نموذج قائم على سترات الأمونيوم الحديدية لتحميل زائد الحديد مع قراءات مرتبطة بالفيروبتوزيس في الخلايا العضلية C2C12

ملخص

هنا، نقدم نموذج تحميل سريع يعتمد على سترات الأمونيوم الحديدية في بلاستات الميوبلاست C2C12، مما يؤدي إلى تحميل الحديد، وتغيرات جزيئية مرتبطة بالفيروبوتسيس، وفقدان مبكر للقدرة على العيش تجاه الفيروستاتين.

الملخص

الفيروبتوزيس هو شكل يعتمد على الحديد من موت الخلايا المنظم، مرتبط بالشيخوخة والأمراض التنكسية. وجدنا سابقا أن الخلايا الجذعية العضلية المتقدمة في السن تتراكم الحديد داخل الخلية وتخضع للموت الفيروبتوزي عند التفعيل. هنا، نصف نموذجا بسيطا في المختبر يستخدم سترات الأمونيوم الحديدي لتوليد حمل زائد للحديد في بلاستات الميكروبلات C2C12 في الفوار. أدى علاج سترات الأمونيوم الحديدي إلى زيادة عبء الحديد داخل الخلية، كما يتضح من ارتفاع نسخ السلاسل الثقيلة والخفيفة في الفيريتين، وزيادة بروتين الفيريتين، وتعزيز الإشارة من صبغة الحديد الحية المتقلبة. كما أدى التعرض لسترات الأمونيوم الحديدي (FAC) إلى تغييرات جزيئية مرتبطة بالفيروبتوزيس، بما في ذلك زيادة تعبير Slc40a1 وHmox1 وتقليل بروتين الجلوتاثيون بيروكسيداز 4. تم عكس الانخفاض المرتبط ب FAC في جلوتاثيون بيروكسيداز 4 جزئيا بواسطة ديفيروكسامين. عند 12 ساعة، قلل سيترات الأمونيوم الحديدية السامة من حيوية الخلايا، وتم إنقاذ هذا التأثير بواسطة الفيروستاتين-1، بما يتوافق مع مكون حساس للفيروبتوسيس في موت الخلايا. في الفترات الزمنية اللاحقة، يحد من زيادة التباين وانخفاض نطاق ديناميكي الاختبارات قابلية تفسير قياسات الجدوى. لذا، يوفر هذا البروتوكول نموذجا سريعا وقابلا للتوسع لتحميل الحديد بوساطة سترات الأمونيوم الحديدي، يمكن استخدامه لدراسة الاستجابات المرتبطة بالفيروبتوزيس واختبار التدخلات المعدلة للحديد أو الفيروبتوزيس في خلايا العضلات.

المقدمة

الفيروبتوزيس هو شكل من أشكال موت الخلايا المنظمة (RCD)، يختلف جزيئيا عن غيره من أمراض الموت الخلوي. تم اكتشافه لأول مرة باستخدام إيراستين، وهو جزيء صغير قاتل انتقائي لعلاج RAS، والذي وجد أنه يسبب موت الخلايا غير المماتة¹. في عملهم الرائد، وصف ديكسون وآخرون آليتها بأنها تعتمد على الحديد، ومن ثم صاغوا مصطلح الفيروبتوزيس، الذي يعني "السقوط (الموت) بالحديد¹". من الناحية الجزيئية، يظهر الفيروبتوزيس على شكل تراكم مفرط للحديد، وزيادة أكسدة الدهون، وتراكم أنواع الأكسجين التفاعلية، مما يؤدي إلى موت الخلايا². يتميز بشكل فريد عن الإجهاد التأكسدي وأشكال أخرى من RCD باستقلاله عن تنشيط الكاسباز، وهو علامة مميزة للموت المبرمج، وغياب كيناز بروتين متفاعل مع مستقبلات الفسفرة (RIPK3) وإزياز كاذب كيناز (MLKL) المختلط الشبيه بمجال الكيناز، والذي لا يرى إلا في النيكروبتوزيوم³. علاوة على ذلك، يمكن أيضا تخفيف الفيروبتوزيس باستخدام مضادات الأكسدة الدهنية الفيروستاتين-1 والليبروكسستاتين-1، ومخلب الحديد ديفيروكسامين⁴. على الرغم من أن الفيروبتوزيس مشابه لأنواع أخرى من RCD من حيث أن جميعها تؤدي في النهاية إلى موت الخلايا، إلا أن ظهوره يجعله مميزا ميكانيكيا عن الأشكال الأخرى من RCD.

اكتسبت دراسة الفيروبتوزيس زخما خلال العقد الماضي، ويرجع ذلك أساسا إلى الجهود المستمرة في المجال لتحديد علامات جديدة وتطوير أدوات جديدة لدراسة آلياته الأساسية ومساهمته^{في الأمراض البشرية}. تشير مجموعة حديثة من الأدلة إلى أن فرط الحديد والفيروبتوسيس هما من المساهمين غير الدقيقين في الضعف المرتبط بالعمر والساركوبينيا ^6,7,8. أظهرنا مؤخرا أن الخلايا الجذعية العضلية القديمة (MuSCs) عرضة بشكل فريد للموت الفيروبتوزي الناتج عن الالتهاب المزمن الذي يثبط برنامجا جينيا مضادا للأكسدة من خلال إسكات فوق جيني⁹. وجدنا أن MuSCs المتقدمة في السن تتراكم مستوى شاذ من الحديد العنصري داخل الخلية، وهو أعلى بحوالي 30 مرة من نظيرتها البالغة. على الرغم من أن الفيروبتوزيس مرتبط بأمراض عبر عدة أعضاء وأنسجة—وخاصة تلك المرتبطة بالشيخوخة—إلا أن دوره الفسيولوجي لا يزال غير واضح ويستحق المزيد من التحقيق.

بينما أظهرت دراستنا السابقة أن MuSCs المتقدمة في العمر تصبح حساسة للموت الفيروبتوزيكي عند التفعيل، لا يزال المساهمة المحددة لتحميل الحديد في هذا النمط الظاهري بحاجة إلى توضيح. هنا، نضع نموذجا بسيطا لتحميل زائد الحديد في كريمات C2C12 المعالجة بسترات الأمونيوم الحديدي (FAC) ونسأل عما إذا كان الحديد الزائد كافيا لإحداث تغييرات جزيئية مرتبطة بالفيروبتوز وفقدان الصلاحية الحساسة للفيروستاتين. توفر خلايا C2C12 نظام سلف عضلات الفأر منخفض الصيانة، قابل للتوسع، وسهل التوفر¹⁰. نتوقع أن يوفر هذا النهج منصة عملية لدراسة استجابات الإجهاد المدفوع بالحديد في خلايا العضلات ولاختبار التدخلات التي تعدل الأنماط الظاهرية المرتبطة بالفيروبتوسيس.

البروتوكول

1. تحضير خلايا C2C12

1. خلايا الذوبان
   ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات زراعة الخلايا في خزانة أمان حيوي معقمة.
   1. جهز أنبوبا مخروطيا يحتوي على 9 مل من وسط دافئ كامل (وسط Eagle المعدل من Dulbecco مع نسبة عالية من الجلوكوز والبيروفات + 10٪ مصل أبقار جنيني + 1٪ قلم أو حلقية).
   2. إذابة قارورة واحدة من خلايا C2C12 المجمدة (~1 مليون) بإضافة 800 ميكرولتر من الوسط الكامل المسخن مسبقا إلى القارورة من المخزون الرئيسي للوسط. ترفع وتخفض ببطء.
   3. عندما يصبح الوسط المضاف إلى قارورة الذوبان باردا، قم بإزالته ووضعه في الأنبوب المخروطي. استبدلها بنفس حجم الوسائط الدافئة من الأنبوب. استمر في التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا وتبديل الوسائط حتى تعاد تعليق الخلايا المجمدة.
   4. قم بتوصيل محتويات القارورة إلى أنبوب مخروطي من الوسط. اقلب لتخلطه، ثم أضف المحتويات إلى طبق معالج بزراعة الخلايا بحجم 10 سم. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
   5. افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها متصلة. الخلايا المتصلة ستبدو ممدودة، بينما الخلايا العائمة دائرية وتتحرك عند تحرك اللوحة.
      ملاحظة: بافتراض أن الخلايا الملصقة سليمة، يجب أن تكون معظمها متصلة.
   6. استنشق الوسائط لإزالة أي خلايا ميتة أو حطام. استبدلها ب 10 مل من الوسط الدافئ الكامل وارجع إلى الحاضنة. اتركه يحتضن طوال الليل، أو حتى يصل الطبق إلى 80٪ من التلاقط.
2. زرع خلايا C2C12 لعلاج الحديد
   1. بمجرد الوصول إلى نقطة الالتقاء المطلوبة، استنشق من وسط الخلية. أضف 2 مل من PBS بشكل إسقاطي إلى اللوحة، لضمان تغطية السطح بالكامل؛ استنشاق.
   2. أضف 2 مل من 0.25٪ تريبسين إلى الخلايا. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5–10 دقائق، أو حتى تنفصل الخلايا. بمجرد فصلها، ستبدو الخلايا دائرية تحت المجهر، ويصبح التريبسين وتعليق الخلية عكرين وسميكين.
   3. قم بتحييد التربسين بإضافة 8 مل من DMEM الدافئ والكامل. استخدم ماصة مصلية لخلط المحلول جيدا وغسل الطبق. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي.
   4. اقلب الأنبوب بلطف 3–5 مرات. قم بإزالة الحجم المناسب وعد الخلايا باستخدام الطريقة المفضلة (عداد الخلية، مقياس الهيموسيتوميتر، إلخ).
   5. اجعل معلقا من الخلايا كافيا لزرع عدد الآبار/الصفائح المرغوب لكل n = 3 لكل حالة: صفيحة 10 سم (للنقطة الغربية): 100,000 خلية/صفيحة، صفيحة 6 آبار (ل qPCR): 50,000 خلية/بئر، صفيحة ب 96 بئر (للحديد المتغير وصبغ التوضيع): 1,000 خلية/بئر. دع الخلايا تحتضن عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
3. تطبيق معالجة الحديد على الخلايا المزروعة
   1. في يوم العلاج، أضف سترات الأمونيوم الحديدي (FAC؛ الصيغة = C₆H₁₁FeNO₇⁺³؛ ميغاوات = 265 جرام/مول) لإكمال DMEM عند التركيزات التالية تحت ظروف معقمة: شديد: 180 ميكرومولار (0.0477 ملغ/مل)، سام الخلوي: 1,800 ميكرومولار (0.477 ملغ/مل).
      ملاحظة: فكر في إضافة ضوابط أيضا، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، ديفيروكسامين شديد + 150 ميكرومولار (مخلب حديد)، ديفروكسامين مركبة + 150 ميكرومولار، و/أو مركبة + RSL3 (محفز فيروبوتوسيس؛ ضابط إيجابي). بالإضافة إلى ذلك، يجدر بالذكر أن DMEM قد يحتوي على كمية صغيرة من الحديد (III) نترات نونهيدرات، وهو مصدر للحديد الحديدي، في القاعدة الأساسية. يجب على القارئ تفسير تركيزات FAC الموصى بها أعلاه على أنها بالإضافة إلى أي حديد حديد موجود بالفعل في وسط زراعة المركبات.
   2. قم بعكس القرص للخلط حتى يذوب FAC في الوسائط الكاملة.
      ملاحظة: بما أن FAC قابل للذوبان في الماء، فلا حاجة إلى DMSO أو مذيب إضافي. قد يؤدي إضافة FAC إلى تغيير درجة الحموضة في المحلول، لذا إذا لوحظ تغير كبير في لون الوسط، ينصح بقياس الرقم الهيدروجيني لضمان بقاء الخلايا عند إضافة الوسط المعالج إلى الزراعة.
   3. استنشق الوسائط من الخلايا. أضف نفس حجم الوسائط الكاملة المدعمة بالحديد إلى ظروف المعالجة، ووسط كامل غير معالج إلى آبار/ألواح المركبة. الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة العلاج المطلوبة قبل الانتقال إلى الفحص المختار: اختبار الحديد المتقلب: علاج 2 ساعة من FAC، qPCR ونقطة غربية: 12–24 ساعة علاج FAC، اختبار التلميع: 12 ساعة علاج FAC.

2. qPCR

1. عزل mRNA لعملية qPCR
   تحذير: كاشف استخراج الحمض النووي الريبي والكلوروفورم يشكلان مخاطر تنفسية. أمسك فقط بغطاء أبخرة وأنت ترتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات مقاومة للمواد الكيميائية، وحماية للعين).
   1. على المقعد، استنشق الوسائط من الخلايا. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS معقم واسحب أي سائل متبق بعناية.
   2. في غطاء البخار، أضف كاشف استخراج الحمض النووي الريبي إلى الخلايا في الحجم: صفيحة ذات 6 آبار: 250 ميكرولتر/بئر، طبق 10 سم: 1 مل/طبق.
   3. عند العمل على الجليد في غطاء البخار، استخدم مكشطة الخلايا لكشط الخلايا المتحللة بلطف. احرص على كشط جميع أجزاء اللوح جيدا لتعظيم عائد الحمض النووي الريبي.
   4. يتم تحويل الليزات إلى أنابيب ميكروفوج معقمة ومبردة مسبقا وخالية من الحمض النووي الريني. دعهم يجلسون في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   5. لكل مل من مادة الاستخلاص، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم داخل غطاء البخار. اهز العينات بقوة لمدة لا تقل عن 30 ثانية لدمج مادة الاستخراج مع الكلوروفورم. دعهم يجلسون في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: بعد مرور الوقت، يحدث فصل الطور، مع وجود الطور المائي الشفاف (الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي) في الأعلى.
   6. عينات الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جرام عند 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه، قم بوضع علامات على أنابيب جديدة معقومة، وأضف 500 ميكرولتر (لكل مل من مادة الاستخلاص) من الأيزوبروبانول إلى الأنابيب المثبتة على الثلج.
   7. انقل فقط الطور المائي إلى كل أنبوب مقابل. اخلط بلطف عن طريق الانقلاب، ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. إذا كان من المتوقع انخفاض الإنتاج، أضف 2 ميكرولتر من GlycoBlue لرؤية الحبيبة.
   8. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جرام عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قد يكون الحمض النووي الريبي المرسوب، مرئيا، في أسفل الأنبوب.
   9. اسكب بحذر فائض الأيزوبروبانول في كأس نفايات مخصص. أضف 1 مل من الإيثانول الجزيئي بنسبة 100٪ إلى الأنبوب، مع الحذر من إزاحة الحبيبة. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 7,500 × جرام عند 4 درجات مئوية.
   10. اسكب الإيثانول. اقلب الأنابيب واترك الغطاء مفتوحا فوق منشفة ورقية. اترك الحبيبة تجف حتى تصبح خالية من القطرات (~15–30 دقيقة).
       ملاحظة: قد تصبح الحبيبات شفافة إذا لم تضاف جلايكو بلو.
   11. أعد تعليق الحبيبة في 25 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من الحمض النووي الريني. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. تطبيع إلى تركيز منتظم عبر العينات يسمح بحد أقصى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 16 ميكرولتر لكل عينة.
2. تخليق cDNA لعلاج qPCR
   ملاحظة: أكمل جميع الخطوات على الجليد لتعظيم إنتاج RNA/cDNA.
   1. عينات إذابة الجليد. اغسل منطقة العمل بمنظف RNAse.
   2. أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي من كل عينة إلى أنبوب شريط PCR المقابل.
   3. أضف 4 ميكرولتر من خليط cDNA إلى كل أنبوب. إذا لزم الأمر، أضف ماء معقم ليصل إلى حجم إجمالي 20 ميكرولتر. شغل الخلطات تحت معايير الترموسايكر التالية: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية إلى ما لا نهاية.
3. تشغيل qPCR
   1. قم بتخفيف cDNA بنسبة 1:10 في ماء معقم قبل إجراء تفاعلات إضافية.
      ملاحظة: يمكن تجميد الحمض النووي القائم على -20 درجة مئوية لمدة شهر أو -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
   2. تخفيف البرايمرات إلى تركيز 10 ميكرومولار باستخدام ماء معقم. أدرج الضوابط المناسبة و/أو جينات التدبير المنزلي (مثل B2M، TBP1).
   3. اصنع خلطات رئيسية لكل جين وجين صيانة منزلية وجين محل اهتمام بحيث يكون هناك خلطة تفاعل كافية لتشغيل كل حالة DNA بثلاث نسخ. وصفة الخليط الرئيسي (لكل تفاعل) هي كما يلي: 2x خليط PCR: 10 ميكرولتر، برايمر أمامي (10 ميكرومتر): 1 ميكرولتر، برايمر عكسي (10 ميكرومتر): 1 ميكرولتر، ماء معقم: 8 ميكرولتر.
   4. ضع لوحة تفاعل qPCR في كتلة معدنية مبردة بسعة 96 جير. أضف 5 ميكرولتر من cDNA المخفف إلى كل بئر عينة و20 ميكرولتر من خليط التفاعل الرئيسي إلى كل بئر. افحص كل بئر للتأكد من أن جميع الأنواع تحصل على نفس الحجم، غط اللوحة بمادة ختم لللوحة، واستخدم أداة مسطحة لتمليم الفقاعات.
   5. قم بطرد المركزي على اللوحة على 1000 × جرام و4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. ضع اللوحة في جهاز qPCR، مع التأكد من تحميلها في الاتجاه الصحيح.
   6. في برنامج qPCR، حدد هويات العينة والجينات المعنية لكل بئر. فكر في إنشاء قالب إذا كنت تخطط لتشغيل عدة نسخ مكررة بنفس الإعداد.
   7. شغل برنامج qPCR (المدة: ~1:36 ساعة) الموضح في الجدول 1.
   8. تصدير النتائج ك . CSV أو . ملف XLSX. إذا كان جهاز qPCR المستخدم يسمح للمستخدم باختيار القيم التي يجب تصديرها، تحقق من تضمين قيم CT في الملف المصدر.
   9. استخدم متوسط قيم الأشعة المقطعية لكل حالة وجين محل اهتمام—مقارنة بقيم التصوير المقطعي لجينات التدبير المنزلي في الحالة المقابلة—لحساب تغير الطي لكل جين. قم بتطبيع تغير الطي في حالة المركبة إلى 1.0.

3. البقعة الغربية

1. عزل البروتين لمنطقة ويسترن بلوت
   ملاحظة: قم بجميع الخطوات على الثلج لتعظيم إنتاج البروتين.
   1. في خزانة السلامة البيولوجية، استنشق وسائط الزراعة. اشطف الخلايا باستخدام كمية كافية من PBS الباردة لتغطية أسفل لوح الزراعة. استنشق النفس، ثم كرر.
   2. أضف محلول RIPA مع مكافحات مثبط للبروتياز وكوكتيلات مثبطات الفوسفاتاز لمنع تحلل البروتين. استخدم 75 ميكرولتر من محلول RIPA للزراعة في صفيحة ذات 6 آبار، أو 200 ميكرولتر من محلول RIPA في صفيحة بحجم 10 سم.
   3. عند العمل على الثلج، استخدم مكشطة الخلايا لتخفيف الخلايا المتحللة بلطف من اللوحة. انتبه بشكل خاص لإزالة الخلايا من جميع أجزاء اللوحة، بما في ذلك الحواف. سيبدو الحل واضحا ولزجا إلى حد ما.
   4. قم بإدخال نظام تعليق خلايا RIPA إلى أنابيب ميكروفوج مبردة. أخذ عينات الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند أقصى سرعة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة (بروتين الليزات) إلى أنبوب مبرد مسبقا. تخلص من الحبيبة.
   5. قم بقياس تركيز البروتين عن طريق إجراء اختبار برادفورد أو تحليل BCA. تطبيع العينات إلى 1 ميكروغرام/ميكرولتر في مياه نقية غنية بكوكتيل الكوكتيل المثني بالبروتيز والفوسفاتاز على الثلج.
   6. تخفف محللات في مخزن لايملي، مما يضمن تركيزات البروتين النهائية متساوية عبر العينات. اغلي التحلل عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتغيير طبيعة البروتين. للحصول على أفضل النتائج، استخدم البلوتينغ الغربي مباشرة بعد التحضير. وإلا، تخزين البروتينات في Laemmli عند -20 درجة مئوية على المدى القصير (≤ شهر واحد) أو -80 °م على المدى الطويل.
2. تحضير جل الأكريلاميد ل SDS-PAGE
   تحذير: الأكريلاميد هو سم عصبي ويجب التعامل معه فقط عند ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات مقاومة للمواد الكيميائية، وحماية للعين).
   1. حدد البروتينات المعنية وحجم هذه البروتينات من خلال مراجعة موقع الشركة الإلكتروني للأجسام المضادة المستخدمة. استخدم الحجم المتوقع للبروتين(البروتينات) المعنية لتحديد نسبة الأكريلاميد التي يجب أن يكون عليها الهلام.
      ملاحظة: 10٪-15٪ أكريلاميد يعمل جيدا لمعظم الأوزان الجزيئية.
   2. قم بتجميع حامل وإطار الصب الهلامي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. لتحضير الجل المعالج، اجمع بين الأكريلاميد والماء المعقم و1.5 M Tris/HCl pH8.8 و10٪ من كبريتات الصوديوم في أنبوب مخروطي بالحجم المناسب لعدد ونسبة الأكريلاميد للهلام المراد تحضيره، وفقا للجدول 2 الذي يسرد المكونات المطلوبة لجلين. امزج عن طريق الانعكاس.
   4. أضف محلول 10٪ من الأمونيوم وTEMED إلى الخليط. اقلب لمزج.
   5. أضف المحلول فورا إلى إطار الصب الهلامي، واملأ حتى يصبح حجم المحلول في إطار الجل أقل بقليل من الكمية المطلوبة للوصول إلى قاع المشط إذا تم إدخال المشط.
   6. أضف فورا 100–200 ميكرولتر من الإيثانول النقي بشكل قطري فوق جل التقسية. إذا كان هناك حاجة إلى إذابة و/أو تفكيك اللواتي البروتيني، أكمل ذلك خلال فترة الحضانة هذه. إذابة البروتينات على الثلج.
      ملاحظة: هذا سيشتت المحلول بحيث لا يتصلب الجل بشكل غير متساو.
   7. بعد أن تصلب، صب الإيثانول من الخارج. لجل التكديس، اجمع بين الأكريلاميد والماء المعقم ومحلول pH 6.8 بمقدار 0.5 متر تريس/HCl و10٪ من كبريتات الصوديوم الدودسيل في أنبوب مخروطي بالحجم المناسب لعدد ونسبة الأكريلاميد في الجل المراد تحضيره، وفقا للجدول 2، الذي يسرد المكونات المطلوبة لجلين. امزج عن طريق الانعكاس.
   8. أضف محلول البرسلفات 10٪ الأمونيوم وTEMED إلى الخليط. امزج عن طريق الانعكاس.
   9. أضف محلول التكديس فورا إلى إطار الصب الهلامي حتى يصل الحجم إلى الأعلى. أضف مشط الجل فور صب الجل. اترك الحوض لمدة ~1 ساعة أو حتى لا يتغير شكل الآبار عندما يهتز حامل الجل قليلا.
3. الجل الجاري للتحميل
   1. املأ غرفة أو غرف الرحلان الكهربائي بمخزن التمرير إلى خط التعبئة المناسب لعدد الجل المراد تشغيله.
   2. انقل إطار الهلام مع بقاء الأمشاط بداخله إلى غرفة الرحلان الكهربائي. أضف المزيد من المسافة بين الجل حتى يمتلئ ذلك الخزان. اسحب المشط بلطف من الجل المغمور.
   3. مضخة 5–10 ميكرولتر من السلم في بئر واحد من كل جل.
   4. أنبوب 5–20 ميكرولتر من عينات البروتين المستخرج وعينات العزل اللاملي في كل بئر. أضف 5–10 ميكرولتر من 1x مخزن لايملي إلى أي آبار فارغة.
      ملاحظة: قد يتطلب الحجم الذي تضيفه تحسينا بناء على انتشار البروتين أو البروتينات المعنية و/أو فعالية الأجسام المضادة.
4. تشغيل SDS-PAGE
   1. وصل غرفة الرحلان الكهربائي بحزمة طاقة. ضبطت على 150 فولت لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على الإعداد، قد يتطلب الأمر وقتا أطول أو جهد أعلى لحدوث الهجرة الكاملة، لذا قم بتعديل الجهد حسب الحاجة.
   2. بمجرد أن ينتقل البروتين إلى نهاية الجل (حيث يلتقي كاستر الجل وإطار الجل في أسفل الجهاز)، توقف عن الركض وأطفئ حزمة الطاقة.
5. إكمال نقل البروتين
   ملاحظة: تم تطوير هذا القسم باستخدام جهاز نقل سريع للبروتين.
   1. صب محلول النقل في صينية الجل. أضف كومة نقل، تليها غشاء نيتروسيلولوزي وكومة نقل أخرى إلى السائل لتكوين ساندويتش مع الغشاء في المنتصف. تأكد من أن كومة السندويشات مغمورة بالكامل في مخزن النقل.
   2. شغل جهاز نقل البروتين السريع واختر البروتوكول المناسب لعدد الجل وحجم البروتين المعني.
      ملاحظة: تم العثور على أن 1.3 أمبير و25 فولت لمدة 10 دقائق يعملان بشكل جيد، لكن قد يكون هناك حاجة للتحسين.
   3. أزل المكدس العلوي للنقل باستخدام الملقط ودع السائل الزائد يتدفق إلى صينية الجل. انقل الكومة إلى جهاز نقل البروتين ووضعها بشكل مسطح ومستقيم قدر الإمكان؛ استخدم بكرة أو أنبوب مخروطي لتنعم أي تجاعيد. كرر العملية مع الغشاء.
   4. استخدم أداة ذات طرف غير حاد لفصل النصف العلوي والسفلي من إطار الصب بلطف. انقل الهلام إلى الغشاء في جهاز نقل البروتين.
   5. استخدم الملقط لرفع بقية التخزين من صينية الجل. قم بتصريف السائل الزائد، ثم ضعه فوق الغشاء والكومة الأخرى. أغلق علبة الجل وشغل البرنامج.
6. الحجب والتلوين بالأجسام المضادة
   1. افتح علبة الجل واستخدم الملقط لإزالة الطبقة العلوية، ثم ارفع الجل. تأكد من وجود شرائط من السلم على الغشاء. اقطع الغشاء ليشمل فقط نطاق الحجم المطلوب.
   2. انقل الغشاء إلى صندوق البقع النظيف. أضف 5 مل من حاجز الحاجز، أو ما يكفي لتغطية الغشاء. حجب التحريك تحت درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
   3. وفي الوقت نفسه، استعد لتلوين الأجسام المضادة بإضافة تركيز موصى به من الأجسام المضادة الأولية إلى 5 مل من ألبومين مصل البقري بنسبة 2٪ في محلول غسيل لكل غشاء. صبغة أيضا لبروتين التدبير المنزلي (مثل GAPDH، β-أكتين).
   4. أزل من التحريك وصب المخزن الحاجز. أضف 5 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية. يحتضن في الظلام تحت حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل (~12–16 ساعة).
      ملاحظة: من الآن فصاعدا، يجب إكمال جميع الخطوات في الظلام.
   5. اغسل الغشاء 3 × 5 دقائق تحت تحريك درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول الغسيل.
   6. أضف تركيز الأجسام المضادة الثانوية الموصى به إلى 5٪ من BSA في محلول الغسيل. جهز 5 مل من المحلول لكل غشاء.
   7. اصب حاجز الغسيل الزائد. أضف 5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية لكل نقطة. حضن في الظلام تحت تحريك درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
   8. اغسل الغشاء 3 × 10 دقائق تحت تحريك درجة حرارة الغرفة باستخدام مخزن الغسيل. الصورة فورا.
7. اكتشاف وتحليل البروتينات ذات الاهتمام
   1. صور البروتينات باستخدام المنصة المفضلة.
   2. استخدم ImageJ أو منصة أخرى لقياس شدة كل نطاق مهم.

4. اختبار صبغة الحديد المتقلبة

1. صبغة الحديد المتغير
   1. أكمل كل القسم 1، حيث زرع الخلايا في صفيحة بسعة 96 بئر تحت معالجة الحديد لمدة ساعتين. تأكد من وجود ثلاثة آبار على الأقل لكل حالة معالجة الحديد، بالإضافة إلى الضوابط السلبية (المركبة؛ وسط الزراعة + 150 ميكرومول من ديفيروكسامين مخلب الحديد) والإيجابية (وسط الزراعة + 180 ميكرومولار FAC + معالجة صبغة الحديد المتقلبة).
   2. جهز تخفيفا كافيا بنسبة 1:200 لمحلول مخزون 1 ملليمول من صبغة الحديد المتغيرة في وسط خال من المصل ليكون 200 ميكرولتر لكل بئر عينة.
   3. استنشق من وسيط الثقافة. اغسل مرتين باستخدام PBS.
   4. أضف محلول التلوين إلى كل بئر وحضن لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
   5. اغسله مرة واحدة باستخدام PBS. استبدلها ب PBS.
   6. صور الخلايا باستخدام قناة مجهر فلورية حمراء بعيدة (646/662 نانومتر). احفظ وصدر الصور ك . ملفات TIF.
2. تحليل التلوين
   1. افتح الصور في ImageJ.
   2. افتح نافذة القياس بالضغط على زر m. داخل نافذة القياس ، تحت النتائج | قم بتعيين القياسات، واختيار المساحة، والكثافة المتكاملة، والقيمة الرمادية المتوسطة. اختر OK.
   3. استخدم أداة المضلعات للرسم حول كل خلية في الصورة. اضغط m بعد كل خلية لإضافة القياسات إلى نافذة القياس.
   4. بمجرد قياس جميع الخلايا في الصورة، انسخ والصق جميع القيم في جدول بيانات. استخدم أداة الدائرة لأخذ ما لا يقل عن ثلاث قياسات خلفية في مناطق خالية من الخلايا.
   5. استخدم الصيغة التالية لحساب الفلورة الكلية المصححة للخلية (CTCF) لكل خلية:
      CTCF = الكثافة المتكاملة – (مساحة الخلية المختارة × القيمة الرمادية المتوسطة لقراءات الخلفية)
   6. قارن قيم CTCF للخلايا المعالجة بالحديد مع تلك الخاصة بخلايا المركبة. تشير زيادة CTCF إلى زيادة مستويات الحديد غير المتقلبة.

5. اختبار تلألؤ الخلايا

1. معالجة الخلايا لاختبار التلميع
   1. أكمل القسم 1، مع التأكد من أن عدد الآبار يتوافق مع n = 3 لكل حالة ترغب في تضمينها. أضف على الأقل ثلاثة آبار تحكم خالية من الخلايا (وسائط كاملة فقط). يجب إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا والوسائط إلى كل بئر.
   2. بعد حضانة الخلايا غير المعالجة طوال الليل، قم بتطبيق العلاجات والتحكم حسب الرغبة. تأكد من تضمين حالة المركبة (غير المعالجة)، الحالات التي تحتوي فقط على FAC، سمية خلوية + 10 ميكرومولار فيرروستاتين-1 (عامل مضاد للفيروبتوتيك)، مركبة + 1 ميكرومولار RSL3، و/أو مركبة + 10 ميكرومولار فيروستاتين-1 + 1 ميكرومولار RSL3. الحضانة لمدة مطلوبة (12–24 ساعة لتعظيم تأثيرات العلاج مع منع موت الخلايا المفرط).
2. إكمال اختبار التلميع
   1. عند معالجة الخلايا، قم بإذابة مكونات حاجز التلميض إلى درجة حرارة الغرفة. اجمع المكونات المطلوبة وخزنها في الظلام حتى تصبح جاهزة للاستخدام. راجع تعليمات المجموعة لمعرفة متطلبات تخزين درجة الحرارة.
   2. بمجرد إتمام العلاج، اتبع تعليمات المجموعة لعلاج الخلايا.
      ملاحظة: من المرجح أن يشمل ذلك توازن درجة حرارة الغرفة، يليه إضافة عازل الإضاءة وفترة حضانة قصيرة نهائية في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إضافة مخزن الإضاءة المضيء، يجب تنفيذ جميع الخطوات في الظلام.
   3. أكمل وسجل التلميع باستخدام قارئ الألواح أو أداة مشابهة.
      ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم استخدام وقت دمج يبلغ 0.3 ثانية.
   4. تطبيع قيم التوهج للآبار التجريبية إلى متوسط التلميع لآبار التحكم الحرة من الخلية.
      ملاحظة: تشير قيم التلمعان الأعلى إلى عدد أكبر من الخلايا الحية.

النتائج

استنادا إلى أبحاث سابقة لنا وأعمال أخرى، افترضنا أن زيادة الحديد خارج الخلية ستؤدي إلى زيادة حمولة الحديد داخل الخلايا في خلايا عضلات الفئران وتسمح لنا بمراقبة الاستجابات المرتبطة بالفيروس اللاحق. لذلك طورنا سير عمل C2C12 الموضح في الشكل 1، حيث تعرضت الخلايا لتركيزات محددة من سترات الأمونيوم الحديدي لمدة 2–24 ساعة، حسب الاختبار اللاحق.

كانت الخطوة الأولى للتحقق من صحة نموذجنا هي التأكد من أن FAC يمكنه دخول الخلايا. باستخدام المبادئات المثبتة الموضحة في الجدول 3، أجرينا qPCR لكل من السلاسل الثقيلة والخفيفة للفيريتين ووجدنا أن زيادة مدخلات الحديد مرتبطة بارتفاع مستويات mRNA في الفيريتين (الشكل 2A,B). على مستوى البروتين، كان هناك زيادة مماثلة في مستويات الفيريتين مع زيادة تركيز FAC، رغم أن ذلك لم يكن معتمدا على الجرعة (الشكل 2C). وبالمثل، أظهر تلوين الخلايا الحية المعالجة ب ACA من C2C12 أن الخلايا التي عولجت بجرعة سامة من الحديد - وكذلك الخلايا التي عولجت بجرعة شديدة وصبغة حديد غير منتظمة في الوقت نفسه كضابط إيجابي - تظهر تخزينا أكبر للحديد بصريا وكمي مقارنة بالخلايا غير المعالجة وتلك التي تعرضت لمخلب الحديد ديفيروكسامين وحده (DFO؛ الشكل 2D). بشكل عام، تشير هذه النتائج إلى أن الحديد الذي يدخل عبر FAC إلى وسط الخلية يدخل بالفعل إلى الخلايا.

بعد أن أثبتنا أن FAC يزيد من عبء الحديد داخل الخلية، سعينا بعد ذلك لمعرفة ما إذا كان التحميل الزائد للحديد مصحوبا بتغيرات جزيئية ووظيفية مرتبطة بفيروس الفروبتوزيس. زاد FAC من تعبير Slc40a1 (الفيروبورتين) (الشكل 3A) ورفع Hmox1 (الشكل 3B). كما أدى FAC إلى تقليل بروتين GPX4، وتم عكس هذا الانخفاض جزئيا بواسطة الديفيروكسامين (الشكل 3C). أدى العلاج ب RSL3 إلى انخفاض مماثل في GPX4، مما وضع استجابة FAC ضمن سياق جزيئي أوسع مرتبط بالفيروس المعدني. وظيفيا، قللت جرعة FAC السامة من قابلية العيش المعتمدة على التلميع عند 12 ساعة، وتم إنقاذ هذا الفقدان المبكر للبقاء بواسطة الفيروستاتين-1 (الشكل 3D). على النقيض من ذلك، عند الساعة 24 ساعة، يصبح الفصل بين الشروط أقل وضوحا وأكثر تغيرا (الشكل 3E). بينما تظل العينات المعالجة بالفيروستاتين-1 مرتفعة مقارنة ب FAC السام للخلايا فقط، فإن النطاق الديناميكي العام للاختبار يقل في هذه المرحلة اللاحقة. تظهر هذه البيانات معا أن علاج FAC يؤدي إلى زيادة الحديد، وتغيرات جزيئية مرتبطة بالفيروبوتوسيس، وانخفاض حساس للفيروستاتين في قابلية الحياة في خلايا C2C12 يعتمد على الزمن.

الشكل 1: ملخص رسومي لنموذج التحميل الزائد للحديد. في هذا النموذج، تزرع خلايا C2C12 وتترك للحضانة طوال الليل قبل العلاج بجرعات فسيولوجية مختلفة ذات أهمية فسيولوجية من وسط الزراعة المملوء بالحديد والتحليل الجزيئي المباشر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: زيادة تخزين الحديد المتقلب وتخليق الفيريتين بعد إضافة سترات الأمونيوم الحديدية. تزداد مستويات mRNA من (A) سلسلة الفيريتين الثقيلة و(B) الفيريتين الخفيفة مع إضافة سترات الأمونيوم الحديدي إلى النظام. (ج) ترتفع مستويات بروتين FTH1 مع إضافة الحديد الحديدي إلى النظام. (د) تزداد مستويات الحديد المتقلب في خلايا C2C12 المعالجة بالحديد الحديدي قبل وبشكل متزامن مع التلوين بصبغة حديدية متقلبة حمراء بعيدة، مقارنة بالتحكم في المركبات + الديفيروكسامين. تشير حالة المعالجة المشتركة إلى معالجة متزامنة باستخدام وسط زراعة + 180 ميكرومولار FAC + صبغة الحديد المتقلبة. أشرطة الخطأ هي +/- SD. الاختصارات: FTH1 = سلسلة الفيريتين الثقيلة؛ FTL1 = سلسلة خفيفة الفيريتين؛ DFO = ديفيروكسامين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التغيرات الجزيئية المرتبطة بالفيروبتوزيس وانخفاض يعتمد على الوقت في قدرة الخلايا على البقاء بعد إضافة FAC. ترتفع مستويات mRNA من (A) الفيروبورتين (Slc40a1) و(B) Hmox1 بعد علاج FAC. (ج) ينخفض بروتين GPX4 بعد علاج FAC وفي وجود RSL3 الضابط الإيجابي؛ يعكس ديفروكسامين جزئيا الانخفاض المرتبط ب FAC4 في GPX4. (د) التوهج لخلايا C2C12 بعد علاج لمدة 12 ساعة باستخدام FAC، RSL3، و/أو الفيروستاتين-1، التي تم تطبيعها إلى آبار خالية من الخلايا (وسائط فقط). (ه) التوهج الطبيعي لخلايا C2C12 المعالجة بعد 24 ساعة من العلاج باستخدام FAC، RSL3، و/أو الفيروستاتين-1. أشرطة الخطأ هي +/- SD. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مسرح الانتظار
1	ارفع إلى 50 درجة مئوية عند 1.6 درجة مئوية/ثانية، ثم ابقيه لمدة دقيقتين
2	ارفع إلى 95 درجة مئوية عند 1.6 درجة مئوية/ثانية، واستمر لمدة 10 دقائق
مرحلة PCR (العدد × 40)
1	حافظ على 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية
2	خفض الحرارة إلى 60 درجة مئوية عند 1.6 درجة مئوية/ثانية، ثم ابقي لمدة دقيقة واحدة
مرحلة منحنى الانصهار
1	زيادة الحرارة إلى 95 درجة مئوية عند 1.6 درجة مئوية/ثانية، والحفاظ على الحرارة لمدة 15 ثانية
2	خفض الحرارة إلى 60 درجة مئوية عند 1.6 درجة مئوية/ثانية، ثم ابقي لمدة دقيقة واحدة
3	زيادة الحرارة إلى 95 درجة مئوية عند 0.15 درجة مئوية/ثانية، مع التوقف لمدة ثانية واحدة

الجدول 1: برنامج qPCR (المدة: ~1:36 ساعة) في القسم 2 من البروتوكول.

	جل المحلول			جل التكديس
المكون	10%	12.50%	15%
أكريلاميد (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
الماء المعقم (مل)	6.9	5.3	3.9	3.05
ترايس/HCl، 1.5 ميل pH 8.8 (mL)	4.2			-
تريس/HCl، 0.5 ميل pH 6.8 (mL)	-			1.25
10٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (μL)	166			50
0.1 جم/مل بيرسلفات الأمونيوم (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

الجدول 2: ملخص المكونات والأحجام المطلوبة لإعداد جيلات المعالجة وتكديس الجل لمنطقة ويسترن بلوت بنجاح. الأحجام المقدمة كافية لجلين ويمكن تحجيمها وفقا لذلك. تشير النسب المئوية إلى كمية الأكريلاميد في الخليط.  ملاحظة: يجب إضافة APS وTEMED في النهاية وفقط عند الاستعداد للصب لأنها ستؤدي إلى عملية بلمرة الهلام.

هدف الجين	رمز الجين	الوظيفة	الأنواع	تسلسل التقديم	التسلسل العكسي
بيتا-2-ميكروغلوبولين	B2m	جين التدبير المنزلي	فأر	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
بروتين رابط صندوق تاتا	الملاحظة	جين التدبير المنزلي	فأر	CAGATGTGC GTCAGGCGT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
سلسلة الفيريتين الثقيلة	Fth1	وحدة فرعية من بروتين تخزين الحديد الفيريتين	فأر	TGGCTGTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTTTTTA
سلسلة فيريتين الخفيفة	Ftl1	وحدة فرعية من بروتين تخزين الحديد الفيريتين	فأر	AATGGGGTAA ACCCAGGAG	AGGAAGTCACA غاغاتجاغت
إناز هيم أوكسجيناز 1	HmoX1	يحول البيليفردين إلى بيليروبين في وجود الهيم، ثاني أكسيد الكربون، والحديد؛ توجد مستويات عالية في الفيروبتوزيس	فأر	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
فيروبورتين 1	Slc40a1	ينقل الحديد الزائد خارج الخلايا	فأر	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG كاكاتغا

الجدول 3: قائمة بالبادئات المثبتة ل qPCR لجينات نقل الحديد والفيروبتوز محل الاهتمام. البرايمرات مخصصة للفأر بسبب استخدامها في mRNA الذي ينشأ من خلايا C2C12.

المناقشة

كان هدف هذه الدراسة هو إنشاء نموذج عملي في المختبر لزيادة الحديد في أسلاف عضلات الفأر وتحديد الظروف التي يمكن فيها اكتشاف الاستجابات المرتبطة بالفيروس بشكل موثوق. باستخدام هذا السير العملي، نظهر أن علاج سترات الأمونيوم الحديدي يؤدي إلى تراكم قوي للحديد داخل الخلية، مصحوبا بزيادة تعبير الفيريتين وارتفاع إشارة الحديد المتقلب. يرتبط حمل الحديد أيضا بالتغيرات الجزيئية المتوافقة مع الإجهاد المرتبط بالفيروبتوسيس، بما في ذلك زيادة تعبير Slc40a1 و Hmox1 وانخفاض بروتين GPX4. وظيفيا، يؤدي التعرض لفيروس FAC السام الخلوي إلى تقليل في قدرة الخلايا على العيش يتم إنقاذه بواسطة الفيروستاتين-1 في النقاط الزمنية المبكرة، مما يدعم وجود مكون حساس للفيروبتوسيس يساهم في موت الخلية المرصود.

جرعة الحديد ومدة العلاج هما معلمان حاسمتان تؤثر بشكل مباشر على قابلية تفسير هذا النظام. في أيدينا، توفر نقاط التوقيت المبكرة (حوالي 12 ساعة) أوضح فصل بين الحالات، مما يسمح للفيروستاتين-1 بإنقاذ السمية الخلوية الناتجة عن FAC بطريقة قابلة للتكرار. في نقاط زمنية لاحقة (مثل 24 ساعة)، تقل الجدوى العامة وتزداد التباين عبر الظروف، مما يقلل من النطاق الديناميكي للاختبار. وهذا يتوافق مع فقدان الخلايا التراكمي وتكيف السكان الباقين، مثل زيادة القدرة المضادة للأكسدة أو تغير التعامل مع الحديد.

كما أن إعطاء الحديد الحديدي (Fe³⁺) بدلا من الحديد الحديدي (Fe²⁺)، بالإضافة إلى تركيز الحديد المعطى ومدة العلاج، هي أيضا جوانب حاسمة في البروتوكول. استخدام الحديد الحديدي ضروري لأن الحديد الحديدي يمتص بسهولة بواسطة ترانسفيرين، الناقل الرئيسي المسؤول عن استيراد الحديد^{الحديدي 11}. على الرغم من أن الحديد الحديدي يمكن أن يمتص بواسطة ناقلات أخرى (وأبرزها ناقل المعادن ثنائية التساوي DMT1)، إلا أنه في هذا السياق، بدا أن الحديد الحديدي مدمج بشكل أكثر فعالية من الحديد^{الحديدي 12}. تم اختيار تركيزات FAC المختارة لهذا البروتوكول بسبب أهميتها الفسيولوجية واستخدامها في نماذج مماثلة^{سابقة 13,14}. مدة معالجة الحديد، التي كانت 24 ساعة، استندت أيضا إلى نماذج مماثلة من قبلنا ونماذج أخرى. ومع ذلك، في بعض السياقات (مثل اختبارات تلوين الحديد غير المنتظم واختبارات تلويع الخلية)، ثبت أن 24 ساعة كانت مدة المعالجة طويلة جدا. في هذه الحالات، أدى علاج استمر 24 ساعة إلى موت خلوي كبير لدرجة أنه لم يكن بالإمكان استخلاص استنتاجات بسبب تدمير المادة الخلوية. على سبيل المثال، يعد RSL3 عامل قوي جدا لزيادة أكسدة الدهون بحيث أن مدة العلاج التي تبلغ 12 ساعة كانت كافية لتحفيز أكسدة الدهون مع ضمان ظهور تأثيرات زيادة الحديد في الوقت نفسه (الشكل 3C-E). بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للصبغة الحديدية غير المستقرة، كانت الخلايا تعالج ب FAC لمدة ساعتين فقط قبل التلوين (بعد محاولة التلوين بعد معالجات الحديد لمدة 2 و4 و24 ساعة) لالتقاط الاستجابة الأولية لتحميل الحديد قبل حدوث تدمير مفرط للخلايا (الشكل 2D). بشكل عام، يبدو أن التغيرات في مستويات الجينات والبروتين تم قياسها بشكل أفضل بعد 12–24 ساعة من معالجة الحديد، ويرجع ذلك إلى أن هذه التغيرات تستغرق وقتا أطول للعمل في الخلايا، بينما كان من الأفضل إجراء التلوين بعد فترة علاج أقصر.

وقد طور آخرون نماذج مشابهة. أنشأت إحدى المجموعات نموذج C2C12 المعالج بالحديد الحديدي لدراسة دور محور p53-Slc7a11 في الفيروبتوزيس. وجدوا أن علاج الحديد الحديدي لمدة 48 ساعة زاد من تأكسد الدهون وخفض مستويات Slc7a11 ، مما يشير إلى الفيروبتوزيس¹³. نموذج مشابه آخر — هذه المرة باستخدام خلايا C2C12 المعالجة بالكبريتات الحديدية لدراسة العلاقة بين مسار ليغاز يوبيكويتين Akt-FoxO3-E3 والفيروبتوسيس — تضمن العلاج بالحديد على مدى 4^{ساعات و14} ساعة. خيط مشترك بينهما هو أنها تشمل معالجة الحديد لخلايا C2C12 التي تم تمايزها إلى أنابيب العضلات، بدلا من البقاء في حالتها الشبيهة بالخلايا الجذعية العضلية. وهذا يجعل نظامنا ذا صلة خاصة بتراكم الحديد الذي لوحظ سابقا في MuSCs.

على الرغم من أنها طريقة بسيطة لدراسة تأثيرات فرط الحديد على العضلات في المختبر، إلا أن الطريقة لها قيود لأنها استخدمت فقط في سياق خلايا C2C12. أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية العضلية عرضة لزيادة الحديد مع التقدم في العمر، مما يشير إلى أن طريقة مماثلة قد تكون صالحة في هذا السياق⁹.

عند النظر إلى هذا النموذج مجتمع، يظهر أن الحمل الزائد للحديد كاف لإحداث مجموعة قابلة للتكرار من التغيرات الجزيئية المرتبطة بالفيروبتوسيس وتقليل قابلية للفيروستين في البقاء في خلايا C2C12. بينما يمكن للاختبارات المتعامدة الإضافية تحسين تصنيف موت الخلايا في سياقات محددة، فإن الاستجابات الجزيئية والدوائية المجمعة التي لوحظت هنا تتوافق مع الإجهاد الخلوي المرتبط بالفيروبتوزيس. نتوقع أن يسهل هذا النهج دراسات ميكانيكية حول اختلال تنظيم الحديد في شيخوخة العضلات والأمراض.

المواد

```html

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Store at -20 °C. Thaw on ice.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Is a neurotoxin. Handle only when wearing appropriate PPE (lab coat, gloves, eye protection).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polymerizing agent for acrylamide gel casting as a 10% weight/volume solution in sterile water. Powder is room temperature stable, but solution should be stored long-term at -20 °C and short-term at 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Use at a 1:2000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Follow manufacturer's instructions for use. Be advised that standards must be kept at 4 °C after first use.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Use in preparation of Laemmli buffer.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Store at 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Store in the vapor phase of liquid nitrogen.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Store at -20 °C. Thaw on ice.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Since larger, use for extraction of cells from 10 cm and larger dishes.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Since they have a small head, they are best suited for removing cells from multi-well plates.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Use in a fume hood only, and dispose of waste in a separate container.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Dissolve 1 tablet in 500 µL of sterile water to create a 100× solution.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Model version CBS 170-120 V. Use for cell culture.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO is an iron chelator, so adding it to cells decreases iron content. Dissolve in water for a stock concentration of 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Use in labile iron staining and reconstitution.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Prepare stock solution by adding 50 µL DMSO to a room temperatureerature aliquot. Light sensitive. Stock concentration: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequesters lipid peroxidation byproducts, inhibiting ferroptosis in vitro. Dissolve in DMSO for a stock concentration of 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Use to supplement DMEM for C2C12 cell culture. Added at 10% by volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Use in 6x Laemmli buffer prep.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Use to visualize pellet during RNA purification.
Image