولية ولكنها تمثل اتجاهاً حاسماً للأبحاث المستقبلية. كما أن المسارات الرئيسية الأخرى المشاركة في تكاثر الورم وبقائه، مثل PI3K/AKT أو العوامل المصبة ذات الصلة، لم يتم استكشافها وقد تساهم أيضاً في التأثيرات الملحوظة. إن النتائج المتعلقة بتعبير VEGF في هذه الدراسة أولية وتولد فرضيات؛ حيث يوفر انخفاض التلوين المناعي لـ VEGF دليلاً مهماً على التعديل المحتمل لمسارات تكون الأوعية الدموية، ولكنه ليس دليلاً قاطعاً على وجود آلية مضادة لتكون الأوعية. ونحن نحذر القراء صراحة من أن IHC لـ VEGF وحده، خاصة بدون قياس كمي أو علامات وعائية مؤيدة، لا يمكنه إثبات آلية مضادة لتكون الأوعية الدموية. ويعد غياب تحليل علامات الخلايا البطانية والوظيفة الوعائية أحد القيود الرئيسية لهذه الدراسة. وبالتالي، هناك حاجة إلى تحليل أكثر شمولاً لمسارات التأشير المشاركة، بما في ذلك الدور المحتمل للكينازات الأخرى وعوامل تكون الأوعية الدموية، للفهم الكامل لآلية عمل العلاج المركب.
تم تحسين الإجراءات الموضحة هنا لخلايا HepG2 وفئران NOD/SCID. وقد تختلف إمكانية تكرار النتائج باختلاف الخطوط الخلوية أو سلالات الفئران. وتشمل العوامل الرئيسية التي تؤثر على إمكانية تكرار النتائج ما يلي: (1) عدد ممرات الخلايا (استخدم ممرات أقل من 20)؛ (2) وقت تحضين MTT (يتم توحيده عند 4 h بالضبط)؛ (3) أرقام تشغيلات الأجسام المضادة (يتم تسجيلها لكل تجربة)؛ و(4) تدريب مشغل الفرجار (استخدام نفس المشغل المتعامل بنظام التعمية طوال فترة التجربة). نوصي المستخدمين بإجراء تجارب ضابطة إيجابية (على سبيل المثال، استخدام sorafenib بمفرده بتركيز 6 µmol/L) للتحقق من صحة إعداداتهم قبل اختبار المجموعات المدمجة.
أظهرت هذه الدراسة من خلال تحليل لطخة وسترن (Western blotting) أن العلاج المركب من سورافينيب (sorafenib) وجيمسيتابين (gemcitabine) خفّض بشكل ملحوظ تعبير p-ERK في خلايا HepG2، مما يشير إلى تعديل في مسار إشارات ERK؛ ومع ذلك، فإن هذه البيانات نوعية ولا تثبت وجود علاقة سببية. يُستخدم p-ERK على نطاق واسع كعلامة وظيفية لتنشيط مسار ERK، وعادةً ما يُفسر انخفاض تنظيمه كمؤشر على تراجع نشاط المسار(11). وعلى الرغم من أننا لم نقم بالكشف عن التغيرات النسخية للجينات المستهدفة في المصب (مثل c-Fos وc-Myc) باستخدام تقنية RT-PCR، فإن الانخفاض الملحوظ في p-ERK يوفر دعماً ارتباطياً لمشاركة مسار ERK، بدلاً من تقديم دليل ميكانيكي مباشر. يمكن للدراسات المستقبلية أن تكشف بشكل أكبر عن تفاصيل التنظيم لشبكة ERK في المصب من خلال تحليل الترانسكريبتوم أو qPCR المستهدف، مما يعزز فهم آلية العلاج المركب. بالإضافة إلى ذلك، ركزت هذه الدراسة على التأثيرات قصيرة المدى للعلاج المركب، لذا تبرز الحاجة إلى دراسات طويلة المدى لتقييم استدامة الاستجابة، والتطور المحتمل للمقاومة، والسميات المتأخرة المرتبطة بالعلاج. وأخيراً، لم يستكشف هذا البحث إمكانية دمج سورافينيب وجيمسيتابين مع استراتيجيات ناشئة أخرى، مثل العلاج المناعي أو العلاجات المستهدفة الأخرى، والتي قد تؤدي إلى تعزيز آثار العلاج. يجب أن تبحث الأبحاث المستقبلية في تركيبات متعددة الأدوية لتطوير أنظمة علاجية أكثر فعالية لسرطان الكبد. وباختصار، بينما تشير هذه الدراسة إلى تأثير تآزري واعد لسورافينيب وجيمسيتابين في سرطان الكبد، يجب تفسير هذه النتائج في سياق قيود الدراسة. هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث للتحقق من هذه النتائج وترجمة هذه الرؤى إلى نتائج سريرية محسنة وتقييم الآثار الجانبية المحتملة لدى مرضى سرطان الكبد.
وفي الختام، تقدم هذه الدراسة أدلة أولية على أن الجمع بين sorafenib وgemcitabine يظهر نشاطاً مضاداً للتكاثر ويرتبط بانخفاض تعبير VEGF في خلايا HepG2 وفي نموذج طعم خارجي لفئران NOD/SCID. ومع ذلك، فإن بيانات VEGF هي بيانات نوعية ولا تثبت بشكل مباشر وجود تأثيرات مضادة لتكون الأوعية الدموية؛ لذا، فإن أي ادعاء بوجود نشاط مضاد لتكون الأوعية الدموية يظل غير مثبت في هذه المرحلة. وعلى الرغم من أن البيانات تظهر ارتباطاً بين انخفاض تعبير p-ERK والتأثير المضاد للتكاثر لهذا المزيج، إلا أن الآليات المسببة لا تزال بحاجة إلى تحديد. وبالنظر إلى قيود تحليل Western blot المذكورة هنا، يظل الدور الميكانيكي لمسار ERK في هذا المزيج تخمينياً في هذه المرحلة. إن الجمع بين sorafenib وgemcitabine يستدعي مزيداً من الاستقصاء، بما في ذلك تجارب إنقاذ المسار والاختبار في نماذج إضافية لسرطان الكبد، لتحديد ما إذا كان تثبيط مسار ERK هو بالفعل وسيط رئيسي للتآزر الملحوظ. كما ستحتاج الأهمية السريرية لإضافة gemcitabine إلى sorafenib إلى التقييم مقابل المعايير الحديثة في الدراسات قبل السريرية والسريرية المستقبلية، خاصة في سياق الأورام المقاومة لـ sorafenib أو في الحالات التي يظل فيها sorafenib خياراً سريرياً.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
ليس لدى المؤلفين أي شكر وتقدير.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نظام التصوير الرقمي للهلام | Bio-Rad Laboratories, Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية | 1708280 | |
| وسط DMEM عالي الجلوكوز | HyClone، الولايات المتحدة الأمريكية | SH30243.01 | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة لـ ERK من الأرنب | سانتا كروز، الولايات المتحدة الأمريكية | sc-94 | |
| مصل جنين البقر | شركة Zhejiang Tianhang Biotechnology المحدودة، الصين | 11011-8611/11011-8615 | |
| مجهر فلوري مقلوب | Olympus، اليابان | IX73 | |
| جسم مضاد متعدد النسائل للأرنب ضد GAPDH | سانتا كروز، الولايات المتحدة الأمريكية | sc-25778 | |
| جيمسيتابين | شركة إيلي ليلي (Eli Lilly and Company) | 95058-81-4 | |
| جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد للأرنب | شركة شنغهاي شنغغونغ للهندسة البيولوجية المحدودة، الصين | D111018 | |
| برنامج ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية | الإصدار 1.8.0_112 | |
| قارئ الأطباق الدقيقة | Thermo Fisher Scientific Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية | MK3 | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة من الأرنب لـ p-ERK | سانتا كروز، الولايات المتحدة الأمريكية | 9106 | |
| جهاز طرد مركزي مبرد | شركة تشانغشا شيانغي لأجهزة الطرد المركزي المحدودة (Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.) | DL-5M | |
| محلول التحلل RIPA المنظم | معهد بييونتيان لأبحاث التكنولوجيا البيولوجية، الصين | P0013B | |
| ميكروتوم دوراني | Leica، ألمانيا | CM3050 | |
| سورافينيب | شركة Bayer، ألمانيا | 284461-73-0 | |
| تيازوليل بلو (MTT) | Sigma، الولايات المتحدة الأمريكية | M5655 | |
| حضانة ثلاثية الغازات | Thermo Fisher Scientific Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية | 51026402 | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة من الأرانب لـ VEGF | BioLegend، الولايات المتحدة الأمريكية | B199116 |
المراجع
- Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
- Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
- Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
- Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
- Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
- Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
- Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
- Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
- Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
- Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
- Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
- Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
- Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
- Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
- Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
- Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
- Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
- Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
- Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
- Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.