تفسير المتغيرات السريرية باستخدام مستعرض الجينوميات التكاملي (IGV) لأخصائيي علم الأمراض الجزيئي

Eitan Halper-Stromberg; Suguna Narayan; Vincent Laufer; Melvin Limson; Tracy Busse; Jeremy P. Segal; Dara L. Aisner; Jennifer J.D. Morrissette; Helga Thorvaldsdottir; James T. Robinson; Somak Roy; Melissa Y. Tjota

doi:10.3791/71808

مقالة منهجية

تفسير المتغيرات السريرية باستخدام مستعرض الجينوميات التكاملي (IGV) لأخصائيي علم الأمراض الجزيئي

DOI:

10.3791/71808

⸱

أغسطس 14, 2026

Eitan Halper-Stromberg^*¹ , Suguna Narayan^*² , Vincent Laufer^*² , Melvin Limson³ , Tracy Busse³ , Jeremy P. Segal⁴ , Dara L. Aisner⁵ , Jennifer J.D. Morrissette⁶ , Helga Thorvaldsdottir⁷ , James T. Robinson⁸ , Somak Roy⁹ , Melissa Y. Tjota⁴

¹University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, ²University of Michigan, Department of Pathology, ³Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), ⁴University of Chicago, Department of Pathology, ⁵University of Colorado, Department of Pathology, ⁶University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, ⁷Broad Institute of MIT and Harvard, ⁸University of California San Diego, Department of Medicine, ⁹Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر برنامج مستعرض الجينوميات المتكامل (IGV) نافذة غنية وبديهية للبيانات الأساسية المستخدمة في تحديد المتغيرات السريرية. نعرض هنا خمس حالات توضيحية تبين كيفية إجراء تمييز سريع بين الأحداث المسببة للأمراض الفعلية والشوائب التقنية، مما يعزز في النهاية الثقة التشخيصية للممارسين المشاركين في المراجعة النهائية للنتائج في فحوصات تسلسل الجيل القادم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يُعد مستعرض الجينوميات التكاملي (IGV) أداة محورية في الجينوميات السريرية، حيث يتيح تصور وتفسير بيانات التسلسل المعقدة. إن دمج المعرفة السريرية مع التقييم البصري لنتائج التسلسل هو الوسيلة الأساسية التي يستخدمها أخصائيو علم الأمراض الجزيئية وغيرهم من المهنيين لتقييم الحالات والبت فيها بشكل نهائي. يمكن لمجموعة متنوعة من الأدوات البرمجية تقديم المساعدة، ولكن يجب فهم علاقتها بالبيانات الأساسية وتطبيقها بشكل منهجي. تتضمن هذه الدراسة خلفية أساسية حول أنواع ملفات بيانات تسلسل الجيل القادم (NGS) (مثل FASTQ وBAM وVCF) مع مناقشة تنسيقاتها والغرض منها. بعد ذلك، نصف ميزات IGV التي تستخلص الفروق الدقيقة من هذه الملفات. نحن نستخدم سلسلة من الحالات العملية المختارة بناءً على سيناريوهات سريرية، يتفاعل من خلالها القارئ مع بيانات تسلسل NGS السريرية باستخدام برنامج IGV لمراجعة أنواع مختلفة من المتغيرات ذات الصلة سريريًا بالنسبة للجينوم المرجعي البشري. وقد تم اختيار هذه السيناريوهات السريرية لوصف أمثلة على بعض تعقيدات تفسير البيانات الجينومية، وكيف يمكن أن يوفر استخدام IGV كجزء من سير العمل الروتيني معلومات تفسيرية إضافية للمتغيرات تتجاوز نداءات المتغيرات الناتجة عن خوارزميات البرامج المعلوماتية الحيوية الروتينية. يمكن للفحص البصري للمتغيرات الجينومية باستخدام الأدوات المتاحة في IGV أن يكشف عن إشارات سياقية دقيقة (مثل تردد الأليل المتغير، وانحياز السلسلة، والسياق الخاص بالأنسجة) التي يمكن أن تؤثر على تفسير المتغيرات الجينومية. وعلى الرغم من أن هذه الدراسة تركز على استخدام IGV للكشف عن المتغيرات الجسدية وتفسيرها، إلا أنه يمكن تعميم التطبيقات المقدمة لاستخدامها في سياق الخط الجرثومي، بما في ذلك تحليل المتغيرات المعقدة والكشف عن الفسيفسائية الجينية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد تحولت رعاية الأورام في السنوات الأخيرة بفضل استخدام تقنيات تسلسل الجيل القادم (NGS) لتوجيه التشخيص والتنبؤ بالمرض واختيار العلاج¹. وأصبح اختبار NGS معياراً للرعاية في أنواع متعددة من الأورام من أجل: 1) وضع تشخيص لورم محدد جزيئياً، 2) استخدام نتائج المؤشرات الحيوية غير المرتبطة بنوع الورم لاتخاذ قرارات علاجية، و3) تحديد تصنيف المخاطر لأنواع معينة من الأورام²^,³. وقد أصبحت النتائج الدقيقة وفي الوقت المناسب من NGS واختبارات المؤشرات الحيوية الأخرى مكوناً حاسماً لرعاية المرضى والتخطيط العلاجي في مجال الأورام.

عادةً ما يتم إجراء اختبارات تسلسل الجيل التالي (NGS) إما في مختبرات مرجعية كبيرة أو في مختبرات أكاديمية/مستشفيات، وذلك عندما تمتلك المؤسسات الخبرة والموارد الكافية لتطوير هذه الاختبارات وصيانتها. وقد تم تصور منظمة الجينوم للمختبرات الأكاديمية (GOAL) كشبكة تعاونية تركز على مشاركة المعرفة الأكاديمية وتكاليف الكواشف⁴. وقد تضمن الجهد الكبير الذي بذله تحالف GOAL دورات تدريبية على المكونات الأساسية لمراجعة الدراسات السريرية وإعداد تقاريرها. وقد تم تطوير هذه الدورات كجلسات تعليمية عملية، وتشمل ورشة عمل تفاعلية حول مستعرض الجينوم التكاملي (IGV) لاستعراض ميزاته الأساسية والمتقدمة في الطب الجينومي.

يعد IGV أداة لتصور البيانات مصممة للسماح للمستخدمين بمراجعة بيانات NGS وغيرها من مجموعات البيانات الكبيرة بسهولة، نظراً لأن معظم بيانات NGS تكون ضخمة وغير قابلة للإدارة بدون واجهة مستخدم رسومية⁵. لم يتم تصميم IGV في البداية لتحليل المتغيرات السريرية، ومع ذلك، ونظراً لسهولة استخدامه من قبل جميع المتخصصين في البيولوجيا الجزيئية، بغض النظر عن مستوى خبرتهم في المعلوماتية الحيوية، فقد اعتمدته العديد من المختبرات على نطاق واسع كجزء من سير عمل مراجعة البيانات المعقدة⁶. وقد أُعدت هذه الدراسة كآلية لنشر هذه المعلومات إلى المجتمع الأوسع من المتخصصين في مختبرات الجينوم.

تتمثل الحاجة السريرية لاستخدام IGV كجزء من سير العمل السريري في الكشف عن أخطاء التسلسل، والتعامل مع التعقيدات في تحديد المتغيرات الجينومية، وغيرها من التغيرات المتكررة حيث يمكن أن يساعد التصوير الإضافي في التفسير المناسب للبيانات⁷. يتطلب استخدام IGV ملفات معلوماتية حيوية قياسية ناتجة عن دراسة NGS⁸. تسمح الميزات الأساسية لبرنامج IGV بتصوير بيانات التسلسل وتتطلب تكوين مجموعة من التفضيلات والخيارات لتفسير المتغيرات السريرية (الملحق 1).

يتميز سير عمل تسلسل القراءات القصيرة بمعايير ملفات FASTQ، وخريطة المحاذاة الثنائية (BAM)، وتنسيق استدعاء المتغيرات (VCF). يحقق تسلسل الجيل القادم (NGS) إنتاجية عالية من خلال توليد الملايين من القراءات القصيرة بالتوازي. ورغم أن هذه الاستراتيجية تسرع إنتاج البيانات بشكل كبير، إلا أن كل قراءة ليست سوى جزء من الحمض النووي DNA أو RNA الأصلي. وتثبت كل قراءة في موقع ما على خلية تدفق NGS بواسطة تسلسل المهايئ الخاص بها. تُسجل معلومات التسلسل وجودة القواعد الناتجة عن المعالجة الضوئية في ملفات FASTQ. وهذه القراءات الخام عبارة عن تسلسلات نوكليوتيدية مصحوبة بدرجات جودة لكل قاعدة. لذلك، تتمثل إحدى الخطوات المبكرة في معالجة القراءات الخام في محاذاة كل قراءة مع جينوم مرجعي⁸. وبما أنه يتم تخصيص موقع محدد في الجينوم المرجعي لكل قراءة بناءً على أعلى احتمالية للمحاذاة، فإن القراءات التي تتوافق مع الموقع نفسه "تتراكم" عند كل موقع، وتُخزن هذه البيانات في ملف BAM وفقاً لمواصفات رسم خرائط محاذاة التسلسل (SAM) (المتاحة على https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf؛ آخر تحقق: 30/9/2025) (الشكل 1A). ويمكن فحص هذه المعلومات بصرياً باستخدام متصفح جينومي مثل IGV. وكما هو موضح في الشكل 1B، فإن مقارنة القراءات ببعضها البعض أو بالتسلسل المرجعي نفسه يمكن أن تشير إلى وجود اختلافات أو تباينات بين التسلسلات النوكليوتيدية. وتُجمع ملخصات هذه المواقع "المتغيرة" فقط عبر الجينوم بأكمله في ملف VCF، والذي يكون بالتالي أصغر حجماً بكثير من ملف BAM ولكن لا يزال يحتوي على معظم المعلومات المفيدة المطلوبة لمراجعة المتغيرات. لهذا السبب، غالباً ما يكون ملف VCF هو المخرج النهائي لسلاسل معالجة استدعاء المتغيرات (الشكل 1C). وهكذا، بينما تحتوي ملفات FASTQ على بيانات القراءة الخام والجودة، يوفر ملف BAM رؤية حول مدى دقة خرائط تلك القراءات على الجينوم، ويمثل ملف VCF الاختلافات بين التسلسل المرجعي وتسلسل العينة، مما يوفر كمية من البيانات يسهل التعامل معها لمراجعتها بهدف إعداد التقارير المحتملة.

توضح الحالات السريرية الست في هذه الدراسة السيناريوهات التحليلية الشائعة المرتبطة بالكشف عن المتغيرات الجسدية في المختبرات الجزيئية، بالإضافة إلى المشكلات التي تعقد الفهم والتفسير الصحيحين للبيانات الأساسية. وبشكل عام، تم اختيار هذه الحالات لتوضيح سيناريوهات تفسيرية تزداد تعقيداً، وكيف يمكن لاستخدام الميزات المتقدمة في برنامج IGV وصف السمات الجينومية الشاملة بشكل أفضل. وعلى الرغم من أن هذه الدراسة تركز على تفسير المتغيرات الجسدية، إلا أن هذه الميزات قابلة للتطبيق عند استخدام برنامج IGV في تصور وتفسير التغيرات السلالية⁶. ومن الجدير بالذكر أن المصطلحات المستخدمة في هذا المقال تستند إلى كيمياء التسلسل عن طريق الاصطناع، ومع استخدام مصطلحات أو مفاهيم مماثلة أخرى للمنصات الأخرى عند الاقتضاء.

تبدأ كل حالة سريرية بسياق سريري موجز للغاية، تليه تعليمات حول كيفية فحص المتغير أو المتغيرات وحل التساؤل: أي متغير موجود (إن وجد) هو متغير حقيقي وأيها (إن وجد) هو ناتج عن خطأ تقني. يعد السياق السريري، إلى جانب تفاصيل بيانات التسلسل، أمراً هاماً للإجابة على هذا التساؤل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل البيانات المعروضة هنا مزيجاً من بيانات NGS لمحاكاة وبيانات مرضى حقيقية. ومع ذلك، تم إلغاء تحديد هوية جميع بيانات المرضى من خلال مزيج من إزالة التسميات واستخراج القراءات أحادية الموضع. يتبع هذا البروتوكول الإرشادات المعمول بها للجنة أخلاقيات البحوث البشرية في جميع المؤسسات التي ينتمي إليها المؤلفون.

1. تحميل أحدث إصدار من مستعرض الجينوم التكاملي (IGV)

ملاحظة: يعتبر IGV برنامجاً مجانياً قابلاً للتنزيل لتصور الجينومات المختلفة، بما في ذلك الجينوم البشري (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). يتم تحديث IGV بشكل دوري ليشمل إصدارات جديدة من النسخ، والميزات، والمسارات، وعادة ما يكون الإصدار الأكثر حداثة في أعلى القائمة.

قم بتنزيل الملف المتاح عبر رابط مورد العنوان الموحد (URL) أعلاه، والمسمى 'IGV for Windows, Java Included'، إلى سطح المكتب، وقد يتطلب ذلك بيانات اعتماد المسؤول، وذلك حسب المؤسسة.
اختر إصدار بناء الجينوم البشري المخطط استدعاؤه من التقارير (على سبيل المثال hg19 أو hg38)، والمستضافة داخل برنامج IGV.
ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة إصدار IGV 2.19.7. وفي هذا البروتوكول، تم تنزيل نسخة Windows التي تتضمن Java. تم تشغيل IGV بتخصيص الذاكرة الافتراضي البالغ 8Gb من RAM. الإعدادات الموصى بها في علامة تبويب تفضيلات IGV والأقسام الأخرى في IGV موضحة في الملحق 1.

2. فهم السيناريوهات السريرية وتنزيل الملفات اللازمة

انتقل إلى مستودع GitHub: جميع الملفات متاحة للتنزيل في مستودع GitHub عبر الرابط https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
ملاحظة: يوجد ملف جلسة في مستودع GitHub لكل شرح توضيحي، وتحميل ملف الجلسة هذا يغني عن الحاجة إلى تحميل الملفات بشكل منفصل والانتقال إلى الموقع الجيني المعني لأن ملف الجلسة يتولى هذه الخطوات.
قم بتحميل ملف جلسة من خلال قائمة الملفات. انقر على File > Open Session, ثم اختر ملف الجلسة المناسب.

3. إعداد مسار التغطية

ملاحظة: تشتمل النافذة الرئيسية في برنامج IGV على "مسار التغطية" (coverage track). وفي سياقات معينة، قد تكون حتى نسبة ضئيلة من القراءات التي تحتوي على متغيرات سرطانية محددة ذات أهمية سريرية. وبسبب ذلك، يعد تحقيق عمق قراءة عالٍ جداً عبر أجزاء الجينوم التي يتم تحليلها أمراً بالغ الأهمية. فإذا كانت 2% فقط من القراءات تحتوي على متغير معين، فقد يتطلب الأمر عمق قراءة يصل إلى المئات أو الآلاف لتحديد المتغير بشكل مقنع – ومن هنا جاء مصطلح "التسلسل العميق" (deep sequencing).

التأكد من وجود مسار التغطية: من القائمة العلوية، انقر فوق View > Preferences، ثم اختر علامة التبويب Alignments. يوجد في الجزء العلوي من علامة التبويب مربع بعنوان 'Show coverage track'. تأكد من تفعيل هذا المربع.
تحديد عتبة ذات دلالة سريرية للمتغيرات منخفضة المستوى: انتقل إلى علامة التبويب Alignments كما هو موضح في الخطوة 3.1، وقم بالتمرير لأسفل حتى يظهر المربع المعنون بـ Coverage allele-fraction. اضبط القيمة في المربع على 0.01 ثم انقر على Save (يجب أن تغلق نافذة التفضيلات عند النقر على Save).

4. إعداد القراءات ذات القص اللين (soft-clipped reads)

ملاحظة: هذا الإعداد ذو قيمة كبيرة في الكشف عن المتغيرات الهيكلية الأكبر، مثل إعادة ترتيب الجينات، أو تغيرات عدد النسخ، أو أحداث الإدخال والحذف المشتركة. وتوضح النماذج التوضيحية المتقدمة — مثل تلك التي تركز على تضخمات وحذوفات EGFR — كيف يمكن للقراءات ذات القص اللين (soft-clipped reads) أن تؤكد وجود متغيرات هيكلية قد يتم إغفالها بواسطة طرق استدعاء المتغيرات القياسية.

تفعيل القص اللين (soft-clips): من القائمة العلوية، انقر فوق View > Preferences، ثم اختر علامة التبويب Alignments. قم بالتمرير لأسفل حتى تصل إلى مربع Show soft-clipped bases وتأكد من تفعيل خيار تحديد المربع (Supplementary File 1) لإظهار القراءات المحاذية جزئياً، وهي القراءات التي لا تتطابق حوافها بدقة مع المرجع ويتم "قصها" بعيداً.

5. السيناريوهات السريرية

الحالة رقم 1: التمييز بين متغير ممرض حقيقي في جين KRAS (نظير الجين الورمي لفيروس ساركوما الجرذ كيرستين) وبين خلل ناتج عن عملية التسلسل.
ملاحظة: تتضمن الحالة (أ) رجلاً يبلغ من العمر 65 عاماً تم تشخيصه حديثاً بسرطان الرئة الغدي، حيث قدر التقييم النسيجي وجود ورم بنسبة 80% تقريباً. حدد تحليل NGS وجود متغير في جين KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C)، وهو طفرة محركة معروفة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). يظهر هذا المتغير المغلط الناتج KRAS c.34G>T (p.G12C) في حوالي 13% من حالات سرطان الرئة الغدي، ويجعل المريض مؤهلاً للعلاجات الموجهة⁹. تتضمن الحالة (ب) امرأة تبلغ من العمر 54 عاماً مصابة بساركوما معروفة (بتقدير 50% ورم و50% نسيج طبيعي). تم تحديد المتغير المتطابق KRAS c.34G>T (p.G12C) في هذه العينة. ومع ذلك، نظراً لأن المتغير KRAS c.34G>T (p.G12C) نادراً ما يتم الإبلاغ عنه في الساركوما، فإن وجوده يثير الشبهة بكونه خللاً محتملاً في عملية التسلسل.
1. سير عمل IGV (ملف الجلسة KRAS.xml)
  1. تحميل البيانات: اختر Hg19 من القائمة المنسدلة للجينوم وقم بتحميل ملف bam، kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam، وانتقل إلى الإحداثيات chr12:25,398,281–25,403,833 للتركيز على منطقة جين KRAS. لاحظ أن ملف الفهرس (الذي يحمل نفس اسم ملف bam ولكن ينتهي بـ .bai) يجب أن يكون في نفس المجلد الذي يتواجد فيه ملف bam.
  2. فحص التغطية وتردد الأليل المتغير (VAF): راجع الكودون 12 في الإكسون 2 (NM_004985.5) وانقر فوق موقع المتغير في مسار التغطية لإظهار عمق القراءة في ذلك الموقع. لاحظ وجود استبدال G→T (حدث تحول عرضي)، بنسبة VAF تتراوح بين 35%–40%، وهو ما يتفق تماماً مع طفرة محركة نسيلية متغايرة الزيجوت (الشكل 2A)، خاصة في سياق خلوية ورمية تبلغ حوالي 80%.
  3. البحث عن انحياز الشريط (StrandBias): استخدم الترميز اللوني حسب الشريط (راجع الملف التكميلي 1، الخطوة 4) للكشف عن توزيع يقترب من 50:50 بين الشريط الأمامي (أحمر): والعكسي (أزرق) في عينة الرئة.
  4. كرر الخطوات من 5.1.1.1 إلى 5.1.1.3 للحالة (ب)، عينة الساركوما: قم بتحميل ملف bam، kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam، ولاحظ أن نسبة VAF أقل من <1% مع دعم حصري تقريباً من الشريط الأمامي، مما يشير إلى خلل في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو في عملية المحاذاة (الشكل 2B).
الحالة رقم 2: تصحيح تصنيف خاطئ لمتغير متعدد النيوكليوتيدات (MNV).
ملاحظة: خضعت امرأة تبلغ من العمر 50 عاماً مصابة بميلانوما نقيلية لتحديد الملف الجيني للورم القائم على NGS. حدد التحليل طفرة محتملة في BRAF (البروتوجين الورمي B-Raf، كيناز السيرين/ثريونين) c.1798_1799delinsAA. وبينما يعد BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) أكثر شيوعاً في مختلف الأورام الصلبة، فإن BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) خاص نسبياً بالميلانوما، حيث يمكن للأشعة فوق البنفسجية أن تحفز انتقالات C > T داخل الديبيريميدينات¹⁰. وفقاً لقواعد HGVS، يجب تسمية متغيرين أحادي النيوكليوتيد (SNVs) في وضعية cis كمتغير MNV واحد. في كثير من الحالات، قد يحدد نظام التحليل المعلوماتي الحيوي بشكل خاطئ هذا المتغير المعقد على أنه متغيران متجاوران من نوع SNV في وضعية in cis: BRAF c.1798G>A و BRAF c.1799T>A. نظراً لوجود اعتبارات تقنية (مرتبطة ببرنامج تحديد المتغيرات) وبيولوجية (التمييز بين cis و trans)، هناك تخوف من إمكانية الإبلاغ عن الطفرة بشكل خاطئ عند اعتماد النتيجة النهائية ما لم يتم تصوير البيانات أثناء المراجعة السريرية.
1. سير عمل IGV (ملف الجلسة BRAF.xml)
  1. تحميل البيانات: اختر Hg38 من القائمة المنسدلة للجينوم وقم بتحميل ملف bam، kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam، وانتقل إلى الإحداثيات chr7:140,453,136–140,753,336. لاحظ أن ملف الفهرس (الذي يحمل نفس اسم ملف bam ولكن ينتهي بـ .bai) يجب أن يكون في نفس المجلد الذي يتواجد فيه ملف bam.
  2. تكبير الكودون 600 في جين BRAF: لاحظ وجود تغيير في ثنائي النيوكليوتيد GT→AA استناداً إلى مواقع مسار التغطية المجاورة التي تظهر باللونين الأخضر والأزرق بدلاً من الرمادي، وهو ما يتفق مع p.V600K.
  3. المسح بحثاً عن اثنين من متغيرات SNV الفردية لتحديد ما إذا كانت في وضعية cis أو trans: لاحظ أن كلا المتغيرين SNVs مرتبطان بنفس القراءات وفي وضعية cis.
  4. فحص الشريط والتغطية: استخدم الترميز اللوني للقراءات لإظهار دعم متساوٍ تقريباً للشريط الأمامي/العكسي (راجع الملف التكميلي 1، الخطوة 4)، مع VAF تتجاوز 50%، مما يتفق مع محرك نسيلي. يضمن تحديد عتبة مسار التغطية عند 0.01 (راجع الملف التكميلي 1، الخطوة 3 للإعداد) بقاء النسائل الفرعية الجزئية مرئية (إن وجدت) (الشكل 2C).
  5. ملاحظة السياق وتسمية MNV: التغييران في النيوكليوتيدات متجاوران. استناداً إلى إجماع الخبراء، يتم تصنيف متغيرات SNVs التي تقع ضمن مسافة 50 زوج قاعدي (bp) وتظهر في نفس قراءة التسلسل كمتغير "معقد" أو متغير "delins" واحد¹¹.
الحالة رقم 3: فحص إقحام (insertion) في الإكسون 9 لجين KIT (البروتوجين الورمي KIT، مستقبل تيروزين كيناز) في ورم سدوي معدي معوي (GIST)
ملاحظة: خضع مريض ذكر يبلغ من العمر 58 عاماً مصاب بورم سدوي معدي معوي لعملية استئصال، وتم طلب اختبار NGS. أظهرت النتائج متغيراً محتملاً في جين KIT. تعد طفرات KIT محركاً شائعاً في أورام GIST، حيث تظهر في حوالي 75% من الحالات، وهي قابلة للاستهداف علاجياً. بعد طفرات تفعيل الإكسون 11، تعد طفرات تفعيل الإكسون 9 في KIT أكثر المحركات الشائعة المحددة، رغم أن أورام GIST ذات الطفرة في الإكسون 9 وأورام GIST ذات الطفرة في الإكسون 11 تختلف في سلوكها فيما يتعلق بالحساسية لمثبطات تيروزين كيناز¹².
1. سير عمل IGV (ملف الجلسة KIT.xml)
  1. تحميل البيانات: اختر جينوم Hg19 وقم بتحميل ملف BAM، KITdupmod2.bam وتأكد من وجود ملف الفهرس (الذي يحمل نفس اسم ملف bam ولكن ينتهي بـ .bai) في نفس المجلد. انتقل إلى الإحداثيات chr4:55,592,144-55,592,257، والتي تقابل جزءاً من الإكسون 9 من جين KIT.
  2. ضغط العرض (Squish): انقر بزر الماوس الأيمن على مسار المحاذاة واختر Squished لضغط العرض (الشكل 3A).
  3. تحديد موقع الإقحام: حدد علامة الإقحام، التي تأخذ شكل رأس سهم، فوق مسار التغطية مباشرة، والموجودة بين الموضعين 55,592,178 و 55,592,179، مما يشير إلى وجود إقحام قصير (الشكل 3B،C).
  4. التفاعل مع الإقحام: انقر فوق رأس السهم لتوسيع العرض، وانقر فوق إحدى القراءات التي تحتوي قواعد تملأ الفجوة لعرض التفاصيل في نافذة منبثقة. قارن التسلسل المقحم بالتسلسل المرجعي لتحديد ما إذا كان تضاعفاً (الشكل 3D،E).
  5. النظر في التغطية: انقر فوق مسار التغطية المجاور مباشرة لرأس سهم الإقحام لعرض عدد القراءات الداعمة، والتي يمكن مقارنتها بإجمالي عدد القراءات لتحديد تردد الأليل المتغير (VAF) التقريبي، وفي هذه الحالة يبلغ ~28%.
  6. التحقق من انحياز الشريط: قم بفرز القراءات حسب شريط القراءة وعاين القواعد المقصوصة برمجياً (soft-clipped) (راجع الملف التكميلي 1، القسم 3) لإظهار المنطقة ذات الأهمية المجاورة للإقحام في القراءات العكسية (الشكل 3F).
الحالة رقم 4: فحص حذف (deletion) في الإكسون 19 لجين EGFR (مستقبل عامل نمو البشرة) في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC).
ملاحظة: خضعت امرأة تبلغ من العمر 70 عاماً تم تشخيصها حديثاً بـ NSCLC لاستئصال جراحي للكتلة. تم طلب NGS على مقطع نسيجي يحتوي على نقاء ورمي كافٍ، وأظهرت النتائج متغيراً محتملاً في EGFR. العديد من طفرات EGFR تستجيب لمثبطات تيروزين كيناز، وقد يكون لهذا المتغير تأثير على العلاج والإنذار للمريضة¹³.
1. سير عمل IGV (ملف الجلسة EGFR.xml)
  1. تحميل البيانات: اختر جينوم Hg19، وقم بتحميل ملف bam المسمى EGFRE746_A750delmod.bam، وتأكد من وجود ملف الفهرس (الذي يحمل نفس اسم ملف bam ولكن ينتهي بـ .bai) في نفس المجلد، وانتقل إلى الإحداثيات chr7:55,242,420-55,242,513، والتي تقابل جزءاً من الإكسون 19 من جين EGFR.
  2. فحص الحذف باستخدام مسار التغطية: راجع مسار التغطية لتحديد منطقة صغيرة ذات تغطية أقل لا تقع في نهايات القراءات (الشكل 4A،B). يظهر فحص مسار التغطية تغطية منخفضة فوق جزء صغير من الإكسون 19.
  3. فحص الحذف باستخدام القراءات: قم بتوسيع عرض المحاذاة لإظهار القراءات التي تحتوي على فجوة محاذاة، والتي تُمثل بخط أسود داخل القراءة (الشكل 4C،D).
  4. مراعاة السياق الجينومي: افحص تسلسل النيوكليوتيدات المرجعي المتورط في الحذف والمحيط به مباشرة. قيم نتيجة الحذف في سياق موقعها ضمن التسلسل المرجعي، حيث أن عمليات الحذف في المناطق متجانسة البوليمر أو المناطق المتكررة قد تمثل خللاً في التسلسل، خاصة عندما تكون موجودة بتردد أليل متغير منخفض. راجع جزء Viewing a small deletion في الملف التكميلي 2 للحصول على وصف تفصيلي لسير العمل.
الحالة رقم 5: فحص تغيرات EGFR في مريضة مصابة بالورم الأرومي الدبقي.
ملاحظة: خضعت امرأة تبلغ من العمر 77 عاماً مصابة بورم أرومي دبقي من النوع البري لجين IDH لاختبار تسلسل الجيل القادم (NGS). تشير نتائجها إلى زيادة محتملة في عدد نسخ EGFR وإعادة ترتيب محتملة في EGFRvIII (حذف الإكسونات 2–7). لكل من تضخم EGFR وتغيرات EGFRvIII أهمية إنذارية وعلاجية في الورم الأرومي الدبقي. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يتزامن هذان التغييران، مما يعني أن وجود أحدهما قد يدعم صحة الآخر عند اكتشافه بمستويات منخفضة.
1. سير عمل IGV (ملف الجلسة copynumber.xml):
  1. تحميل البيانات: اختر جينوم Hg38، وقم بتحميل ملف القطاعات proband.seg، وعينات المقارنة c1.seg-c9.seg، عن طريق سحبها وإسقاطها في نافذة IGV. انتقل إلى Chr7.
    ملاحظة: تتوفر ملفات التقسيم الناتجة عن CNVKit للتنزيل. إن سير العمل الكامل لاستخدام CNVKit لتوليد كمية عدد النسخ خارج نطاق هذه الدراسة. ومع ذلك، باختصار، تم استخدام نسخة CNVKit 0.9.9 (المتاحة للتنزيل من https://github.com/etal/cnvkit) مع مرجع مجمع مسبق يتكون من عينات طبيعية موازية الصيغة (euploid). تتكون المدخلات من ملف bed يحتوي على 9,144 موقع مسبار لهيكل CNV، موزعة عبر الجينوم. هناك اعتبار مهم هنا وهو أن تفاصيل مدخلات ومعاملات مسار عدد النسخ أقل أهمية من حقيقة أن العينات تتم معالجتها باستخدام إعداد موحد لجميع العينات في التشغيلة الواحدة، مما يسهل التعرف على الانحياز المنهجي.
  2. تقييم الخريطة الحرارية: قارن كثافة اللون النسبية بين العينة المعنية (حدد صف الخريطة الحرارية المقابل لهذه العينة، والمسمى proband) والعينات الأخرى (c1-9) للتمييز بين التغيرات الحقيقية في عدد النسخ وبين العيوب التقنية.
    ملاحظة: المقارنة البصرية الرأسية لموقع ما عبر جميع العينات هي الوسيلة لتحديد الشذوذ (اختلافات نوعية بناءً على اختلافات اللون عبر الصفوف بدلاً من الاختلافات الكمية) في موقع معين في كل عينة بالنسبة للخلفية. راجع الشكل 5 وقسم Viewing copy number changes في الملف التكميلي 2 للخطوات التفصيلية.
الحالة رقم 6: فحص EGFRvIII في مريضة مصابة بالورم الأرومي الدبقي.
ملاحظة: لدى المريضة نفسها أيضاً دليل على إعادة ترتيب EGFRvIII (حذف الإكسونات 2–7). لكل من تضخم EGFR وتغيرات EGFRvIII أهمية إنذارية وعلاجية في الورم الأرومي الدبقي. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يتزامن هذان التغييران، مما يعني أن وجود أحدهما قد يدعم صحة الآخر عند اكتشافه بمستويات منخفضة.
1. سير عمل IGV (ملف الجلسة egfr_vIII.xml):
  1. تحميل البيانات: اختر جينوم Hg19، وقم بتحميل ملف bam الخاص بالمريضة proband.bam، وتأكد من وجود ملف الفهرس (الذي يحمل نفس اسم ملف bam ولكن ينتهي بـ .bai) في نفس المجلد، وانتقل إلى جين EGFR.
  2. تصوير نقاط الكسر في EGFRvIII: اضبط العرض لفحص نقاط الكسر المرشحة بشكل فردي (أعلى الإكسون 2 وأسفل الإكسون 7 لـ EGFRvIII)، وقم بإجراء 'الفرز حسب القاعدة' (sort-by-base) (أو استخدم الاختصار Ctrl-s على ويندوز/لينكس أو Cmd-s على ماك) عند نقاط الكسر لتصوير تراكمات القراءات المقصوصة برمجياً.
  3. محاذاة القراءات باستخدام BLAT: انقر بزر الماوس الأيمن على تسلسل مقصوص برمجياً واختر BLAT sequence (يستخدم IGV الإعدادات الافتراضية من UCSC، راجع https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html لمعرفة معاملات BLAT الافتراضية). انقر فوق الصف الأول ولاحظ مسار Blat الذي يظهر في أسفل قسم مسار IGV.
    ملاحظة: حتى القراءة الواحدة التي تتماشى مع الوصلة بين الإكسون 1/الإنترون 1 والوصلة بين الإنترون 6/الإكسون 7 قد تكون دليلاً كافياً على وجود EGFRvIII, طالما تم استبعاد التلوث المتبادل من عينة أخرى كسبب لهذه القراءة. راجع الشكل 6 وقسم Viewing structural rearrangement في الملف التكميلي 2 للخطوات التفصيلية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسة تركز على وصف تفاصيل مراجعة المتغيرات في برنامج IGV لغرض التقارير السريرية. ويجب أن يعتمد التقرير السريري النهائي على مسار العمل المعتمد، ومعايير الجودة، وسياسة إعداد التقارير الخاصة بكل مختبر على حدة. إن المناقشة الكاملة لهذا الموضوع الهام تخرج عن نطاق الدراسة الحالية؛ ومع ذلك، فقد وضعت الكلية الأمريكية للوراثة الطبية وعلم الجينوم (American College of Medical Genetics and Genomics) وجمعية علم الأمراض الجزيئي (Association for Molecular Pathology)⁷ المعايير والإرشادات الموصى بها، والتي يتم تطبيقها بانتظام في المختبرات السريرية.

تفسير السيناريو السريري رقم 1:

نظرًا للقيمة العالية لـ VAF، والتوزيع المتوازن للسلاسل، والحدوث المعروف لطفرة KRAS c.34G>T (p.G12C) في سرطان الرئة (الشكل 2A)، فإن المتغير في الحالة A يمكن أن يؤدي إلى علاج موجه، وبالتالي، من الضروري الإبلاغ عنه سريريًا. وبالرغم من وجود نتيجة إيجابية لنفس متغير KRAS c.34 G>T في الحالة الثانية (ساركوما) (الشكل 2B)، إلا أن هناك العديد من علامات التحذير التي تشير إلى نتيجة إيجابية كاذبة: (1) إن كسر الأليل المتغير (VAF) المُبلغ عنه يبلغ نحو 1%، وهو أقل بكثير مما هو متوقع لحدث سائق (driver event) في سياق عينة يُقدر أن لديها حتى نسبة منخفضة من الخلايا الورمية (20%)، و(2) تُظهر القراءات الداعمة لهذا المتغير انحيازًا في السلسلة، حيث تظهر بشكل حصري تقريبًا على السلسلة الأمامية. وبدمج ذلك مع غياب المعقولية البيولوجية لهذا النوع من السرطان، تشير الأدلة إلى أن النتيجة في الحالة B هي مجرد خلل اصطناعي (artifact).

تفسير الحالة السريرية رقم 2:

توضح هذه الحالة عدة أخطاء متميزة يجب على السريريين أن يكونوا على دراية بها. أولاً، قد تقوم أدوات تحديد المتغيرات (variant callers) بتصنيف المتغيرات الجينية المتجاورة، سواء بشكل صحيح أو غير صحيح، إما على أنها اثنين من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNVs) أو كمتغير نوكليوتيدي متعدد (MNV) واحد (الشكل 2C). ويرجع ذلك إلى الاختلاف في تنفيذ خوارزمية تحديد المتغيرات المدركة للنمط الفرداني (haplotype-aware variant calling algorithm) في أدوات تحديد المتغيرات الجسدية. وهناك عدد قليل فقط من أدوات تحديد المتغيرات التي نُشرت مؤخراً والتي تتضمن هذه الميزة¹⁴^,¹⁵. ثانياً، يتم تزويد قواعد البيانات الخارجية بالاختلافات التقنية وتلك القائمة على التسميات من قبل مراكز التسلسل التي تستخدم مسارات تحليل معلوماتية حيوية (bioinformatic pipelines) مختلفة. وبناءً على ذلك، قد تحتوي هذه القواعد على سجلات متميزة متعددة لما يجب إدراجه كمتغير جيني واحد. وما لم تتم عملية تحديد الطور (phasing) في قاعدة البيانات بشكل دوري، فقد يؤدي ذلك إلى مجموعة متنوعة من الآثار غير المرغوب فيها على التفسير السريري لاحقاً. وبشكل عام، يمكن أن تتضافر هذه المصادر المحتملة للخطأ لتؤدي إلى تقرير مريض غير صحيح. ويسلط هذا السيناريو المعقد الضوء على قيمة تصور المتغيرات باستخدام برامج عالية الجودة مثل IGV.

تفسير الحالة السريرية رقم 3:

بالنظر إلى دعم القراءات المتعددة لعملية التضاعف والآلية المعروفة للتنشيط التأسيسي لـ KIT مع تضاعفات الإكسون 9 في أورام سدى الجهاز الهضمي (GIST)، يمكننا استنتاج أن هذا المتغير KIT c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) حقيقي وليس ناتجاً عن خطأ تقني (الشكل 3). تعد طفرات KIT محركات شائعة في أورام GISTs، حيث تحدث في حوالي 90% من الحالات. ويعد التوصيف الدقيق للمتغير أمراً بالغ الأهمية هنا لأنه بينما تعد طفرات التنشيط في الإكسون 11 هي الأكثر شيوعاً، فإن أورام GISTs التي تعاني من طفرات في الإكسون 9 تسلك سلوكاً مختلفاً فيما يتعلق بالحساسية لمثبطات تيروزين كيناز، مما يؤدي إلى تغيير النهج العلاجي. ونظراً للأهمية السريرية لطفرات KIT في أورام GISTs، يجب إدراج هذا المتغير في التقرير النهائي.

تفسير الحالة السريرية رقم 4:

بالنظر إلى مسار التغطية، والمظهر النمطي للحذف القصير، ودعم القراءات، وآلية التنشيط التلقائي المعروفة لحذوفات الإكسون 19 في جين EGFR في حالات سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، يمكننا استنتاج أن هذا المتغير EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) حقيقي وليس ناتجاً عن خلل تقني (الشكل 4). إن العديد من طفرات EGFR، بما في ذلك حذف الإكسون 19 المعروف جيداً، تكون حساسة للغاية لمثبطات تيروزين كيناز. ونظراً للأهمية السريرية لطفرات EGFR في حالات سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLCs)، يجب إدراج هذا المتغير في التقرير النهائي.

تفسير الحالة السريرية رقم 5 والحالة رقم 6:

تؤكد مناظر الخريطة الحرارية تضخيم EGFR، كما يؤكد تقييم نقطة اتصال الكسر بين الإكسونات 1 و8 باستخدام BLAT كلا النتيجتين لدى هذا المريض (الشكل 5 والشكل 6). يُعتبر تضخيم EGFR عموماً عاملاً إنذارياً يشير إلى مرض أكثر عدوانية، ويُعد إعادة ترتيب جين EGFRvIII علامة حيوية خاصة بـ GBM ومن المحتمل أن تكون قابلة للاستهداف العلاجي¹⁶^,¹⁷.

يمكن إعادة إنتاج سير عمل مختارة باستخدام الملفات المحفوظة في الفرع الرئيسي لمستودع GitHub عبر الرابط https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (تم التحديث في 6/9/2026)، والذي يحتوي على ستة ملفات جلسات، ملف واحد لكل شرح توضيحي، وخمسة أزواج من ملفات bam و bai، زوج واحد لكل شرح توضيحي يستخدم ملف محاذاة، و 10 ملفات seg للشرح التوضيحي الخامس، الذي يستخدم ملفات تقسيم بدلاً من ملفات المحاذاة.

figure-results-1
الشكل 1: معايير ملفات NGS وسير عمل التسلسل. (A) يتم تتبع القراءات القصيرة الناتجة في خلية التدفق من خلال القياسات البصرية وتُخزن بتنسيق FASTQ، والذي يتضمن بيانات التسلسل ودرجات الجودة لكل قاعدة. بعد ذلك يتم فرز هذه القراءات ومحاذاتها مع جينوم مرجعي، مما ينتج عنه ملف BAM حيث يتم "تجميع" كل قراءة في الموقع المطابق لها. (B) يتم تحديد الاختلافات بين المرجع والقراءات (مثل الطفرات النقطية، أو عمليات الإدراج والحذف الصغيرة indels) بواسطة خوارزميات استدعاء المتغيرات (variant-calling algorithms). (C) وأخيرًا، يتم تجميع هذه المتغيرات المكتشفة في ملف VCF، والذي يلخص مواقعها، والقواعد المرجعية/البديلة، وبيانات التوصيف الأخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التصوير المرئي القائم على IGV لـ KRAS c.34G>T (p.G12C) و BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (أ) تصوير متغير حقيقي (KRAS c.34G>T (p.G12C)) في IGV، يظهر عمق قراءة مرتفع (آلاف القراءات) وحوالي 35–40% من القراءات تحمل تغييراً من G→T. القراءات الأمامية (باللون الأحمر) والعكسية (باللون الأزرق) متوازنة، مما يشير إلى طفرة متغايرة الزيجوت حقيقية. (ب) خلل اصطناعي مشتبه به في نسيج غير ذي صلة يظهر متغيراً بدعم قراءة أدنى (1% VAF). تظهر معظم قراءات المتغير على الشريط الأمامي (باللون الأحمر)، مما يشير إلى انحياز الشريط. (ج) متغير معقد BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) يظهر في IGV ويكشف عن استبدال قاعدتين (GT→AA) في وضع cis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تصور إدخال صغير. (A) العرض "المضغوط" (Squished) للإكسون 9 من جين KIT في برنامج IGV يساعد في تحديد المنطقة ذات الأهمية. (B) تحديد المنطقة ذات الأهمية (المربع الأحمر) من خلال تصور شريط الإدخال والقواعد المقصوصة برمجياً (soft clipped bases). (C) ضبط العرض "الموسع" (Expanded) في برنامج IGV للسماح بتصور الإدخال. (D) يؤدي النقر فوق شريط الإدخال (المربع الأحمر) إلى عرض التسلسل المُدخل. (E) تتم مقارنة التسلسل المُدخل بالتسلسل المرجعي لتحديد القواعد المكررة. (F) فرز القراءات حسب شريط القراءة (read-strand)، مما يوضح أن القواعد المقصوصة برمجياً تتوافق مع الإدخال في القراءات العكسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تصور حذف صغير. (A) عرض "مضغوط" للإكسون 19 من جين EGFR يوضح الحذف الموجود في قراءات عديدة. (B) استخدام مسار التغطية لمراجعة عدد القراءات في المواقع الواقعة ضمن الحذف والمجاورة له. (C) عرض "موسع" يوضح الحذف، ويحدد عدد القواعد المحذوفة. (D) المقارنة مع التسلسل المرجعي (المربع الأحمر) تحدد القواعد المحذوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تصوير زيادة عدد النسخ. (A) يتكون ملف seg من ستة أعمدة: معرف العينة، والكروموسوم، ونقطة البداية، ونقطة النهاية، والعلامات في القطعة، ومتوسط القطعة. (B) يسمح تحميل ملفات seg مباشرة في برنامج IGV بتصور مريح للبيانات. (C) تصور البيانات في عرض شامل للجينوم. ستظهر كل عينة كصف من البيانات، مع ألوان تحدد القيم؛ اللون الأحمر للقيم >0 واللون الأزرق للقيم <0، وتعكس الألوان الأكثر كثافة القيم الأبعد عن 0. عند فتح العينة المعنية وتسع عينات عشوائية من نفس التشغيل، تظهر النتائج في خريطة حرارية متعددة العينات مكونة من عشرة صفوف. تم تظليل العينة المعنية في الأسفل داخل المربع الأحمر. (D) عند تضييق العرض إلى موقع جين EGFR، يظهر شريط أحمر في العينة المعنية في الأسفل، وأشرطة بيضاء أو زرقاء للعينات العشوائية. يوضح هذا التباين اللوني بين العينة المعنية والعينات العشوائية في الصفوف الأخرى أن تحديد التضخيم في العينة المعنية يتجاوز مستوى الخلفية أو الضجيج في هذا الموقع. (E) عند التكبير للخروج لرؤية chr7، يلاحظ تباين بين الموقع الذي يحتوي على EGFR في عينتنا وعدم وجوده في العينات العشوائية. يظهر تضخيم EGFR كشريحة حمراء في العينة السفلية. (F) عند تضييق العرض إلى موقع جين MET ، يتكرر تضخيم MET بدرجات متفاوتة عبر العينات العشوائية التسع جنباً إلى جنب مع العينة المعنية، مما يشير إلى أن تحديد التضخيم هذا هو مجرد خلل تقني (artifact). يسلط هذا الضوء على الفرق في المظهر بين التحديد الحقيقي لعدد النسخ في موقع EGFR وبين الخلل التقني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تصوير إعادة ترتيب جين EGFRvIII. قبل العمل على هذه الحالة، تأكد من إعداد تصور القواعد ذات القص الناعم (انظر الملف التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل). (A) انتقل إلى أول وصلة مرشحة واضبط عرض مسار المحاذاة على "Squished". (B) تحرك عبر الموضع، مع تطبيق اختصار الفرز حسب القاعدة "control-s" بشكل متكرر، حتى يصبح تراكم للقراءات ذات القص الناعم المماثلة مرئياً في الجزء العلوي من مسار المحاذاة. كلما زادت كمية القراءات ذات القص الناعم المماثلة (المربع الأحمر) في التراكم، زادت الثقة في وجود إعادة ترتيب هيكلي. (C) تقوم أداة BLAT باستخراج تسلسل القواعد ذات القص الناعم وتحدد مكان وجود هذا التسلسل في الجينوم، إلى جانب درجة كمية تقيس مدى تطابق التسلسل مع تسلسل محدد في قاعدة بيانات مستهدفة. سيؤدي تحديد صف معين إلى الانتقال إلى ذلك الموقع. (D) يظهر استخدام وظيفة الفرز حسب القاعدة "control-s" مرة أخرى تراكم القص الناعم، ولكن هذه المرة على الجانب المقابل من القراءات. وللتأكيد على عدم وجود قواعد إضافية في العينة بالنسبة للمرجع hg38، انقر بزر الماوس الأيمن فوق قراءة تحتوي على سلسلة من القواعد ذات القص الناعم وقم بإجراء BLAT للقواعد ذات القص الناعم مرة أخرى. يعرض الجدول الناتج نقطة الكسر الأولى للوصلة، وهي الموضع الذي تم تصويره في البداية، أي وصلة exon 1-intron 1. (E) يؤدي تحديد الصف العلوي إلى العودة إلى نقطة الكسر الأولى. القواعد عند وصلة محاذاة مرجع BLAT مطابقة للقواعد ذات القص الناعم المستخدمة في الاستعلام، مما يشير إلى أن سلسلة القراءات ذات القص الناعم بالكامل موجودة في محاذاة التسلسل المرجعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: إعداد IGV الموصى به.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: سير العمل المكثف.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد المراجعة الدقيقة للمتغيرات من أجل التقارير السريرية على خوارزميات معلوماتية حيوية معقدة ودمج المراجعة المرئية للمتغيرات المعقدة باستخدام برنامج IGV⁵^,⁶. صُممت هذه الدراسة لتجميع مورد موجز من الإعدادات الموصى بها لتصور التغيرات الجينومية البسيطة والمعقدة في IGV (الملف التكميلي 1). تركز هذه الدراسة على التغيرات الجسدية الشائعة وكيفية مراجعتها في IGV.

يبدأ البروتوكول بتقييم طفرة استبدال بسيطة (الشكل 2A) وطفرة استبدال معقدة (الشكل 2C)، مع إيلاء اهتمام خاص لتحديد ما إذا كانت النتيجة المحددة حقيقية أم مجرد خلل تقني (artifact). ثم ينتقل إلى دراسة عملية إقحام بسيطة (الشكل 3) وحذف بسيط (الشكل 4)، مع تسليط الضوء على كيفية ظهور هذه التغيرات في برنامج IGV. وأخيراً، يتناول التغيرات الجينومية المعقدة، بما في ذلك تغيرات عدد النسخ (الشكل 5) وإعادة الترتيب الهيكلي (الشكل 6). تم تلخيص سير العمل المكثف الذي يبرز الخطوات الرئيسية لكل ميزة من هذه الميزات في الملف التكميلي 2. تهدف هذه الدراسة إلى تعريف القارئ بكيفية ظهور التغيرات الجينومية المختلفة في برنامج IGV⁵.

تجدر الإشارة إلى أن برنامج IGV لا يُستخدم كأداة ضمن مسار تحليلي للكشف عن المتغيرات بشكل مستقل. ورغم أن ذلك يخرج عن نطاق هذه المخطوطة، إلا أنه يُوصى بشدة للمختبرات البحثية، ويُشترط للمختبرات السريرية¹^,⁷، أن تتناول السياسات والإجراءات المختبرية المتغيرات الواجب الإبلاغ عنها بناءً على قيود التحقق من المقايسة فيما يخص كسر أليل المتغير وعمق التغطية، وما إذا كان التأكيد المتعامد مطلوباً للمتغيرات في ظل ظروف معينة، والتعقيدات المتعلقة بإصدارات برمجيات المعلوماتية الحيوية، والتباين بين الملاحظين في التفسير البصري.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفصح جميع المؤلفين عن عدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون لجميع مطوري برنامج IGV وكذلك منحة NIH التي تمول تطوير IGV حالياً: U24CA258406. لم يتم تلقي أي تمويل لتطوير هذه الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BLAT	البحث في الجينوم باستخدام BLAT	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	صفحة ويب BLAT مستقلة. تتوفر واجهة برمجة تطبيقات BLAT API ضمن IGV، ولا يتطلب الأمر أي تثبيت إضافي
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	مستودع gitHub عام يتوفر فيه CNVKit للتحميل مجانًا. تتوفر تعليمات تحميل/تشغيل CNVKit هنا أيضًا.
ملف مقطع المقارنة رقم 1 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 2 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 3 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 4 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 5 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 6 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 7 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة رقم 8 للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	ملفات عدد النسخ
ملف مقطع المقارنة للمثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	ملفات عدد النسخ
تسلسل الجينوم البشري	تسلسل الجينوم البشري	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	ملف fasta قابل للتحميل يحتوي على إصدار الجينوم البشري Hg38. وهذا متاح ضمن IGV، ولا يتطلب الأمر أي تحميل إضافي
تسلسل الجينوم البشري	تسلسل الجينوم البشري	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	ملف fasta قابل للتحميل يحتوي على إصدار الجينوم البشري Hg19. وهذا متاح ضمن IGV، ولا يتطلب الأمر أي تحميل إضافي
حزمة برنامج IGV	برنامج IGV	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	برنامج IGV الإصدار 2.19.7 مع Java (JDK 21)، متاح للتحميل مجانًا. الرابط هنا مخصص لنظام windows، بينما تتوفر أيضًا روابط لنظامي Linux وMac.
ملف المقطع لحالة المثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	ملفات عدد النسخ
مستودع GitHub التعليمي	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	مستودع GitHub عام يحتوي على جميع الملفات اللازمة لإعادة إنتاج الأمثلة التوضيحية الستة
المثال التوضيحي رقم 1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	ملفات الجلسة
فهرس bai للحالة أ من المثال التوضيحي رقم 1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	ملفات المحاذاة
ملف محاذاة bam للحالة أ من المثال التوضيحي رقم 1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	ملفات المحاذاة
فهرس bai للحالة ب من المثال التوضيحي رقم 1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	ملفات المحاذاة
ملف محاذاة bam للحالة ب من المثال التوضيحي رقم 1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	ملفات المحاذاة
المثال التوضيحي رقم 2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	ملفات الجلسة
فهرس bai للمثال التوضيحي رقم 2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	ملفات المحاذاة
ملف محاذاة bam للمثال التوضيحي رقم 2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	ملفات المحاذاة
المثال التوضيحي رقم 3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	ملفات الجلسة
ملف فهرس bai للمثال التوضيحي رقم 3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	ملفات المحاذاة
ملف محاذاة bam للمثال التوضيحي رقم 3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	ملفات المحاذاة
المثال التوضيحي رقم 4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	ملفات الجلسة
ملف المحاذاة للمثال التوضيحي رقم 4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	ملفات المحاذاة
فهرس bai للمثال التوضيحي رقم 4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	ملفات المحاذاة
المثال التوضيحي رقم 5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	ملفات الجلسة
المثال التوضيحي رقم 6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	ملفات الجلسة
فهرس bai للمثال التوضيحي رقم 6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	ملفات المحاذاة
ملف محاذاة bam للمثال التوضيحي رقم 6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	ملفات المحاذاة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

VCF BAM

تفسير المتغيرات السريرية باستخدام مستعرض الجينوميات التكاملي (IGV) لأخصائيي علم الأمراض الجزيئي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة