يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مقايسة ELISpot لتقدير كمية الخلايا المفرزة للأجسام المضادة الكلية وتلك النوعية للمستضد في دم ونخاع عظم قردة الريسوس الملقحة

59 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71836

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

يعد مقايسة ELISpot للخلايا البائية طريقة معتمدة لكمية ومدى استمرارية الخلايا البلازمية طويلة العمر النوعية للمستضد من نوع IgG وIgM وIgA، بالإضافة إلى إجمالي الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs)، سواء في الدم (التي تعكس الخلايا البلازمية قصيرة العمر بعد التحصين) أو الخلايا المفرزة للأجسام المضادة الأكثر استدامة في نخاع العظم.

الملخص

تعتمد عملية تقييم مستضدات اللقاحات والمواد المساعدة المبتكرة تقليدياً على قياس عيارات الأجسام المضادة، والتي تستغرق وقتاً للتطور بعد التحصين. ويوفر تقدير كمية الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) بعد التحصينات الأولية والتعزيزية مقياساً أبكر ومعلوماتيًا من الناحية الميكانيكية للمناعة الخلطية المستحثة باللقاح، ويمكن أن يسهل تحسين تركيبات اللقاح واستراتيجيات التحصين. يتم هنا وصف بروتوكول لتعداد الـ ASCs من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) وخلايا نخاع العظم (BM) في قرود المكاك الريسوس؛ وتعد قرود المكاك الريسوس نموذجاً قبل سريرياً هاماً لأبحاث لقاح HIV. يتيح اختبار البقع المناعية المرتبط بالإنزيم (ELISpot) هذا تقدير كمية الـ ASCs النوعية للمستضد والكلية لكل من IgG وIgM وIgA من خلال قياس تردداتها المطلقة والنسبية. وفي الدم المحيطي، يلتقط الاختبار ذروة استجابة الخلايا البلازمية (plasmablast) بعد التحصين، بينما يكتشف في نخاع العظم تراكم الخلايا البلازمية النوعية للمستضد من أنماط نظيرة مختلفة، مما يتيح تقييم استمرارية الـ ASCs طويلة العمر. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً وقابلاً للتكرار لتقييم تركيبات المولدات المناعية والمواد المساعدة في الدراسات قبل السريرية للقاحات، ويوفر بيانات قيمة لدعم نقل المرشحين الواعدين من اللقاحات إلى مرحلة التطوير السريري.

المقدمة

تعد الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) مكونات رئيسية للمناعة التكيفية، وهي تشمل كلًا من أرومات البلازما (plasmablasts) قصيرة العمر، التي تتكون بسرعة بعد التحصين، وخلايا البلازما طويلة العمر، المسؤولة عن الإنتاج المستدام للأجسام المضادة. يمكن الكشف عن أرومات البلازما بشكل عابر في الدم المحيطي والأعضاء اللمفاوية الثانوية، حيث تصل تردداتها إلى الذروة في نقاط زمنية محددة بعد التحصين تختلف باختلاف تركيبة اللقاح ونوع المضيف (عادةً في الأيام 4-5 في قرود الريسوس واليوم 7 تقريبًا في البشر). في المقابل، تتميز خلايا البلازما الناضجة بأنها طويلة العمر وتقيم بشكل أساسي داخل الأنسجة اللمفاوية الثانوية ونخاع العظم (BM). يجب أن يحفز اللقاح الفعال استجابات مناعية خلطية وخلوية قوية على حد سواء. ويوفر قياس استجابات التذكير، التي تظهر من خلال التوسع السريع لأرومات البلازما في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) بعد جرعة التعزيز، رؤية قيمة حول حجم الاستجابة المناعية الناجمة عن اللقاح. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طريقة قوية لكمية استجابات أرومات البلازما المبكرة وخلايا البلازما طويلة العمر بعد التحصين النوعي ببروتين Env في قرود الريسوس.

في مقايسة البقع المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISpot)، يتم استزراع الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) في أطباق ذات 96 بئراً، قاعدتها عبارة عن غشاء من فلوريد متعدد الفينيليدين (PVDF) أو إستر السليلوز المختلط (MCE)، ومطلية بمستضد (Ag)، مما يسمح للخلايا الحية بإفراز بروتينات يتم التقاطها مباشرة على سطح الغشاء. يتم بعد ذلك الكشف عن البروتينات الملتقطة باستخدام أجسام مضادة وفق تنسيق مقايسة مناعية شطيرية تقليدية. وفي مقايسات ELISpot الملونة، تتكون البقع من خلال تحويل مادة الركيزة 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) بواسطة إنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) إلى راسب ملون غير قابل للذوبان، مما يمكن من رؤية وتعداد الخلايا المفرزة للأجسام المضادة الفردية. يوفر نظام ELISpot عدة مزايا مهمة، بما في ذلك القدرة على الكشف عن الاستجابات النوعية للمستضد ex vivo، والتقييم الوظيفي عالي الحساسية للخلايا المناعية الفردية، والرصد الكمي للاستجابات المناعية للخلايا التائية والبائية في كل من الدراسات قبل السريرية والسريرية1,2,3.

يوصف هنا بروتوكول ELISpot للخلايا البائية لتقدير كمية الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) الكلية وتلك النوعية للمستضد من أنواع IgG وIgM وIgA في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) وخلايا نخاع العظم (BM) المستخلصة من قرود الريسوس. يفصل البروتوكول جميع الخطوات الحرجة، بما في ذلك طلاء الأطباق، والحجب، واستزراع الخلايا، وتطوير المقايسة، وتعداد البقع، وتحليل البيانات، لتوصيف حركية استجابات الخلايا البلازمية الأولية والخلايا البلازمية الكلية والنوعية لبروتين Env. توفر هذه الطريقة نهجاً قابلاً للتكرار لتقييم ومقارنة القدرة المناعية لتركيبات مختلفة من المستضدات والمواد المساعدة في الدراسات قبل السريرية للقاحات، وتدعم تحسين استراتيجيات اللقاحات للنقل السريري اللاحق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على قرود المكاك الريسوس المستخدمة في هذا البروتوكول من مستعمرات خالية من مسببات أمراض محددة (SPF) في مركز أبحاث نيو إيبيريا، وأُبقيت في مركز مايكل إي. كيلينج للطب المقارن والأبحاث التابع لمركز جامعة تكساس إم دي أندرسون للسرطان. وقد امتثلت رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية لدليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر، وحصلت على موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مركز جامعة تكساس إم دي أندرسون للسرطان (بروتوكول رقم 2616RN00).

يمثل هذا البروتوكول تحسيناً للتقنية الموصوفة في الدراسات قبل السريرية السابقة للتمنيع4,5,6,7، والتي طُوِّرت للكشف عن استجابات ASC. يصف البروتوكول أدناه إجراء ELISpot باستخدام تحضيرات خلايا PBMCs وBM طازجة من قرود المكاك الريسوس المشاركة في بروتوكول تجريبي للقاح HIV.

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات الواردة في الأقسام من 1 إلى 4 داخل كابينة سلامة بيولوجية معتمدة من الفئة الثانية (Class II) وباستخدام تقنية التعقيم. استخدم الماصات متعددة القنوات كلما أمكن ذلك.

1. تحضير أطباق مقايسة البقع المناعية (ELISpot)

  1. طلاء ألواح ELISpot
    1. قم بطلاء ألواح الغلوبولين المناعي (Ig) الكلي 1 و3 بوضع 100 µL/well من 5 µg/mL من أجسام مضادة لماعز مضادة لـ IgG + IgM + IgA في القرد غير المقترنة والمخففة في DPBS معقم. حضّن الألواح عند 4 °C لمدة 8 h على الأقل، ويفضل طوال الليل (Figure 1A,C).
    2. قم بطلاء الألواح النوعية للمستضد 2 و4 بوضع 100 µL/well من 20 µg/mL من ليكتين Galanthus nivalis (GNL) المخفف في DPBS. حضّن الألواح عند 4 °C لمدة 8 h على الأقل، ويفضل طوال الليل (Figure 1B,D).
    3. خزن الألواح المطلية عند 4 °C حتى وقت الاستخدام.
  2. غسل وحجب ألواح الغلوبولين المناعي الكلي
    1. أزل محلول الطلاء من اللوحين 1 و3 عن طريق قلب كل لوح بسرعة فوق حاوية النفايات. انقر على اللوح المقلوب بقوة على ورق ماص لإزالة السوائل المتبقية.
    2. اغسل كل لوح مرتين باستخدام 200 µL/well من PBS يحتوي على 0.05% Tween 20. بعد ذلك، اغسل الألواح مرتين باستخدام 200 µL/well من DPBS لإزالة المنظف المتبقي.
      ملاحظة: Tween 20 مادة سامة للخلايا. أزلها تماماً قبل استزراع الخلايا.
    3. أضف 200 µL/well من RPMI-10 إلى كل بئر. حضّن الألواح لمدة 2 h عند 37 °C في حضانة رطبة.
  3. غسل وحجب الألواح النوعية للمستضد
    1. أزل محلول طلاء GNL من اللوحين 2 و4 عن طريق قلب كل لوح بسرعة فوق حاوية النفايات. انقر على الألواح المقلوبة بقوة على ورق ماص لإزالة السوائل المتبقية.
    2. اغسل كل لوح أربع مرات باستخدام 200 µL/well من DPBS.
      ملاحظة: لا تستخدم PBS يحتوي على Tween 20 للألواح المطلية بـ GNL.
    3. أضف 200 µL/well من RPMI-10 إلى كل بئر. حضّن الألواح لمدة 2 h عند 37 °C في حضانة رطبة.
    4. تخلص من محلول الحجب. اغسل كل لوح أربع مرات باستخدام 200 µL/well من DPBS.
    5. أضف 100 µL/well من مستضد CH505 SOSIP بتركيز نهائي قدره 5 µg/mL. حضّن الألواح لمدة 2 h عند 37 °C.
    6. تخلص من محلول المستضد واغسل كل لوح أربع مرات باستخدام DPBS معقم.
      ملاحظة: اترك DPBS في الآبار بعد الغسلة الأخيرة لمنع جفاف غشاء MCE قبل استزراع الخلايا.

2. تحضير العينات: عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) والخلايا أحادية النواة في نخاع العظم

  1. عزل الخلايا اللمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من الدم الكامل
    1. قم بطرد مركزي لأنابيب دم EDTA سعة 10 mL عند 450 x g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون تفعيل المكابح.
    2. أزل البلازما وأضف 4 mL من DPBS الخالي من Ca2+ و Mg2+. اخلط بلطف باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 10 mL.
    3. ضع الدم المخفف بعناية في طبقة فوق 4 mL من Ficoll في أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL. قم بالطرد المركزي عند 800 x g لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام تسارع وبطء تدريجيين.
    4. انقل الطبقة الكريمية (buffy coat) التي تحتوي على الخلايا اللمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي إلى أنبوب جديد سعة 15 mL. أضف 8–10 mL من DPBS وقم بالطرد المركزي عند 450 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. تخلص من الراسب العلوي وأعد تعليق كتلة الخلايا بلطف.
    6. أضف 2 mL من منظم تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) إلى معلق الخلايا. حضّن المزيج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: لا تتجاوز فترة التحضين البالغة 5 دقائق، لأن التعرض المطول لمنظم تحلل ACK يقلل من حيوية الخلايا.
    7. أوقف تحلل كريات الدم الحمراء بإضافة 10 mL من DPBS المحتوي على 2% مصل جنين البقر (FBS). قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. تخلص من الراسب العلوي وأعد تعليق الخلايا في RPMI-10.
    9. قم بعدّ خلايا PBMCs باستخدام طريقة مناسبة لعدّ الخلايا وتأكد من أن الحيوية >90%، على سبيل المثال، عبر صبغ تريبان الأزرق.
    10. اضبط تركيز الجزء الأول إلى 5 × 106 خلية/mL لمقايسات ELISpot النوعية للمستضد. اضبط تركيز الجزء الثاني إلى 1 × 106 خلية/mL لمقايسات ELISpot للغلوبولين المناعي الكلي.
  2. عزل الخلايا أحادية النواة من نخاع العظم
    1. ضع مصفاة خلايا بقطر 70 µm في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL. بلل المصفاة مسبقاً بـ 1 mL من DPBS.
    2. أضف 4 mL من DPBS إلى 1 mL من شفاط نخاع العظم. اخلط جيداً باستخدام ماصة سيرولوجية.
    3. مرر معلق نخاع العظم عبر مصفاة الخلايا 70 µm. اشطف المصفاة بـ 2 mL من DPBS قبل التخلص منها.
    4. ضع المعلق المفلتر في طبقة فوق 4 mL من Ficoll في أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL. قم بالطرد المركزي عند 800 x g لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام تسارع وبطء تدريجيين.
    5. انقل طبقة الخلايا أحادية النواة إلى أنبوب جديد سعة 15 mL. أضف 8–10 mL من DPBS وقم بالطرد المركزي عند 450 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تخلص من الراسب العلوي وأعد تعليق كتلة الخلايا بلطف.
    7. أضف 2 mL من منظم تحلل ACK إلى معلق الخلايا. حضّن المزيج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: لا تتجاوز وقت التحلل الموصى به للحفاظ على حيوية الخلايا.
    8. أوقف تحلل كريات الدم الحمراء بإضافة 10 mL من DPBS المحتوي على 2% FBS. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. تخلص من الراسب العلوي وأعد تعليق الخلايا في RPMI-10.
    10. قم بعدّ الخلايا أحادية النواة لنخاع العظم باستخدام طريقة مناسبة لعدّ الخلايا وتأكد من أن الحيوية >90%، على سبيل المثال، عبر صبغ تريبان الأزرق.
    11. اضبط تركيز الجزء الأول إلى 5 × 106 خلية/mL لمقايسات ELISpot النوعية للمستضد. اضبط تركيز الجزء الثاني إلى 1 × 106 خلية/mL لمقايسات ELISpot للغلوبولين المناعي الكلي.

3. استزراع الخلايا وحضنها

  1. استزراع أطباق الغلوبولين المناعي الكلي
    1. أزل الوسط الحاجب من الطبقين 1 و3 عن طريق قلب كل طبق بسرعة فوق حاوية النفايات. انقر على الأطباق المقلوبة بقوة على ورق ماص لإزالة الوسط المتبقي.
    2. أضف 100 µL من RPMI-10 إلى كل بئر في الصف الأول و133 µL من RPMI-10 إلى كل بئر في الصفين الثاني والثالث. يتم تنفيذ هذه الخطوات في مكررات تقنية.
    3. أضف 100 µL من معلق PBMC (بتركيز 1 × 106 cells/mL) إلى البئر الأول من كل عمود في الطبق 1. رتب العينات وفقًا لمخطط الطبق [على سبيل المثال، الآبار A1–A6 للقرد المكاكي الريسوسي 1 (RM1) والآبار A7–A12 للقرد المكاكي الريسوسي 2 (RM2)].
    4. أضف 100 µL من معلق خلايا نخاع العظم (بتركيز 1 × 106 cells/mL) إلى البئر الأول من كل عمود في الطبق 3. رتب العينات وفقًا لمخطط الطبق.
    5. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية ثلاثية عن طريق نقل 67 µL من بئر إلى الذي يليه مع الخلط جيدًا بعد كل عملية نقل. استمر في التخفيف التسلسلي وصولاً إلى الآبار المحددة، ثم تخلص من الـ 67 µL الأخيرة للحفاظ على حجم نهائي قدره 133 µL لكل بئر.
    6. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO2.
      ​ملاحظة: تجنب تحريك الأطباق أو زعزعتها أثناء التحضين لمنع ظهور البقع المزدوجة.
  2. استزراع الأطباق النوعية للمستضد
    1. أزل DPBS من الطبقين 2 و4 عن طريق قلب كل طبق بسرعة فوق حاوية النفايات. انقر على الأطباق المقلوبة بقوة على ورق ماص لإزالة المحلول المنظم المتبقي.
    2. أضف 100 µL من RPMI-10 إلى كل بئر في الصف الأول و133 µL من RPMI-10 إلى كل بئر في الصفين الثاني والثالث.
    3. أضف 100 µL من معلق PBMC (بتركيز 5 × 106 cells/mL) إلى البئر الأول من كل عمود في الطبق 2. أضف العينات وفقًا لمخطط الطبق.
    4. أضف 100 µL من معلق خلايا نخاع العظم (بتركيز 5 × 106 cells/mL) إلى البئر الأول من كل عمود في الطبق 4. أضف العينات وفقًا لمخطط الطبق.
    5. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية ثلاثية عن طريق نقل 67 µL من بئر إلى الذي يليه مع الخلط جيدًا بعد كل عملية نقل. استمر في التخفيف التسلسلي وصولاً إلى الآبار المحددة، ثم تخلص من الـ 67 µL الأخيرة للحفاظ على حجم نهائي قدره 133 µL لكل بئر.
    6. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO2.
      ملاحظة: تجنب زعزعة الحضانة أثناء عملية التحضين، حيث يمكن أن يؤدي الاهتزاز إلى ظهور بقع مزدوجة أو شوائب تشبه ذيل المذنب.

4. معالجة أطباق ELISpot

  1. معالجة ألواح الغلوبولين المناعي الكلي
    1. أخرج الألواح من المحضنة بعد حوالي 18 h من التحضين.
    2. تخلص من الخلايا ووسط الزراعة عن طريق قلب كل لوح بسرعة فوق حاوية نفايات تحتوي على 10% مبيض. ربت على الألواح المقلوبة بقوة على ورق ماص لإزالة السوائل المتبقية.
      ملاحظة: قم بتنفيذ خطوات المعالجة المتبقية في ظروف غير معقمة.
    3. اغسل كل لوح أربع مرات باستخدام 200 µL/well من DPBS يحتوي على 0.05% Tween 20.
      ملاحظة: اترك محلول الغسيل النهائي في الآبار لمنع جفاف الأغشية.
    4. بدلاً من ذلك، اغسل الألواح باستخدام غسالة ألواح دقيقة آلية عند معالجة أعداد كبيرة من الألواح.
    5. حضّر محلول الأجسام المضادة الكاشفة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المبيوتنة anti-monkey IgG و IgM بنسبة 1:1,000، والجسم المضاد المبيوتن anti-monkey IgA بنسبة 1:500 في DPBS يحتوي على 0.05% Tween 20 و 1% FBS.
    6. أزل محلول الغسيل النهائي عن طريق التربيت على الألواح باستخدام ورق ماص. أضف 100 µL/well من الجسم المضاد anti-IgG المخفف إلى الأعمدة 1 و 2، و 7 و 8، والجسم المضاد anti-IgM إلى الأعمدة 3 و 4، و 9 و 10، والجسم المضاد anti-IgA إلى الأعمدة 5 و 6، و 11 و 12.
      ملاحظة: عالج لوحاً واحداً في كل مرة لمنع جفاف الأغشية.
    7. حضن الألواح لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة.
    8. تخلص من محلول الأجسام المضادة الكاشفة واغسل الألواح أربع مرات باستخدام DPBS يحتوي على 0.05% Tween 20.
    9. حضّر المتقارن الإنزيمي بتخفيف HRP-avidin بنسبة 1:1,000 في DPBS يحتوي على 0.05% Tween 20 و 1% FBS.
    10. أضف 100 µL/well من HRP-avidin المخفف إلى كل بئر. حضن الألواح لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة، مع حمايتها من الضوء.
    11. تخلص من محلول HRP-avidin واغسل الألواح أربع مرات باستخدام DPBS يحتوي على 0.05% Tween-20.
      ​ملاحظة: اترك محلول الغسيل النهائي في الآبار حتى يكتمل ظهور الركيزة.
  2. معالجة الألواح النوعية للمستضد
    ملاحظة: الإجراء مشابه لذلك المستخدم في ألواح الغلوبولين المناعي الكلي. ومع ذلك، قم بتنفيذ جميع خطوات الغسيل باستخدام DPBS بدون Tween 20 للحفاظ على طلاء GNL.
    1. أخرج الألواح من المحضنة بعد حوالي 18 h من التحضين.
    2. تخلص من الخلايا ووسط الزراعة عن طريق قلب كل لوح بسرعة فوق حاوية نفايات تحتوي على 10% مبيض. ربت على الألواح المقلوبة بقوة على ورق ماص لإزالة السوائل المتبقية.
      ملاحظة: قم بتنفيذ خطوات المعالجة المتبقية في ظروف غير معقمة.
    3. اغسل كل لوح أربع مرات باستخدام 200 µL/well من DPBS.
      ملاحظة: اترك محلول الغسيل النهائي في الآبار لمنع جفاف الأغشية.
    4. حضّر محلول الأجسام المضادة الكاشفة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المبيوتنة anti-monkey IgG و IgM بنسبة 1:1,000، والجسم المضاد المبيوتن anti-monkey IgA بنسبة 1:500 في DPBS يحتوي على 1% FBS.
    5. أزل محلول الغسيل النهائي عن طريق التربيت على الألواح باستخدام ورق ماص. أضف 100 µL/well من الجسم المضاد anti-IgG المخفف إلى الأعمدة 1 و 2، و 7 و 8، والجسم المضاد anti-IgM إلى الأعمدة 3 و 4، و 9 و 10، والجسم المضاد anti-IgA إلى الأعمدة 5 و 6، و 11 و 12.
      ملاحظة: عالج لوحاً واحداً في كل مرة لمنع جفاف الأغشية.
    6. حضن الألواح لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة.
    7. تخلص من محلول الأجسام المضادة الكاشفة واغسل الألواح أربع مرات باستخدام 200 µL/well من DPBS.
    8. حضّر المتقارن الإنزيمي بتخفيف HRP-avidin بنسبة 1:1,000 في DPBS يحتوي على 1% FBS.
    9. أضف 100 µL/well من HRP-avidin المخفف إلى كل بئر. حضن الألواح لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة، مع حمايتها من الضوء.
    10. تخلص من محلول HRP-avidin واغسل الألواح أربع مرات باستخدام 200 µL/well من DPBS.
      ملاحظة: اترك محلول الغسيل النهائي في الآبار حتى يكتمل ظهور الركيزة.
  3. إجراء الغسيل الآلي (اختياري)
    1. قم بتجهيز غسالة الألواح الدقيقة الآلية باستخدام DPBS وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. اختر برنامج غسيل ELISpot المحدد مسبقاً ونفذ جميع خطوات الغسيل باستخدام DPBS.
      ملاحظة: استخدم DPBS لجميع عمليات الغسيل الآلية لتجنب تكرار تجهيز الجهاز بمحاليل غسيل مختلفة.
    3. استخدم إعدادات الغسالة المدرجة في  الجدول 1 لغسالة الألواح الدقيقة.

5. الكشف

  1. تحضير محلول الركيزة
    1. قم بتحضير الركيزة العاملة AEC مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة قطرة واحدة من محلول الكروموجين إلى كل 1 mL من محلول الركيزة. اخلط المزيج جيداً باستخدام جهاز دوامة (vortex).
      ملاحظة: قم بتحضير 40 mL تقريباً من الركيزة العاملة لأربعة أطباق من فئة 96 بئراً.
  2. تظهير أطباق ELISpot في درجة حرارة الغرفة
    1. قم بمعالجة طبق واحد في كل مرة. تخلص من محلول غسيل المنظم النهائي وأضف على الفور 100 µL/well من الركيزة العاملة AEC.
    2. راقب تظهير البقع بصرياً حتى تصبح البقع الحمراء المتميزة مرئية، وعادة ما يحدث ذلك خلال 2–4 min.
      تنبيه: لا تبالغ في تظهير الأطباق، لأن التظهير المفرط يزيد من صبغة الخلفية ويضعف دقة وضوح البقع.
    3. أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق شطف الطبق جيداً تحت مياه الصنبور الجارية.
    4. اغسل الطبق من أربع إلى خمس مرات بمياه الصنبور. أزل المياه الزائدة باستخدام مناشف ورقية ممتصة.
    5. أزل نظام التصريف السفلي للطبق واترك الأطباق لتجف في الهواء لمدة 24 h تقريباً قبل عد البقع.
      ملاحظة: أوقف التفاعل بمجرد ظهور البقع في الآبار التي تحتوي على أعلى تركيزات خلوية لتجنب التظهير المفرط.
    6. كرر الخطوات من 5.2.1 إلى 5.2.5 لكل طبق متبقٍ.

6. تقدير كمية البقع

  1. الحصول على صور ELISpot
    1. امسح كل لوحة باستخدام قارئ ELISpot مجهز ببرنامج للحصول على الصور.
    2. اختر قالب اللوحة المناسب، وحدد الآبار المراد تحليلها، واحصل على الصور وفقًا لتعليمات البرنامج.
    3. احفظ البيانات الخام وصدر صور اللوحات بتنسيق TIFF لأغراض الأرشفة.
  2. عد الخلايا المفرزة للأجسام المضادة
    1. راجع أعداد البقع الآلية لكل بئر.
    2. تحقق يدويًا من كل بئر لتحديد البقع المدمجة أو المنقسمة بشكل غير صحيح. حدد البقع الفردية يدويًا عند الضرورة للحصول على أعداد دقيقة.
      ملاحظة: يُوصى بالتحقق اليدوي لأن البقع الكبيرة قد يتم عدها عدة مرات بواسطة برنامج التحليل الآلي.
    3. سجل أعداد البقع مع عوامل التخفيف المقابلة لها في جدول بيانات كما هو موضح في الجدول 2.
    4. حلل الآبار المكررة بشكل منفصل لكل من IgG و IgM و IgA قبل حساب متوسط عدد البقع لكل تخفيف.
    5. احسب عدد الخلايا المفرزة للأجسام المضادة لكل مليون خلية مدخلة عن طريق ضرب متوسط عدد البقع في عامل التخفيف المقابل.
      ملاحظة: استخدم عوامل تخفيف 15× و 45× و 135× لمقاييس الغلوبولين المناعي الكلي، و 3× و 9× و 27× للمقاييس النوعية للمستضد.
    6. قم بإجراء جميع الحسابات في برنامج جداول بيانات وأنشئ الرسوم البيانية باستخدام برنامج رسم بياني إحصائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا المقايسة لتقنية ELISpot للخلايا البائية، تم الكشف عن الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) باستخدام CH505 SOSIP، وهو ثلاثي بروتين سكري غلافي (Env) ذائب لفيروس HIV-1، كأنتيجين طلاء في دراسة لقاح تهدف إلى تحفيز أجسام مضادة معادلة واسعة النطاق (bnAbs) ضد فيروس HIV-1. يوضح الشكل 1 مخطط لوحة ELISpot المستخدم لتقدير كمية الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) الكلية وتلك النوعية للأنتيجين على لوحات منفصلة. ويحدد المخطط الحيوانات الفردية ومواقع الآبار المخصصة لتحليلات IgG و IgM و IgA. كما ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يُعد اختبار ELISpot للخلايا البائية طريقة حساسة للكشف عن إجمالي الغلوبيولين المناعي واستجابة الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASC) النوعية للمستضد في خلايا الدم والبلازما ونخاع العظم8,9,10,11. هناك عدة خطوات ضرورية لضمان تكرارية هذا البروتوكول؛ أولاً، يجب تغليف الأغشية بدقة باستخدام التركيز الأمثل للأجسام المضادة الالتقاطية. كما يعد حجب الغشاء أمراً أساسياً لمنع الارتباط غير النوعي، ويفضل إجراؤ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

يود المؤلفون شكر الحيوانات وموظفي الرعاية البحثية في مركز كيلينج للطب المقارن والأبحاث على رعايتهم، والعديد من أعضاء الفريق السابقين والمتعاونين على التحسينات المتتالية التي أُدخلت على الإجراء. تم توفير تمويل مشروع لقاح HIV في الرئيسيات غير البشرية (NHP) من خلال منح NIH رقم 5R01AI183472 لـ MBZ ورقم R24OD010947 لـ FJV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول تحلل ACK LysisQuality Biological118-156-101500 ml
مرشح بمسام µm 70Fisher22363548مرشح خلايا معقم، مناسب لأنابيب مخروطية سعة 50 mL
ركيزة AEC العاملةBD Biosciences551951كواشف لـ 10 أطباق
التحليل: ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel لـ Microsoft 365
التحليل: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
مضاد Rhesus IgA البيوتينNHPRRAB-3086851مجفف بالتجميد
مضاد monkey IgG البيوتينRocklandP/N 617-106-012مجفف بالتجميد
مضاد monkey IgM البيوتينRocklandP/N 617-106-007مجفف بالتجميد
وسط حجبكواشف محضرة مختبرياًمُركب داخلياًRPMI-10
منظم لتخفيف الأجسام المضادة الثانوية وHRPكواشف محضرة مختبرياًمُركب داخلياً1X DPBS مع 1%FBS
جهاز طرد مركزي Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR، سنة الصنع: 2013، دوار TX-750 و 75003608 (دلو دائري)
منظم تغطيةكواشف محضرة مختبرياًمُركب داخلياً1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
أطباق ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50عبوة 50 طبقاً
مصل جنين البقر (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL غير مقترنVector LaboratoriesL-1240-5مجفف بالتجميد
بيروكسيداز الفجل (HRP) - أفيدينVector LaboratoriesA-20045mg/ml جاهز للاستخدام
قارئ Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000تصوير وتحليل آلي لمقايسة ELISpot و Flurospot
بنسلين/ستريبتومايسينGibco15140-122100X
غسالة أطباقBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSغسالة أطباق دقيقة 405 TS
RPMI-10كواشف محضرة مختبرياًمُركب داخلياًRPMI-1640 + 10% مصل جنين البقر و 1% بنسلين/ستريبتومايسين 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
جسم مضاد متعدد النسائل من الماعز غير مقترن مضاد لـ monkey IgG+IgA+IgM من نوع IgG/IgM/IgALS-BioC347340مجفف بالتجميد
منظم غسيل (أطباق خاصة بالمستضد)كواشف محضرة مختبرياًمُركب داخلياً(DPBS 1X فقط)
منظم غسيل (أطباق Ig الكلية)كواشف محضرة مختبرياًمُركب داخلياً( DPBS 1X + 0.05% Tween 20)

المراجع

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الدم المحيطيالقدرة المناعية للقاحاستجابة أرومات البلازماالخلايا البلازميةاستراتيجية التحصينالدراسات قبل السريرية للقاحات

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.