يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

سير عمل موحد للتصوير عالي المحتوى ومعالجة البيانات

44 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71863

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولاً للتصوير عالي المحتوى الموحد ومعالجة البيانات للخلايا المصبوغة بـ propidium iodide (PI)/Hoechst 33342 لإجراء تحليل قابل للتكرار لحيوية الخلايا باستخدام سير عمل مؤتمت لالتقاط الصور وتحليلها.

الملخص

لمواجهة تحديات انخفاض قابلية التكرار الناتجة عن التباينات التشغيلية في التصوير الخاص بالبحث العلمي، وتعقيد تحليل عدد كبير من العينات باستخدام الطرق التقليدية، نقدم بروتوكولاً لصبغ خلايا HT22 بصبغتي PI وHoechst 33342، ومن ثم تصوير وتحليل البيانات باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى (High-Content Imaging System). يهدف سير العمل هذا إلى وضع معلمات مضبوطة لإعدادات التصوير ومعايير صارمة لمراقبة الجودة. كما يوضح إعدادات التصوير في الجهاز وسير العمل لثلاث طرق مختلفة لمعالجة الصور يوفرها الجهاز، وهي: تسجيل الخلايا متعدد الأطوال الموجية (Multi)، والحي-الميت (Live)، ومحرر الوحدات المخصصة (CME). وقد تمت مقارنة طرق معالجة الصور هذه والتحقق من صحتها مقابل الطريقة التقليدية، ImageJ، لضمان فعاليتها. وتلخص الدراسة في النهاية سير عمل لاستخدام نظام التصوير عالي المحتوى لتحديد حيوية الخلايا باستخدام طريقة الصبغ المزدوج بـ PI وHoechst. ومن خلال توحيد سير عمل التصوير ومعالجة البيانات بالكامل، تعزز الدراسة بشكل كبير من قابلية تكرار وموثوقية التصوير في البحث العلمي، مما يوفر دعماً منهجياً قوياً لمقارنة البيانات بين المختبرات ويدفع عجلة البحث العلمي.

المقدمة

يعد نظام التصوير عالي المحتوى أداة حاسمة في البحوث العلمية الحديثة، حيث يتيح التصوير عالي السرعة والتقييم متعدد المعايير للخلايا المصابة أو غير المصابة1,2,3. وهو يلعب دوراً لا يمكن الاستغناء عنه في تخصصات متنوعة؛ ففي مجال علوم الحياة، يساعد الباحثين في استكشاف العالم المجهري للخلايا والأنسجة4,5. على سبيل المثال، يتيح الكشف الدقيق عن الجزيئات والبنى المحددة بصبغات فلورية داخل الخلايا تصوراً واضحاً للبنى الخلوية الدقيقة والتغيرات الديناميكية6. أما في أبحاث العلوم العصبية، فيمكن للنظام إجراء تصوير ثلاثي الأبعاد للعصبونات، مما يساعد في تحليل الروابط المعقدة وآليات نقل الإشارات في الشبكات العصبونية، ويوفر أدلة حاسمة لفهم وظائف الدماغ والمسببات المرضية للأمراض العصبية7,8,9.

على الرغم من المزايا الكبيرة لتقنية نظام التصوير عالي المحتوى، لا تزال هناك عدة مشكلات في عملية التصوير. ففي مرحلة تحضير العينة، توجد درجة عالية من الذاتية؛ إذ تفتقر عمليات تحضير العينات البيولوجية، مثل التعامل مع الخلايا والصباغة، إلى المعايير ذات الصلة. أما فيما يتعلق بمعلمات التصوير، فهناك اختلافات ملحوظة في أوقات التعريض واختيار أطباق الآبار بين المختبرات وموديلات المجاهر عالية المحتوى. وفي مرحلة معالجة البيانات، هناك نقص في التوحيد القياسي، بدءاً من تقليل الضجيج وضبط التباين للصور الخام، وصولاً إلى تحديد المعلمات وتعيين السمات المستهدفة. وتؤدي هذه المشكلات بشكل مباشر إلى انحيازات في نتائج التصوير بالمجهر، مما يتسبب في أزمة في إمكانية تكرار النتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يستخدم هذا البروتوكول خطاً خلوياً تجارياً (HT22, ATCC) ولا يتضمن مشاركين بشريين أو أنسجة بشرية أولية. كما لم يتم استخدام أي حيوانات في هذه الدراسة.

1. تحضير العينات الموحد

  1. تحضير خلايا HT22
    1. عندما تصل درجة تلاقي خلايا HT22 إلى 80%10,11، تخلص من الوسط القديم. استخدم تريپسين 0.25% لفصل الخلايا، مع التحضين لمدة 1–2 min في درجة حرارة الغرفة.
    2. أضف وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) بمقدار 3 أضعاف حجم التريپسين 0.25% لإيقاف عملية الفصل. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL.
    3. قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 175 x g لمدة 3 min في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من الراشح. أعد تعليق الخلايا في وسط DMEM كامل لإنشاء معلق من الخلايا المفردة.
    4. قم بعد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا. ازرع 5,000 خلية لكل بئر في 100 µL من الوسط الكامل في طبق 96-well plate12.
    5. حضن الطبق عند 37 °C مع 5% CO2 لمدة 24 h. قم بعمليات تقسيم العينات، وتحديد الجرعات، والصبغ في طبق 96-well plate وفقاً للتصميم التجريبي.
      ​ملاحظة: استخدم طبق 96-well plate متوافقاً مع نظام التصوير. اختر طبقاً بسمك وقاعدة هندسية مناسبين، وفقاً لمواصفات الشركة المصنعة. يوصى باستخدام الأطباق ذات القاعدة الزجاجية (سمك القاعدة 130–170 µm) عندما تكون هناك حاجة لجودة صورة أعلى13,14,15,16.
  2. إجراء الصبغ
    1. تأكد من أن الخلايا تشكل طبقة أحادية مفردة جيدة التوزيع وألا تتجاوز درجة التلاقي 70% لتقليل تداخل الخلايا (الشكل 1B).
    2. قسم العينات وفقاً للمتطلبات التجريبية وابدأ بالصبغ بعد المعالجة. حضر محاليل الصبغة العاملة بتركيز نهائي 6.684 µg/mL لـ PI و 10 µg/mL لـ Hoechst 3334217,18.
    3. تخلص من الوسط القديم من طبق 96-well plate واغسل كل بئر مرتين باستخدام 100 µL من PBS. أضف محلول الصبغة العامل واحضنه في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لمدة 30 min لإتمام الصبغ.
    4. اغسل كل بئر مرتين باستخدام 100 µL من PBS، ثم أضف DMEM.
      ملاحظة: قد تختلف التصاميم التجريبية المختلفة في معايير تحميل العينات والصبغ.

2. مواصفات التصوير وإعدادات المعلمات

  1. معايير بارامترات التصوير
    ​ملاحظة: توضح هذه الدراسة فقط سير عمل التصوير بالمجال الواسع للجهاز بعد صبغ PI و Hoechst 33342.
    1. قم بتشغيل الجهاز ثم ابدأ تشغيل الكمبيوتر. افتح برنامج التحليل الملحق بالجهاز.
    2. قم بتحميل اللوحة ذات الـ 96 بئراً في الجهاز. حدد مجال الرؤية الذي يحتوي على العينات المراد تصويرها.
    3. في إعدادات الشيئية والكاميرا، اضبط التكبير على "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230)، وتجميع بكسلات الكاميرا (Camera binning) على "2"، ووضع الاستحواذ (Acquisition Mode) على "Widefield".
    4. في وضع اللوحة (plate mode)، اختر البارامترات المقابلة للوحة ذات الـ 96 بئراً واضبط بارامترات اللوحة وفقاً لبيانات حجم المنتج.
    5. ضمن خيار الموقع (Site Option)، اختر عادةً 9 مجالات لكل بئر للتصوير الكثيف. وفي خيارات التركيز التلقائي (Autofocus)، اختر تفعيل التركيز القائم على الليزر (Enable laser-based focusing).
    6. اضبط بارامترات التركيز التلقائي بالليزر تحت بند Autofocus، بناءً على متوسط سمك قاع اللوحة المقاس من ثلاث آبار عينات على الأقل. اضبط سمك القاع (bottom thickness)، والتباين الأقصى لسمك القاع (Bottom thickness max variation)، والتباين الأقصى للبئر المجاورة (Adjacent well max variation)، والتباين الأقصى داخل البئر (Intra-well max variation)، والتباين الأقصى للوحة (Plate max variation) وفقاً لذلك.
    7. تحت بند الأطوال الموجية (Wavelengths)، اضبط عدد الأطوال الموجية على 3. بالنسبة للإضاءة الأولى، اختر DAPI. وفي تصحيح التظليل (Shading Correction)، اختر "Auto Correction for FL" (الشكل 2B).
    8. بعد العثور على الصورة، اضبط زمن التعريض الأولي (Exposure (ms)) على 20–30. راقب الصور الملتقطة واضبط التعريض باستمرار لتحقيق كثافة فلورية معتدلة دون تعريض مفرط، واضبط عمق البت (bit depth) على 16 (الشكل 2A).
    9. اختر الليزر مع إزاحة z (z-offset) لضبط التركيز. إذا لم يكن التركيز واضحاً، فقم بتفعيل Use Z stack، وانقر على Calculate Offset، واختر مسافة بؤرية مناسبة. قم بتفعيل Digital Confocal (info) واضبط بارامترات الضبط لـ زيادة الحدة (Increase Sharpness) و تقليل الضوضاء (Reduce Noise) على 0.200.
      ملاحظة: إذا كان تعريض الصورة أو وضوحها غير مرضٍ، فقم بتعديل التعريض وإعادة حساب بارامترات الإزاحة (offset).
    10. بالنسبة للإضاءة الثانية، اختر Cy3. اتبع نفس الإعدادات كما في الخطوات 2.1.7-2.1.9.
    11. بالنسبة للإضاءة الثالثة، اختر TL 25. اتبع نفس الإعدادات كما في الخطوات 2.1.7-2.1.9.
      ملاحظة: اضبط تصحيح التظليل بناءً على القناة، وبالنسبة لـ TL 25 يجب اختيار Auto Correction for TL. في الأطوال الموجية، يجب ضبط قناة TL لتحديد موقع الخلايا والملاحظة المورفولوجية.
    12. في علامة تبويب التشغيل (Run)، سمِّ اللوحة وفقاً لاتفاقية التسمية: اسم اللوحة-نوع الخلية-معرف التجربة-التاريخ-تكبير الشيئية-نوع التصوير. أكد البارامترات المتعلقة بقناة التصوير تحت بند الوصف (Description).
    13. انقر على Acquire Plate لبدء التصوير. بعد اكتمال التصوير، قم بإيقاف تشغيل البرنامج والجهاز والكمبيوتر بالتتابع.
      ​ملاحظة: لاحقاً، يمكن فتح الكمبيوتر فقط لتصدير الصور، ومعالجة البيانات، وتحليل النتائج.
  2. معايير ومتطلبات عمليات التصوير
    1. اجعل مجال الرؤية متمركزاً في وسط البئر لتجنب تأثيرات الحواف (الشكل 1A). أثناء إعداد بارامترات التصوير، استخدم الضابط الموجب ذو الكثافة الفلورية الأعلى كمرجع. بالإضافة إلى ذلك، عند التركيز، اختر مجال رؤية يحتوي على طبقة واحدة من الخلايا، بحيث يكون نظيفاً وخالياً من الرواسب.
    2. بالنسبة للكاميرا، تحكم في قيم البكسل بحيث تظل بدقة أقل من 60000 (القيمة القصوى هي 65535) لمنع التشبع، والذي يمكن أن يسبب فقداناً دائماً للمعلومات. إذا ظهرت نقاط أو مناطق ساطعة مشبعة، فقم بتقليل زمن التعريض. وفي الوقت نفسه، لا تجعل زمن التعريض منخفضاً جداً؛ وإلا ستطغى الضوضاء على الصورة.
    3. بالنسبة لإشارات الفلورة الضعيفة، أعطِ الأولوية لزيادة التعريض قليلاً بدلاً من رفع البارامترات قسرياً لتجنب الضرر غير القابل للعكس الناتج عن التبييض الضوئي (photobleaching).
      ملاحظة: بالنسبة للتصوير بالمجال المضيء، يمكن تخفيف هذه المبادئ بشكل مناسب، ولكن يظل التركيز الأساسي على سلامة الإشارة وحماية العينة.
    4. تأكد من أن الخطوط الخارجية للعينة مميزة بوضوح، وتأكد من أن الهياكل الدقيقة الداخلية (مثل الحبيبات، والألياف، والعضيات) لها أنسجة متميزة وغير ضبابية، وأن الضوء المشتت في الخلفية موزع بالتساوي دون وجود نقاط ساطعة موضعية أو هالات ضبابية. تجنب تماماً التركيز المفرط (over-focusing) أو نقص التركيز (under-focusing).
    5. تأكد من وجود مجموعات طبيعية، وموجبة، وسالبة، وتجريبية، وأن كل مجموعة علاجية تحتوي على 3 آبار متوازية على الأقل. يوصى بترتيب الآبار المتوازية رأسياً.

3. معالجة الصور وتحليلها

ملاحظة: يوضح هذا المستند ثلاث طرق لمعالجة الصور يوفرها البرنامج المصاحب للجهاز، وجميعها مناسبة لبروتوكول التلوين المستخدم في هذه الدراسة. وبينما تشترك هذه الطرق في نفس المبدأ الأساسي للتعرف، إلا أنها تختلف في تقنيات المعالجة المحددة وأنواع نتائج البيانات. كان سير عمل معالجة الصور ذاته على النحو التالي: فتح الملف → قم بتحميل الصورة الأصلية مع طريقة المعالجة المقابلة لها → ضبط معلمات القناة المناسبة → إنشاء قناع → اضبط نوع بيانات القياس في Measure → إجراء التحليل → لاحظ النتائج → تصدير البيانات.

  1. افتح برنامج التحليل المرفق مع الجهاز → مراجعة الطبق → اختر الطبق.
  2. في عرض التاريخ، حدد ترتيب الآبار واختر مجال رؤية من المجموعة الإيجابية كمرجع.
  3. ضمن "تشغيل التحليل" (Run Analysis)، حدد برنامج المعالجة المقابل واضبط معاملات معالجة الصور أو قم بتصدير الصورة.
  4. بعد ضبط المعلمات وحفظها، اختر "التشغيل على جميع الآبار" (Run on all wells) أو "التشغيل على المختارات" (Run on selections) أو "التشغيل على الموقع المعروض" (Run on displayed site) بناءً على كائن إعداد المعلمات.
  5. بعدما ينتهي الكمبيوتر من معالجة البيانات، اختر برنامج معالجة البيانات المقابل في قائمة "التحليل" (Analysis) ضمن علامة التبويب "القياسات" (Measurements)، ثم اختر نتائج قياس مختلفة في قائمة "القياس" (Measurement) لمراجعة البيانات.
  6. انقر فوق "Open Log" لبدء تصدير البيانات. حدد التفاصيل التالية في إعدادات المعلمات لطرائق معالجة الصور الثلاث:
    1. طريقة معالجة الصور الأولى: تقدير عدد الخلايا متعدد الأطوال الموجية
      1. حدد برنامج "Multi-Wavelength Cell Scoring" وقم بتكوين الإعدادات. حدد عدد الأطوال الموجية، ثم اختر قياسي من أجل الخوارزمية.
      2. اضبط معاملات التعرف لجميع النوى بناءً على نتائج صبغ الـ PI. صورة المصدر W1 الافتراضية هي قناة DAPI.
      3. اضبط الحد الأدنى التقريبي للعرض على 8-10 µم وعرض الحد الأقصى التقريبي من 30 إلى 35 µم، وذلك بناءً على حجم الأجسام الفردية المراد التعرف عليها.
      4. اضبط الشدة فوق الخلفية المحلية لتكون بين 2,000 و10,000 مستوى رمادي. استخدم "المعاينة" (Preview) لاختبار الإعدادات وضبطها بناءً على نتائج التعرف.
      5. اضبط معاملات W2 بناءً على نتائج صبغ Hoechst 33342. قم بتسمية هذه القناة. صورة مصدر W2 هي Cy3.
      6. في منطقة "Stained area"، حدد المنطقة المصبوغة بواسطة هذه القناة كـ "Nucleus". اتبع نفس الإعدادات المذكورة في الخطوات 3.6.1.3–3.6.1.4 بالنسبة للإعدادات اللاحقة. في "Configure Summary Log" أو "Configure Data Log (Cells)"، اختر تكوين "Parameter" المقابل بناءً على معاملات النتائج المطلوبة.
        ملاحظة: عادةً ما يُستخدم خيار "تكوين سجل الملخص" (Configure Summary Log) لضبط أنواع البيانات المطلوبة، بينما يُستخدم خيار "تكوين سجل البيانات (الخلايا)" (Configure Data Log (Cells)) عند الحاجة إلى تمييز خاص لخلايا فردية.
      7. أجرِ تشغيلًا تجريبيًا لملاحظة عملية التعرف. وفي حال كانت نتائج التعرف مرضية، احفظ الإعدادات.
    2. طريقة معالجة الصور الثانية: اختبار الخلايا الحية والميتة (Live-Dead)
      1. اختر برنامج Live-Dead وابدأ في تكوين الإعدادات. حدد معاملات الطول الموجي 1 ومعاملات الطول الموجي 2 بالتتابع.
      2. ضمن معاملات الطول الموجي 1 (Wavelength 1 Parameters)، اضبط مصدر الطول الموجي 1 (Wavelength 1 Source) على DAPI. الخوارزمية (Algorithm) الافتراضية هي "قياسي"
      3. اضبط نوع الخلايا المصبوغة (Stained cell type) على "جميع الخلايا" (All Cells)، والمنطقة المصبوغة (Stained area) على "النواة" (Nucleus) بناءً على ظروف التصبغ. اضبط الحد الأدنى التقريبي للعرض (Approximate min width)، والحد الأقصى التقريبي للعرض (Approximate max width)، والشدة فوق الخلفية المحلية (intensity above local background) باستخدام نفس إعدادات طريقة تسجيل الخلايا متعددة الأطوال الموجية (Multi-Wavelength Cell Scoring).
      4. تحقق من خيار "تقسيم الكائنات المتلامسة" (Split touching objects) واستخدم "المعاينة" (Preview) للاختبار.
      5. ضمن معاملات الطول الموجي 2 (Wavelength 2 Parameters)، اضبط مصدر الطول الموجي 2 (Wavelength 2 Source) على Cy3.
      6. اضبط "نوع الخلية المصبوغة" (Stained cell type) على "ميتة" (Dead) و"المنطقة المصبوغة" (Stained area) على "النواة" (Nucleus) بناءً على الصبغ المحدد. واضبط "أدنى عرض تقريبي" (Approximate min width)، و"أقصى عرض تقريبي" (Approximate max width)، و"الشدة فوق الخلفية المحلية" (intensity above local background) باستخدام الإعدادات نفسها المستخدمة في طريقة "تحديد درجات الخلايا متعددة الأطوال الموجية" (Multi-Wavelength Cell Scoring).
      7. انقر فوق "تكوين سجل الملخص" (Configure Summary Log) واختر "تكوين المعاملات" (Parameter configuration) بناءً على أنواع البيانات المطلوبة. قم بإجراء "تشغيل تجريبي" (Test Run) لمراقبة عملية التعرف. وفي حال الرضا عن نتائج التعرف، قم بحفظ الإعدادات.
    3. طريقة معالجة الصور الثالثة: وضع المظهر CME
      1. حدد برنامج الوحدة المخصصة (CME) وابدأ في تكوين الإعدادات. قم بإعداد أسماء الصور والقنوات.
        ملاحظة: لتسهيل إعدادات المعلمات اللاحقة، يتم تعيينها عموماً وفقاً لأسماء القنوات المستخدمة أثناء التصوير.
      2. في "Find Objects"، افتح "Simple Threshold" لضبط التعرف على المجموعة بأكملها.
      3. اضبط المصدر ليتوافق مع اسم الصورة. وبناءً على نطاق قيم التدرج الرمادي لـ 16 بت، أدخل 0 في العتبة الدنيا و65535 في العتبة العليا.
      4. سمِّ نتيجة المعالجة في Result، ثم طبقها، ولاحظ حالة التحديد. وفي Find Objects، افتح Find Blobs لإنتاج نتيجة قناع Mask.
      5. اضبط المصدر (Source) ليتوافق مع اسم الصورة (Image Name)، كما هو الحال في العتبة البسيطة (Simple Threshold). ثم اضبط الحد الأدنى التقريبي للعرض (Approximate min width)، والحد الأقصى التقريبي للعرض (Approximate max width)، والشدة فوق الخلفية المحلية (intensity above local background) وفقاً لإعدادات تسجيل الخلايا متعدد الأطوال الموجية (Multi-Wavelength Cell Scoring).
      6. قم بتسمية نتيجة المعالجة في Result، ثم طبقها، ولاحظ نتيجة التحديد. وبالنسبة لنتيجة تعرّف Find Blobs، استخدم أداة Modify Objects للتصفية، والزيادة، والتقليص، والعكس.
      7. ضمن خيار القياس (Measure)، حدد معدل (Modified). وفي مدخلات القياس (Measurement Inputs)، أدخل القيمة 1 لقيمة المساحة القياسية (Standard Area Value) وقم بتفعيل خيار إنشاء تراكب كائن (Create Object Overlay).
      8. في "الأجسام المراد قياسها" (Objects to Measure)، حدد مصدر الأجسام المحددة في "قناع الأجسام" (Mask of Objects)، وصورة المصدر المراد قياسها في "الصورة المراد قياسها" (Image to Measure). اختر "اسم القياس" (Measurement Name) المقابل بناءً على معاملات نتيجة المعالجة المطلوبة، ثم اضغط تطبيق، ولاحظ نتيجة التعرف على المعاملات.
      9. بعد التأكد من إعدادات المعلمات، احفظ التكوين.
    4. الطريقة العامة: ImageJ
      ​ملاحظة: قم بتحليل نتائج التصوير باستخدام طريقة ImageJ للصور الفلورية19 ثم إجراء تحليل مقارن بين الطرق الثلاث لهذا الجهاز.
      1. افتح برنامج ImageJ. استيراد الصور: ملف → فتح → اختر صورة التدرج الرمادي الأصلية المراد تحليلها.
      2. تحويل الصورة إلى 8 بت: صورة → النوع → 8-بت. التعرف على قيمة التدرج الرمادي: الصورة → ضبط → العتبة → افتراضي، أحمر → التحقق من الخلفية المظلمة → مجموعة → يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته.
        ملاحظة: إذا كان التعرف على المنطقة الحمراء غير مرضٍ، فاستبدل الخيار الافتراضي (Default) بأحد نماذج التعرف الـ 16 الأخرى المدمجة في ImageJ أو قم بتعديل الشريط المنزلق في مربع الحوار.
      3. ضبط المعلمات: تحليل → ضبط القياسات (Set Measurements). في مربع الحوار المنبثق، قم بتحديد Area، وMean gray value، وIntegrated density، وLimit to threshold، وDisplay label، وRedirect to None by default، وأدخل الرقم 2 في خانة Decimal places (0-9). انقر فوق موافق (OK).
      4. تحليل نتائج التعرف: تحليل → قياس. حفظ النتائج: في مربع حوار النتائج المنبثق، ملف → اختر "حفظ باسم" (Save As)، ثم حدد موقع الحفظ.
  7. تصدير الصور
    1. اختر مجال رؤية عالي الجودة لبئر إيجابي ليكون بمثابة المعيار المرجعي.
      ملاحظة: تتمثل متطلبات الجودة الأساسية في الموثوقية، والدقة في التركيز، والتعرض المناسب (16 بت)، والتباين الملائم (حيث يُفضل أن تكون نسبة الإشارة إلى الضجيج أعلى). وتتضمن متطلبات الجودة العالية وجود سمات مميزة، والتباين، والعملية، والتغيرات المورفولوجية البديهية، وإبراز النقاط الرئيسية.
    2. ضمن "تحليل التشغيل" (Run Analysis)، حدد ExportPro في قسم "التحليل" (Analysis)، وابدأ "إعداد التشغيل للتحليل" (Run Setup for Analysis). في "تحديد خيارات المخرجات" (Select output options)، اختر "القناة الفردية" (Individual channel)، و"تراكب الألوان" (Color overlay)، و"تصغير الصورة" (shrink image) (اختياري)، و"شريط المقياس" (Scale bar) (اختياري) بناءً على متطلبات الصورة.
    3. حدد صور القنوات الفلورية المراد تصديرها لكل مجال رؤية. في خيار "القناة الفردية" (Individual Channel)، اختر لوناً لكل قناة، مثل اللون الأزرق (Blue) لقناة DAPI واللون أحادي اللون (Monochrome) لقناة TL.
    4. في قائمة تراكب الألوان (Color overlay)، اختر القنوات المقابلة لكل من المجال المضيء (BRIGHTFIELD)، والأحمر (RED)، والأزرق (BLUE)، والأخضر (GREEN) على الترتيب (حدد الطول الموجي للون من أجل تراكب الألوان). اضبط العدد (Number) على 100؛ ثم عاين الصورة المسبقة واقبل نتيجة المعاينة.
    5. في خانة "التصدير إلى مجلد" (Export to folder) ضمن المخرجات، اختر المجلد الذي ستُحفظ فيه الصور المُصدّرة، ثم ابدأ التشغيل.
      ملاحظة: يجب عدم تصدير الصور من الدفعة الواحدة بشكل منفصل؛ وتشير دفعة الصور إلى مجموعة من الصور المأخوذة من أربع عينات أساسية: المجموعة الضابطة السلبية، والمجموعة الضابطة الإيجابية، ومجموعة الضبط الأساسية، والمجموعة التجريبية المستهدفة، على أن يتم الحصول عليها جميعاً تحت ظروف تجريبية متطابقة تماماً.
  8. مقارنة بين طرق معالجة الصور
    1. اختر 9 حقول رؤية وقارن بين العد اليدوي التقليدي للخلايا الميتة والحية وبين طرق (Multi-Wavelength Cell Scoring) و(Live-Dead) و(CME) و(ImageJ) لعد الخلايا الحية والخلايا الميتة وحساب نسبة الخلايا الميتة إلى الحية. استخدم برنامج GraphPad Prism الإصدار 10.1 لإجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA)، مصحوباً باختبار توكي للمقارنات المتعددة (Tukey's multiple comparisons test)، لتحليل الفروق.
    2. اختر 81 حقلاً مجهرياً وقارن الاختلافات في عد الخلايا، والمساحة، والكثافة بين طرق: تسجيل الخلايا متعدد الأطوال الموجية (Multi-Wavelength Cell Scoring)، واختبار الخلايا الحية والميتة (Live-Dead)، والتحليل المجهري لتقدير الخلايا (CME)، وبرنامج ImageJ. استخدم برنامج GraphPad Prism الإصدار 10.1 لإجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA)، مصحوباً باختبار توكي للمقارنات المتعددة (Tukey's multiple comparisons test)، لتحليل هذه الاختلافات.
      ملاحظة: يجب إجراء تجارب زراعة الخلايا والتصبيغ داخل كابينة السلامة البيولوجية. تخلص من السوائل العادمة، والرؤوس الطرفية، وغيرها من النفايات التجريبية وفقاً للوائح المختبر. تأكد من توفر الحماية الكاملة طوال فترة التجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تأثير التحضير الموحد على جودة التصوير

تم تكوين معاملات الطبق لضمان قدرة الجهاز على تحديد موقع طبقة صورة الخلايا بشكل موثوق. وقد سهّل تحضير العينات كطبقة واحدة من الخلايا ذات تلاقي متوسط عملية تركيز الصورة عند تكبيرات مختلفة للعدسات الشيئية، كما أدى ذلك إلى تحسين التعرف على الصور والتحليل الكمي. وقد ساهم توحيد تحضير العينات وتحسين معاملات الطبق في تقليل تأثيرات الحواف، وتداخل الخلايا، والعوامل الأخرى التي تساهم في رداءة جودة التصوير (الشكل 1).

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

باستخدام طريقة الصبغ المزدوج بـ PI وHoechst لتحديد حيوية الخلايا، يمكن لجهاز التصوير عالي المحتوى، على سبيل المثال، حساب حيوية الخلايا ضمن الدفعة نفسها بسرعة وبطريقة عالية الإنتاجية باستخدام وحدات خوارزمية مدمجة. وتتميز هذه الطريقة بعدة مزايا، منها انخفاض حجم العينة، والتكلفة المنخفضة، والحد الأدنى من تلف الخلايا، وضعف بهتان الفلورة، ومقاومة الخمود، والقدرة على التقاط صور متعددة. بالإضافة إلى ذلك، فإن وقت التصوير للوحة ذات 96 بئراً يستغرق عموماً من 30 إلى 45 min20 فقط.

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يقر جميع المؤلفين بعدم وجود تضارب في المصالح. وخلال عملية ترجمة المخطوطة، تم استخدام Zhipu AI لأغراض الترجمة فقط، وليس لتوليد بيانات بحثية أو نتائج تجريبية أو محتوى أكاديمي أساسي. ويتحمل المؤلفون المسؤولية الكاملة عن محتوى المخطوطة.

شكر وتقدير

يتوجه المؤلفون بالشكر على الدعم المقدم من مؤسسة كلية جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي. كما يشكر المؤلفون الدعم المقدم من المنحة MPRC2022034. وقد استُخدم هذا التمويل لتطوير طريقة تصوير ديناميكي ثلاثي الأبعاد لبكتيريا الأمعاء في مستخلص Erchen Decoction لعلاج الفئران المصابة بالسمنة البسيطة. كما يقر المؤلفون بالمنصة البحثية التي وفرها معهد الابتكار للطب والصيدلة الصينية ومعهد الدراسات متعددة التخصصات بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب طرد مركزي 1.5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
رؤوس ماصات 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
أنبوب طرد مركزي 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
رؤوس ماصات 2.5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
رؤوس ماصات 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
أنبوب طرد مركزي 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
طبق زراعة خلايا بـ 96 بئراًCorning Incorporated3599
ماصة أحادية القناة قابلة للضبط، 0.1–2.5 μLEppendorf SE3120000216
ماصة أحادية القناة قابلة للضبط، 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
ماصة أحادية القناة قابلة للضبط، 20–200 μLEppendorf SE3120000259
ماصة أحادية القناة قابلة للضبط، 2–20 μLEppendorf SE3120000232
طبق زراعة خلاياCorning Incorporated430167
قوارير تجميدLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
وسط دولبيكو المعدل (DMEM)Life Technologies Limited11966-025في هذه الدراسة، تم تحضير وسط DMEM الكامل باستخدام 10% FBS، و1% محلول بنسلين-ستريبتومايسين، و89% DMEM.
حاضنة ESCO CelCulture CO2Esco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
مصل بقري جنيني (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
أصباغ Hoechst 33342 الفلوريةBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
خلية HT22Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of Healthبرنامج ImageJ هو أحد برامج معالجة الصور المستخدمة في المخطوطة.
نظام التصوير عالي المحتوى بؤري ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices, LLCImageXpress Micro Confocalفي المخطوطة، استخدم "نظام التصوير عالي المحتوى" كبديل لاسم الجهاز.
جهاز طرد مركزي للتجميد منخفض السرعةHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
برنامج MetaXpress لتحصيل وتحليل الصور عالية المحتوىMolecular Devices, LLCهذا البرنامج مكمل لنظام التصوير عالي المحتوى بؤري ImageXpress® Micro Confocal. في المخطوطة، يشير مصطلح "برنامج التحليل المرفق مع الجهاز" إلى هذا البرنامج.
خزانة تدفق صفائحي عمودي OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
محلول بنسلين-ستريبتومايسينProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
محلول يوديد البروبيديوم (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
محلول Trypsin-EDTABasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

المراجع

  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

سير عمل التصويرحيوية الخلاياصبغ PI Hoechstخلايا HT22طرق معالجة الصورتسجيل الخلايا متعدد الأطوال الموجيةمقايسة الخلايا الحية والميتةمقارنة ببرنامج ImageJ

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.