يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد الخلايا العصبية GABAergic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان باستخدام تعبير ASCL1/DLX2 المحفز على دوكسيسيكلين عند AAVS1

86 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71804

⸱

يوليو 31, 2026

 , 
1Centre de recherche Azrieli du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neurosciences, Universite de Montreal

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد الخلايا العصبية GABAergic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان عن طريق دمج الجينات المحسنة القادرة على تحفيز الدوكسيكلين في موقع الملاذ الآمن AAVS1. يوفر التعبير المستقر والمتجانس للجينات المنقولة نهجا فعالا للتمايز المباشر إلى الخلايا العصبية GABAergic مع الحد من كتم الجينات المحولة، وهي مشكلة شائعة في طرق الفيروسات العدسية.

الملخص

توفر الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان (hiPSCs) فرصة غير مسبوقة لنمذجة الأمراض العصبية البشرية في المختبر. التوليد الموثوق لمجموعات عصبية محددة، مثل الخلايا العصبية حمض غاما-أمينوبيوتيريك (GABAergic)، ضروري لهذه الدراسات. يوضح هذا البروتوكول طريقة قوية لتمييز الخلايا العصبية العالية إلى خلايا GABAergic باستخدام نظام محفز للدوكسيسيكلين. يعتمد هذا النهج على التكامل المستقر للجينات المحولة التي تشفر عوامل النسخ ASCL1 وDLX2 في موقع تكامل الفيروسات المرتبط بالأدينو 1 (AAVS1.) عبر نقطة اتصال بوساطة CRISPR/Cas9. هذا التكامل المستهدف يتجنب كتم الجينات المنقولة التي غالبا ما تلاحظ مع التكامل العشوائي للفيروسات العدسية. يغطي البروتوكول صيانة الخلايا الدقيقة الفائقة للجينات، وعملية النوى لدمج الجينات المعدلة، واختيار البيوروميسين لإثراء الخلايا الهندسية بنجاح، وإجراء التمايز خطوة بخطوة. عند التحفيز بالدوكسيسيكلين، تخرج الخلايا العضلية المهندسة بسرعة من دورة الخلية، وتكتسب شكل الخلايا العصبية، وتعبر عن علامات النسب GABAergic خلال 21 يوما. تشمل الخطوات الرئيسية التحفيز العصبي والنضج اللاحق باستخدام عوامل نمو محددة، بالإضافة إلى طرق محتملة لتحسين التصاق الخلايا أثناء النضج. تنتج هذه الطريقة الموحدة مجموعات غنية من الخلايا العصبية المستحثة التي تعبر عن علامات النسب GABAergic، مما يوفر أداة قيمة لأبحاث علم الأعصاب ونمذجة الخلايا.

المقدمة

توفر الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان منصة فريدة لنمذجة الأمراض العصبية البشرية في المختبر. ولدراسة الآليات الجزيئية المعقدة التي تدفع التطور والانحلال1. تمكن هذه التقنية من توليد نماذج خلوية خاصة بالمريض للتحقيق في مجموعة واسعة من الحالات، بدءا من الشذوذات العصبية المبكرة في اعتلاليات الهديةالملازمية 2 إلى التغيرات الجينومية الطفيفة التي لوحظت في مرض الزهايمر المتقطع3. وبالتالي، أصبح التمايز الموجه لخلايا hiPSC حجر الأساس في علم الأعصاب الجزيئي الحديث.

لالتقاط تفاصيل العمليات العصبية البشرية بفعالية، فإن توليد أنواع عصبية نقية ومحددة للغاية أمر ضروري. على سبيل المثال، تتطلب مجموعات عصبية محددة توضيح الأدوار النسخية المحددة للبروتينات مثل MECP2 في الخلايا العصبية البشرية4، أو لتقييم الضعف المستهدف للخلايا العصبية الحسية الطرفية للعدوى الفيروسية، مثل SARS-CoV-25. علاوة على ذلك، فإن بناء بيئات دقيقة معقدة ذات صلة فسيولوجية، مثل دمج الخلايا الدبقية الصغيرة الوظيفية في الأعضاء الدماغية ثلاثية الأبعاد، يعتمد بشكل أساسي على التوليد القوي والمتوقعللسلالات العصبية والدبقية المميزة. من بين هذه الأنواع الفرعية، تعد الخلايا العصبية GABAergic ذات أهمية خاصة بسبب دورها المثبط الحاسم في الجهاز العصبي المركزي وتأثيرها على اضطرابات عصبية ونفسية مختلفة.7. الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول موثوق وفعال وقابل للتكرار للتمييز الموجه لخلايا hiPSC إلى خلايا عصبية مستحثة تعبر عن علامات نسب GABAergic. بروتوكولات التمايز الموجهة التقليدية للخلايا العصبية GABAerg، التي تعتمد على جزيئات الإشارات الخارجية، يمكن أن تكون مستهلكة للوقت، ومتغيرة للغاية، وتؤدي إلى تجمعات خلايا غير متجانسة8.

لتجاوز هذه القيود، ظهرت البرمجة المستقبلية بوساطة عامل النسخ كبديل قوي9. يستخدم هذا البروتوكول نظام تعبير محفز بالدوكسيسيكلين لزيادة تعبير عوامل النسخ الشبكية ASCL1 وDLX210. من خلال استهداف هذه الجينات المحولة إلى موقع تكامل الفيروس المرتبط بالأدينو 1 (AAVS1.) باستخدام CRISPR/Cas9، تتجاوز هذه الطريقة المشكلة الشائعة وهي إسكات الجينات المنقولة المرتبطة بدمج الفيروسات العدسيةالعشوائية 10. يتضمن تركيب المتبرع مراسلا فلوريا، مثل mCherry، لمراقبة الخلايا الموجبة للجينات المحولة بعد الاختيار. تهدف هذه الاستراتيجية إلى دعم تعبير أكثر تجانسا للجينات المحولة مقارنة بطرق التكامل العشوائي، رغم أنه يجب التحقق من استقرار التعبير وقابلية إعادة إنتاج التمايز لكل خط هندسي. تولد هذه الطريقة الموحدة مجموعات غنية من الخلايا العصبية المستحثة التي تعبر عن علامات النسب GABAergic خلال حوالي 21 يوما، وهو إطار زمني أقصر من الحدود التقليدية للجزيئات الصغيرة التي تقتربمن 8,10. هذا البروتوكول مناسب جدا للباحثين الذين يحتاجون إلى مجموعات عصبية قابلة للتوسع ومتسقة لتطبيقات لاحقة مثل المجهر عالي المحتوى، أو النسخ الأحادية الخلية، أو الفحوصات الفسيولوجية الوظيفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تحذير: يجب التعامل مع زراعة الخلايا البشرية لسرطان الدم الخفيف كمواد قد تكون خطيرة بيولوجيا بموجب إجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية. إجراء جميع إجراءات زراعة الهيبسك البشرية في خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية معتمدة باستخدام تقنية التعقيم. يجب إزالة جميع النفايات التي تحتوي على خلايا بشرية، أو وسائط مكشوفة للخلايا البشرية، ومواد بلازميد كريسبر/كاس9 وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المحلية قبل التخلص منها. يجب التعامل مع دوكسيسيكلين، بورومايسين، DMSO، وغيرها من المواد الكيميائية باستخدام القفازات وحماية مناسبة للعين والجلد، ويجب التخلص من النفايات وفقا لإجراءات النفايات الكيميائية المؤسسية. يجب التعامل مع مستخلص الغشاء القاعدي (BME) باستخدام تقنية التعقيم وتخزينه على الثلج قبل الاستخدام لمنع البلمرة المبكرة. يجب إجراء تخزين النيتروجين السائل والتعامل بالتبريد باستخدام قفازات تبريدية مناسبة، وحماية للوجه، وحذر لتجنب الحروق الباردة أو انفجار القوارير أثناء الذوبان.

ملاحظة: قبل التحرير الذي يبوط بواسطة CRISPR/Cas9 والتمايز العصبي، يجب أن تستوفي زراعات hiPSC معايير مراقبة جودة محددة مسبقا. يجب تأكيد أن الخلايا سلبية للفطرطرية، وأن تظهر نمط كاريوتايبايل طبيعي أو ملف سلامة جينومية مقبول، وأن تحافظ على تعبير قوي عن علامات تعددية القدرات، بما في ذلك OCT4، SOX2، NANOG، TRA-1-60، و /أو SSEA4. يجب أن تظهر الثقافات شكل مستعمرات hiPSC مضغوط نموذجي، مع نسبة عالية من النوى إلى السيتوبلازم، وحدود مستعمرة محددة، وتمايز عفوي بسيط. يجب استخدام المزارع التي تكاثر بنشاط ضمن نطاق الممر الموصى به فقط، ويجب ألا تتجاوز الخلايا الحد الأقصى المحدد في المختبر، عادة أقل من المقطع 40، ما لم يتم التحقق من خلاف ذلك. يجب استبعاد المزارع التي تظهر ظاهرا غير طبيعي، أو تمايز عفوي مفرط، أو نمو ضعيف، أو تلوث مؤكد، أو أدلة على عدم استقرار جينومي من تجارب التحرير والتمايز. جميع المواد المطلوبة لهذا البروتوكول، بما في ذلك وصفات الوسائط، مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المواد الكيميائية وألواح الزراعة

  1. جهز وسط التجميد بدمج 40 مل من محلول مصل الاستبدال (KOSR) و10 مل من كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
  2. قم بتجانس وسط التجميد عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل 10 مرات. احتفظ بالمحلول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. يتم تخفيف مستخلص الغشاء القاعدي (BME) في وسط دولبيكو المعدل إيغل ميديوم/F12 (DMEM/F12) بتركيز نهائي يبلغ 80 ميكروغرام/مل.
    ملاحظة: قبل التخفيف، تحقق من تركيز محلول الطب الحيوي المستلم باستخدام رقم الدفعة الموجود على موقع البائع.
  4. أضف 1 مل من الكتلة الحيوية المخففة لكل بئر إلى صفيحة ذات 6 آبار. أعد المؤشر الطبي البخاري الأصلي فورا إلى 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.
  5. قم بإمالة الصفيحة لتوزيع المحلول بشكل متساو على كامل سطح الآبار. تأكد من عدم وجود مناطق غير مغطاة.
  6. حضن الطبق لمدة لا تقل عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    ملاحظة: لا يوجد حد أقصى لوقت الحضانة. إذا استمر الحضانة لأكثر من يوم واحد، تأكد من عدم تبخر DMEM/F-12. يمكن إعادة استخدام محلول BME المستخدم في بئر واحد مرة واحدة فقط لتغطية بئر ثان. يجب أن يكون التلاعب بالكهرومغناطيسية الحيوية في درجة حرارة الغرفة قصيرا بسبب سرعة بلمراته.

2. صيانة وتمرير الهيبسكي

ملاحظة: في هذا البروتوكول، يشير وسيط صيانة hiPSC إلى mTeSR plus. mTeSR plus هو الوسط الموصى به للصيانة الروتينية، والمرور، والتعافي بعد النوية، واختيار البورومايسين.

  1. قم بإجراء مرور الخلايا العضلية العالية تقريبا كل 4-6 أيام عندما تصل الخلايا إلى 60٪ من التقاء الجسم.
  2. استنشق وسيط الزراعة من الآبار باستخدام ماصة استنشاق.
  3. أضف 1 مل من ReLeSR إلى البئر وحضن لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  4. استنشق مادة التفكك وحضن الصفيحة لمدة 8 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف بلطف 1 مل من وسط صيانة hiPSC باستخدام ماصة 5 مل. اجمع تعليق الخلية في أنبوب بسعة 50 مل.
  6. اخلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من زيت التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق. تحميل 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة عداد الخلية لتحديد تركيز الخلية القابل للحياة.
  7. استنشق طلاء BME من بئر تم تجهيزه مسبقا. أضف 2 مل من وسط صيانة hiPSC مع مكمل مثبط كيناز ملفوف مرتبط ب Rho (ROCK) (Y-27632؛ 10 ميكرومولار نهائي).
  8. زرع 100,000 مقياس hiPSC في البئر، بهدف تحقيق جدوى >90٪. حرك اللوح بحركة على شكل ثمانية لضمان توزيع متجانس للخلايا.
  9. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  10. بعد 24 ساعة، استبدل الوسط ب 2 مل من mTeSR طازج بالإضافة إلى وسط بدون مثبط ROCK.
    ملاحظة: من المتوقع حدوث تغير مؤقت في شكل الخلية (استطالة الخلية) في وجود مثبط ROCK. تحقق من أن الخلايا تستعيد شكلها المميز بعد إزالتها.

3. تكوين نواة العضلات الخلفية المنخفضة (hiPSC)

  1. مر الخلايا عندما يصل الالتقاء إلى حوالي 60٪.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، حوالي 60٪ من التقاء القارئ يعادل نمو مستعمرات hiPSC النشطة التي تغطي أكثر من نصف سطح البئر، مع وجود مساحة مرئية بين المستعمرات وأقل تمايز تلقائي. يجب ألا تكون المستعمرات متضخمة أو مدمجة بشكل واسع أو تظهر مراكز كثيفة ومتعددة الطبقات في وقت تكوين النواة.
  2. تأكد من تشغيل جهاز النيوليفكشن وإضافة مكمل النيوليفكشن إلى محلول النيوكليوفيكشن P3. حضر دلو ثلج.
  3. أضف 110 ميكرولتر من محلول النيوليفكشن P3 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق موضوع على الثلج.
  4. أضف 1 ميكروغرام من بلازميد كريسبر/كاس9 و1 ميكروغرام من البلازميد المانح الذي يحتوي على الكاسيت القابل للدوكسيسيكلين ASCL1-P2A-DLX2. إلى الأنبوب. اخلط بلطف دون إدخال فقاعات.
  5. جهز لوحة الوجهة عن طريق شفط الميكروفون الطبي من بئرين مطليين. أضف 2 مل من وسط صيانة hiPSC يحتوي على مثبط ROCK لكل بئر، وحضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية.
  6. انفصال الهيPSCs عند التقاء 60٪ من بئر في صفيحة ذات 6 آبار كما هو موضح في الخطوات 2.2 إلى 2.5. انقل التعليق إلى أنبوب معقم وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جرام في درجة حرارة الغرفة.
  7. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في محلول النيوليفكشن P3 الذي يحتوي على 110 ميكرولتر من محلول النوى P3. استخدم المقبض بلطف لتجنب تكون الفقاعات.
  8. انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى درع نووي يوضع على الجليد.
  9. أدخل الكوفيت في جهاز النيوكليوفيكتور وشغل برنامج CB-150 لعضلات hiPSCs.
  10. استرجع الخلايا فورا باستخدام ماصحة باستور بلاستيكية. نقل أحجام متساوية من تعليق الخلية إلى البئرين المعدة مسبقا.
  11. توزيع الخلايا بحركة رقم ثمانية وحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  12. بعد 24 ساعة، استبدل الوسط ب mTeSR بالإضافة إلى وسط يفتقر إلى مثبط ROCK. تحقق من كفاءة التكوين النووي من خلال مراقبة الفلورة إذا كان ذلك مناسبا.

4. اختيار المضادات الحيوية

تحذير: بوروميسين سام. التعامل مع المعدات الوقائية الشخصية المناسبة والتخلص من النفايات وفقا لإرشادات المؤسسات.

ملاحظة: قبل اختيار hiPSCs المعدلة، حدد التركيز الأمثل للبوروميسين لكل خط hiPSC. تم زرع hiPSCs غير معدلة بمعدل 100,000 خلية لكل بئر في صفيحة مغطاة ب BME مكونة من 6 آبار في وسط صيانة hiPSC مع مكمل مثبط ROCK. بعد 24 ساعة، استبدل الوسط بوسط صيانة hiPSC جديد يحتوي على بوروميسين عند 0، 0.2، 0.4، 0.6، 0.8، 1.0، و1.5 ميكروغرام/مل. استبدال الوسط الذي يحتوي على بورومايسين يوميا ومراقبة شكل الخلايا وبقائه بواسطة مجهر برايت فيلد لمدة 5 أيام. يجب أن يستبعد التركيز المختار جميع الخلايا الهيPSC غير المعدلة خلال 3–5 أيام مع تقليل السمية المفرطة. في هذا البروتوكول، يكون التركيز الأمثل للبوروميسين عادة بين 0.4–0.6 ميكروغرام/مل.

  1. انتظر 3 ممرات بعد النوى، عادة حوالي أسبوع إلى أسبوعين حسب معدل التعافي ومعدل النمو، للسماح بفقدان البلازميدات غير المدمجة قبل بدء الانتقاء.
  2. قم بإجراء مرور خلوي وزرع 100,000 خلية في كل بئر.
  3. بعد 24 ساعة، أضف البيوروميسين عند التركيز الذي يحدده منحنى القتل، عادة بين 0.4–0.6 ميكروغرام/مل.
  4. حافظ على اختيار البيوروميسين للمدة المحددة مسبقا، عادة حوالي 5 أيام.
  5. التحقق من صحة المجموعة المختارة باستخدام المجهر الفلوري أو قياس خلوي التدفق لتقدير نسبة الخلايا الإيجابية للمراسل.
    ملاحظة: تابع فقط مع مجموعات مجمعة تظهر تعبيرا متجانسا بشكل عام، ويفضل >80-90٪ من الخلايا الإيجابية للتقرير. إذا ظل تعبير المراسل فسيفسائيا، قم بتوسيع الاختيار، أو تكرار الإثراء، أو فكر في العزل النسخي قبل التمايز.
  6. تأكد من صحة الاستهداف AAVS1 بواسطة PCR الوصلة قبل بدء التمايز العصبي.
  7. عندما يتطلب الأمر التحقق الصارم، تحقق من منتجات PCR بواسطة تسلسل سانجر وقيم عدد النسخ المعدلة بواسطة qPCR أو ddPCR أو اختبار رقم نسخ مناسب آخر.
  8. تقييم التكامل العشوائي باستخدام اختبارات تعتمد على PCR لتسلسلات العمود الفقري للبلازميدات أو تحليل التكامل الجينومي الأوسع، اعتمادا على التطبيق المقصود في مرحلة الانتقال.
  9. تأكد من أن مجموعة hiPSC المختارة لا تزال سالبة للميكوبلازما، وتحتفظ بنمط مستعمرة hiPSC النموذجي، وتحافظ على نمو قوي بعد انتقاء البورومايسين.
  10. إعادة تقييم سلامة الجينوم من خلال التصنيف الكاريوتايبجي، أو مصفوفة SNP، أو اختبار موثق آخر، خاصة عندما تستخدم الخلايا المعدلة لنمذجة الأمراض أو الاختبارات الوظيفية أو الدراسات طويلة الأمد.
  11. تقييم التأثيرات المحتملة خارج الهدف ل CRISPR/Cas9 من خلال التسلسل المستهدف للمواقع المتوقعة أو، عند الحاجة، بأساليب جينومية أوسع.
    ملاحظة: لا تستخدم الثقافات للتمايز إذا أظهرت شكلية غير طبيعية، أو تعافي ضعيف بعد الاختيار، أو تعبير مستمر من مراسلات الفسيفساء، أو تشوهات جينومية مؤكدة، أو فشل في دمج AAVS1 . في هذا البروتوكول، تستخدم مختارات hiPSC الهندسية المختارة كمجموعة سكانية مجمعة ويمكن حفظها بالتجميد قبل تحفيز الدوكسيسايكلين، وبمجرد التعبير عن التقرير، والتحقق من استهداف AAVS1، والشكل، والنمو. الحفظ بالتبريد بعد تحفيز الدوكسيسيكلين أو أثناء نضج الخلايا العصبية ليس جزءا من سير العمل القياسي ويجب التحقق منه تجريبيا قبل الاستخدام.

5. التمايز إلى الخلايا العصبية GABAergic

  1. جهز العدد اللازم من الآبار المطلية بالطب الحيوي. لاحظ أن البذر الجيد في اليوم 0 سينتج بئرا واحدا من الخلايا العصبية GABAergic.
  2. جهز 6.9 مل من وسط الحث العصبي لكل بئر، مع إضافته بالدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام/مل). أضف حجم زائد بنسبة 15٪ لتعويض أخطاء التبخر أو التوصيل.
    ملاحظة: يستخدم دوكسيسيكلين بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل، بدءا من اليوم الصفر، ويحافظ عليه طوال فترة التمايز والنضج. يتم تحضير وسط جديد يحتوي على دوكسيسيكلين عند كل تغيير في الوسط للحفاظ على استحث متسق للجينات المحولة. تم اختيار هذه الجرعة لأنها أنتجت تعبيرا قويا للمراسل وتحويلا عصبيا فعالا في أيدينا. لم يتم إجراء استجابة جرعة رسمية للدوكسيسيكلين في هذا البروتوكول؛ لذلك، قد تختبر المختبرات التي تعتمد الطريقة بشكل تجريبي 0.1–2 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين إذا بدا أن التحفيز المعدل للجينات غير المثالية.
  3. في اليوم 0، قم بفصل الخلايا الهيPSCs الهندسية وزرع 200,000 خلية في الآبار المحضرة المغطاة بالكهنة الحيوية الحيوية. الحضانة عند 37 درجة مئوية.
  4. في الأيام 1 و2 و3، استنشق الوسط وأضف 2 مل من وسط الحث العصبي الطازج الذي يحتوي على دوكسيسيكلين.
    ملاحظة: بحلول اليوم الثالث، يجب أن ينخفض توسع الخلايا بشكل ملحوظ، وقد تبدأ الهياكل الشبيهة بالشغلات. إذا كان هناك حاجة لتأكيد تجريبي لخروج دورة الخلية، يمكن إجراء صبغة مناعة Ki-67 أو دمج EdU/BrdU في اليوم 3–4.
  5. في اليوم الرابع، حضر وسط نضج عصبي يحتوي على عامل عصبي مشتق من الدماغ (BDNF)، وعامل عصبي مشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF)، ونيوروتروفين-3 (NT-3)، كل منها بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل، ودوكسيسيكلين عند 1 ميكروغرام/مل، وPluriSln عند 20 ميكرومومول.
  6. استنشق وسط التحفيز العصبي. أضف بعناية 2 مل من وسط النضج العصبي قطرة قطرة قطرة على طول جدار البئر لتجنب إزعاج الخلايا العصبية الجديدة.
  7. في اليوم السابع، استنشق الوسط وأضف بلطف 2 مل من وسط النضج العصبي الذي يحتوي على النيوروتروفينات والدوكسيسيكلين، مع استبعاد مثبط بقاء الخلايا متعددة القدرات.
  8. للصيانة طويلة الأمد، استبدل وسط النضج العصبي بالكامل كل 3 إلى 4 أيام، مع تعديل التردد بناء على كثافة الخلايا.
    ملاحظة: اليوم 21 هو النقطة النهائية القياسية لتقييم الهوية العصبية GABAergic. بحلول اليوم 21، يجب أن تظهر الخلايا ميزات عصبية GABAergية، بما في ذلك DLX1.وتستمر في نضوج شبكاتها المحورية. تم اختيار كثافة بذور تبلغ 200,000 خلية لكل بئر تجريبيا لإنتاج مستعمرات متباعدة جيدا مع تجنب الاكتظاظ وموت الخلايا المرتبط بالنضج. كثافات تتراوح بين 150,000 و300,000 خلية/بئر متوافقة، مع تفضيل الكثافات المنخفضة للشكل وأعلى كثافات لاستعادة المواد. لتقليل الانفصال، قم بإجراء تغييرات أكثر تكرارا بين نصف ومتوسط باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر عند تدفق منخفض دون إمالة اللوحة. إذا لزم الأمر، يمكن إعادة طلاء الخلايا مرة واحدة بعد تحفيز الدوكسيسيكلين لمدة 3 أيام، قبل إضافة وسط النضج، باستخدام طلاءات محسنة مثل بولي-إل-ليزين/لامينين أو لامينين-521. يجب تجنب المزيد من الانتقال بعد بدء النضج.
  9. يمكن الحفاظ على الثقافات بعد اليوم الحادي والعشرين لنضج مطول إذا بقيت الشبكات متصلة وقابلة للحياة وخالية من المستعمرات الشبيهة ب hiPSC المتزايدة. بعد اليوم 21، قم بإجراء تغييرات نصف متوسطة كل 3-4 أيام باستخدام وسط نضج عصبي جديد يحتوي على الدوكسيسيكلين والعوامل العصبية الغذائية.
    ملاحظة: استخدم الثقافات في الاختبارات اللاحقة بمجرد استقرار شكل الخلايا العصبية وشبكات العصب العصبية، ويكون الانفصال ضئيلا، ولا تكون هناك مستعمرات غير متمايزة مرئية. في أيدينا، تستخدم الثقافات عادة بين اليوم 21 واليوم 35.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يؤدي التطبيق الناجح لهذا البروتوكول إلى زيادة عدد الخلايا العصبية المستحثة ذات الخصائص الجزيئية GABAergic. تعتمد الاستراتيجية على إدخال مستهدف لشريط ASCL1-P2A-DLX2 القادر على تحفيز الدوكسيسيكلين في موقع AAVS1 (الشكل 1A). بعد اختيار الخلايا العصبية العضلية الهندسية، يستخدم تحفيز دوكسيسيكلين لدفع التمايز العصبي الجابا، كما هو موضح في الجدول الزمني الموضح في الشكل 1B. بعد النيوكليوفيكشن واختيار البوروميسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعتمد التوليد الناجح للخلايا العصبية GABAergic بشكل كبير على عدة خطوات حاسمة ضمن هذا البروتوكول. الحفاظ على مستويات عالية الجودة وغير مميزة هو أمر بالغ الأهمية؛ التمايز التلقائي قبل النوى يقلل بشكل كبير من كفاءة التكامل ونقاء الخلايا العصبية في المراحل النهائية8. علاوة على ذلك، فإن تحديد منحنى قتل البوروميسين بدقة أمر ضروري لضمان القضاء الكامل على الخلايا غير المدمجة دون ضغط مفرط على النسخ المصممة بشكل صحيح. خلال مرحلة التمايز، يعد التعامل الحذر واللطيف مع الثقافا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم تقديم الدعم من قبل برنامج التنشيط المبكر لشبكة الخلايا الجذعية الكندية وصندوق UdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine - معهد Imagine en épilepsie de l'enfant. يحظى ثيو رابين بدعم شبكة أوديسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4D-Nucleofector™ Core UnitLonzaAAF-1002Bلإلكتروبورشن/نوكلوفكشن من hiPSCs.
6-well culture platesSarstedt83.3920300لوحات معالجة لزراعة الأنسجة للحفاظ على hiPSCs و التمايز.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)STEMCELL Technologies78005بروتين بشري معاد التركيب للنضج العصبي؛ قم بالتحضير وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدم بتركيز نهائي 10 نانوجرام / ملليلتر.
Cell counter (Countess)Thermo Fisher ScientificC10283يُستخدم لعد الخلايا.
CentrifugeVWR76468-134لتجمع الخلايا.
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i أو ما يعادلهحاضنة زراعة الخلايا التي تحافظ على 37 درجة مئوية، وجو رطب، و5٪ CO2.
CryotubesThermo Fisher Scientific5000-0020قوارير مبردة معقمة للتبريد من hiPSCs؛ قد يتم استخدام أنابيب حفظ بحرية 1.8-2.0 ملليلتر ذات خيوط خارجية.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractBio-TechneBME001-05مصفوفة طلاء BME القياسية المستخدمة في البروتوكول. تحقق من تركيز المخزون الخاص بالدفعة من شهادة تحليل Bio-Techne وقم بتخفيفها في DMEM/F-12 إلى تركيز عملي 80 ميكروجرام / ملليلتر.
DMEM/F-12Wisent319-090-CLالوسط القاعدي المستخدم لتخفيف BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-AldrichD2650مادة حماية من التجمد المستخدمة في تحضير وسط التجميد.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassetteCustom plasmidAddgene accession pendingبلاسموديد AAVS1 مخصص يحتوي على كاسيت ASCL1-P2A-DLX2 المحفز بالدوكسيسيكلين وعناصر الاختيار/التقرير. قم بتوفير خريطة البلاسمود وسلسلة كاملة كملف تكميلي أو عند الطلب.
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891يُستخدم لإحداث التعبير عن ASCL1-P2A-DLX2. قم بتحضير محلول تخزين معقم، وقسم، وحماية من الضوء، والتخزين المجمد، واستخدامه بتركيز نهائي 1 ميكروجرام / ملليلتر.
Ethanol (70%)Commercial Alcohols / Greenfield GlobalP016EAANللتعقيم داخل خزانة السلامة البيولوجية؛ استخدم الإيثانول المعتمد من المؤسسة بنسبة 70٪ أو ما يعادله.
Fluorescence microscopeECHORevolve R4الميكرسكوب المستخدم لتصوير التباين الطور وتصوير الفلورة لتعبير التقارير والمورفولوجيا العصبية.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)STEMCELL Technologies78058بروتين بشري معاد التركيب للنضج العصبي؛ قم بالتحضير وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدم بتركيز نهائي 10 نانوجرام / ملليلتر.
hiPSC line PGP1EditCo BioPGP1 human iPSC lineخط hiPSC المتاح تجاريًا بإذن مفتوح المستخدم في هذا البروتوكول؛ قم بتسجيل رقم الممر وحالة التحكم في الجودة قبل التحرير والتمايز.
Image-analysis softwareImageJ/FijiOpen-source; version used should be reportedلتحديد كمية الفلورة ومعالجة الصور التمثيلية.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)Thermo Fisher Scientific10828028يُستخدم في تحضير وسط التجميد.
Laminin-521STEMCELL Technologies200-0117مكون معالجة إشكالي اختياري فقط. ليس جزءًا من بروتوكول الطلاء القياسي؛ قد يتم استخدامه كبديل أو كقاعدة طلاء مزدوجة إذا استمر فصل الخلايا العصبية.
Liquid nitrogen dewarThermo Fisher ScientificLocator 6 Plus أو ما يعادلهالتخزين طويل الأمد للخلايا المجمدة hiPSCs في مرحلتي البخار أو النيتروجين السائل وفقًا لإجراءات السلامة المجمدة المؤسسية.
Mr. Frosty™ Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001للتجميد بمعدل متحكم فيه للخلايا عند -80 درجة مئوية.
mTeSR™ PlusSTEMCELL Technologies100-0276وسط صيانة hiPSCs بدون خلايا غدية.
Neuro-induction mediumSTEMCELL Technologies08582وسط تحريض عصبي تجاري يستخدم للتحريض العصبي المبكر.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)STEMCELL Technologies05790الوسط الأساسي للنضج العصبي؛ قم بالتكميل باستخدام BDNF، وGDNF، وNT-3، والدوكسيسيكلين، وPluriSln-1 كما هو موضح في البروتوكول.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)STEMCELL Technologies78074بروتين بشري معاد التركيب للنضج العصبي؛ قم بالتحضير وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدم بتركيز نهائي 10 نانوجرام / ملليلتر.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X KitLonzaV4XP-3024مجموعة تحتوي على المحلول P3 والأنابيب لحشو الخلايا hiPSC.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122مضاد حيوي اختياري لتقليل مخاطر التلوث البكتيري.
Plasmocin™ prophylacticInvivoGenant-mppمضاد حيوي اختياري لمنع تلوث المايكوبلازما.
PluriSIn-1STEMCELL Technologies72822مثبط بقاء الخلايا متعددة القدرات للتخلص من الخلايا hiPSCs غير المتمايزة؛ قم بتحضير المخزون وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدم بتركيز نهائي 20 ميكرومولار.
Puromycin DihydrochlorideThermo Fisher ScientificA1113803مضاد حيوي يُستخدم للاختيار؛ قم بتحضير محلول تخزين معقم، وقسم، وتخزين المجمد، وتحديد تركيز العمل النهائي بواسطة منحنى القتل، عادةً 0.4-0.6 ميكروجرام / ملليلتر.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmidAddgene85802بلاسموديد CRISPR / Cas9 المستخدم لتوجيه AAVS1؛ قم بتضمين تسلسل AAVS1 gRNA في خريطة البلاسمود أو المعلومات التكميلية.
qPCR analysis softwareApplied Biosystems / Thermo Fisher ScientificQuantStudio Design & Analysis Software أو ما يعادلهلتحديد Ct وتحليل RT-qPCR؛ قم بالإبلاغ عن إصدار البرنامج المستخدم.
qPCR master mixThermo Fisher ScientificPowerUp SYBR Green Master Mix, A25742لتقدير RT-qPCR لعلامات الخلايا العصبية والغابائية.
qPCR primers: DLX1

المراجع

  1. Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.
  2. Barabino A, Flamier A, Hanna R, Héon E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.
  3. Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer’s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.
  4. Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.
  5. Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).
  6. Wogram E, Sümpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.
  7. Marín O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107–20. PubMed PMID: 22251963.
  8. Yang N, Ng YH, Pang ZP, Südhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.
  9. Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.
  10. Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.
  11. Gu J, Rollo B, Liu Z, O’Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

علوم الأعصابالعدد 233العدد 233قيمة فارغةعددالخلايا الجذعية الجنينية البشرية/الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشريةالتمايزCRISPR/Cas9.

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.