طريقة محددة قائمة على الهيدروجيل لتوليد عضويات الثدي ثلاثية الأبعاد في الإنسان تعيد تكوين الشكل الثدي

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة محددة تعتمد على الهيدروجيل لتوليد عضويات الثدي البشرية التي تعيد تلخيص السمات الرئيسية لتكوين الثدي في نظام زراعة ثلاثي الأبعاد محكم.

Abstract

يظل تطوير أنظمة نماذج بشرية ذات صلة فسيولوجية تعيد ملخص بنية الأنسجة وديناميكيات حالة الخلايا تحديا كبيرا في دراسة تطور الثدي والأحداث المبكرة في السرطان الطبيعي. تفشل الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد والعديد من الأنظمة ثلاثية الأبعاد في التقاط التنظيم البنيوي والإشارات البيئية الدقيقة التي تحدد الغدة الثديية البشرية. هنا، نصف طريقة قابلة للتكرار لتوليد عضويات الثدي ثلاثية الأبعاد من خلايا ظهارية أولية مدمجة ضمن مصفوفة هيدروجيل محددة تتكون من الكولاجين من النوع الأول، واللامينين، والفيبرونكتين، وحمض الهيالورونيك. يدعم هذا النظام تقدم الخلايا المفردة عبر مراحل رئيسية من تشكل الثدي، بما في ذلك توسع السلف، وتشكيل النمط الطلائي، وتكوين هياكل تشبه وحدات القناة الفصية النهائية، بالإضافة إلى ظهور حجرة شبيهة بالميزنشيم، خلال فترة زراعة مدتها 21 يوما. نوفر بروتوكولا خطوة بخطوة لتحضير الهيدروجيل، وزرع الخلايا، وظروف الزراعة. تتوافق الطريقة مع التصوير عالي المحتوى والتحليل الكمي لعدد العضويات، وتوزيع الحجم، وتعقيد العمارة. تتيح هذه المنصة دراسات ميكانيكية للمرونة الظهارية والاضطرابات البيئية، مما يوفر نظاما قابلا للتوسع وذو صلة بيولوجية للتحقيق في التغيرات المبكرة على مستوى الأنسجة المرتبطة بخطر سرطان الثدي.

Introduction

فهم تطور الغدد الثديية البشرية والأحداث المبكرة التي تعرضت للأنسجة للتحول الخبيث يتطلب أنظمة تجريبية تلخص بأمانة بنية الأنسجة، والتسلسل الخلوي، والإشارات البيئية الدقيقة. بينما قدمت الثقافات الظهارية ثنائية الأبعاد رؤى ميكانيكية مهمة، إلا أنها تفتقر إلى السياق البنيوي اللازم لنمذجة تنظيم الظهارة والتشكل¹. أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد الحالية، بما في ذلك تلك القائمة على مستخلصات الأغشية القاعدية، قد طورت المجال لكنها لا تزال محدودة بسبب التركيب المتغير، وعدم السيطرة الكاملة على مكونات المصفوفة خارج الخلية، والدعم غير المتسق لبنية الأنسجة ذات الرتبة^{العليا 1}. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأنظمة العضوية المعتمدة على مستخلصات الأغشية القاعدية مقيدة بعدم قدرتها على دعم ظهور تنظيم شبيه بالأنسجة^{بشكل مستمر 1}. على وجه الخصوص، تعتمد العديد من الأنظمة على مكونات البثوضية الخارجية بدلا من تمكين التطور الداخلي لبيئات دقيقة داعمة، مما يحد من قدرتها على نمذجة التفاعلات الظهارية–الميزنكيمية التي تشكل مركزية لتطور الأنسجة والمرض. تقيد هذه القيود الدراسة القابلة للتكرار لعمليات التطور، والمرونة الظهارية، وتأثيرات الاضطرابات البيئية أو الجزيئية على تنظيم الأنسجة.

ولمعالجة هذه القيود، طورنا نموذجا ثلاثي الأبعاد للثدي العضوي البشري المعتمد على الهيدروجيل، والذي يمكن الخلايا الظهارية الأولية من توليد هياكل منظمة ضمن مصفوفة خارج الخلية المحددة 2,3,4,5,8. يتكون الهيدروجيل من الكولاجين من النوع الأول، واللامينين، والفيبرونيكتين، وحمض الهيالورونيك، وهي مكونات يتم اختيارها بناء على أدوارها المعروفة في تطور الغدد الثديية وتكوين الظهارة. تتفاعل هذه الجزيئات المصفوفة خارج الخلية مع مستقبلات خلوية مميزة، بما في ذلك الإنتجرينات ومستقبلات مجال الديسكويدين وCD44 وRHAMM، ومعروفة بتنظيم القطبية الظهارية، وتكوين الشكل المتفرع، وصيانة الخلايا الجذعية، والتحويل الميكانيكي، وتنظيم الأنسجة في الغدة الثديية ^6,7. أظهرت الدراسات السابقة التي وصفت هذا النظام الهيدروجيلي أن دمج هذه المكونات المصفوفة خارج الخلوية حسن بشكل ملحوظ من تكوين القنوات الفصية ونضج الظهارة مقارنة بالحالات التي تعتمد على الكولاجين فقط أو المعتمدة على ماتريجيل ^3,8. بالإضافة إلى ذلك، كانت الخصائص الفيزيائية لهذا التركيبة من الهيدروجيل قد تميزت سابقا بمجهر القوة الذرية، مما أظهر أن مصفوفة الهيدروجيل المركب خارج الخلية أظهر صلابة أقل وزيادة في التورم مقارنة بالجل الكولاجين فقط (معامل يونغ: 256.7 ± 20.0 باسكال مقابل 559.2 ± 204.0 باسكال على التوالي)، مما يتوافق مع بيئة مصفوفة أكثر ليونة وترطيبا⁸.

ومن المهم أن هذا النموذج يدعم ظهور حجرة شبيهة بالميزنشيم تنشأ جنبا إلى جنب مع البنى الظهارية، مما يوفر دعما هيكليا وإشارات داخليا يعكس بشكل أوثق تنظيم الأنسجة الطبيعية³. تم تقييم الأهمية الفسيولوجية لهذا النظام الهيدروجيلي من خلال مقارنات مباشرة مع الزراعة العضوية التقليدية القائمة على ماتريجيل باستخدام التحليلات الشكلية والتحليل الترانسكريبتوميك. أظهرت الدراسات السابقة أن زراعة الهيدروجيل دعمت تكوين أنسجة قنوية-فصوصية أكثر تنظيما وتمايز متعدد السلالات مقارنة بالثقافات المعتمدة على الماتريجيل، مع الحفاظ أيضا على استجابة الهرمونات⁸. مؤخرا، أظهرت تحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي المدمج أحادي الخلية التي قارنت بين الأعضاء المشتقة من الهيدروجيل، والعضويات المزروعة في الماتريجيل، والأنسجة الأولية للثدي البشرية أن العضويات الناتجة بالهيدروجيل تعيد بشكل أكثر دقة تسلسل الهرم الطلائي، والتنوع الخلوي، والتفاعلات الظهارية–الميزنكيمية الموجودة في نسيج الثدي البشري الأصلي³. على النقيض من ذلك، كانت العضويات المزروعة في الماتريجيل غنية بحالات القاعدة الهجينة التكاثرية وتفتقر إلى مجموعات شبيهة بالسترومال الهوائية، مما يتوافق مع التجميع الذاتي للظهارة بدلا من التكوين العضوي الموجه.

يوفر البروتوكول الموضح هنا طريقة قابلة للتكرار والتوسع لتوليد الأعضاء من الأنسجة البشرية الأولية، مع خطوات اختيارية لاستنزاف الخلايا الليفية وتفككها إلى خلايا فردية. نظرا لأن هذه المنصة متوافقة مع التصوير الحي، والتصوير عالي المحتوى، والتحليل المورفومتري الكمي، وتتبع الخلايا، ودراسات الاضطراب الجيني، يمكن دمجها مع الأساليب اللاحقة التي تقيم عدد الأعضاء وحجمها وبنيتها وديناميكيات النمو. لذلك، توفر هذه المنصة نظاما بيولوجيا ذا صلة لدراسة تطور الثدي البشري، واللدونة الظهارية، والتفاعلات بين الظهارة والبيئة الدقيقة، واستجابات الأنسجة للاضطرابات النمائية أو الجزيئية أو البيئية.

يتم تقديم نظرة عامة تخطيطية لسير العمل، بما في ذلك معالجة الأنسجة، تحضير الهيدروجيل، زراعة العضويات، تقدم النمو، والتحليلات اللاحقة، في الشكل 1، بينما تظهر الأشكال العضوية التمثيلية التي تم توليدها باستخدام هذه المنصة في الشكل 2.

الشكل 1. نظرة عامة على سير عمل توليد العضويات المعتمدة على الهيدروجيل. (أ) مخطط انسيابي يلخص سير عمل البروتوكول، بما في ذلك جمع الأنسجة، معالجة الأنسجة، الحفظ بالتجميد، الاسترداد وتحضير الخلايا الاختياري، تحضير الهيدروجيل، زراعة العضويات، تطوير العضويات، والتطبيقات التحليلية لاحقا. (ب) مخطط بصري يصور المراحل الرئيسية لبروتوكول توليد العضوية المعتمدة على الهيدروجيل، بما في ذلك معالجة وتحضير الأنسجة، والاسترداد والتحضير الاختياري للخلايا، وتحضير الهيدروجيل والبذور العضوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. أشكال عضوية تمثيلية مولدة في نظام الهيدروجيل المعرف. صور مميزة ممثلة للعضويات المشتقة من أنسجة بشرية مختلفة تم زراعتها في مصفوفة الهيدروجيل المحددة. تم تصوير عضويات الثدي الناتجة عن الخلايا الظهارية المفردة المشتقة من جراحة التصقل في اليوم الحادي والعشرين من الزراعة. تم تصوير عضويات الزينوغرافات المشتقة من المريض الناتجة عن شظايا الأورام في اليوم السادس عشر من الزراعة. تم تصوير عضويات الغدد اللعابية الناتجة عن شظايا ظهارية في اليوم الثالث من الزراعة. تم تصوير عضويات الكلى الناتجة عن شظايا الظهارة في اليوم السابع عشر من الزراعة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

تم الحصول على الأنسجة الأولية التي كان من الممكن التخلص منها كنفايات طبية بعد الجراحة وفقا لجميع القوانين ذات الصلة باستخدام بروتوكولات وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية في مركز مين الطبي ومركز تافتس الطبي. تم إخفاء هوية جميع الأنسجة قبل النقل ولم يكن بالإمكان تتبعها إلى مرضى محددين. لهذا السبب، حصل هذا البحث على حالة استثناء من لجنة استخدام البشر كمواضيع تجريبية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وفي جامعة تافتس للعلوم الصحية (IRB #13521). جميع المرضى المسجلين في هذه الدراسة وقعوا على نموذج موافقة مستنيرة يوافقون على المشاركة في الدراسة ونشر النتائج.

1. معالجة الأنسجة وتحضيرها

ملاحظة: قم بجميع الإجراءات المتعلقة بالأنسجة البشرية وفقا للإرشادات المؤسسية للسلامة البيولوجية والأخلاقيات. راجع مخططات سير العمل المعروضة في الشكلين 1A و1B للحصول على نظرة بصرية على خطوات البروتوكول وسير عمل تحضير الأعضاء قبل بدء الإجراء.

1. تحضير MEGM باستخدام وسط قاعدي للظهارة الثديية مع مكمل مستخلص الغدة النخامية البقري 52 ميكروغرام/مل، وعامل نمو بشري بشري 10 نانوغرام/مل، و5 ميكروغرام/مل إنسولين، و500 نانوغرام/مل هيدروكورتيزون، و1٪ (v/v) جلوتا ماكس، و1٪ (v/v) مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X).
2. جهز وسط التفكك بإضافة 1.5 ملغ/مل كولاجناز A (مخزن عند −20°C) و100 U/mL هيالورونيداز (مخزن عند 4°C) إلى وسط نمو ظهارة الثدي (MEGM).
3. يتلقون أنسجة الثدي البشرية التي تم الحصول عليها من عمليات استئصال الثدي الوقائية وعمليات تصغير الثدي خلال 24 ساعة من الاستئصال، غير مثبتة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، ويحافظ عليها عند 4°C. وزن النسيج على ميزان دقيق لتحديد الوزن الكلي للنسيج.
4. ضع النسيج في خزانة أمان حيوي معقمة. قم بتقطيع النسيج ميكانيكيا^إلى شظايا بحجم 3 مم باستخدام مشارط معقمة. انقل حوالي 2–3 جرام من الأنسجة المفروم إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. أضف 10 مل من وسط التفكك إلى كل أنبوب.
5. حضن الأنابيب عند 37°C على محول مداري بسرعة 8 دورات في الدقيقة لمدة 12–18 ساعة لهضم الأنسجة إنزيما. اعتبر الهضم مكتملا عندما لا تبقى شظايا كبيرة من الأنسجة ويكون تعليق متجانس لمادة مجزأة بشكل متساو مرئيا في جميع أنحاء الوسط.
6. دع شظايا الظهارة تستقر بالجاذبية لمدة 5 دقائق. تأكد من عدم وجود شظايا مرئية معلقة في الوسط وأن هناك كرة مميزة. قم بإخراج المحلول الزائد بعناية وتخلص منه دون إزعاج الحبيبة.
   ملاحظة: يحتوي الفائق على خلايا البترومال ومكونات مصفوفة، ويمكن غسله واستخدامه أو حفظه في دراسات أخرى.
7. أعد تعليق الحبيبة في وسط غسيل بسعة 10 مل يتكون من مصل بقري جنيني بنسبة 5٪ (FBS) في PBS. الطرد المركزي عند 250 × جرام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي بدلو متحرك في درجة حرارة الغرفة.
8. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات إضافية أو حتى يصبح السائل الشفاف خاليا من الحطام الظاهر.
9. أعد تعليق الحبيبة النهائية في وسط تجميد يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) في MEGM بحجم 1 مل لكل جرام من وزن النسيج الأولي.
   تحذير: DMSO ضار عند ملامسته أو استنشاقه. التعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والعمل في غطاء السلامة الكيميائية إذا كانت هناك حاجة لإرشادات المؤسسات.
10. أليكوت 1 مل من نظام التعليق في كل جهاز تجميد. ضع المجمدات المبردة عند −80°C في حاوية تجميد قبل تخزينها طويل الأمد في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: تمثل هذه الخطوة نقطة توقف. تخزين العينات عند −80°C قبل نقلها إلى ظروف تخزين طويلة الأمد.

2. التعافي وتحضير الخلايا الاختياري

1. الذوبان والتعافي الأولي
   1. إزالة الأنسجة المحفوظة بالتبريد من تخزين −80°C بعد التجميد لمدة لا تقل عن 24 ساعة، أو من التخزين طويل الأمد للنيتروجين السائل. اغمر الكرويفيال فورا حتى الغطاء في حمام ماء بدرجة حرارة 37°C واذيب بسرعة لمدة دقيقة واحدة لتقليل موت الخلايا.
      ملاحظة: حرك الكريوفيال بلطف أثناء الذوبان لضمان تدفئة منتظمة.
   2. بمجرد إذابة الدماغ الكامل، انقل فورا محتويات الكريوفيال إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 10 مل من MEGM. الطرد المركزي عند 250 × جرام لمدة 5 دقائق.
2. استنزاف الأرومات الليفية الاختياري
   ملاحظة: استنزاف الأرومات الليفية عن طريق الطلاء المسبق هو خطوة إثراء اختيارية تستخدم لتقليل أعداد البترومات أو الأروميات الليفية الملتصقة بسرعة عندما يرغب في وجود مجموعة أولية أكثر ثراء بالظهارة. هذه الخطوة غير مطلوبة لتكوين العضويات ويمكن تعديلها حسب الهدف التجريبي.
   1. أعد تعليق الرصاصة في 10 مل من MEGM.
   2. انقل النسيج المعلق إلى طبق زراعة خلايا بحجم 10 سم. حضن عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂ لمدة 90 دقيقة للسماح بتثبيت الأرواح الليفية.
      ملاحظة: لا تزعج طبق الزراعة أثناء الحضانة لضمان التصاق فعال للأروية الليفية.
   3. اجمع المادة الفائقة التي تحتوي على خلايا غير ملتصقة باستخدام ماصة مصلية بحجم 10 مل مع إمالة طبق الزراعة بلطف إلى حوالي 45°. اشطف الطبق بلطف بسعة 5 مل من PBS وامزج الغسل مع السوبرناتانت المجمع.
   4. قم بجهاز الطرد المركزي بنظام التعليق المشترك عند 250 × جرام لمدة 5 دقائق لاستعادة المواد المخصبة بالظهارة.
      ملاحظة: الخلايا التي التصقت بالصفيحة تثري لعمل الأرومات الليفية للغدد الثديية، ويمكن تكاثرها بشكل منفصل بإضافة وسط مكون من DMEM + 10٪ FBS ومضادات حيوية.
3. التفكك الاختياري إلى الخلايا المفردة
   1. أعد تعليق الحبيبة في محلول إنزيم تفكيك مدفأ مسبقا (37°C) يتكون من 0.25٪ تريبسين. قد تتطلب كواشف التفكك البديلة تحسينا. انقل نظام التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل. قم بتثبيط العينة 20 مرة باستخدام ماصة P1000 لتعزيز التفكك.
      تحذير: قد تكون مواد التفكك الإنزيمي ضارة. تعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وتجنب التواصل البشري أو البصري.
   2. حضن الأنبوب عند 37°C لمدة 3-5 دقائق. يتم تفكيك العينة ميكانيكيا مباشرة بعد الحضانة عن طريق التفكيك 20 مرة باستخدام ماصة P1000.
   3. أضف 1 مل من وسط الغسيل المحتوي على المصل لتحييد التفاعل الإنزيمي. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق.
   4. أعد تعليق الحبيبة في محلول ديسباز 300 ميكرولتر (5 U/mL) ومحلول DNase بسعة 30 ميكرولتر (1 ملغ/مل). حضن الغرفة عند 37°C لمدة 3–5 دقائق.
   5. قم بتفكيك العينة ميكانيكيا عن طريق التوصيل بالماصة 15–20 مرة. أضف وسط غسيل يحتوي على السيروم بسعة 700 ميكرولتر إلى نظام التعليق.
   6. قم بترشيح تعليق الخلية عبر مصفاة خلايا بقطر 40 ميكرومتر إلى أنبوب نظيف. يمكن استخدام مصفاة خلايا قياسية بحجم 40 ميكرومتر أو مصفاة فلومي ذات رأس الماصة. قد تقلل مصفاات فلومي من فقدان العينات عند العمل مع أعداد خلايا محدودة.
   7. حدد عدد الخلية الصالح باستخدام استبعاد الأزرق التريباني. اخلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع اللون الأزرق التريبان بنسبة 1:1 وحمل 10 ميكرولتر من الخليط في غرفة عد الخلايا أو شريحة العد. تحديد مدى بقاء الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم الخلوي.
   8. قم بعمل نظام الطرد المركزي في نظام التعليق عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   9. أعد تعليق حبيبات الخلية في MEGM بالتركيز المطلوب لتلقيح الهيدروجيل.
      ملاحظة: بالنسبة لتجارب التلقيح على خلية واحدة، تتراوح المدخلات النموذجية بين حوالي 1,000–5,000 خلية لكل 200 ميكرولتر هيدروجيل، وذلك حسب الهدف التجريبي وخصائص عينة المتبرع. تستخدم كثافات البذور المنخفضة عادة في التصوير الحي ودراسات الشكل لتسهيل تتبع تطور الأعضاء الفردية، بينما تستخدم الكثافات الأعلى عادة في التحليلات الجزيئية النهائية، بما في ذلك جمع الحمض النووي الريبي والبروتينات.

3. تحضير الهيدروجيل والبذور العضوية

1. تحضير المخزون وحسابات الحجم
   1. ضع محلول اللامينين (1.18 ملغ/مل)، ومحلول حمض الهيالورونيك (1 ملغ/مل في ماء معقم)، ومحلول الفيبرونكتين (2 ملغ/مل في ماء معقم)، وPBS 1× على الثلج قبل الاستخدام. خزن أليكوتات اللامينين والفيبرونيكتين عند −80°C وتخزين محلول حمض الهيالورونيك عند 4°C. إذابة المكونات المجمدة ببطء على الجليد عند 0°C إلى 4°C قبل الاستخدام.
   2. حضر محلول مكمل مكملات مصفوفة خارج الخلوية بحجم 25×. لتحضير 1 مل، اجمع 425 ميكرولتر من اللامينين، 250 ميكرولتر حمض الهيالورونيك، 250 ميكرولتر فيبرونيكتين، و75 ميكرولتر PBS في أنبوب مثبت على الثلج. اخلط بلطف عن طريق قلب الأنبوب 3–4 مرات. احتفظ بالمحلول عند 4°C لمدة تصل إلى شهر.
   3. حدد حجم وتركيب الهيدروجيل النهائي المطلوب قبل التحضير. جهز حجم زائد لا يقل عن 20٪ لتعويض فقدان المواد أثناء التوصيل والنقل في السعر.
      ملاحظة: تركيبة الهيدروجيل تتكون من كولاجين I، وهو تركيز نهائي 1× من مكملات المصفوفة خارج الخلية (من مخزون 25×)، و12.5٪ (v/v) 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم بالنسبة لحجم الكولاجين I لتحييد الحموضة والبلمرة.
      ملاحظة: التركيزات النهائية للهيدروجيل هي 1.7 ملغ/مل كولاجين I، 20 ميكروغرام/مل لامينين، 20 ميكروغرام/مل فيبرونكتين، و10 ميكروغرام/مل حمض الهيالورونيك.
   4. احسب الحجم المطلوب للكولاجين I (_{كولاجين} V) باستخدام الصيغة التالية:
      
      هنا، C_{النهائي} = 1.7 mg/mL، V_الكلي هو حجم الهيدروجيل النهائي المطلوب، _ومخزون C هو تركيز محلول الكولاجين. استخدم تركيزات مخزون الكولاجين بين 2–12 ملغ/مل.
      ملاحظة: قد يختلف تركيز مخزون الكولاجين بين الدفعات. التركيزات الأعلى تزيد من اللزوجة ويجب أن تصب ببطء.
   5. احسب حجم هيدروكسيد الصوديوم 0.1 نيوتن (V_NaOH) باستخدام الصيغة التالية:
      V_NaOH = 0.125 ×_{كولاجين} V
      حضر محلول هيدروكسيد الصوديوم بقوة 0.1 نيتروفن عن طريق تخفيف 1 نيتروفن من هيدروكسيد الصوديوم في ماء معقم.
   6. احسب حجم مكمل المصفوفة خارج الخلية (V_ES) باستخدام الصيغة التالية:
      
   7. احسب الحجم المتبقي الذي سيتم ملؤه بوسط النمو باستخدام الصيغة التالية:
      _{وسط نمو} V = _{V إجمالي} - (_{كولاجين} V + _{V NaOH} + V_ES + _{V خلايا/نسيج} V)
      ملاحظة: حدد حجم الخلايا أو شظايا الأنسجة لكل تجربة على حدة. استخدم نطاقا نموذجيا يتراوح بين 10–100 ميكرولتر ضمن الحجم المسموح به. لا يتم إجراء عد دقيق للشظايا لأن حجم وتركيب الشظايا يختلف بشكل كبير بين التحضيرات. توحيد التلقيح من خلال التقييم البصري لوفرة وتوزيع الشظايا.
2. تحضير خليط الهيدروجيل الرئيسي
   1. ضع الكولاجين I، مكمل المصفوفة خارج الخلية، هيدروكسيد الصوديوم (0.1 نيوتن)، ووسط النمو على الثلج بين 0°C–4°C. حافظ على جميع المكونات في درجة حرارة منخفضة لمنع البلمرة المبكرة.
   2. أضف الحجم المحسوب من الكولاجين I إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد.
   3. أضف الحجم المحسوب لوسط النمو المبرد مسبقا إلى محلول الكولاجين.
   4. أضف الحجم المحسوب 0.1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم لتحييد المحلول.
      ملاحظة: التحسين السابق ثبت أن هذه الظروف تنتج درجة حموضة هلام مناسبة؛ لذلك، لا يلزم إجراء اختبار دوري لدرجة الحموضة لخليط الهيدروجيل.
      ملاحظة: قم بجميع الخطوات التالية بسرعة لمنع بلمرة الكولاجين المبكرة.
   5. اخلط المحلول بهز الأنبوب بقوة بمعدل هز واحد في الثانية لمدة لا تقل عن 6 نسخ.
   6. أضف الحجم المحسوب لمكملة المصفوفة خارج الخلية إلى الخليط.
   7. أضف الحجم المحسوب للخلايا المفردة أو شظايا الأنسجة باستخدام ماصة P1000 أو رأس ماصة عريضة التجويف. اخلط فورا عن طريق الهز كما هو موضح في الخطوة 3.2.5 وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.
3. ترسيب الهيدروجيل
   1. يقوم بتوصيل خليط الهيدروجيل إلى أوعية الزراعة بالحجم المطلوب لكل بئر. استخدم 200 ميكرولتر هيدروجيل لكل بئر لشرائح الغرف ذات الأربعة آبار، و100 ميكرولتر لكل بئر للشرائح ذات 8 آبار، و20 ميكرولتر لكل بئر لألواح 96 بئر.
   2. انشر الهيدروجيل على شكل وسادة رقيقة على السطح عند استخدام شرائح الحجرة. ضع رأس الماصة عند الحافة العليا المركزية للغرفة جيدا واسحب الطرف عبر السطح أثناء توزيع الجل لتكوين وسادة متساوية. بالنسبة لألواح 96 بئر، ضع رأس الماصة في مركز البئر مع الحفاظ على الاتصال بالسطح ووزع الجل في المركز للحفاظ على هيكل القبة. تجنب ضخ الهواء في الجل لأن ذلك سيخلق فقاعات.
   3. حضن أوعية الزراعة عند 37°م في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 60 دقيقة للسماح بالبلمرة الكاملة.
      ملاحظة: تم تحسين ظروف البلمرة الموضحة هنا لتنسيقات الزراعة المستخدمة في هذه الدراسة. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة في وقت البلمرة حسب هندسة وعاء الزراعة، حجم الهيدروجيل، وظروف الحضانة.
4. الثقافة والصيانة
   1. أضف MEGM مسخن مسبقا إلى كل بئر. اضبط الصوت حسب تنسيق الثقافة المستخدم.
   2. افصل الهيدروجيل بلطف عن سطح الزراعة باستخدام رأس ماصة للسماح للجل بالطفو. قم بتحريك طرف الماصة حول محيط الجل ورفعها بلطف تحت الهيدروجيل المبلمر لتحريره من السطح.
   3. استبدل MEGM مرتين في الأسبوع بوسط طازج مسخن مسبقا. الحفاظ على الثقافات في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ CO₂ لمدة تقارب 3-4 أسابيع وإنهاء الزراعة قبل حدوث انهيار كامل للهيدروجيل. حدد الهيدروجيلز المنهارة من خلال ظهور هياكل كثيفة ومعتمة تشبه السدادات الناتجة عن نمو خلوي واسع داخل الجل (انظر أمثلة ممثلة في الشكل التكميلي 1).

Results

يؤدي التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول إلى تكوين هياكل عضوية ثلاثية الأبعاد تظهر شكل الظهارة المنظمة وخصائص معمارية خاصة بالنسيج. تبدأ الأورجينويدات في التكون خلال 3–7 أيام من التلقيح وتستمر في التطور طوال فترة الزراعة. أظهرت التوصيفات السابقة لهذا النظام العضوي الهيدروجيلي تكوين عضوي قابل للتكرار عبر عدة معطحين أوليين مستقلين من البشر³. في تلك الدراسة، تم تقييم الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من 12 متبرعا بجراحة الميموبلاستي التاختزال الخالية من الأمراض، ونجحت 11 من أصل 12 عينة متبرعة في توليد عضويات تحت ظروف الزراعة المذكورة. عبر المتبرعين، كان العدد الوسيط للهياكل العضوية المكونة لكل 100 خلية مزروعة 1.775 (فاصل الثقة 95٪: 0.45–4.10). على الرغم من ملاحظة تباين كبير بين المتبرعين في كفاءة تكوين الأعضاء وديناميكيات النمو، إلا أن الأشكال المعقدة بين القنوات-الفصوص والأسينار تم توليدها بشكل متكرر عبر المتبرعين.

تظهر الأعضاء العضوية للثدي المشتقة من خلايا ظهارية مفردة تطورا تدريجيا، مكونة هياكل متفرعة بحلول اليوم 21 من الزراعة (الشكل 2). تتميز هذه البنى بالإسقاطات الممدودة والتنظيم المتعدد الخلوي. أظهرت العضويات مناطق متوقعة تتراوح بين 10,000–90,000 ميكرومتر^مربع بحلول اليوم الثامن عشر، مع قيم دائرية أقل من 0.3، محسوبة ك 4π × (المساحة/المحيط²)^3.9. عادة ما تكون الأعضاء المشتقة من شظايا الأنسجة هياكل تتجاوز 90,000 ميكرومتر^مربع بحلول اليوم الثامن عشر، بينما العضويات المشتقة من شظايا الأورام تتكون هياكل أكثر كثافة وعدم انتظام مع تنظيم أقل وزيادة في الإسقاط الشعاعي، مما يتوافق مع تغير سلوك النمو.

تظهر الأعضاء المشتقة من شظايا الغدد اللعابية وظهارية الكلى أيضا أشكال مميزة تحت نفس ظروف الهيدروجيل (الشكل 2). تشكل عضويات الغدد اللعابية هياكل مضغوطة في النقاط الزمنية المبكرة (اليوم الثالث)، بينما تتطور عضويات الكلى بشكل ممتد وغير متماثل بحلول اليوم السابع عشر. تتضمن هذه الملاحظات لإظهار القدرة الأوسع على التكيف لنظام العضويات القائم على الهيدروجيل خارج نسيج الثدي، وتوضيح قدرته على دعم تكوين العضويات من مصادر متعددة للأنسجة الظهارية.

أظهرت التحاليل المناعية والجزيئية التي أجريت سابقا ^3,5,8 وجود علامات نسب الظهارة، بما في ذلك العلامات المضيئة KRT8، KRT18، KRT19، E-cadherin، GATA3، JAG1، Notch1، وMUC1، بالإضافة إلى العلامات القاعدية أو الظهارية KRT5، KRT14، Slug، SOX9، وTP63، مما يشير إلى الحفاظ على التغاير الظهاري داخل الأعضاء العضوية. تمت ملاحظة السمات الهيكلية المتوافقة مع تنظيم وحدات الفص الفصي الطرفي بواسطة المجهر الكونفوكلي وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وعرفت كهياكل تحتوي على مناطق قنوية ممدودة متصلة ببراعم شبيهة بالفصوص النهائي أو السنخية التي تشبه تنظيم وحدات القنوات النهائية الأصلية للبشر. كما أظهرت هذه الهياكل تنظيما طبقيا للظهارة مع نمط خلايا ضوئية وقاعدية متوافقة مع التحليلات المنشورة سابقا لهذه المنصة³.

لوحظ وجود حجرة شبيهة بالميزنشيم مرتبطة بالبنية الظهارية وبينها، وتميزت بسلوك هجرة وتعبير عن علامات مثل VIM، SNAI1، ZEB1، S100A، CD90، وFAPα. مع تحليلات المجهر بتقنية التايم لابس، تدعم هذه الملاحظات ظهور بيئة دقيقة داعمة داخل نظام الزراعة³.

ومن المهم أن هذا البروتوكول يهدف إلى توفير إطار منهجي قابل للتكيف بشكل واسع بدلا من وضع معيار بيولوجي ثابت واحد. قد تختلف النتائج الكمية، بما في ذلك كفاءة تكوين العضويات، الحجم، تعقيد التفرع، وتركيب الخلية، حسب مصدر المتبرع، وحالة انقطاع الطمث، والمادة الابتدائية (مثل شظايا الأنسجة مقابل الخلايا المفردة)، والظروف التجريبية.

تشمل النتائج غير المثالية انخفاض كفاءة تكوين الأعضاء (<1 عضوي لكل 500 خلية مزروعة)، وزيادة الحطام الخلوي، وفشل بلمرة الكولاجين أو الفشل في تأسيس هياكل منظمة. غالبا ما ترتبط هذه النتائج بانخفاض قدرة العيش على الخلايا، أو تفكك الأنسجة غير المكتمل، أو تركيب غير صحيح للهيدروجيل، أو تعادلها غير الصحيح لدرجة الحموضة.

يمكن إجراء التحليل الكمي لتطور العضويات باستخدام التصوير الحي وطرق التصوير عالي المحتوى لقياس عدد العضويات، توزيع الحجم، سلوك التفرع، تعقيد البنيو، وديناميكيات الخلايا. أجرت دراسات سابقة باستخدام هذه المنصة تصويرا طولا حيا، وتتبع الخلايا، وتحليل مورفومتري، ودراسات اضطراب جيني لقياس ديناميكيات نمو العضوية وسلوك النسب عبر الزمن ^3,5. تم إجراء التصوير باستخدام المجهر الكونفوكالي، وأجري تحليل الصور باستخدام برنامج NIS-Elements.

الشكل 1 الإضافي. مثال تمثيلي لانهيار الهيدروجيل أثناء زراعة العضوية طويلة الأمد في اليوم الثامن عشر. تظهر الهيدروجيلات المنهارة كهياكل كثيفة وعتامة تشبه السدادات ناتجة عن نمو خلوي واسع وانكماش المصفوفة. تم استخدام هذه الخصائص الشكلية كمعايير لإنهاء الزراعة قبل انهيار الهيدروجيل الكامل. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

البروتوكول الموضح هنا يتيح التوليد القابل للتكرار لعضويات الثدي ثلاثية الأبعاد البشرية ضمن بيئة دقيقة محددة من الهيدروجيل تدعم الميزات الرئيسية لتكوين الثدي³. تعد هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح هذه الطريقة. أولا، يجب التحكم بعناية في معالجة الأنسجة والتفكك الإنزيمي للحفاظ على صلاحية الظهارة مع تقليل فرط الهضم، مما قد يقلل من إنتاج الخلايا ويضعف التكوين اللاحق¹⁰. على وجه الخصوص، فإن العلاجات الإنزيمية القصيرة والمتسلسلة، مع التفكك الميكانيكي اللطيف، ضرورية للحفاظ على تجمعات الظهارة الوظيفية. ثانيا، يتطلب تحضير الهيدروجيل تحكما دقيقا في تركيز الكولاجين، ودرجة الحموضة، والتوقيت¹¹. تحييد الكولاجين يبدأ عملية البلمرة؛ لذلك، يجب تنفيذ جميع الخطوات بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم بسرعة وعلى الثلج لضمان تكون هلام متسق. يمكن أن يؤدي عدم اكتمال أو تأخير البلمرة إلى هيدروجيلز سيئة البنية أو منهارة لا تدعم تطور العضويات. أخيرا، يجب تحسين كثافة البذور تجريبيا لكل عينة مانحة، حيث أن التحميل الزائد للأنسجة أو الخلايا قد يؤدي إلى انقباض هلام سريع وفقدان السلامة الهيكلية¹².

يمكن لعدة اعتبارات لحل المشكلات تحسين قابلية التكرار. قد ينتج عن ضعف تكوين العضويات نتيجة انخفاض قدرة الهيدروجيل على الحيوانات، أو تركيب الهيدروجيل غير المثالي، أو التعامل غير الصحيح مع الجل أثناء الترسيب¹³. ضمان الحفاظ على مخزون الكولاجين عند 4°C وعدم خضوعها للبلمرة المبكرة أمر ضروري لجودة هلام ثابتة¹¹. بالإضافة إلى ذلك، فإن فصل الهيدروجيلز الناجح عن سطح الزراعة بعد البلمرة يعد مؤشرا على تكوين الجل الصحيح؛ عادة ما يعكس عدم الفصل عدم البلمرة أو ظروف سطحية غير مناسبة¹⁴. من المتوقع أن يكون هناك تباين في حجم العضويات وشكلها عبر عينات المتبرعين ويعكس التباين البيولوجي أكثر من الفشل التقني. أظهرت الدراسات السابقة التي استخدمت هذه المنصة تكوين عضوي قابل للتكرار عبر مجموعة واسعة من المتبرعين الأساسيين المستقلين على البشر على الرغم من التفاوت الكبير بين المتبرعين في كفاءة تكوين الأعضاء والتشكل³.

لهذه الطريقة عدة قيود. بينما يدعم النموذج ظهور حجرة شبيهة بالميزنشيم جنبا إلى جنب مع الهياكل الظهارية، إلا أنه لا يعكس تماما تعقيد البيئة الدقيقة في الجسم الحي، والبيئة المناعية، والوعائية الدقيقة. تركيب الهيدروجيل، رغم تعريفه، يمثل مصفوفة خارج الخلية مبسطة وقد لا يلتقط جميع الإشارات الميكانيكية الحيوية أو الكيميائية الحيوية الموجودة في الأنسجة الأصلية^15,16. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر التغيرات بين المتبرعين على ديناميكيات نمو الأعضاء وشكلها، مما يستلزم التحسين التجريبي لتطبيقات محددة. على الرغم من هذه القيود، فإن قدرة هذا النظام على دعم التنظيم الذاتي والتفاعلات الظهارية-الميزنشيمية الداخلية تمثل تقدما كبيرا مقارنة بالعديد من نماذج الثقافة الحالية³.

مقارنة بالأنظمة الشائعة المستخدمة باستخدام مستخلصات الغشاء القاعدي، يوفر هذا النهج تحكما أكبر في تركيب المصفوفة خارج الخلية ويقلل من التباين المرتبط بالمواد غير المعرفة¹⁷. أظهرت الدراسات السابقة التي قارنت مباشرة بين منصة الهيدروجيل هذه والأنظمة العضوية المعتمدة على ماتريجيل اختلافات كبيرة في تنظيم الأنسجة وتركيب الخلايا ^3,8. كانت العضويات المزروعة بالهيدروجيل تشبه أكثر نسيج الثدي البشري الأصلي على المستويين الشفي والنسخ، محافظة على مجموعات ظهارية متعددة السلالات، بما في ذلك الأجزاء اللومية، القاعدية، السلفية، والأجزاء المتوسطة الشبيهة، بينما كانت العضويات المزروعة في الماتريجيل تهيمن عليها حالات هجينة تشبه القاعدة التكاثرية وتفتقر إلى تجمعات الستروم. بالإضافة إلى ذلك، وعلى عكس أنظمة الزراعة المشتركة التي تعتمد على إضافة خلايا سترومال خارجية، يتيح هذا النموذج ظهور جزء داخلي داعم يشبه الميزنشيم، مما يسمح بدراسة التفاعلات الظهارية والبيئة الدقيقة في سياق أكثر صلة فسيولوجيا وأقل هندسة صناعية. تم التحقق من صحة مجموعات شبيهة بالميزنكيمي الناشئة داخل الهيدروجيلز سابقا من خلال التصوير الحي التكاملي، والتلوين المناعي، وتحليلات النسخ الأحادية الخلية³. أظهرت هذه الدراسات ظهور خلايا شبيهة بالسترومال شديدة الحركة تعبر عن مؤشرات الانتقال الميزنشيمية والانتقالية الظهارية-الميزنشيمية مثل فيمنتين، THY1/CD90، FAP، S100A4، ZEB1، وسنايل، إلى جانب تفاعلات إشارات ظهارية-ميزنكيمية متبادلة تم تحديدها من خلال تحليلات الليغاند-مستقبلات. تجعل هذه الميزات النظام مناسبا بشكل خاص لدراسة العمليات التي تعتمد على بنية الأنسجة والتواصل بين الخلايا والخلية، بما في ذلك التشكل، واللدونة الظهارية، وإعادة تشكيل الأنسجة المبكر ^4,5.

المنصة الموصوفة لها تطبيقات واسعة في البحث الأساسي والترجمي. يمكن استخدامه لدراسة تطور الثدي البشري، ونمذجة الأحداث المبكرة لبدء المرض، وتقييم تأثيرات الاضطرابات الجزيئية أو البيئية على تنظيم الأنسجة. أظهرت الدراسات السابقة التي استخدمت هذه المنصة أن الاضطراب الوظيفي للمنظمات التطورية مثل DDR1 وRUNX1 يغير تمايز السلالة، وتنظيم الظهارة، وتكوين القنوات الفصولية في الزراعة ثلاثية الأبعاد ^5,18. تمكن التوافق مع التصوير الكمي والتحليل عالي المحتوى من الاستجواب المنهجي للنتائج الظاهرية، بما في ذلك التغيرات في حجم العضويات، وتركيبها، وتعقيدها. وبالتالي، توفر هذه الطريقة منصة قابلة للتوسع وذات صلة بيولوجية لدراسة تنظيم الأنسجة البشرية واضطرابها في السياقات المرتبطة بالأمراض.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أنابيب مخروطية بحجم 15 مل	VWR	89039-664	أنابيب معقمة لمعالجة الأنسجة والطرد المركزي
40 & mu; مصفاة خلية M	VWR	732-2757	جهاز ترشيح لتحضير نظام التعليق أحادي الخلية
40 & mu; مصفاة خلية M للأحجام المنخفضة	بيل-آرت	136800040	جهاز ترشيح لتحضير نظام التعليق أحادي الخلية
عداد الخلايا الآلي	بيو-راد	1450102	الجهاز المستخدم لعد الخلايا وتحديد قابلية الصلاحية
مستخلص الغدة النخامية البقرية	ثيرمو ساينتفيك	13028014	مكمل لوسائط الخلايا الظهارية
شرائح عد الخلايا	بيو-راد	145-0011	شرائح ذات حجرة مزدوجة تستخدم في عد الخلايا
الطرد المركزي	لا يوجد	لا يوجد	يجب أن تحتوي أجهزة الطرد المركزي/المنصات على سطح الطرد المركزي بقدرة سرعة لا تقل عن 500 x g واستيعاب أنابيب 15 مل و1.5 مل.
الكولاجين I	ميليبور سيغما	08-115	بروتين المصفوفة خارج الخلية المستخدم في تكوين الهيدروجيل
كولاجناز أ	سيغما-ألدرتش	11088793001	الإنزيم المستخدم في تفكك الأنسجة
الكريوفيال	كورنينغ	976171	قوارير معقمة لتخزين العينات بالتبريد
أوعية الزراعة (مثل شرائح الحجرة، الصفائح متعددة الآبار)	كورنينغ	354104 354108 3603	منصات لترسيب الهيدروجيل وزراعة العضويات.
ثنائي ميثيل كبريتات	ميليبور سيغما	317275	المادة الواقية من التبريد المستخدمة في وسط التجميد
ديسباسي II	روش	4942078001	الإنزيم المستخدم في تفكك الأنسجة الثانوي
DNase I	روش	10104159001	إنزيم يستخدم أثناء تفكك الخلايا.
مصل الأبقار الجنيني	جيبكو	10437	مكمل المصل المستخدم في وسائط الغسيل والمعادلة
الفيبرونكتين	سيغما-ألدرتش	F2006	مكون البروتين المصفوفة خارج الخلية
جلوتاماكس	ثيرمو ساينتفيك	35050061	مكمل لوسائط الخلايا الظهارية
عامل نمو البشرة البشرية	سيغما-ألدرتش	E9644	مكمل لوسائط الخلايا الظهارية
الهيدروكورتيزون	سيغما-ألدرتش	H0888	مكمل لوسائط الخلايا الظهارية
حمض الهيالورونيك	ميليبور سيغما	385908	مكون المصفوفة خارج الخلية لتركيبة الهيدروجيل
هيالورونيداز	سيغما-ألدرتش	H3506	الإنزيم المستخدم في تفكك الأنسجة
الحاضنة	ثيرمو ساينتفيك	3598	الجهاز المستخدم في حضانة زراعة الأنسجة
الأنسولين	سيغما-ألدرتش	I9278	مكمل لوسائط الخلايا الظهارية
اللامينين	جيبكو	23017-015	مكون البروتين المصفوفة خارج الخلية
الوسط الظهاري للثدي القاعدي	ثيرمو ساينتفيك	M171500	وسط نمو الخلايا الطهارية
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)	ثيرمو ساينتفيك	3451	الأنابيب المستخدمة في التفاعلات ذات الحجم الصغير
المدور المداري	ثيرمو ساينتفيك	400110	المدور المستخدم في تشتت الأنسجة أثناء التفكك الإنزيمي
ماصة P1000	جيلسون	P1000	الجهاز المستخدم لخلط ونقل أحجام تصل إلى 1,000 وميكرو؛ L
البنسلين-ستربتوميسين	ثيرمو ساينتفيك	15140122	مكمل مضاد حيوي لوسائط خلايا الظهارة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	جيبكو	20012-027	محلول العزل المستخدم للغسل والشطف
توازن الدقة	ميتلر توليدو	ML303E	التوازن المستخدم في وزن الأنسجة
الماصة المصلية	نونك	170356N	بيبت تستخدم لجمع الخلايا الظهارية غير الملتصقة
هيدروكسيد الصوديوم (1 نيتروجان)	فيشر كيميكال	SS261	المادة المستخدمة في تحييد الكولاجين
المشارط المعقمة	بارد-باركر	372615	الأدوات المستخدمة في تقطيع الأنسجة الميكانيكي
محلول تريبان الأزرق	جيبكو	15250061	الصبغة المستخدمة في تقييم بقاء الخلايا
تريبسين (0.25٪)	جيبكو	25200056	الكاشف الإنزيمي المستخدم في تفكك الخلايا
حمام مائي (37 ودرجة مئوية؛ C)	VWR	10LA	الجهاز المستخدم في إذابة العينات بشكل متحكم فيه