مقالة منهجية

تحضير وتقييم جودة الجسيمات الشحمية المحملة بالريفامبيسين المضاد للسل

5 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71858

⸱

أكتوبر 1, 2026

 ,  ,  , 
1School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources Biorefinery, Guangdong University of Technology

المؤلفون المراسلون: Yan Liu <yanliu@gdut.edu.cn>

في هذه المقالة

ملخص

يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين عملية تحضير الليبوزومات المحملة بأدوية مضادة للسل، وتأسيس نظام معياري لتقييم جودة التركيبات الليبوزومية.

الملخص

لا يزال مرض السل (TB)، الذي تسببه بكتيريا Mycobacterium tuberculosis (MTB)، أحد المسببات الرئيسية للوفيات المعدية على مستوى العالم، مع عبء مرضي ثقيل في الصين، يتفاقم بسبب انتشار السل المقاوم للأدوية المتعددة أو المقاوم للريفامبيسين، والقيود الحرجة للعلاج الكيميائي التقليدي، بما في ذلك ضعف نفاذ الدواء، والسمية الجهازية الشديدة، وانخفاض الامتثال العلاجي. توفر أنظمة التوصيل الليبوزومية مزايا فريدة للعلاج المضاد للسل، ومع ذلك، فإن تطويرها يعيقه عدم اتساق عمليات التحضير، وانخفاض كفاءة تحميل الدواء، والافتقار إلى إطار عمل معياري لتقييم الجودة. في هذه الدراسة، استُخدمت طريقة ترطيب الغشاء الرقيق، مدمجة مع المعالجة بالموجات فوق الصوتية والترشيح، لتحضير ليبوزومات نانوية محملة بالريفامبيسين بنسب مختلفة من الفوسفوليبيد إلى الكوليسترول. تم إنشاء طريقة تم التحقق من صحتها باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتحديد كفاءة التغليف وتحميل الدواء. استُخدم تشتت الضوء الديناميكي والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتوصيف حجم الجسيمات، وجهد زيتا، والمورفولوجيا المجهرية، كما تم تحليل أنماط إطلاق الدواء في المختبر عن طريق اختبار الذوبان. أظهرت الليبوزومات المحسنة كفاءة تغليف عالية، وتحميلاً مثالياً للدواء، وحجماً جسيمياً نانوياً موحداً، واستقراراً تخزينياً جيداً، وإطلاقاً مستداماً للدواء في المختبر. يوفر هذا العمل طرقاً تجريبية معيارية ونظاماً شاملاً لتقييم الجودة لتطوير الليبوزومات المضادة للسل، مما يدعم الترجمة السريرية لأنظمة التوصيل الليبوزومية لعلاج السل.

المقدمة

يظل مرض السل (TB)، وهو مرض معدٍ مزمن تسببه بكتيريا Mycobacterium tuberculosis (MTB)، السبب الرئيسي للوفيات بين الأمراض المعدية التي يعزوها مسبب مرضي واحد، مما يشكل تهديداً مستمراً وخطيراً لكل من صحة الإنسان والأمن الصحي العالمي. ووفقاً للتقرير العالمي للسل لعام 2025 الصادر عن منظمة الصحة العالمية (WHO)، قُدِّرت الحالات الجديدة للإصابة بالسل بنحو 10.7 مليون حالة، وحدثت حوالي 1.23 مليون وفاة مرتبطة بالسل في جميع أنحاء العالم في عام 20241. ومن بين هذه الحالات، تم الإبلاغ عن ما يقرب من 390,000 حالة جديدة من السل المقاوم للأدوية المتعددة أو المقاوم للريفامبيسين (MDR/RR-TB)، مع انخراط 42% فقط من الأفراد المصابين في العلاج. وقد برز الانتقال المستمر للسل المقاوم للأدوية كعقبة أساسية أمام تنفيذ استراتيجية "إنهاء السل" العالمية التابعة لمنظمة الصحة العالمية.

لا يزال العلاج الكيميائي في الوقت الحالي يمثل الركيزة الأساسية للعلاج السريري لمرض السل (TB). يتكون النظام العلاجي القياسي من الخط الأول من مزيج من isoniazid وrifampicin وpyrazinamide وethambutol، مع فترة علاج طويلة تتراوح من 6 إلى 9 أشهر2. أما في حالات السل المقاوم للأدوية المتعددة أو المقاوم للريفامبيسين (MDR/RR-TB)، فإن النظام العلاجي يستلزم إدراج أدوية مضادة للسل من الخط الثاني، مما يمدد دورة العلاج إلى 18–24 شهرًا3، ويصاحب ذلك زيادة كبيرة في التكاليف وارتفاع ملحوظ في التفاعلات الدوائية الضارة4. وعلى الرغم من اعتماد عوامل جديدة مضادة للسل في السنوات الأخيرة — مثل bedaquiline وdelamanid وpretomanid — والتي وفرت خيارات علاجية جديدة للسل المقاوم للأدوية5، إلا أنها لم تتغلب بعد على العقبات الجوهرية المتأصلة في العلاجات الحالية المضادة للسل6,7.

أولاً، تُعد بكتيريا *M. tuberculosis* ممرضاً نموذجياً داخل الخلايا، حيث تستقر بشكل أساسي داخل البلاعم السنخية للعائل. وتظهر الأدوية الحرة نفاذية ضعيفة عبر غشاء البلاعم، مما يؤدي إلى وصول تركيزات الدواء داخل الخلايا إلى مستويات أقل بكثير من التركيز المثبط الأدنى (MIC).8ويعمل الفشل اللاحق في القضاء على الخلايا المستمرة داخل الخلايا كمحرك رئيسي لانتكاس مرض السل وظهور المقاومة الدوائية.9ثانياً، تفرض آفات مرض السل عوائق بيولوجية متعددة، بما في ذلك الأنسجة النخرية التجبنية والمحفظات الليفية، والتي تعيق نفاذ الأدوية الحرة إلى قلب الآفة، مما يؤدي إلى تركيزات دوائية موضعية دون المستوى الأمثل وتراجع الفعالية المبيدة للبكتيريا.10,11وثالثاً، فإن الإعطاء الجهازِي طويل الأمد بجرعات عالية عُرضة لحدوث تفاعلات عكسية شديدة، مثل السُمِّيَّة الكَبَدِيَّة الناجمة عن الريفامبيسين، والسُمِّيَّة الأذُنِيَّة والكَلَوِيَّة المرتبطة بالأمينوغليكوزيدات، واعتلال الأوتار والسُمِّيَّة القلبِيَّة المرتبطة بالفلوروquinolones، والتي تُعد أسباباً رئيسية لانقطاع العلاج وضعف امتثال المرضى.12,13رابعاً، يؤدي العلاج الأحادي أو الإعطاء المتسلسل للأدوية إلى اختيار سريع للطفرات المقاومة للعقاقير في ميكروب *M. tuberculosis*، بينما تزيد أنظمة العلاج المركبة متعددة الأدوية من خطر التسمم التراكمي، مما يخلق معضلة سريرية مستمرة.14.

يوفر تطوير أنظمة توصيل الأدوية النانوية استراتيجية واعدة لمعالجة العقبات المذكورة سابقاً في علاج السل. ومن بين هذه الأنظمة، برزت الليبوزومات — وهي حاملات حويصلية مغلقة ذات مقياس نانوي تتجمع ذاتياً من طبقات مزدوجة من الفسفوليبيدات — كواحدة من أكثر منصات الناقلات النانوية قابلية للتطبيق السريري في العلاج المضاد للعدوى، وذلك بفضل توافقها الحيوي الممتاز، وقابليتها للتحلل الحيوي، وقدرتها على التوصيل المستهدف، وخصائص التحرير المستدام والمحكوم15,16. وبالمقارنة مع الأدوية المضادة للسل الحرة، تمتلك أنظمة التوصيل الليبوزومية عدة مزايا لا غنى عنها لعلاج السل.

أولاً، تتيح الليبوسومات الإثراء المستهدف في البلاعم؛ حيث يتم امتصاص الليبوسومات تفضيلياً بواسطة الخلايا البلعمية في الجهاز الشبكي البطاني (RES)، مما يؤدي إلى تراكمها بشكل محدد في الأعضاء الرئيسية التي تستضيف بكتيريا MTB، مثل الرئتين والكبد والطحال. وعلاوة على ذلك، فإنها تخترق غشاء البلاعم بكفاءة17، مما يرفع تركيزات الدواء داخل الخلايا بشكل كبير، ويقضي على البكتيريا الموجودة داخل الخلايا والمستمرة، وبالتالي يقلل بشكل أساسي من انتكاس مرض السل ومقاومة الأدوية. ثانياً، تظهر قدرة معززة على اختراق آفات السل؛ فمن خلال تعديل حجم الجسيمات، والشحنة السطحية، والتعديلات السطحية، يمكن لليبوسومات عبور الكبسولة الليفية وحاجز النخر الجبني لآفات السل بفعالية، مما يزيد بشكل ملحوظ من تركيزات الدواء الموضعية ويحسن الفعالية القاتلة للبكتيريا18. ثالثاً، فهي تقلل بشكل ملحوظ من سمية الأدوية؛ حيث تعمل الليبوسومات على تغيير التوزيع الحيوي للأدوية داخل الجسم، مما يحد من تعرض الأنسجة والأعضاء السليمة لها، وبالتالي يقلل بشكل كبير من السمية الجهازية للعوامل المضادة للسل. فعلى سبيل المثال، تقلل الليبوسومات المحملة بالأمينوغليكوزيد بشكل كبير من تراكم الدواء في القوقعة والكلى، مما يقضي تقريباً على مخاطر السمية الأذنية والسمية الكلوية19. رابعاً، توفر تحرراً مستداماً وطويل المفعول؛ إذ تتيح بنية الطبقة الفوسفوليبيدية المزدوجة تحرراً بطيئاً ومنضبطاً للدواء، مما يطيل عمر النصف للدوران في الجسم الحي ومدة المفعول، ويقلل من تكرار الجرعات، ويحسن امتثال المريض للعلاج بشكل كبير20. خامساً، تسمح بالتوصيل المشترك لأدوية متعددة؛ حيث يمكن لليبوسومات تغليف عدة أدوية مضادة للسل ذات خصائص فيزيائية وكيميائية مختلفة في آن واحد، مما يحقق توصيلاً متزامناً وتأثيرات تآزرية قاتلة للبكتيريا، وبالتالي كبح ظهور طفرات MTB المقاومة للأدوية بفعالية21.

لقد تم تحقيق تقدم ملحوظ في الترجمة السريرية لأنظمة إيصال الأدوية باستخدام الليبوزومات لعلاج السل. فقد حصل معلق استنشاق ليبوزوم الأميكاسين (ALIS) على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لعلاج مرض الرئة الناجم عن مجموعة Mycobacterium avium (MAC)22، ومنذ ذلك الحين تم إدراجه في نظم علاج السل المقاوم للأدوية المتعددة (MDR-TB) في عدة بلدان، مما يؤكد القيمة السريرية وآفاق التطبيق الواسعة لمنصات الليبوزومات في إدارة مرض السل23. ومع ذلك، لا يزال تطوير وتصنيع ليبوزومات مضادات السل يواجه العديد من العقبات التقنية الحرجة، بما في ذلك ضعف إمكانية تكرار عمليات التحضير، وانخفاض سعة تحميل الدواء وكفاءة التغليف، وعدم تجانس توزيع حجم الجسيمات، والتجمع وتسرب الدواء أثناء التخزين، فضلاً عن ضعف فهم العلاقة بين سلوك الذوبان/الإطلاق في المختبر (in vitro) والفعالية في الجسم الحي (in vivo). وتعيق هذه التحديات بشكل كبير عملية البحث والتطوير والترجمة السريرية لتركيبات ليبوزومية جديدة مضادة للسل24,25.

تؤسس هذه الدراسة طريقة الترطيب بالغشاء الرقيق-الموجات فوق الصوتية-الترشيح المناسبة لتغليف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة الكارهة للماء أو ضعيفة الألفة للدهون (مثل rifampicin) داخل طبقة الفسفوليبيد الثنائية. وبالنسبة للأدوية عالية الألفة للماء، فإن طريقة الغشاء الرقيق التقليدية تعطي كفاءة تغليف منخفضة ما لم يتم تطبيق تحسينات إضافية (مثل التحميل بتدرج كبريتات الأمونيوم). يستخدم الإجراء معدات قياسية (مبخر دوراني، ومنظف بالموجات فوق الصوتية، وHPLC، وDLS، وTEM)، مما يضمن سهولة التكرار دون الحاجة إلى أدوات متخصصة. وينتج عن الإعداد الحالي على مقياس مختبري بسعة 10 mL جودة مستقرة واتساقاً جيداً بين الدفعات. وسيتطلب التوسع في النطاق الصناعي تحسين فراغ التبخير، وسرعة الدوران، وقدرة الموجات فوق الصوتية، ومواصفات الغشاء. ومن الجدير بالذكر أن الليبوزومات تظل مستقرة خلال 30 يوماً عند 4 °C ولكنها تظهر أكسدة وتكتلاً وطبقات بعد 60 يوماً، مما يستلزم التجفيف بالتجميد أو تعديل التركيبة للحفظ طويل الأمد. لقد قمنا بتحسين نسبة الفسفوليبيد إلى الكوليسترول بشكل منهجي، وتوحيد سير عمل التحضير، وإنشاء نظام شامل لتقييم الجودة يشمل كفاءة التغليف، وتحميل الدواء، وحجم الجسيمات، وجهد زيتا، والمورفولوجيا، والإطلاق في المختبر، واستقرار التخزين. يوفر هذا البروتوكول إرشادات واضحة للباحثين لتقييم مدى ملاءمة الطريقة لإيصال الأدوية الكارهة للماء، ويعمل كمرجع لتكييف التركيبة، والتصميم التجريبي، والاستكشاف الأولي للتوسع في الإنتاج.

البروتوكول

لم تتضمن هذه الدراسة مشاركين بشريين أو حيوانات، ولم يكن هناك حاجة للحصول على موافقة أخلاقية.

1. تحضير الجسيمات النانوية الشحمية المحملة بالريفامبيسين

ملاحظة: قم بتحضير جميع التركيبات في ثلاث مكررات.

  1. زن مكونات الليبوزوم باستخدام ميزان تحليلي بدقة عشرة آلاف من المائة. تم تحديد نسب الكتلة للفوسفوليبيد إلى الكوليسترول لتكون 95:5، و90:10، و85:15، و80:20، و75:25، و70:30، على التوالي (الجدول 1).
  2. ضع المكونات الثلاثة في دورق سعة 100 mL على شكل إجاصة مناسب للتبخير الدوار. أذب جميع المكونات الدهنية في 6 mL من الكلوروفورم. قم بإجراء المعالجة بالسونيكيشن للمزيج في حمام مائي (40 kHz، 100 W) لمدة 1 min حتى يتم الحصول على محلول رائق.
    ​تنبيه: الكلوروفورم مذيب عضوي متطاير، وهو ضار في حالة استنشاقه أو امتصاصه عبر الجلد. يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن الكلوروفورم (1.3-1.5) داخل خزانة استرداد أبخرة كيميائية معتمدة. ارتدِ قفازات النتريل، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة الكيميائية.
  3. أزل الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوار وفق المعلمات التالية:
    1. اضبط درجة حرارة المكثف بحيث لا تزيد عن -5 °C.
    2. اضبط درجة حرارة الحمام المائي على 37 °C
    3. اضبط سرعة الدوران على 60 rpm
    4. اضبط الفراغ (Vacuum) على 330 mbar لخفض نقطة غليان الكلوروفورم
      تنبيه: يجب تشغيل المبخر الدوار داخل خزانة استرداد الأبخرة. تأكد من توصيل المصيدة الباردة بشكل صحيح لمنع أبخرة المذيب من الدخول إلى مضخة الفراغ.
  4. قم بالتشغيل عند 330 mbar لمدة 20 min، ثم زد الفراغ إلى 80 mbar واستمر لمدة 10 min أخرى لإزالة المذيب المتبقي تماماً وتكوين غشاء دهني رقيق26.
    ملاحظة: اجمع المذيب المتبخر المتكثف في المكثف كنفايات عضوية تحتوي على الهالوجين. تخلص من جميع نفايات الكلوروفورم في حاوية مذيبات عضوية مهلجنة محددة بملصق مناسب. لا تسكبها في الحوض.
  5. جفف الغشاء الدهني تحت الفراغ (≤ 80 mbar) عند 25 °C لمدة 12 h.
    ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة التجفيف في مجفف فراغي داخل خزانة استرداد الأبخرة لمنع انبعاث أي مذيب متبقي.
  6. قم بترطيب الغشاء المجفف باستخدام 10 mL من محلول الفوسفات المنظم المالح (PBS). ضع الدورق على المبخر الدوار (بدون فراغ) بسرعة 100 rpm ودرجة حرارة 37 °C لمدة 1 h حتى ينفصل الغشاء الدهني تماماً. يكون التركيز النهائي للريفامبيسين 1 mg/mL.
  7. قم بإجراء السونيكيشن في حمام مائي (40 kHz، 100 W) عند 37 °C لمدة 10 min. تأكد من بقاء درجة حرارة الحمام المائي عند 37 °C. الحجم الإجمالي للعينة المعالجة هو 10 mL.
  8. قم بترشيح المعلق المعالج بالسونيكيشن بالتتابع. قم بترطيب مرشح سرنجة PES بمسامية 0.45 µm (قطر 13 mm) مسبقاً بـ 1 mL من محلول PBS. وباستخدام سرنجة سعة 10 mL، مرر عينة الـ 10 mL كاملة عبر مرشح 0.45 µm مرة واحدة. بعد ذلك، قم بترطيب مرشح سرنجة PES بمسامية 0.22 µm (قطر 13 mm) مسبقاً ومرر الرشاحة من خلاله مرة واحدة. لا تستخدم جهاز بثق الليبوزوم (الشكل 1).

2. كفاءة التغليف

ملاحظة: تم تحديد كفاءة التغليف (EE) عن طريق الطرد المركزي بالترشيح الفائق، والذي يفصل الدواء الحر بسرعة عن الدواء المحصور داخل الليبوزومات بناءً على الاحتجاز الفيزيائي. بعد ذلك، يتم قياس محتوى الدواء في كلا الجزئين وحساب كفاءة التغليف27.

  1. أضف بالضبط 200 µL من معلق الليبوزومات إلى خزان العينة في أنبوب ترشيح فائق سعة 0.5 mL (بحد قطع للوزن الجزيئي 3 kDa MWCO)، ثم قم بالطرد المركزي لفصل الدواء الحر عن الليبوزومات.
  2. قم بالطرد المركزي عند 7,000 x g (دوار ثابت الزاوية) عند درجة حرارة 25 °C لمدة 15 min. اجمع الرشاحة في أنبوب التجميع، وكرر العملية من 4 إلى 5 دورات.
  3. اجمع كل الرشاحة وقم بتخفيفها إلى 10 mL باستخدام الميثانول في دورق قياسي. قم بالترشيح عبر مرشح حقنة من Nylon66 بمسامية 0.22 µm قبل الحقن في جهاز HPLC.
  4. اضبط ظروف جهاز HPLC كما يلي: العمود: عمود C18 (4.6 mm x 250 mm, 5 µm)؛ الطور المتحرك: أسيتونتريل: حمض الفوسفوريك المائي = 45: 55 (V/V)؛ طول موجة الكشف: 475 nm؛ معدل التدفق: 1.0 mL/min؛ درجة حرارة العمود: 40 °C؛ حجم الحقن: 20 µL؛ وقت التشغيل: 20 min
    تنبيه: الأسيتونتريل مادة قابلة للاشتعال وسامة. قم بتحضير الطور المتحرك والتعامل معه داخل خزانة استخلاص من الأدخنة. ارتدِ معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة.
  5. احسب كفاءة التغليف (EE) باستخدام المعادلة التالية: كفاءة التغليف (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
  6. احسب تحميل الدواء (DL) باستخدام المعادلة التالية: تحميل الدواء (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%.
    ملاحظة: Wtotal—المحتوى الإجمالي للفوسفوليبيدات والكوليسترول والريفامبيسين المضافة؛ Wrfb—محتوى الريفامبيسين المضاف؛ Wfree—محتوى الأدوية الحرة في الليبوزومات.

3. التحقق من صحة طريقة HPLC

ملاحظة: قم بإجراء التحقق من صحة طريقة HPLC من حيث الخطية، والدقة، وقابلية التكرار، والاستقرار، والاسترداد، والنوعية على النحو التالي.

  1. حضّر محاليل قياسية من الريفامبيسين بالتركيزات التالية في الطور المتحرك: 1.15، و2.3، و4.6، و9.2، و13.8، و18.4، و23.0 µg/mL. قم بتحليل كل منها بواسطة HPLC، وسجل مساحات القمم، واحسب معادلة الانحدار ومعامل التحديد R2.
  2. قس مساحات القمم لمحاليل ريفامبيسين بتركيزات 9.2، و13.8، و18.4 µg/mL. أجرِ خمسة اختبارات متوازية في يوم واحد واحسب الانحراف المعياري النسبي (RSD).
  3. حضّر أربعة محاليل متوازية من الريفامبيسين بتركيز 9.2 µg/mL. قس مساحات القمم بواسطة HPLC واحسب قيمة RSD لتكرارية الطريقة.
  4. احفظ المحلول القياسي بتركيز 9.2 µg/mL في درجة حرارة الغرفة. قم بتحليل المحلول عند الساعات 0، و2، و4، و6، و12، و24، وسجل مساحات القمم، واحسب قيمة RSD لتقييم الاستقرارية.
  5. أضف مقداراً معروفاً من الريفامبيسين القياسي إلى مصفوفات ليبوسوم فارغة. عالج العينات عن طريق الترشيح الفائق، وحللها بواسطة HPLC، ثم احسب نسبة الاستعادة وقيمة RSD.
  6. افحص الكروماتوغرامات للبحث عن أي قمم تداخل عند زمن الاستبقاء الخاص بالريفامبيسين.

4. حجم الجسيمات وجهد زيتا

  1. انقل 20 µL من معلق الليبوزومات إلى 980 µL من الماء فائق النقاء (المفلتر مسبقاً عبر غشاء 0.22 µm). استخدم جهاز الرج (Vortex) لمدة 10 s، ثم قم بالسونكة (sonication) في حمام مائي لمدة 30 s.
  2. انقل العينة المخففة إلى كيوفيت عالمية (universal cuvette) لقياس الحجم، وإلى خلية شعيرية مطوية لقياس جهد زيتا.
  3. اضبط المعاملات كما يلي: المشتت = الماء، درجة الحرارة = 25 °C.
  4. أجرِ 3 مكررات تقنية على الأقل، بحيث تتكون كل منها من 10-15 دورة قياس. سجل متوسط Z (متوسط القطر الهيدروديناميكي الموزون حسب الشدة) ومؤشر تعدد التشتت (PDI).
  5. أدخل قطب بالاديوم في الكيوفيت لقياس جهد زيتا تحت نفس المعاملات28.
  6. أخرج الكيوفيت وأغلق الجهاز.

5. التوصيف المورفولوجي (TEM)

  1. خفف معلق الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين بمقدار 50-100 ضعف باستخدام ماء فائق النقاء للوصول إلى تركيز مناسب للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
  2. قم بمعالجة العينة المخففة بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي باستخدام جهاز سونيكاتور حمامي (40 kHz, 100 W) لمدة 30 s.
    تنبيه: تجنب المعالجة المفرطة بالموجات فوق الصوتية لمنع تمزق الليبوزومات.
  3. ضع شبكة نحاسية مطلية بالكربون بمسامية 300-mesh على ورق الترشيح بحيث يكون الجانب الكربوني متجهًا للأعلى.
  4. انقل بواسطة الماصة 10 µL من معلق الليبوزومات المخفف إلى مركز الشبكة. اتركها للامتصاص لمدة 1 min.
  5. قم بتجفيف المعلق الزائد من حافة الشبكة باستخدام ورق ترشيح نظيف؛ مع مراعاة عدم لمس منطقة الفحص المركزية.
  6. التصبيغ السلبي: أضف فورًا 10 µL من حمض الفسفو-تنجستيك بتركيز 2% (w/v) (pH 7.0) على الشبكة. وبعد مرور 1 min، قم بتجفيف الصبغة الزائدة من الحافة.
  7. اترك الشبكة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 h. ثم ضع الشبكة المجففة في حامل عينات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
  8. افحص العينة عند جهد تسريع يتراوح بين 80–120 kV. استخدم وضع التصوير منخفض الجرعة29 والتقط الصور باستخدام كاميرا CCD (مثل Gatan OneView) بتكبيرات اسمية قدرها 10,000x و25,000x و40,000x.
  9. اختر حقولًا تمثيلية وتجنب المناطق التي تحتوي على تكتلات أو عيوب في التصبيغ.

6. إطلاق الدواء في المختبر

  1. قطع غشاء دياليز (MWCO 7 kDa) إلى أطوال مناسبة. تحضير محلول بحجم كبير من بيكربونات الصوديوم بتركيز 2% (w/v) وEDTA بتركيز 1 mmol/L، مع ضبط الرقم الهيدروجيني عند pH 8.0.
  2. غلي غشاء الدياليز في هذا المحلول لمدة 10 min. غسل الغشاء جيداً بالماء المقطر.
  3. موازنة الغشاء المغسول في وسط التحرير (0.01 M PBS) لمدة 30 min. نقل 1 mL من معلق الليبوزوم إلى كيس الدياليز المعالج مسبقاً؛ ثم إغلاق الطرفين باستخدام مشابك الدياليز.
  4. وضع كيس الدياليز في دورق سعة 100 mL يحتوي على 80 mL من وسط التحرير المسخن مسبقاً عند 37 °C، والمضاف إليه 0.1% حمض أسكوربيك (w/v) و 0.1 mL من Tween 80. تغطية الدورق بورق ألومنيوم لحمايته من الضوء.
  5. التقليب في الظلام عند 37 °C وبسرعة 200 rpm باستخدام محرك مغناطيسي. سحب 1 mL من وسط التحرير في نقاط زمنية محددة مسبقاً: 0.5، 1.5، 3، 5، 7، 9، 12، 24، و 48 h.
  6. إضافة 1 mL من وسط تحرير جديد ومسخن مسبقاً (37 °C) إلى الدورق باستخدام ماصة، مع توجيه التدفق بلطف نحو جدار الدورق30 (النظام مغلق؛ لذا لا يلزم إجراء تصحيح للتبخر).
  7. ترشيح العينات عبر مرشح 0.22 µm وتحليلها بواسطة HPLC. تحليل العينات باستخدام نفس ظروف HPLC الموضحة في القسم 2.4.
  8. حساب نسبة التحرير التراكمي (Cumulative Release %) = (إجمالي الدواء المكتشف عند كل نقطة زمنية / حمولة الدواء الأولية) × 100%

7. تقييم استقرار التخزين

  1. يُحفظ مستعلق الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين المحضر في قارورة زجاجية محكمة الإغلاق عند درجة حرارة 4 °C، مع حمايته من الضوء.
  2. تُجمع العينات في اليوم الأول والرابع والثلاثين بعد التخزين. تخلص من العينة المسحوبة (ولا تعيدها إلى القارورة الأصلية).
  3. يتم تحديد حجم الجسيمات، ومؤشر تشتت تعدد الأحجام، وجهد زيتا لليبوزومات عند كل نقطة زمنية31.
  4. سجل المظهر المرئي ولاحظ أي ترسب أو طبقية في مستعلق الليبوزومات.
  5. تُجمع عينات إضافية في اليوم الستين للملاحظة المرئية لأكسدة المستعلق والترسب والطبقية.
    ملاحظة: أُجريت جميع القياسات في ثلاث تجارب متوازية. وعُبر عن البيانات التجريبية كمتوسط ± الانحراف المعياري.

النتائج

تم وضع طريقة HPLC مُصدقة لتقدير كمية rifampicin. تظهر الكروماتوغرامات التمثيلية لمحاليل rifampicin القياسية في الشكل 2A. ظهرت القمة الرئيسية لـ rifampicin عند زمن احتجاز قدره 14.13 min، مع شكل قمة جيد وعدم وجود تداخل ملحوظ من القمم الأخرى. أظهر منحنى المعايرة خطية جيدة عبر نطاق تركيز يتراوح بين 1.15–23 µg/mL، بمعادلة انحدار Y = 12729.5X-4778.6 ومعامل تحديد R2=0.9995. وتُعتبر قيمة R2 ≥ 0.999 مقبولة عموماً للتحليل الكمي في المختبرات الصيدلانية؛ لذا فإن القيمة التي تم الحصول عليها وهي 0.9995 تثبت أن الطريقة ذات خطية عالية عبر النطاق المختبر. تمثل المربعات السوداء نقاط البيانات المقاسة، ويمثل الخط المتصل الانحدار الخطي الملاءم (الشكل 2B).

أُجريت اختبارات الدقة عند ثلاثة تركيزات من الريفامبيسين (9.2 و13.8 و18.4 µg/mL). وكانت قيم الانحراف المعياري النسبي (RSD) لمساحات القمم جميعها أقل من 1%، مما يؤكد الدقة العالية للجهاز (Table 2). وقد أعطى اختبار التكرارية (n = 4) قيمة RSD بلغت 0.32%، مما يشير إلى تكرارية موثوقة (Table 3). وأظهر اختبار الاستقرار، الذي أُجري على مدار 24 h في درجة حرارة الغرفة، قيمة RSD بلغت 0.59%، مما يثبت أن محلول الريفامبيسين ظل مستقراً في ظل هذه الظروف (Table 4). وكان متوسط معدل الاسترداد 98.12%، مما يؤكد دقة الطريقة في تحليل الريفامبيسين في عينات الليبوزومات. وقد أثبتت هذه النتائج مجتمعة أن طريقة HPLC مناسبة للتقدير الكمي للريفامبيسين في هذه الدراسة. ويضمن هذا التحقق الصارم أن القياسات اللاحقة لكفاءة التغليف، وتحميل الدواء، وملفات الإطلاق موثوقة وقابلة للتكرار عبر دفعات تجريبية مختلفة.

تم فصل الدواء الحر عن الدواء المحبوس داخل الليبوزومات عن طريق الطرد المركزي بالترشيح الفائق. وأظهر التحليل الكمي باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أنه عندما كانت نسبة الكوليسترول 20%، وصلت كفاءة التغليف لليبوزومات محملة بالريفامبيسين إلى حد أقصى بلغ 68.54 ± 2.19، وكان معدل تحميل الدواء 11.42 ± 0.37 (الشكل 3). وعندما يكون الكوليسترول فائضاً، تنخفض كفاءة التغليف ومعدل تحميل الدواء في الليبوزومات بشكل ملحوظ (الجدول 5). وتثبت هذه النتائج أن نسبة الكوليسترول إلى الفوسفوليبيد البالغة 20% هي النسبة المثالية لتحقيق التوازن بين صلابة الغشاء وسيولته والاحتفاظ بالريفامبيسين داخل الطبقة المزدوجة. وتؤكد الانحرافات المعيارية الصغيرة (جميعها <2.2% لـ EE و <0.4% لـ DL عبر ثلاث تحضيرات مكررة) أن بروتوكول التحضير ينتج جودة صياغة متسقة مع إمكانية تكرار جيدة بين الدفعات.

أظهرت الليبوزومات التي تم تحضيرها باستخدام الطريقة المُحسّنة توزيعاً ضيقاً للحجم (الشكل 4)، بمتوسط حجم يبلغ 185 نانومتر. وقيمة مؤشر تشتت تعدد الحجم (PDI) <تُقبل القيمة 0.3 على نطاق واسع كمؤشر على وجود مجتمع أحادي التشتت؛ لذا فإن مؤشر تشتت متعدد (PDI) الذي تم الحصول عليه والبالغ 0.153 يؤكد أن الليبوزومات موحدة الحجم بدرجة عالية. أما جهد زيتا المطلق >30 توفر قيمة الجهد الكهربائي (mV) عموماً تنافراً إلكتروستاتيكياً كافياً لمنع التكتل. وتبلغ القيمة المقاسة −38 وبالتالي فإن قيمة mV تتنبأ باستقرار غرواني جيد32إن الانحرافات المعيارية المنخفضة عبر العينات المكررة ثلاث مرات (على سبيل المثال، الحجم 185.41 ± 0.72 (نانومتر عند تركيز كوليسترول 20%) تؤكد مجددًا القابلية العالية للتكرار في إجراء التحضير. وتظهر هذه النتائج أن بروتوكول ترطيب الغشاء الرقيق والترطيب بالموجات فوق الصوتية والترشيح ينتج بشكل موثوق ليبوزومات نانوية ذات توزيع ضيق للحجم وشحنة سطحية مناسبة، مما يضمن استقرارها على المدى الطويل.

أظهرت الليبوزومات المُحضرة تأثير تيندال (Tyndall effect) واضحاً. يوضح الشكل 5A تأثير تيندال لليبوزوم33. وقد تم تقييم الخصائص المورفولوجية للليبوزومات النانوية المحملة بالريفامبيسين باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) وتشتت الضوء الديناميكي (DLS). وكما هو موضح في الشكل 4، أظهرت منحنيات توزيع الحجم الموزونة بالكثافة لليبوزومات بواسطة DLS ذروة واحدة ضيقة، مع عدم وجود جزيئات كبيرة أو تجمعات مرئية، مما يشير إلى تجانس وتشتت أحادي جيد للتركيبة المُحضرة (الشكل 5B). عند التكبير المنخفض، لوحظت حويصلات ليبوزومية كروية؛ ومع ذلك، لوحظ بعض التجمع الموضعي (الشكل 5C)، والذي قد يُعزى إلى عدم اكتمال التشتت أثناء تحضير العينة، بالإضافة إلى احتمال اندماج الحويصلات أثناء التجفيف. وعند التكبير العالي (50,000×، الشكل 5D)، كانت اختلافات التباين واضحة: حيث تتوافق المنطقة المركزية الداكنة مع النواة المائية التي تحتوي على الدواء، بينما تمثل الحلقة الخارجية الفاتحة الطبقة lipid bilayer، وهي سمة نموذجية لليبوزومات المصبوغة سلبياً34.

كان حجم الجسيمات المرصود بواسطة TEM أصغر من القطر الهيدروديناميكي الذي تم تحديده بواسطة DLS. وينشأ هذا التباين من المبادئ المختلفة للتقنيتين؛ حيث يقيس TEM قطر النواة المنزوعة الماء تحت الفراغ، بينما يكشف DLS عن القطر المميه، بما في ذلك طبقة التميؤ السطحية، وهي خاصية معروفة للجسيمات النانوية الليبوزومية35.

لم يكن هناك تحرر انفجاري واضح في مجموعات الليبوزوم الثلاث الأولى (كان معدل التحرر التراكمي عند 0.5 ساعة) <40% في جميع المجموعات). تحرر انفجاري <تعتبر نسبة 40% خلال الساعة الأولى آمنة عموماً لمستحضرات مضادات السل طويلة المفعول، حيث تقلل من خطر التسمم الجهاز الحاد. ويمكن تقسيم مراحل التحرر المحددة على النحو التالي:

فترة التحرر السريع (0.5–12 h): انتشر الدواء ببطء من الطبقة السطحية أو المنطقة القريبة من الغشاء للليبوزومات، وكان معدل التحرر سريعاً نسبياً. وقد اقترب معدل التحرر التراكمي للمجموعات الثلاث الأولى من 90% عند 12 h (الشكل 6).

بعد مرور 24 ساعة، يُفترض أن الريفامبيسين قد خضع لعمليتي تحلل تأكسدي وتحلل مائي، مما أدى إلى انخفاض غير طبيعي في معدل التحرر التراكمي.36عندما كان محتوى الكوليسترول 30%، كان معدل التحرر التراكمي عند 0.5 ساعة هو >%40، وهي نسبة لم تستوفِ معيار التحرر المستدام.

وبناءً على ذلك، تُعد التركيبات التي تحتوي على 5–15% من الكوليسترول مقبولة، كما أن نسبة 20% تستوفي أيضاً معيار التحرر الانفجاري. ويؤكد التباين الضئيل بين الدفعات (الشكل 6) إمكانية تكرار طريقة اختبار التحرر.

تمت مطابقة بيانات التحرر للمجموعات الثلاث الأولى مع نماذج حركية شائعة (الرتبة الصفرية، والرتبة الأولى، ونموذج Higuchi، ونموذج Ritger-Peppas) (الشكل 7). وأظهرت النتائج أن نموذج الحركية من الرتبة الأولى حقق أعلى جودة مطابقة (R2= 0.987)، وهو ما كان متفوقاً بشكل ملحوظ على نماذج الرتبة الصفرية (R2= 0.246)، وHiguchi (R2= 0.544)، وRitger-Peppas (R2 = 0.926). وهذا يشير إلى أن سلوك تحرر الدواء من الليبوزومات يتبع حركية الرتبة الأولى. ويرتبط معدل التحرر ارتباطاً إيجابياً بتركيز الدواء المتبقي في الليبوزومات، مما يظهر خاصية "التحرر الانفجاري الأولي - يليه تحرر مستدام" النموذجية، وهو ما يؤكد بشكل أكبر الآلية التي يؤثر بها الكوليسترول على معدل الانتشار من خلال تنظيم بنية الغشاء37.

أظهرت الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين استقراراً جيداً على المدى القصير خلال 30 يوماً من التخزين عند 4 °C. وعلى مدار فترة التقييم التي شملت 1 و4 و30 يوماً، زاد حجم الجسيمات بشكل طفيف، بينما تم الحفاظ على تجانس ممتاز في الحجم (PDI < 0.15) واستقرار غرواني ملائم (جهد زيتا المطلق > 24 mV) (الجدول 6). ولوحظ حدوث أكسدة واضحة وتكون تكتلات في اليوم 60، مما يشير إلى ضعف الاستقرار طويل الأمد للمستحضر. وتؤكد هذه النتيجة ضرورة التجفيف بالتجميد أو تعديل التركيبة (على سبيل المثال، إضافة مضادات الأكسدة أو المواد الواقية من التجميد) للحفظ طويل الأمد – وهي ملاحظة عملية هامة للباحثين الذين يستخدمون هذا البروتوكول.

figure-results-1
الشكل 1. تحضير الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين عن طريق ترطيب الغشاء الرقيق. مخطط لسير العمل يوضح تحضير الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين. تم إذابة المكونات الدهنية في مذيب عضوي، يليه تكوين غشاء رقيق من خلال التبخير الدوار، والتجفيف تحت التفريغ، والترطيب، والمعالجة بالموجات فوق الصوتية لإنتاج التركيبة الليبوزومية النهائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2تحديد ومعايرة الريفامبيسين باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). (A(كروماتوجرام HPLC نموذجي للريفامبيسين يوضح ذروة الاستبقاء المميزة المستخدمة في التحليل الكمي.)Bمنحنى معايرة تم إنشاؤه عن طريق رسم مساحة القمة مقابل تركيز الريفامبيسين (1.15-23.0 µg/mL). معادلة الانحدار ومعامل الارتباط (R2 (= 0.9995) تُظهر خطية ممتازة عبر نطاق التركيز المختبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. كفاءة التغليف وتحميل الدواء لليبوسومات المحملة بالريفامبيسين. كفاءة التغليف (EE) وتحميل الدواء (DL) لليبوسومات التي تم تحضيرها بمحتويات متفاوتة من الكوليسترول. لوحظت أعلى كفاءة تغليف (68.5%) وأعلى تحميل للدواء (11.4%) عند نسبة 20% من الكوليسترول، مما يشير إلى أن محتوى الكوليسترول يؤثر بشكل كبير على تغليف الدواء وتحميله. تمثل أشرطة الخطأ المتوسط × SD (العدد = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. توزيع حجم الجسيمات للليبوزومات المحملة بالريفامبيسين. ملفات توزيع حجم الجسيمات لليبوزومات محملة بالريفامبيسين تم تحضيرها بنسب مختلفة من الفوسفوليبيد إلى الكوليسترول. أظهرت الصيغة المحسنة متوسط قطر Z-average يبلغ 185 nm ومؤشر تشتت متعدد (PDI) قدره 0.153، مما يشير إلى توزيع ضيق للحجم وتجانس جيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5. التوصيف الفيزيائي والكيميائي لليبوزومات المحملة بالريفامبيسين. (أ) يشير تأثير تيندال الملاحظ في معلق الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين إلى وجود جسيمات نانوية. (ب) منحنيات توزيع حجم الجسيمات من ثلاث مكررات متوازية لتركيبة الليبوزوم المحسنة. (ج) صورة بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) تظهر حويصلات ليبوزومية كروية متعددة. (د) صورة تمثيلية عالية التكبير بالمجهر الإلكتروني النافذ لحويصلة ليبوزومية فردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6ملفات التحرر في المختبر للريفامبيسين من الليبوزومات. ملفات التحرر التراكمي للريفامبيسين من الليبوزومات التي تم تحضيرها بنسب مختلفة من الفسفوليبيد إلى الكوليسترول على مدار فترة الدراسة. تباين سلوك التحرر باختلاف محتوى الكوليسترول، مما يوضح تأثيره على خصائص تحرر الدواء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7. النمذجة الحركية لتحرر الريفامبيسين من الليبوزومات. تم تطبيق بيانات التحرر للتركيبة المثلى (20% كوليسترول) على النماذج الحركية التالية: (A) الرتبة الصفرية، (B) الرتبة الأولى، (C) نموذج هيجوتشي (Higuchi)، و(D) نموذج ريتجر-بيباس (Ritger-Peppas). أظهر نموذج الرتبة الأولى أعلى جودة للمطابقة (R2 = 0.987)، مما يشير إلى أفضل توافق مع بيانات التحرر التجريبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مكونات الليبوسومليسيثينكوليسترولريفامبيسين
5%٤٧.٥ مجم٢.٥ مجم١٠ ملجم
10%٤٥ ملجم5 ملغ10 mg
15%٤٢.٥ ملجم7.5 mg10 mg
20%٤٠ ملغ10 مجم10 ملجم
25%37.5 مجم١٢.٥ ملغ١٠ ملجم
30%35 ملغ١٥ ملجم10 مجم
الحجم النهائي10 مل

الجدول 1: تركيب تركيبات الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين. تم استخدام الليسيتين والكوليسترول والريفامبيسين لتحضير ليبوزومات بنسب مختلفة من الفوسفوليبيد إلى الكوليسترول، مع الحفاظ على حجم نهائي قدره 10 mL.

التركيز (µg/mL)X±Sالانحراف المعياري النسبي (%)
9.2114012.75 ± 502.420.44
13.8171412.50 ± 493.900.29
18.4232334.00 ± 1358.420.59

الجدول 2: دقة القياس الكمي بواسطة HPLC عند تركيزات مختلفة من الريفامبيسين. تم الحصول على قياسات مساحة القمة لمحاليل قياسية من الريفامبيسين بتركيزات 9.2 و13.8 و18.4 µg/mL. يتم عرض النتائج في صورة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، حيث تظهر قيم الانحراف المعياري النسبي (RSD) دقة تحليلية عالية.

الرقم1234الانحراف المعياري النسبي (%)
مساحة الذروة1145031141251139691145390.32

الجدول 3: دقة الجهاز في طريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). تقييم الدقة بناءً على أربع حقنات متتالية من المحلول القياسي نفسه للريفامبيسين. يتم تسجيل قيم مساحة القمة والانحراف المعياري النسبي (RSD) لتقييم تكرارية الجهاز.

الزمن (ساعة)024681224الانحراف المعياري النسبي (%)
مساحة القمة1145031143251145161139781138941136381125760.59%

الجدول 4: استقرار المحلول القياسي للريفامبيسين. تقييم استقرار محلول قياسي من الريفامبيسين بتركيز 9.2 µg/mL تم تخزينه في درجة حرارة الغرفة وتحليله عند 0 و2 و4 و6 و8 و12 و24 ساعة. تم تسجيل قيم مساحة القمة والانحراف المعياري النسبي (RSD) لتقييم استقرار المحلول خلال فترة الاختبار.

كوليسترولالحجم (nm)مؤشر تشتت الحجم (PDI)جهد زيتا (mV)كفاءة التغليف (EE %)نسبة تحميل الدواء (DL %)
5%206.27±1.140.240±0.004-42.72±0.2664.09±1.3010.68±0.22
10%183.87±2.540.149±0.004-24.80±1.0464.70±0.3010.78±0.05
15%202.06±3.160.131±0.007-27.90±1.0465.11±1.6210.85±0.27
20%185.41±0.720.164±0.044-37.74±1.4468.54±2.1911.42±0.37
25%181.58±1.310.100±0.008-19.96±0.1649.38±2.528.23±0.42
30%178.78±0.820.074±0.014-40.25±0.3348.24±2.068.04±0.34 

الجدول 5: الخصائص الفيزيائية والكيميائية لليبوزومات المحملة بالريفامبيسين. حجم الجسيمات، ومؤشر تشتت تعدد القياسات (PDI)، وجهد زيتا، وكفاءة التغليف (EE)، وتحميل الدواء (DL) لليبوزومات المحضرة بمحتويات مختلفة من الكوليسترول. البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري (n = 3).

يوم واحد٤ أيام٣٠ يوماً 
الحجم (نانومتر)183.87±2.54212.42±3.12273.57±4.38
مؤشر تشتت متعدد (PDI)0.149±0.0040.106±0.0020.126±0.009
جهد زيتا (ملي فولت)-24.80±1.04-57.12±1.49-55.38±2.50

الجدول 6: استقرار تخزين الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين عند درجة حرارة 4 °C. التغيرات في حجم الجسيمات، ومؤشر تشتت الحجم (PDI)، وجهد زيتا لليبوزومات المحملة بالريفامبيسين بعد التخزين لمدة 1 و4 و30 يوماً عند درجة حرارة 4 °C. استُخدمت النتائج لتقييم الاستقرار الفيزيائي للتركيبة الليبوزومية أثناء التخزين.

المناقشة

لا يزال الريفامبيسين يشكل حجر الزاوية في العلاج الكيميائي لمرض السل من الخط الأول، ومع ذلك، فإن فائدته السريرية تتأثر بشدة بسبب السمية الكبدية المعتمدة على الجرعة، وضعف النفاذ داخل الخلايا إلى البلاعم التي تأوي بكتيريا Mycobacterium tuberculosis (MTB)، والظهور السريع للمقاومة الدوائية عند التعرض لجرعات دون علاجية. ولمعالجة هذه الاحتياجات السريرية غير الملباة، قامت هذه الدراسة بإنشاء وتحسين بروتوكول قوي لترطيب الغشاء الرقيق مقترنًا بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية والترشيح لتصنيع ليبوزومات محملة بالريفامبيسين. وأظهرت الصيغة المحسنة حجم جسيمات نانويًا منتظمًا، ومورفولوجيا حويصلية سليمة، وكفاءة عالية في تغليف الدواء، وملف إطلاق دوائي مستدام في المختبر، مع إجراء توصيف فيزيائي كيميائي شامل عبر تشتت الضوء الديناميكي (DLS)، والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، وكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC)، واختبارات الذوبان في المختبر.

تؤثر عدة خطوات في البروتوكول بشكل حاسم على جودة الليبوزومات وقابلية تكرار النتائج. أولاً، تعد نسبة الفوسفوليبيد إلى الكوليسترول ذات أهمية قصوى؛ حيث تؤدي النسبة المثلى 80:20 إلى كفاءة تغليف (EE) تبلغ 68.5% وتسرّب دوائي (DL) بنسبة 11.4%، بينما تؤدي الانحرافات إلى نسب 75:25 أو 70:30 إلى >فقدان بنسبة 30% من الإيثانول (EE). يُعد الوزن الدقيق باستخدام ميزان بدقة عشرة آلاف جزء من المليجرام أمراً إلزامياً. ثانياً، الترطيب (قسم 1.6) يتطلب التدوير بسرعة 100 دورة في الدقيقة، 37 °C لـ 1 على مبخر دوراني بدون تفريغ. وتؤدي الحضن الساكن أو الرج اليدوي إلى ضعف في إمكانية تكرار النتائج. ثالثاً، المعالجة بالموجات فوق الصوتية (قسم 1.7): 40 100 كيلو هرتز و، 10 دقيقة عند 37 °C يعطي متوسطاً حسابياً Z قدره 185 نانومتر ومؤشر تشتت متعدد (PDI) < 0.2. سونيكة أقصر (5 دقيقة) ينتج عنها >300 النانومتر ومؤشر تشتت تعدد القياسات (PDI) > 0.3؛ سونيكة أطول (20 دقيقة) يُعرض الدواء لخطر التحلل. حافظ على درجة حرارة 37 °C بسبب حساسية الريفامبيسين (rifampicin) للحرارة. رابعاً، بالنسبة للترشيح المتسلسل (0.45 µm ثم 0.22 µm)، قم بترطيب المرشحات مسبقاً باستخدام محلول PBS واستخدم تمريرة واحدة رقيقة. إن الدفع القسري عبر المرشحات الجافة أو استخدام حقنة صغيرة قد يؤدي إلى تمزق الحويصلات. خامساً، الترشيح الفائق لـ EE (أقسام (2.1-2.3): 200 بالضبط µL، ٤ دورات بسرعة ٧,٠٠٠ × جرام, 25 °C، مع جمع ودمج جميع الرشاحات بعد كل دورة. وتؤدي الدورات غير المكتملة إلى تقدير مفرط لكفاءة الاستخلاص (EE). سادساً، الصبغ السلبي بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) (قسم 5.6): حمض الفوسفوتونجستيك بنسبة 2%، والأس الهيدروجيني pH 7.0، وتجفيف فوري. يؤدي التأخير أو استخدام درجة حموضة (pH) غير صحيحة إلى انهيار الحويصلات. إن اتباع هذه الخطوات الست باستمرار ينتج ليبوزومات تستوفي معايير القبول، كما يتضح من الانحرافات المعيارية المنخفضة عبر المكررات الثلاثية.

يعد الكوليسترول مكوناً هيكلياً حاسماً في الطبقات الثنائية لليبوزومات، وله تأثيرات مزدوجة موثقة جيداً على سيولة الغشاء والاستقرار الميكانيكي والاحتفاظ بالأدوية المحبة للدهون. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم تأثير النسبة المولية للكوليسترول على أداء التركيبة بشكل منهجي، ووجدنا أن أقصى كفاءة تغليف بلغت 68.5% تم تحقيقها عند محتوى كوليسترول بنسبة 20% (نسبة كتلية). ويُفترض أن هذه النسبة المثالية تحقق توازناً بين الحفاظ على البنية الصفائحية المنظمة للطبقة الثنائية من الفوسفوليبيد لتقليل تسرب الدواء، والحفاظ على سيولة غشائية كافية لاستيعاب جزيئات الريفامبيسين المحبة للدهون داخل النواة الكارهة للماء في الطبقة الثنائية. وعلى العكس من ذلك، أدى تجاوز محتوى الكوليسترول نسبة 20% إلى تصلب مفرط في الطبقة الثنائية الدهنية، وتعطيل الترتيب الصفائحي المنتظم، مما أدى لاحقاً إلى انخفاضات كبيرة في كل من كفاءة التغليف وسعة تحميل الدواء. وتتوافق هذه النتائج مع الفهم الآلي الراسخ لدور الكوليسترول في هندسة أغشية الليبوزومات. وبناءً على ذلك، فإن الوزن الدقيق للدهون (باستخدام ميزان بدقة 100,000) والالتزام الصارم بنسبة الكتلة 20% من الكوليسترول أمر إلزامي لتحقيق تحميل عالٍ للدواء.

أظهرت الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين والمحسنة متوسط قطر هيدروديناميكي قدره 185 nm مع مؤشر تشتت متعدد (PDI) يبلغ 0.164 ± 0.044، مما يشير إلى توزيع موحد للغاية في حجم الجسيمات. وهذا البعد النانوي (< 200 nm) لا يتوافق فقط مع تأثير النفاذية والاحتفاظ المعزز (EPR) للاستهداف السلبي للآفات السلية الرئوية الملتهبة، بل يعد أيضاً مثالياً لعملية البلعمة الفعالة بواسطة البلاعم السنخية، وهي الموضع الخلوي الأساسي لبكتيريا MTB. ويمتلك تصميم حجم الجسيمات هذا القدرة على معالجة القصور الجوهري في الريفامبيسين الحر، الذي يفشل في تحقيق تركيزات علاجية داخل البلاعم المصابة بـ MTB. ويوفر جهد زيتا البالغ −38 mV للتركيبة المحسنة تنافراً إلكتروستاتيكياً قوياً بين الجسيمات، مما يمنع بفعالية تجمع الحويصلات واندماجها وترسيبها أثناء التخزين قصير المدى، وبالتالي ضمان استقرار غرواني ممتاز. ومن الملاحظ أن حجم الجسيمات الأساسي الذي تم قياسه بواسطة TEM كان أصغر من القطر الهيدروديناميكي الذي تم الحصول عليه عبر DLS، وهي ظاهرة موثقة جيداً في توصيف الليبوزومات؛ حيث يقوم DLS بقياس قطر الحويصلة المميّهة، بما في ذلك طبقة التميّه المائية المحيطة، بينما يلتقط التصوير بواسطة TEM لب القلب الدهني منزوع الماء تحت ظروف تفريغ عالٍ. لذا، فإن هذا التباين هو نتيجة متوقعة ومنطقية من الناحية الفيزيائية والكيميائية، وليس تعارضاً في عملية التوصيف.

أكد التصوير المجهري الإلكتروني النافذ (TEM) الخصائص المورفولوجية للليبوزومات المحسنة، والتي ظهرت في الغالب كحويصلات أحادية الطبقة كروية وسليمة ومنتظمة، مع وجود تكتلات محلية طفيفة فقط وعدم وجود اندماج واضح أو تمزق في الغشاء. وتؤكد هذه النتائج أن عملية الموجات فوق الصوتية والترشيح المدمجة تتيح تحكماً دقيقاً في مورفولوجيا الحويصلات وتعدد الطبقات، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للطبقة الثنائية الليبوزومية. وتعد السلامة الهيكلية سمة جودة حرجة لتركيبات الليبوزومات، حيث ترتبط مباشرة بالاحتفاظ بالدواء أثناء التخزين، واستقرار الدوران داخل الجسم الحي، وأداء التوصيل المستهدف. بالإضافة إلى ذلك، أكد تأثير تيندال (Tyndall effect) البارز الذي لوحظ في معلق الليبوزومات الطبيعة الغروية لتشتت الحويصلات نانوية الحجم.

أظهرت دراسات تحرر الدواء في المختبر أن الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين والمحسنة لم تظهر تحرراً انفجارياً ملحوظاً خلال أول 0.5 h، وهي ميزة حاسمة تقلل من خطر السمية الجهازية الحادة المرتبطة بالتركيزات القصوى السريعة للريفامبيسين الحر في البلازما. وكشف نمذجة حركية تحرر الدواء أن ملف التحرر كان الأكثر ملاءمة لنموذج حركي من الرتبة الأولى، مما يشير إلى أن تحرر الريفامبيسين من الطبقة الليبوزومية الثنائية محكوم بشكل أساسي بالانتشار السلبي بدلاً من تآكل المصفوفة الدهنية. ويعد نمط التحرر المستدام الذي يتحكم فيه الانتشار مرغوباً للغاية في علاج السل، حيث يتيح الحفاظ لفترة طويلة على تركيزات دوائية علاجية فعالة، مما يقلل من خطر التعرض لتركيزات دون المستوى العلاجي التي تدفع نحو ظهور مقاومة للأدوية. ولوحظ انخفاض طفيف في التحرر التراكمي للدواء بعد 24 h، وهو ما يعزى على الأرجح إلى التحلل التأكسدي والمائي للريفامبيسين غير المغلف في وسط التحرر المائي، وهي نتيجة تتفق مع بيانات الاستقرار المنشورة سابقاً للريفامبيسين في البيئات المائية38. ومن المهم الإشارة إلى أن الطبقة الليبوزومية الثنائية توفر بيئة دقيقة واقية للدواء المغلف، مما يقلل من تعرضه لظروف التحلل مقارنة بالريفامبيسين الحر.

توفر تركيبة الليبوزومات المحملة بالريفامبيسين والمحسنة التي تم تطويرها في هذه الدراسة مزايا متعددة ومتميزة للعلاج المضاد للسل، حيث تعالج بشكل مباشر القيود الرئيسية للعلاج الكيميائي التقليدي بالريفامبيسين. أولاً، توفر الطبقة المزدوجة للليبوزومات حاجزاً واقياً ضد التحلل المبكر للدواء في البيئات المائية والبيولوجية، مما يحافظ على النشاط المضاد للميكروبات للريفامبيسين. ثانياً، يعمل ملف التحرر المستدام والخاضع للتحكم عبر الانتشار على إطالة نصف عمر الدوران الجهازي للدواء، مما يتيح تقليل تكرار الجرعات وتحسين التزام المريض بالعلاج، وهو تحدٍ كبير في العلاج الكيميائي طويل الأمد للسل. ثالثاً، يسهل حجم الجسيمات النانوية المحسن كلاً من الاستهداف السلبي للآفات السلية الملتهبة عبر تأثير EPR والامتصاص الفعال من قبل البلاعم السنخية المصابة بـ MTB، مما يحقق تركيزات دوائية عالية داخل الخلايا لا يمكن الوصول إليها باستخدام الريفامبيسين الحر39,40. وأخيراً، تتكون التركيبة من فوسفوليبيدات وكوليسترول متوافقة حيوياً ومستمدة طبيعياً، مما يقلل من خطر الاستجابة المناعية أو السمية الجهازية المرتبطة بوسيلة التوصيل نفسها.

من الجدير بالذكر أن هذه الدراسة تشمل عدة قيود يجب معالجتها في الأبحاث المستقبلية. وبينما أظهر التوصيف الفيزيوكيميائي في المختبر (in vitro) ومخططات التحرر أداءً واعداً للمستحضر، فإن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات في الجسم الحي (in vivo) لتقييم السلوك الحركي الدوائي، والتوزع النسيجي، والفعالية المضادة للسل، والسمية الجهازية لليبوزومات المحملة بالـ rifampicin في نماذج حيوانية ذات صلة. بالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية توسيع نطاق بروتوكول التحضير المُحسّن للتصنيع على النطاق الصناعي تتطلب مزيداً من التحقق.

في الختام، أرست هذه الدراسة بروتوكولاً بسيطاً وقوياً وعالي التكرار يعتمد على ترطيب الغشاء الرقيق والسونيكة والترشيح لتصنيع ليبوزومات محملة بالريفامبيسين. وقد حدد التحسين المنهجي للتركيبة الدور الحاسم لمحتوى الكوليسترول في التحكم في كفاءة التغليف واستقرار الغشاء، حيث أظهرت التركيبة المحسنة خصائص فيزيائية وكيميائية مثالية، وكفاءة عالية في تغليف الدواء، واستقراراً غروانياً ممتازاً، وتحرراً منضبطاً ومستداماً للدواء في المختبر. يوفر هذا البروتوكول المعياري إطاراً منهجياً موثوقاً لتطوير وتوصيف أنظمة توصيل أدوية السل الليبوزومية، ويضع أساساً متيناً للتقييم قبل السريري اللاحق لليبوزومات المحملة بالريفامبيسين لعلاج السل الحساس للأدوية والمقاوم لها على حد سواء.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 21977019).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
L-α-فوسفاتيديل كولين (فول الصويا)RHAWNR024502≥نقاء 90%، 25 جم/عبوة، CAS: 97281-47-5
1× محلول منظم من الفوسفات الملحى (PBS)SolarbioP1038٥٠٠ مل، ٠.٠١ مول/لتر، الرقم الهيدروجيني ٦.٥
1× محلول منظم PBS، بأس هيدروجيني 7.4ThermoFisher Scientific (Gibco)C10010500BT-1٥٠٠ مل، pH ٧.٤
كلوروفورمعلامة قوانغتشو التجاريةGD10-AR-2.5Lدرجة AR، 500 مل/زجاجة، CAS: 67-66-3
الكوليسترولعلاء الدينC104028-5g درجة التحليل (AR grade)، ≥95% (HPLC)، 5 جم/زجاجة، CAS 57-88-5
أغشية الديالزة (MD25، 7000 دالتون)SolarbioYA1081-5mحد قطع للوزن الجزيئي 7000 دالتون، بطول 5 م، من مادة غير معدنية
نظام تحليل كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC)، موديل LC-20Aشركة Shimadzu، اليابانLC-20Aالنظام مجهز بكاشف للأشعة فوق البنفسجية من طراز SPD-20A، ومضخة رباعية من طراز CBM-20A، وجهاز لإزالة الغازات عبر الإنترنت من طراز LC-20AT، وحاقن تلقائي من طراز SIL-20A، وفرن للأعمدة من طراز CTO-20A، وبرنامج LC-solution لمحطة العمل. وقد استُخدم النظام في التحديد الكمي للريفامبيسين.
جهاز طرد مركزي مكتبي عالي السرعةمصنع شنغهاي أنتينغ للأجهزة العلميةTGL-16Bتُستخدم لطرد العينات مركزياً
حمض إل-أسكوربيكماكلينA800296نقاء 99.99%، 100 جم/زجاجة، CAS: 50-81-7
جهاز تحليل حجم الجسيمات وجهد زيتا OmniBrookhaven Instruments Corporation، الولايات المتحدة الأمريكية173PIتُستخدم لتحديد حجم الجسيمات، ومؤشر تشتت تعدد الأحجام (PDI)، وجهد زيتا لليبوزومات.
ريفامبيسينماكلينR817237نقاء 97%، 250 ملجم/زجاجة، رقم CAS: 13292-46-1
المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)شركة Hitachi, Ltd.، اليابانHT7700تُستخدم للملاحظة المورفولوجية لليبوسومات
Tween 80كيمياء الطاقةE0807391000-A01درجة الكاشف التحليلي (AR)، 100 مل/زجاجة، رقم CAS: 9005-65-6
وحدات ترشيح طرد مركزي فائقة الترشيح (0.5 مل، 3 كيلو دالتون)Merck MilliporeUFC500396حد قطع للوزن الجزيئي 3 كيلو دالتون، وحجم 0.5 مل، ومصنوع من مادة بلاستيكية

المراجع

  1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2025. Geneva: World Health Organization; 2025.
  2. Wei X, Yue L, Zhao B, Jiang N, Lei H, Zhai X. Recent advances and challenges of revolutionizing drug-resistant tuberculosis treatment. Eur J Med Chem. 2024;277:116785.
  3. World Health Organization. Consolidated guidelines on tuberculosis: module 4: treatment and care. Geneva: World Health Organization; 2022.
  4. Singh V. Tuberculosis treatment-shortening. Drug Discov Today. 2024;29(5):103955.
  5. Li SY, et al. Next-generation diarylquinolines improve sterilizing activity of regimens with pretomanid and the novel oxazolidinone TBI-223 in a mouse tuberculosis model. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(4).
  6. Timm J, et al. Baseline and acquired resistance to bedaquiline, linezolid and pretomanid, and impact on treatment outcomes in four tuberculosis clinical trials containing pretomanid. PLOS Glob Public Health. 2023;3(10).
  7. Chesov E, et al. Emergence of bedaquiline resistance in a high tuberculosis burden country. Eur Respir J. 2022;59(3):2100621.
  8. Dhillon J, Mitchison DA. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Mycobacterium microti OV254. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33(8):1255-9.
  9. Ge Z, Wang Z, Wei M. Measurement of the concentration of three antituberculosis drugs in the focus of spinal tuberculosis. Eur Spine J. 2008;17(11):1482-7.
  10. Parbhoo T, Schurz H, Mouton JM, Sampson SL. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in response to infection burden and host-induced stressors. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:981827.
  11. Sarathy JP, et al. Prediction of drug penetration in tuberculosis lesions. ACS Infect Dis. 2016;2(8):552-63.
  12. Fountain FF, Tolley EA, Jacobs AR, Self TH. Rifampin hepatotoxicity associated with treatment of latent tuberculosis infection. Am J Med Sci. 2009;337(5):317-20.
  13. Chen X, et al. Acquired resistance during short-course treatment for rifampicin-resistant tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2026;32(2):315-22.
  14. Singh V, Chibale K. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis. Acc Chem Res. 2021;54(10):2361-76.
  15. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000;13:155-68.
  16. Drulis-Kawa Z, Dorotkiewicz-Jach A. Liposomes as delivery systems for antibiotics. Int J Pharm. 2010;387(1-2):187-98.
  17. Singh SR, et al. Advancing tuberculosis chemotherapy: targeted nanomedicines for the mycobacterium TB granuloma. Small. 2025;21(49).
  18. Ferreira M, et al. Liposomes as antibiotic delivery systems: a promising nanotechnological strategy against antimicrobial resistance. Molecules. 2021;26(7):2047.
  19. Zweijpfenning SMH, et al. Safety and outcomes of amikacin liposome inhalation suspension for Mycobacterium abscessus pulmonary disease: a NTM-NET study. Chest. 2022;162(1):76-81.
  20. Allen TM, Cullis PR. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(1):36-48.
  21. Truzzi E, et al. Drugs/lamellae interface influences the inner structure of double-loaded liposomes for inhaled anti-TB therapy: an in-depth small-angle neutron scattering investigation. J Colloid Interface Sci. 2019;541:399-406.
  22. U.S. Food and Drug Administration. ARIKAYCE (amikacin liposome inhalation suspension) [prescribing information]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2018.
  23. Yıldırım M, Düzgüneş N. Liposome-encapsulated antibiotics for the therapy of mycobacterial infections. Antibiotics (Basel). 2025;14(7):728.
  24. Yun Y, et al. Recent advances in functional lipid-based nanomedicines as drug carriers for organ-specific delivery. Nanoscale. 2025;17(13):7617-38.
  25. Farooque F, Mughees MM, Wasi M. Liposomes as drug delivery system: an updated review. J Drug Deliv Ther. 2021;11(5 Suppl):149-58.
  26. Wang Z, Liu L, Yin W, Liu Z, Shi L, Tang M. A novel drug delivery system: the encapsulation of naringenin in metal-organic frameworks into liposomes. AAPS PharmSciTech. 2021;22(2):61.
  27. Niu NK, et al. Preparation and characterization of HRZ triple anti-tuberculosis drugs/TGF-β1 siRNA nanoliposomes. Orthop J China. 2018;26(23):2177-82.
  28. Wang Y, et al. Formulation and pharmacokinetic evaluation of a paclitaxel nanosuspension for intravenous delivery. Int J Nanomedicine. 2011;6:1497-507.
  29. Mishra M, et al. Mycobacterial lipid-derived immunomodulatory drug-liposome conjugate eradicates endosome-localized mycobacteria. J Control Release. 2023;360:578-90.
  30. Yoshizawa Y, Kono Y, Ogawara KI, Kimura T, Higaki K. PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharm. 2011;412(1-2):132-41.
  31. Guo LN, et al. Liposome and exosome pre-treatment for transmission electron microscopy and morphological observation. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni. 2025;64(4):62-68.
  32. Crommelin DJA, van Bommel EMG. Stability of liposomes on storage: freeze dried, frozen or as an aqueous dispersion. Pharm Res. 1984;1(4):159-63.
  33. Wang F, et al. Nanoliposome-encapsulated brinzolamide-hydropropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: a potential therapeutic ocular drug-delivery system. Front Pharmacol. 2018;9:91.
  34. Ubhe AS. Imaging of liposomes by negative-stain transmission electron microscopy and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 2023;2633:245-51.
  35. Filippov SK, et al. Dynamic light scattering and transmission electron microscopy in drug delivery: a roadmap for correct characterization of nanoparticles and interpretation of results. Mater Horiz. 2023;10:2023-42.
  36. Wallenwein CM, et al. How wound environments trigger the release from rifampicin-loaded liposomes. Int J Pharm. 2023;633:122606.
  37. Forte J, et al. Mucoadhesive rifampicin-liposomes for the treatment of pulmonary infection by Mycobacterium abscessus: chitosan or ε-poly-L-lysine decoration. Biomolecules. 2023;13(6):924.
  38. Sorokoumova GM, et al. Bacteriostatic activity and decomposition products of rifampicin in aqueous solution and liposomal composition. Pharm Chem J. 2008;42:475-8.
  39. Fenaroli F, et al. Enhanced permeability and retention-like extravasation of nanoparticles from the vasculature into tuberculosis granulomas in zebrafish and mouse models. ACS Nano. 2018;12(8):8646-61.
  40. Hamed A, Osman R, Al-Jamal KT, Holayel SM, Geneidi AS. Enhanced antitubercular activity, alveolar deposition and macrophage uptake of mannosylated stable nanoliposomes. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:513-23.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ليبوزومات الريفامبيسينعلاج السلإيصال الأدوية بواسطة الليبوزوماتترطيب الغشاء الرقيقكفاءة التغليفتحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداءتشتت الضوء الديناميكيالمجهر الإلكتروني النافذتحرر الدواء في المختبر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.