طريقة محددة قائمة على الهيدروجيل لتوليد عضويات الثدي ثلاثية الأبعاد في الإنسان تعيد تكوين الشكل الثدي

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة محددة تعتمد على الهيدروجيل لتوليد عضويات الثدي البشرية التي تعيد تلخيص السمات الرئيسية لتكوين الثدي في نظام زراعة ثلاثي الأبعاد محكم.

الملخص

يظل تطوير أنظمة نماذج بشرية ذات صلة فسيولوجية تعيد ملخص بنية الأنسجة وديناميكيات حالة الخلايا تحديا كبيرا في دراسة تطور الثدي والأحداث المبكرة في السرطان الطبيعي. تفشل الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد والعديد من الأنظمة ثلاثية الأبعاد في التقاط التنظيم البنيوي والإشارات البيئية الدقيقة التي تحدد الغدة الثديية البشرية. هنا، نصف طريقة قابلة للتكرار لتوليد عضويات الثدي ثلاثية الأبعاد من خلايا ظهارية أولية مدمجة ضمن مصفوفة هيدروجيل محددة تتكون من الكولاجين من النوع الأول، واللامينين، والفيبرونكتين، وحمض الهيالورونيك. يدعم هذا النظام تقدم الخلايا المفردة عبر مراحل رئيسية من تشكل الثدي، بما في ذلك توسع السلف، وتشكيل النمط الطلائي، وتكوين هياكل تشبه وحدات القناة الفصية النهائية، بالإضافة إلى ظهور حجرة شبيهة بالميزنشيم، خلال فترة زراعة مدتها 21 يوما. نوفر بروتوكولا خطوة بخطوة لتحضير الهيدروجيل، وزرع الخلايا، وظروف الزراعة. تتوافق الطريقة مع التصوير عالي المحتوى والتحليل الكمي لعدد العضويات، وتوزيع الحجم، وتعقيد العمارة. تتيح هذه المنصة دراسات ميكانيكية للمرونة الظهارية والاضطرابات البيئية، مما يوفر نظاما قابلا للتوسع وذو صلة بيولوجية للتحقيق في التغيرات المبكرة على مستوى الأنسجة المرتبطة بخطر سرطان الثدي.

المقدمة

فهم تطور الغدد الثديية البشرية والأحداث المبكرة التي تعرضت للأنسجة للتحول الخبيث يتطلب أنظمة تجريبية تلخص بأمانة بنية الأنسجة، والتسلسل الخلوي، والإشارات البيئية الدقيقة. بينما قدمت الثقافات الظهارية ثنائية الأبعاد رؤى ميكانيكية مهمة، إلا أنها تفتقر إلى السياق البنيوي اللازم لنمذجة تنظيم الظهارة والتشكل¹. أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد الحالية، بما في ذلك تلك القائمة على مستخلصات الأغشية القاعدية، قد طورت المجال لكنها لا تزال محدودة بسبب التركيب المتغير، وعدم السيطرة الكاملة على مكونات المصفوفة خارج الخلية، والدعم غير المتسق لبنية الأنسجة ذات الرتبة^{العليا 1}. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأنظمة العضوية المعتمدة على مستخلصات الأغشية القاعدية مقيدة بعدم قدرتها على دعم ظهور تنظيم شبيه بالأنسجة^{بشكل مستمر 1}. على وجه الخصوص، تعتمد العديد من الأنظمة على مكونات البثوضية الخارجية بدلا من تمكين التطور الداخلي لبيئات دقيقة داعمة، مما يحد من قدرتها على نمذجة التفاعلات الظهارية–الميزنكيمية التي تشكل مركزية لتطور الأنسجة والمرض. تقيد هذه القيود الدراسة القابلة للتكرار لعمليات التطور، والمرونة الظهارية، وتأثيرات الاضطرابات البيئية أو الجزيئية على تنظيم الأنسجة.

ولمعالجة هذه القيود، طورنا نموذجا ثلاثي الأبعاد للثدي العضوي البشري المعتمد على الهيدروجيل، والذي يمكن الخلايا الظهارية الأولية من توليد هياكل منظمة ضمن مصفوفة خارج الخلية المحددة 2,3,4,5,8. يتكون الهيدروجيل من الكولاجين من النوع الأول، واللامينين، والفيبرونيكتين، وحمض الهيالورونيك، وهي مكونات يتم اختيارها بناء على أدوارها المعروفة في تطور الغدد الثديية وتكوين الظهارة. تتفاعل هذه الجزيئات المصفوفة خارج الخلية مع مستقبلات خلوية مميزة، بما في ذلك الإنتجرينات ومستقبلات مجال الديسكويدين وCD44 وRHAMM، ومعروفة بتنظيم القطبية الظهارية، وتكوين الشكل المتفرع، وصيانة الخلايا الجذعية، والتحويل الميكانيكي، وتنظيم الأنسجة في الغدة الثديية ^6,7. أظهرت الدراسات السابقة التي وصفت هذا النظام الهيدروجيلي أن دمج هذه المكونات المصفوفة خارج الخلوية حسن بشكل ملحوظ من تكوين القنوات الفصية ونضج الظهارة مقارنة بالحالات التي تعتمد على الكولاجين فقط أو المعتمدة على ماتريجيل ^3,8. بالإضافة إلى ذلك، كانت الخصائص الفيزيائية لهذا التركيبة من الهيدروجيل قد تميزت سابقا بمجهر القوة الذرية، مما أظهر أن مصفوفة الهيدروجيل المركب خارج الخلية أظهر صلابة أقل وزيادة في التورم مقارنة بالجل الكولاجين فقط (معامل يونغ: 256.7 ± 20.0 باسكال مقابل 559.2 ± 204.0 باسكال على التوالي)، مما يتوافق مع بيئة مصفوفة أكثر ليونة وترطيبا⁸.

ومن المهم أن هذا النموذج يدعم ظهور حجرة شبيهة بالميزنشيم تنشأ جنبا إلى جنب مع البنى الظهارية، مما يوفر دعما هيكليا وإشارات داخليا يعكس بشكل أوثق تنظيم الأنسجة الطبيعية³. تم تقييم الأهمية الفسيولوجية لهذا النظام الهيدروجيلي من خلال مقارنات مباشرة مع الزراعة العضوية التقليدية القائمة على ماتريجيل باستخدام التحليلات الشكلية والتحليل الترانسكريبتوميك. أظهرت الدراسات السابقة أن زراعة الهيدروجيل دعمت تكوين أنسجة قنوية-فصوصية أكثر تنظيما وتمايز متعدد السلالات مقارنة بالثقافات المعتمدة على الماتريجيل، مع الحفاظ أيضا على استجابة الهرمونات⁸. مؤخرا، أظهرت تحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي المدمج أحادي الخلية التي قارنت بين الأعضاء المشتقة من الهيدروجيل، والعضويات المزروعة في الماتريجيل، والأنسجة الأولية للثدي البشرية أن العضويات الناتجة بالهيدروجيل تعيد بشكل أكثر دقة تسلسل الهرم الطلائي، والتنوع الخلوي، والتفاعلات الظهارية–الميزنكيمية الموجودة في نسيج الثدي البشري الأصلي³. على النقيض من ذلك، كانت العضويات المزروعة في الماتريجيل غنية بحالات القاعدة الهجينة التكاثرية وتفتقر إلى مجموعات شبيهة بالسترومال الهوائية، مما يتوافق مع التجميع الذاتي للظهارة بدلا من التكوين العضوي الموجه.

يوفر البروتوكول الموضح هنا طريقة قابلة للتكرار والتوسع لتوليد الأعضاء من الأنسجة البشرية الأولية، مع خطوات اختيارية لاستنزاف الخلايا الليفية وتفككها إلى خلايا فردية. نظرا لأن هذه المنصة متوافقة مع التصوير الحي، والتصوير عالي المحتوى، والتحليل المورفومتري الكمي، وتتبع الخلايا، ودراسات الاضطراب الجيني، يمكن دمجها مع الأساليب اللاحقة التي تقيم عدد الأعضاء وحجمها وبنيتها وديناميكيات النمو. لذلك، توفر هذه المنصة نظاما بيولوجيا ذا صلة لدراسة تطور الثدي البشري، واللدونة الظهارية، والتفاعلات بين الظهارة والبيئة الدقيقة، واستجابات الأنسجة للاضطرابات النمائية أو الجزيئية أو البيئية.

يتم تقديم نظرة عامة تخطيطية لسير العمل، بما في ذلك معالجة الأنسجة، تحضير الهيدروجيل، زراعة العضويات، تقدم النمو، والتحليلات اللاحقة، في الشكل 1، بينما تظهر الأشكال العضوية التمثيلية التي تم توليدها باستخدام هذه المنصة في الشكل 2.

الشكل 1. نظرة عامة على سير عمل توليد العضويات المعتمدة على الهيدروجيل. (أ) مخطط انسيابي يلخص سير عمل البروتوكول، بما في ذلك جمع الأنسجة، معالجة الأنسجة، الحفظ بالتجميد، الاسترداد وتحضير الخلايا الاختياري، تحضير الهيدروجيل، زراعة العضويات، تطوير العضويات، والتطبيقات التحليلية لاحقا. (ب) مخطط بصري يصور المراحل الرئيسية لبروتوكول توليد العضوية المعتمدة على الهيدروجيل، بما في ذلك معالجة وتحضير الأنسجة، والاسترداد والتحضير الاختياري للخلايا، وتحضير الهيدروجيل والبذور العضوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. أشكال عضوية تمثيلية مولدة في نظام الهيدروجيل المعرف. صور مميزة ممثلة للعضويات المشتقة من أنسجة بشرية مختلفة تم زراعتها في مصفوفة الهيدروجيل المحددة. تم تصوير عضويات الثدي الناتجة عن الخلايا الظهارية المفردة المشتقة من جراحة التصقل في اليوم الحادي والعشرين من الزراعة. تم تصوير عضويات الزينوغرافات المشتقة من المريض الناتجة عن شظايا الأورام في اليوم السادس عشر من الزراعة. تم تصوير عضويات الغدد اللعابية الناتجة عن شظايا ظهارية في اليوم الثالث من الزراعة. تم تصوير عضويات الكلى الناتجة عن شظايا الظهارة في اليوم السابع عشر من الزراعة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

تم الحصول على الأنسجة الأولية التي كان من الممكن التخلص منها كنفايات طبية بعد الجراحة وفقا لجميع القوانين ذات الصلة باستخدام بروتوكولات وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية في مركز مين الطبي ومركز تافتس الطبي. تم إخفاء هوية جميع الأنسجة قبل النقل ولم يكن بالإمكان تتبعها إلى مرضى محددين. لهذا السبب، حصل هذا البحث على حالة استثناء من لجنة استخدام البشر كمواضيع تجريبية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وفي جامعة تافتس للعلوم الصحية (IRB #13521). جميع المرضى المسجلين في هذه الدراسة وقعوا على نموذج موافقة مستنيرة يوافقون على المشاركة في الدراسة ونشر النتائج.

1. معالجة الأنسجة وتحضيرها

ملاحظة: قم بجميع الإجراءات المتعلقة بالأنسجة البشرية وفقا للإرشادات المؤسسية للسلامة البيولوجية والأخلاقيات. راجع مخططات سير العمل المعروضة في الشكلين 1A و1B للحصول على نظرة بصرية على خطوات البروتوكول وسير عمل تحضير الأعضاء قبل بدء الإجراء.

1. تحضير MEGM باستخدام وسط قاعدي للظهارة الثديية مع مكمل مستخلص الغدة النخامية البقري 52 ميكروغرام/مل، وعامل نمو بشري بشري 10 نانوغرام/مل، و5 ميكروغرام/مل إنسولين، و500 نانوغرام/مل هيدروكورتيزون، و1٪ (v/v) جلوتا ماكس، و1٪ (v/v) مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X).
2. جهز وسط التفكك بإضافة 1.5 ملغ/مل كولاجناز A (مخزن عند −20°C) و100 U/mL هيالورونيداز (مخزن عند 4°C) إلى وسط نمو ظهارة الثدي (MEGM).
3. يتلقون أنسجة الثدي البشرية التي تم الحصول عليها من عمليات استئصال الثدي الوقائية وعمليات تصغير الثدي خلال 24 ساعة من الاستئصال، غير مثبتة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، ويحافظ عليها عند 4°C. وزن النسيج على ميزان دقيق لتحديد الوزن الكلي للنسيج.
4. ضع النسيج في خزانة أمان حيوي معقمة. قم بتقطيع النسيج ميكانيكيا^إلى شظايا بحجم 3 مم باستخدام مشارط معقمة. انقل حوالي 2–3 جرام من الأنسجة المفروم إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. أضف 10 مل من وسط التفكك إلى كل أنبوب.
5. حضن الأنابيب عند 37°C على محول مداري بسرعة 8 دورات في الدقيقة لمدة 12–18 ساعة لهضم الأنسجة إنزيما. اعتبر الهضم مكتملا عندما لا تبقى شظايا كبيرة من الأنسجة ويكون تعليق متجانس لمادة مجزأة بشكل متساو مرئيا في جميع أنحاء الوسط.
6. دع شظايا الظهارة تستقر بالجاذبية لمدة 5 دقائق. تأكد من عدم وجود شظايا مرئية معلقة في الوسط وأن هناك كرة مميزة. قم بإخراج المحلول الزائد بعناية وتخلص منه دون إزعاج الحبيبة.
   ملاحظة: يحتوي الفائق على خلايا البترومال ومكونات مصفوفة، ويمكن غسله واستخدامه أو حفظه في دراسات أخرى.
7. أعد تعليق الحبيبة في وسط غسيل بسعة 10 مل يتكون من مصل بقري جنيني بنسبة 5٪ (FBS) في PBS. الطرد المركزي عند 250 × جرام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي بدلو متحرك في درجة حرارة الغرفة.
8. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات إضافية أو حتى يصبح السائل الشفاف خاليا من الحطام الظاهر.
9. أعد تعليق الحبيبة النهائية في وسط تجميد يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) في MEGM بحجم 1 مل لكل جرام من وزن النسيج الأولي.
   تحذير: DMSO ضار عند ملامسته أو استنشاقه. التعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والعمل في غطاء السلامة الكيميائية إذا كانت هناك حاجة لإرشادات المؤسسات.
10. أليكوت 1 مل من نظام التعليق في كل جهاز تجميد. ضع المجمدات المبردة عند −80°C في حاوية تجميد قبل تخزينها طويل الأمد في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: تمثل هذه الخطوة نقطة توقف. تخزين العينات عند −80°C قبل نقلها إلى ظروف تخزين طويلة الأمد.

2. التعافي وتحضير الخلايا الاختياري

1. الذوبان والتعافي الأولي
   1. إزالة الأنسجة المحفوظة بالتبريد من تخزين −80°C بعد التجميد لمدة لا تقل عن 24 ساعة، أو من التخزين طويل الأمد للنيتروجين السائل. اغمر الكرويفيال فورا حتى الغطاء في حمام ماء بدرجة حرارة 37°C واذيب بسرعة لمدة دقيقة واحدة لتقليل موت الخلايا.
      ملاحظة: حرك الكريوفيال بلطف أثناء الذوبان لضمان تدفئة منتظمة.
   2. بمجرد إذابة الدماغ الكامل، انقل فورا محتويات الكريوفيال إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 10 مل من MEGM. الطرد المركزي عند 250 × جرام لمدة 5 دقائق.
2. استنزاف الأرومات الليفية الاختياري
   ملاحظة: استنزاف الأرومات الليفية عن طريق الطلاء المسبق هو خطوة إثراء اختيارية تستخدم لتقليل أعداد البترومات أو الأروميات الليفية الملتصقة بسرعة عندما يرغب في وجود مجموعة أولية أكثر ثراء بالظهارة. هذه الخطوة غير مطلوبة لتكوين العضويات ويمكن تعديلها حسب الهدف التجريبي.
   1. أعد تعليق الرصاصة في 10 مل من MEGM.
   2. انقل النسيج المعلق إلى طبق زراعة خلايا بحجم 10 سم. حضن عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂ لمدة 90 دقيقة للسماح بتثبيت الأرواح الليفية.
      ملاحظة: لا تزعج طبق الزراعة أثناء الحضانة لضمان التصاق فعال للأروية الليفية.
   3. اجمع المادة الفائقة التي تحتوي على خلايا غير ملتصقة باستخدام ماصة مصلية بحجم 10 مل مع إمالة طبق الزراعة بلطف إلى حوالي 45°. اشطف الطبق بلطف بسعة 5 مل من PBS وامزج الغسل مع السوبرناتانت المجمع.
   4. قم بجهاز الطرد المركزي بنظام التعليق المشترك عند 250 × جرام لمدة 5 دقائق لاستعادة المواد المخصبة بالظهارة.
      ملاحظة: الخلايا التي التصقت بالصفيحة تثري لعمل الأرومات الليفية للغدد الثديية، ويمكن تكاثرها بشكل منفصل بإضافة وسط مكون من DMEM + 10٪ FBS ومضادات حيوية.
3. التفكك الاختياري إلى الخلايا المفردة
   1. أعد تعليق الحبيبة في محلول إنزيم تفكيك مدفأ مسبقا (37°C) يتكون من 0.25٪ تريبسين. قد تتطلب كواشف التفكك البديلة تحسينا. انقل نظام التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل. قم بتثبيط العينة 20 مرة باستخدام ماصة P1000 لتعزيز التفكك.
      تحذير: قد تكون مواد التفكك الإنزيمي ضارة. تعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وتجنب التواصل البشري أو البصري.
   2. حضن الأنبوب عند 37°C لمدة 3-5 دقائق. يتم تفكيك العينة ميكانيكيا مباشرة بعد الحضانة عن طريق التفكيك 20 مرة باستخدام ماصة P1000.
   3. أضف 1 مل من وسط الغسيل المحتوي على المصل لتحييد التفاعل الإنزيمي. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق.
   4. أعد تعليق الحبيبة في محلول ديسباز 300 ميكرولتر (5 U/mL) ومحلول DNase بسعة 30 ميكرولتر (1 ملغ/مل). حضن الغرفة عند 37°C لمدة 3–5 دقائق.
   5. قم بتفكيك العينة ميكانيكيا عن طريق التوصيل بالماصة 15–20 مرة. أضف وسط غسيل يحتوي على السيروم بسعة 700 ميكرولتر إلى نظام التعليق.
   6. قم بترشيح تعليق الخلية عبر مصفاة خلايا بقطر 40 ميكرومتر إلى أنبوب نظيف. يمكن استخدام مصفاة خلايا قياسية بحجم 40 ميكرومتر أو مصفاة فلومي ذات رأس الماصة. قد تقلل مصفاات فلومي من فقدان العينات عند العمل مع أعداد خلايا محدودة.
   7. حدد عدد الخلية الصالح باستخدام استبعاد الأزرق التريباني. اخلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع اللون الأزرق التريبان بنسبة 1:1 وحمل 10 ميكرولتر من الخليط في غرفة عد الخلايا أو شريحة العد. تحديد مدى بقاء الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم الخلوي.
   8. قم بعمل نظام الطرد المركزي في نظام التعليق عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   9. أعد تعليق حبيبات الخلية في MEGM بالتركيز المطلوب لتلقيح الهيدروجيل.
      ملاحظة: بالنسبة لتجارب التلقيح على خلية واحدة، تتراوح المدخلات النموذجية بين حوالي 1,000–5,000 خلية لكل 200 ميكرولتر هيدروجيل، وذلك حسب الهدف التجريبي وخصائص عينة المتبرع. تستخدم كثافات البذور المنخفضة عادة في التصوير الحي ودراسات الشكل لتسهيل تتبع تطور الأعضاء الفردية، بينما تستخدم الكثافات الأعلى عادة في التحليلات الجزيئية النهائية، بما في ذلك جمع الحمض النووي الريبي والبروتينات.

3. تحضير الهيدروجيل والبذور العضوية

1. تحضير المخزون وحسابات الحجم
   1. ضع محلول اللامينين (1.18 ملغ/مل)، ومحلول حمض الهيالورونيك (1 ملغ/مل في ماء معقم)، ومحلول الفيبرونكتين (2 ملغ/مل في ماء معقم)، وPBS 1× على الثلج قبل الاستخدام. خزن أليكوتات اللامينين والفيبرونيكتين عند −80°C وتخزين محلول حمض الهيالورونيك عند 4°C. إذابة المكونات المجمدة ببطء على الجليد عند 0°C إلى 4°C قبل الاستخدام.
   2. حضر محلول مكمل مكملات مصفوفة خارج الخلوية بحجم 25×. لتحضير 1 مل، اجمع 425 ميكرولتر من اللامينين، 250 ميكرولتر حمض الهيالورونيك، 250 ميكرولتر فيبرونيكتين، و75 ميكرولتر PBS في أنبوب مثبت على الثلج. اخلط بلطف عن طريق قلب الأنبوب 3–4 مرات. احتفظ بالمحلول عند 4°C لمدة تصل إلى شهر.
   3. حدد حجم وتركيب الهيدروجيل النهائي المطلوب قبل التحضير. جهز حجم زائد لا يقل عن 20٪ لتعويض فقدان المواد أثناء التوصيل والنقل في السعر.
      ملاحظة: تركيبة الهيدروجيل تتكون من كولاجين I، وهو تركيز نهائي 1× من مكملات المصفوفة خارج الخلية (من مخزون 25×)، و12.5٪ (v/v) 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم بالنسبة لحجم الكولاجين I لتحييد الحموضة والبلمرة.
      ملاحظة: التركيزات النهائية للهيدروجيل هي 1.7 ملغ/مل كولاجين I، 20 ميكروغرام/مل لامينين، 20 ميكروغرام/مل فيبرونكتين، و10 ميكروغرام/مل حمض الهيالورونيك.
   4. احسب الحجم المطلوب للكولاجين I (_{كولاجين} V) باستخدام الصيغة التالية:
      
      هنا، C_{النهائي} = 1.7 mg/mL، V_الكلي هو حجم الهيدروجيل النهائي المطلوب، _ومخزون C هو تركيز محلول الكولاجين. استخدم تركيزات مخزون الكولاجين بين 2–12 ملغ/مل.
      ملاحظة: قد يختلف تركيز مخزون الكولاجين بين الدفعات. التركيزات الأعلى تزيد من اللزوجة ويجب أن تصب ببطء.
   5. احسب حجم هيدروكسيد الصوديوم 0.1 نيوتن (V_NaOH) باستخدام الصيغة التالية:
      V_NaOH = 0.125 ×_{كولاجين} V
      حضر محلول هيدروكسيد الصوديوم بقوة 0.1 نيتروفن عن طريق تخفيف 1 نيتروفن من هيدروكسيد الصوديوم في ماء معقم.
   6. احسب حجم مكمل المصفوفة خارج الخلية (V_ES) باستخدام الصيغة التالية:
      
   7. احسب الحجم المتبقي الذي سيتم ملؤه بوسط النمو باستخدام الصيغة التالية:
      _{وسط نمو} V = _{V إجمالي} - (_{كولاجين} V + _{V NaOH} + V_ES + _{V خلايا/نسيج} V)
      ملاحظة: حدد حجم الخلايا أو شظايا الأنسجة لكل تجربة على حدة. استخدم نطاقا نموذجيا يتراوح بين 10–100 ميكرولتر ضمن الحجم المسموح به. لا يتم إجراء عد دقيق للشظايا لأن حجم وتركيب الشظايا يختلف بشكل كبير بين التحضيرات. توحيد التلقيح من خلال التقييم البصري لوفرة وتوزيع الشظايا.
2. تحضير خليط الهيدروجيل الرئيسي
   1. ضع الكولاجين I، مكمل المصفوفة خارج الخلية، هيدروكسيد الصوديوم (0.1 نيوتن)، ووسط النمو على الثلج بين 0°C–4°C. حافظ على جميع المكونات في درجة حرارة منخفضة لمنع البلمرة المبكرة.
   2. أضف الحجم المحسوب من الكولاجين I إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد.
   3. أضف الحجم المحسوب لوسط النمو المبرد مسبقا إلى محلول الكولاجين.
   4. أضف الحجم المحسوب 0.1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم لتحييد المحلول.
      ملاحظة: التحسين السابق ثبت أن هذه الظروف تنتج درجة حموضة هلام مناسبة؛ لذلك، لا يلزم إجراء اختبار دوري لدرجة الحموضة لخليط الهيدروجيل.
      ملاحظة: قم بجميع الخطوات التالية بسرعة لمنع بلمرة الكولاجين المبكرة.
   5. اخلط المحلول بهز الأنبوب بقوة بمعدل هز واحد في الثانية لمدة لا تقل عن 6 نسخ.
   6. أضف الحجم المحسوب لمكملة المصفوفة خارج الخلية إلى الخليط.
   7. أضف الحجم المحسوب للخلايا المفردة أو شظايا الأنسجة باستخدام ماصة P1000 أو رأس ماصة عريضة التجويف. اخلط فورا عن طريق الهز كما هو موضح في الخطوة 3.2.5 وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.
3. ترسيب الهيدروجيل
   1. يقوم بتوصيل خليط الهيدروجيل إلى أوعية الزراعة بالحجم المطلوب لكل بئر. استخدم 200 ميكرولتر هيدروجيل لكل بئر لشرائح الغرف ذات الأربعة آبار، و100 ميكرولتر لكل بئر للشرائح ذات 8 آبار، و20 ميكرولتر لكل بئر لألواح 96 بئر.
   2. انشر الهيدروجيل على شكل وسادة رقيقة على السطح عند استخدام شرائح الحجرة. ضع رأس الماصة عند الحافة العليا المركزية للغرفة جيدا واسحب الطرف عبر السطح أثناء توزيع الجل لتكوين وسادة متساوية. بالنسبة لألواح 96 بئر، ضع رأس الماصة في مركز البئر مع الحفاظ على الاتصال بالسطح ووزع الجل في المركز للحفاظ على هيكل القبة. تجنب ضخ الهواء في الجل لأن ذلك سيخلق فقاعات.
   3. حضن أوعية الزراعة عند 37°م في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 60 دقيقة للسماح بالبلمرة الكاملة.
      ملاحظة: تم تحسين ظروف البلمرة الموضحة هنا لتنسيقات الزراعة المستخدمة في هذه الدراسة. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة في وقت البلمرة حسب هندسة وعاء الزراعة، حجم الهيدروجيل، وظروف الحضانة.
4. الثقافة والصيانة
   1. أضف MEGM مسخن مسبقا إلى كل بئر. اضبط الصوت حسب تنسيق الثقافة المستخدم.
   2. افصل الهيدروجيل بلطف عن سطح الزراعة باستخدام رأس ماصة للسماح للجل بالطفو. قم بتحريك طرف الماصة حول محيط الجل ورفعها بلطف تحت الهيدروجيل المبلمر لتحريره من السطح.
   3. استبدل MEGM مرتين في الأسبوع بوسط طازج مسخن مسبقا. الحفاظ على الثقافات في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ CO₂ لمدة تقارب 3-4 أسابيع وإنهاء الزراعة قبل حدوث انهيار كامل للهيدروجيل. حدد الهيدروجيلز المنهارة من خلال ظهور هياكل كثيفة ومعتمة تشبه السدادات الناتجة عن نمو خلوي واسع داخل الجل (انظر أمثلة ممثلة في الشكل التكميلي 1).

النتائج

يؤدي التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول إلى تكوين هياكل عضوية ثلاثية الأبعاد تظهر شكل الظهارة المنظمة وخصائص معمارية خاصة بالنسيج. تبدأ الأورجينويدات في التكون خلال 3–7 أيام من التلقيح وتستمر في التطور طوال فترة الزراعة. أظهرت التوصيفات السابقة لهذا النظام العضوي الهيدروجيلي تكوين عضوي قابل للتكرار عبر عدة معطحين أوليين مستقلين من البشر³. في تلك الدراسة، تم تقييم الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من 12 متبرعا بجراحة الميموبلاستي التاختزال الخالية من الأمراض، ونجحت 11 ...

المناقشة

البروتوكول الموضح هنا يتيح التوليد القابل للتكرار لعضويات الثدي ثلاثية الأبعاد البشرية ضمن بيئة دقيقة محددة من الهيدروجيل تدعم الميزات الرئيسية لتكوين الثدي³. تعد هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح هذه الطريقة. أولا، يجب التحكم بعناية في معالجة الأنسجة والتفكك الإنزيمي للحفاظ على صلاحية الظهارة مع تقليل فرط الهضم، مما قد يقلل من إنتاج الخلايا ويضعف التكوين اللاحق¹⁰. على وجه الخصوص، فإن العلاجات الإنزيمية القصيرة والمتسلسلة، مع التفكك الميكانيكي الل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Sterile tubes for tissue processing and centrifugation
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Filtration device for single-cell suspension preparation
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Filtration device for single-cell suspension preparation
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Device used to count cells and determine viability
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplement for epithelial cell media
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Dual-chamber slides used for cell counting
Centrifuge	N/A	N/A	Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Extracellular matrix protein used for hydrogel formation
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzyme used for tissue dissociation
Cryovials	Corning	976171	Sterile vials for cryogenic storage of samples
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Cryoprotectant used in freezing medium
Dispase II	Roche	4942078001	Enzyme used for secondary tissue dissociation
DNase I	Roche	10104159001	Enzyme used during cell dissociation.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Serum supplement used in wash and neutralization media
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Extracellular matrix protein component
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplement for epithelial cell media
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplement for epithelial cell media
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplement for epithelial cell media
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Extracellular matrix component for hydrogel formulation
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzyme used for tissue dissociation
Incubator	Thermo Scientific	3598	Device used for tissue culture incubation
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplement for epithelial cell media
Laminin	Gibco	23017-015	Extracellular matrix protein component
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Growth medium for epithelial cells
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubes used for small-volume reactions
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation
P1000 pipette	Gilson	P1000	Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Antibiotic supplement for epithelial cell media
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Buffer solution used for washing and rinsing
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balance used for tissue weighing
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagent used for collagen neutralization
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Tools used for mechanical tissue mincing
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Dye used for cell viability assessment
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Enzymatic reagent used for cell dissociation
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Device used for controlled thawing of samples