مقالة منهجية

اختبار تكمل لوسيفراز منقسم لقياس تاو في الخلايا الدبقية الصغيرة (micro glia) بالحل الزمني

DOI:

10.3791/71870

⸱

يوليو 24, 2026

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Behavior Graduate Program, University of Massachusetts Amherst, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts Amherst, 3Molecular and Cellular Biology Graduate Program, University of Massachusetts Amherst

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصفي منصة كمية حساسة ومحددة زمن لقياس تصفية التاو خارج الخلية في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) باستخدام نظام إضاءة قائم على الصفائح الدقيقة. يتيح هذا النهج الكشف الحساس لحركيات تحلل التاو في صيغة البئر الدقيقة، مما يسمح بفحص عالي الإنتاجية لمعالجة التاو تحت ظروف تجريبية مختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باعتبارها الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي، تعد الخلايا الدبقية الصغيرة منظما مركزيا لتوازن الدماغ ووسطاء رئيسيين للأمراض التنكسية العصبية. تقوم هذه الخلايا باستمرار بمسح البيئة العصبية وتلعب دورا حاسما في التعرف على الركائز خارج الخلية واستيعابها وتحللها، بما في ذلك البروتينات التي تم طيها بشكل خاطئ أو مجمعة مثل التاو المرضي. على الرغم من تزايد الأدلة التي تشير إلى تورط الخلايا الدبقية الصغيرة في تطهير التاو، إلا أن الأساليب الحالية لقياس امتصاص وتحلل التاو تفتقر إلى الدقة الزمنية والحساسية اللازمة لالتقاط هذه العمليات الديناميكية بالكامل. هنا، طورنا اختبارا قائما على الإضاءة لمراقبة إزالة التاو بشكل كمي في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان (iPSC). تستفيد هذه المنصة من نظام تكمل قائم على تقسيم اللوسيفيراز لتمكين الكشف الحساس والفوري للتاو في الخلايا الحية، مما يسمح بتتبع دقيق لمعالجتها داخل الخلية. هذا الاختبار قابل للتوسع والتكيف عبر أنواع خلايا متعددة، ويوفر أداة متعددة الاستخدامات لاستكشاف المسارات الانتباذية الجزوفية والآليات الخلوية التي تحكم التعامل مع التاو في الأمراض التنكسية العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز الاعتلالات، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، بتجمع وانتشار البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة تاو عبر الدوائر العصبية 1,2. أصبحت الخلايا الدبقية محل تقدير متزايد كمنظمات لديناميكيات مرض التاو، بما في ذلك الامتصاص والتدهور والانتشار 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. فهم كيف تساهم الخلايا الدبقية في اضطرابات التاوواعتيات هو أمر ملح لحل ديناميكيات الأمراض الرئيسية، بما في ذلك الالتهاب العصبي وانتشار التاو. بين مجموعات الخلايا الدبقية، تكون الخلايا الدبقية الصغيرة - البلعوم المقيمة في الدماغ - في موقع فريد للتوسط في إزالة التاو.

على الرغم من الحاجة الملحة لتوضيح آليات التعامل مع التاو في الخلايا الدبقية الدقيقة، لا يزال المجال محدودا في دقة وإنتاجية الاختبارات المتاحة. لا تزال الأسئلة الرئيسية المتعلقة باستيعاب التاو، والاتجار داخل الخلية، وإزالة الهوائية دون حل. كل خطوة من هذه الخطوات تمثل عملية ميكانيكية مميزة: يشير الامتصاص إلى استيعاب التاو خارج الخلية عند غشاء البلازما؛ يشمل التنقل الفرز ونقل التاو الداخلي عبر أقسام داخلية داخلية واستثنائية، وليزوزومية، وأقسام أخرى داخل الخلية؛ ويشير التحلل إلى التفكك البروتيولي للتاو، بشكل رئيسي عبر المسارات الليزوسومية والبروتيازومي. على الرغم من أن هذه الخطوات متتابعة لمعالجة التاو خارج الخلية، حيث يجب أن تمر التاو الداخلي عبر حجرات داخل الخلية قبل الوصول إلى آلية التحلل، إلا أنها منظمة بشكل مستقل وقد يؤثر اضطراب تجريبي معين على خطوة واحدة دون تغيير أخرى. على سبيل المثال، قد يعكس انخفاض إشارة التاو داخل الخلية ضعف في الامتصاص، أو الابتعاد عن الأقسام المتدهورة، أو زيادة في التدهور. يتطلب حل هذه العمليات منصات اختبار جديدة يمكنها اكتشاف وجود البروتين وأن تدمج مع التدابير الحالية لتحديد مصير البروتين مع مرور الوقت.

تعتمد الطرق الحالية لحل استيعاب وتدهور التاو على الكيمياء المناعية، وقياس تدفق الخلية، وتحديد النقطة الغربية، وطرق الوسم الفلورية لقياس الامتصاص، وتحديد المواقع تحت الخلية، والمعالجة داخل الخلايا لأنواع التاو13، 14، 15، 16، 17، 18. ومع ذلك، يعاني كل من هذه الأساليب من قيود أساسية عند تطبيقه على دراسة ديناميكيات إزالة البروتينات. تفتقر الكيمياء المناعية الخلوية وإزالة الطلاء الغربي إلى الحساسية اللازمة لاكتشاف أنواع التاو منخفضة الوفرة، وتستغرق جهدا كبيرا. تفشل القياسات الخلوية التدفقية والاختبارات القائمة على التألق في الإبلاغ بدقة عن تصفية البروتين لأن الفلوروفورات يمكن أن تستمر بعد تحلل البروتين المترافق، مما يؤدي إلى فصل الإشارة الفلورية عن المصير الفعلي للبروتين المعني. معا، تترك هذه القيود فجوة حرجة، حيث لا توفر طريقة موجودة في الوقت نفسه الحساسية والدقة الزمنية والقابلية للتوسع المطلوبة لتتبع ديناميكيات تطهير التاو بشكل كمي. لذلك، كان أحد العقبات الرئيسية أمام فهم ديناميكيات تعامل التاو في الخلايا الدبقية الصغيرة هو غياب الاختبارات الكمية عالية الإنتاجية والدقيقة الزمنية لقياس تطهير التاو في الخلايا الحية.

ولمعالجة نقص المنصة الكمية لمراقبة ديناميكيات التاو الحي، طورنا اختبارا حساسا يعتمد على التوهج يمكن استخدامه للكشف عن ديناميكيات بروتينات التاو داخل الخلية. يستخدم هذا النهج نظام تكمل قائم على الانقسام اللوسيفيراز، حيث يتم دمج علامة ببتيدية صغيرة (تقنية ثنائية عالية الألفة أو HiBiT) مع التاو، مما يمكن من إجراء قياسات حركية في الخلايا الحية. عند التفاعل مع شريكه المكمل (Large Binary Technology أو LgBiT)، يعيد البروتين الموسوم تشكيل إنزيم لوسيفيرازي نشط، مولدا إشارة كمية متوهجةحيويا 20,21,22. توفر هذه الإشارة المتوهجة قراءة مباشرة وحساسة لوفرة البروتين، مما يمكن من تتبع التغيرات الديناميكية في المستويات داخل الخلايا مع مرور الوقت. وبالتالي، يمكن استخدام التلميع كمؤشر قوي على وجود أو فقدان البروتين، كما في حالة التحلل داخل الخلية. معا، تتيح هذه المنصة قياسا دقيقا ومؤقتا لمعالجة التاو، وتوفر استراتيجية واسعة التطبيق لدراسة معدل تبديد البروتين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب الخلوية في مختبر مناسب للسلامة البيولوجية من المستوى الثاني، معتمد من خدمات البيئة والصحة بجامعة ماساتشوستس أمهيرست.

1. التعبير، والتنقية، وإزالة السموم الداخلية لبروتين Tau-SLP

  1. أضف ببتيد اللوسيفيراز المنقسم أو علامة SLP (VSGWRLFKKIS) على بنية تاو لإنشاء بناء موسوم (Tau-SLP) باستخدام طرق الاستنساخ القياسية، مثل مجموعة Gibson23.
    ملاحظة: تكمل علامة ببتيد منقسم-لوسيفيراز يولد إشارة قوية عند وضعها إما في الطرف C أو الطرف N أو في المجالات الداخلية ل 2N4R Tau24.
  2. التعبير عن وتنقية Tau-SLP باستخدام الطرق الموصوفةسابقا 25،26 وضمان النقاء باستخدام SDS-PAGE وإزالة المناعة.
  3. للاستخدام مع الخلايا الدبقية الدقيقة، اتبع البروتوكولات المنشورة لإزالة السم الداخلي البكتيري بعد تنقية Tau-SLP للحد من التفاعل المربك27.
  4. قم بقياس تركيز بروتين تاو-SLP باستخدام اختبار حمض البيسينكونينيك القياسي (BCA) أو اختبار برادفورد28,29.
  5. إذا رغب، قم بتجميع Tau-SLP وفقا للبروتوكولاتالموصوفة سابقا 24.
  6. تحقق من صحة التوهج الوظيفي ل Tau-SLP عن طريق توليد منحنى قياسي باستخدام ركيزة لوسيفيراز متوفرة تجاريا وكاشف مكمل، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

2. زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC (iTF-Microglia)

  1. زراعة الخلايا الدقيقة دبقيا في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية في وسط الزراعة المناسب.
  2. تمييز خط خلية جذعية متعددة القدرات (iPSC) مستحثة يحتوي على ستة عوامل نسخ محفزة للدوكسيسيكلين لإنتاج خلية شبيهة بالخلايا الدبقية (عامل النسخ المستحث مثل الدبقية الدبقية أو iTF-ميكروغليا) باستخدام بروتوكول موثق30 (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: هذا التحليل لا يقتصر على iTF-Microglia ويمكن استخدامه مع أي خط خلوي ملتصق. قد يكون من الضروري تحسين أوقات الإزالة عند العمل مع خطوط خلايا أخرى.

3. اختبار تاو للإزالة

  1. في صفيحة تحتوي على 24 بئرا، تضع خلايا الصفائح بكثافة 1 × 105 خلايا لكل بئر، بثلاث نسخ لكل حالة، مع وسط زراعة (250 ميكرولتر) وتحضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (الشكل 1A).
  2. قم بإزالة وسط الزراعة، وغسل الخلايا مرة واحدة ب PBS (250 ميكرولتر)، واستبدلها بوسط زراعة بسعة 250 ميكرولتر.
  3. لقياس إزالة Tau-SLP مؤقتا، عرض الخلايا ل Tau-SLP بطريقة متدرجة بحيث يتم حصاد جميع الآبار في نفس الوقت مع اختلاف الوقت فقط. على سبيل المثال، لمجموعات التجويف 0 ح، 2 ساعة، و4 ساعات، أضف أولا وسط يحتوي على تاو-SLP بسعة 100 نانومالتر إلى مجموعة 4 ساعات، ثم ساعة بعد ذلك إلى مجموعة 2 ساعة، وأخيرا ساعة واحدة لاحقا إلى مجموعة 0 ساعات (انظر الشكل 1B لتوصيات التوقيت). بمجرد اكتمال فترة الاستيعاب النهائية، ستكون جميع الآبار قد خضعت لنفس فترة التعرض ل Tau-SLP لكنها ستختلف فقط في مدة الإزالة (الشكل 1B).
  4. تشمل الآبار التي لا تتلقى أي علاج لعلاج Tau-SLP للطرح الخلفي (الشكل 1C).
  5. في نهاية فترة الاستيعاب، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على Tau-SLP. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة Tau-SLP خارج الخلية واستبدلها بوسط زراعة خال من Tau-SLP.
  6. حضن الخلايا لفترة الإزالة المحددة (الشكل 1A). تمثل مجموعة إزالة 0 ساعة، التي يتم جمعها مباشرة بعد فترة الاستيعاب، الكمية الإجمالية لمادة Tau-SLP الداخلية في بداية مرحلة التصويح.
  7. بعد جميع نقاط وقت التخلص، قم بإزالة الوسائط من الآبار واغسلها بزيت PBS بسعة 250 ميكرولتر.
  8. عالج كل واحدة جيدا بجرعة 250 ميكرولتر من تريبسين-إيدتا 0.25٪ لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تقوم هذه الخطوة بإزالة التاو المرتبط بالسطح لضمان انعكاس التوهج للتاو الداخلي الداخلي. قم بتحييد كل بئر باستخدام مثبط تريبسين بسعة 250 ميكرولتر (5 ملغ/مل).
  9. اجمع كل بئر في أنبوب وحبيبات مجهزة دقيقة بسعة 1.5 مل معلمة بشكل مناسب عن طريق الطرد المركزي (500 × جم، 5 دقائق).
  10. جهز كمية مناسبة من مخزن التحلل الذي يحتوي على ركيزة لوسيفيراز ومكونات تكميلية (انظر جدول المواد؛ 50 ميكرولتر × # من الآبار + 10٪).
  11. إزالة كل مادة فائقة باستخدام ماصة شفط وأعد تعليق حبيبة الخلية في 50 ميكرولتر من محلول التحلل يحتوي على ركيزة لوسيفيراز ومكونات مكملة. هذا سينتج مركب تكامل منقسم-لوسيفيراز ويولد تلألؤ (الشكل 1D).
  12. انقل الخلايا المحللة إلى صفيحة بيضاء نصف حجم بسعة 96 بئر.
  13. اقرأ التلميع على قارئ الميكرولوح مع اهتزاز مداري لمدة 10 ثوان عند درجة حرارة الغرفة (~23 درجة مئوية) قبل القراءة لضمان تحلل كامل لحبيبات الخلايا.
  14. تحديد وفرة Tau-SLP الطبيعية أولا بطرح متوسط قيمة التلميع المستخرجة من الآبار غير المعرضة ل Tau-SLP. قم بتطبيع كل قيمة إلى متوسط إشارة الخلفية المطروحة لمجموعة المسافة 0 ساعة.
  15. قام المخطط بتطبيع وفرة Tau-SLP كدالة لوقت التخلي. يشير الانخفاض التدريجي في التوهج إلى انخفاض في وفرة التاو-SLP داخل الخلية ويفسر على أنه تطهير تاو-SLP، بينما تشير قيم التوهج المستقرة إلى ضعف أو تأخير في التخلص. احسب نسبة التخليص كالتالي: ٪ التخلي = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] × 100.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا الاختبار الحساس القائم على التلميع، يمكن مراقبة وفرة التاو-SLP داخل الخلايا مع مرور الوقت بعد فترة امتصاص متزامنة في الخلايا الصغيرة المشتقة من iPSC البشرية. بعد فقدان Tau-SLP، انخفض التوهج تدريجيا، بما يتوافق مع إزالة Tau-SLP داخل الخلية. كانت هذه المنصة حساسة بما يكفي لاكتشاف الفروقات في التعامل مع أنواع Tau-SLP الأحادية والليفية بواسطة الخلايا الدبقية الدقيقة. تم التخلص من التاو-SLP الأحادي تماما في iTF-Microglia خلال 60 دقيقة، بينما استمر Tau-SLP الليفي لأكثر من 240 دقيقة (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، أجرينا الاختبار باستخدام تاو الطافور (مثل N279K) لتقييم حركية التنظيف، ووجدنا أن TauN279K-SLP يظهر انخفاضا ملحوظا في حركيات التنظيف عند نقاط زمنية قصيرة فقط (15 دقيقة) (الشكل 2B). تشير هذه النتائج إلى أن التدهور الملحوظ قد يكون واضحا فقط بسبب الحساسية العالية لهذا الاختبار. قمنا بإجراء تجربة تحلل Tau-SLP باستخدام الجزيء الصغير L-Leucyl-L-Leucine Methyl Ester (LLOMe) لتأكيد تورط الليسوسوم. LLOMe هو ركيزة كاثيبسين C تخترق أغشية الليسوسوم، مما يعطل النشاط الليسوسومي31. مع معالجة LLOMe، لاحظنا زيادة ملحوظة في مستويات الحالة المستقرة ل Tau-SLP عند t=0 (الشكل 3A) ومعدل تدهور منخفض بشكل ملحوظ (الشكل 3B) مع زيادة 4 أضعاف في Tau-SLP المتبقية بعد فترة إزالة 60 دقيقة. أخيرا، أجرينا اختبار إزالة Tau-SLP في الخلايا العصبية المشتقة من iPSC لتأكيد توافق الاختبارات عبر أنواع الخلايا. هنا، وجدنا أن الخلايا العصبية المشتقة من iPSC لديها حركية تفاضل منخفضة لكل من الأشكال الأحادية (الشكل 4A) والألياف (الشكل 4B) من Tau-SLP. ومن الجدير بالذكر أن مستويات ألياف Tau-SLP تبقى مستقرة عند ~100٪ خلال فترة إزالة زمنية مدتها 240 دقيقة، بينما في نفس الفترة انخفضت مستويات ألياف Tau-SLP إلى أقل من 50٪ في iTF-Microglia. تظهر هذه النتائج أن منصة التكملات المعتمدة على الانقسام اللوسيفيراز لدينا تقدم اكتشافا قويا وموثوقا لإزالة الانكوليزوزومات داخل الخلايا لمادة Tau-SLP وتظهر تصميم اختبار قابل للتكيف للغاية يمكن تطبيقه على العديد من البروتينات أو أنواع الخلايا الأخرى.

figure-results-1
الشكل 1: التصميم التجريبي التمثيلي لاختبار تصريح Tau-SLP. (أ) صورة ممثلة للمجال الساطع لتقنية iTF-ميكروغليا المستخدمة في هذا الاختبار (شريط المقياس = 100 ميكرومتر) (ب) تتعرض الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية (iTF-Microglia) للدبقية الصغيرة (iTF-Microglia) للدبقية المعاد تركيبها بطريقة متداخلة، مما يمكن من الكشف القوي القائم على اللمعان. بعد حضانة لمدة ساعة، يتم إزالة التاو خارج الخلوي عن طريق تبادل الوسائط وغسل الخلايا ب PBS. يتم الحفاظ على الخلايا في وسط قاعدي خلال فترات التنظيف الخاصة بها (0 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعات) قبل الحصاد. في النهاية، يتم تحلل الخلايا ويتم قياس التلميع. (ج) تصميم لوحة مقترح لقياس تطهير Tau-SLP مقارنة بين التحلل الأحادي والليفي. (د) يتم استيعاب بروتين تاو-SLP داخل الخلايا ويوكل لتحلل الليسوسوم. إضافة LgBiT توفر قراءة كمية لكمية Tau-SLP المتبقية في الخلية من خلال التكامل وإنتاج اللمعان. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: iTF-Microglia شفاف خارج الخلية Tau-SLP. (أ) تعرضت iTF-ميكروغليا لتاو-SLP أحادي السطح (100 نانوميول) أو تاو-SLP الليفي (50 نانوملار)، وتم تطبيع العينات إلى الامتصاص الأولي (t = 0؛ 100٪) وللخلايا التي لم تتعرض ل Tau-SLP (0٪) (المتوسط ± SD؛ n = 9 من ثلاث تمايزات مستقلة). (ب) تم حضان iTF-Microglia ب Tau-SLP الأحادي أو TauN279K-SLP (100 نانوم)، وتم تطبيع العينات إلى الامتصاص الأولي (t = 0؛ 100٪) والخلايا التي لم تتعرض ل Tau-SLP (0٪) (متوسط ± SD؛ n ≥ 7 من ثلاث تمايزات مستقلة؛ ∗ p < 0.05 باستخدام اختبار t غير المرتبط بويلش). البيانات معاد طباعتها من شولتز وآخرين، 202524، واستخدمت بموجب رخصة المشاع الإبداعي للنسبة (CC BY 4.0). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تثبيط الليسوسوم يؤثر على تطهير Tau-SLP. (أ) العلاج بمثبط ليزوسومي 1 ململ L-Leucyl-L-Leucine Methyl Ester (LLOMe) لمدة 24 ساعة زاد من امتصاص Tau-SLP الأولي (t = 0) في خلايا H4 العصبية الدبقية (المتوسط ± SD؛ n = 9 مزارع مستقلة؛ ∗ p < 0.05 باستخدام اختبار t غير المرتبط بويلش). (ب) العلاج ب LLOMe (1 ملم) لمدة 24 ساعة زاد نسبة الفحص الطبيعي لعلاج TAU-SLP RLU بعد فترة إزالة 60 دقيقة (t = 60 دقيقة) مقارنة بالمركبة (DMSO). يتم تطبيع إشارة المضيء إلى مستويات الامتصاص الأولية الخاصة (100٪) والخلايا التي لم تتعرض ل Tau-SLP (0٪) (متوسط ± SD؛ n = 9 مزارع مستقلة؛ ∗∗∗∗ p < 0.0001، ∗ p < 0.05 باستخدام اختبار t غير المزوج لويلش). البيانات معاد طباعتها من شولتز وآخرين، 202524، واستخدمت بموجب رخصة المشاع الإبداعي للنسبة (CC BY 4.0). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تظهر iTF-ميكروغليا وiNeurons اختلافات في تصفية Tau-SLP. (أ) تم حضن iTF-ميكروغليا أو iNeurons مع تاو-SLP أحادي النمط (100 نانوم)، وتم تطبيع العينات إلى الامتصاص الأولي على التوالي (t=0؛ 100٪)، والخلايا التي لم تتعرض ل Tau-SLP (0٪) (المتوسط±SD؛ عدد ≥ 6 من تمايزين مستقلين إلى ثلاثة؛ ∗∗ p < 0.01، ∗∗∗∗ p < 0.0001 باستخدام تحليل التدرجات الصبغية ثنائي الاتجاه؛ الوقت: F(1, 28) = 7.489، p = 0.0107؛ نوع الخلية: F(1, 28) = 46.61، p < 0.0001; التفاعل: F(1, 28) = 3.229، p = 0.0831; اختبار المقارنات المتعددة لسيداك، حيث تم عرض قيم p في الشكل، حيث تم عرض قيم t=0 كمرجع لكنها استبعدت من التحليل الإحصائي). (B) تم حضنة iTF-ميكروغليا أو iNeurons مع Tau-SLP الليفي (50nM)، وتم تطبيع العينات إلى الامتصاص الأولي (t=0؛ 100٪) والخلايا التي لم تتعرض ل Tau-SLP (0٪) (المتوسط±SD؛ n ≥ 6 من تمايزين مستقلين إلى ثلاثة؛ ∗∗ p < 0.01، ∗∗∗∗ p < 0.0001 باستخدام تحليل التدرجات الصبغي ثنائي الاتجاه؛ الوقت: F(1, 26) = 0.3888, p = 0.5384; نوع الخلية: F(1, 26) = 43.09، p < 0.0001; التفاعل: F(1, 26) = 1.209، p = 0.2816؛ اختبار المقارنات المتعددة لسيداك، حيث تم عرض قيم p في الشكل، حيث تم عرض قيم t=0 كمرجع لكنها استبعدت من التحليل الإحصائي). البيانات معاد طباعتها من شولتز وآخرين، 202524، واستخدمت بموجب رخصة المشاع الإبداعي للنسبة (CC BY 4.0). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا الاختبار منصة قابلة للتوسع والكمية لقياس تصريح التاو-SLP خارج الخلايا بواسطة الخلايا الصغيرة الدبقية ذات حساسية عالية ودقة زمنية عالية. على عكس الأساليب التقليدية القائمة على التصوير، التي غالبا ما تتطلب معالجة عينات شاقة ومحدودة في معدل النقل والعينة الزمنية، يتيح هذا النظام القائم على التلميع القياس المباشر على مستوى السكان لمعالجة التاو في شكل الصفائح الدقيقة. يوفر القراءة الناتجة قياسا كميا لإزالة Tau-SLP بعد التعرض للتاو خارج الخلية. نظرا لأن القياسات يمكن الحصول عليها بشكل متكرر عبر نقاط زمنية متعددة وبفترات حضانة أطول، فإن الاختبار يتيح تحليلا عالي الإنتاجية ودقيق حركيا لديناميكيات امتصاص التاو والتطهير. بالإضافة إلى ذلك، تتوافق التغيرات في التوهج مع مرور الوقت مع التغيرات في وفرة التاو-SLP داخل الخلية، لكنها لا تميز بين الاتجار أو التحلل أو الإفراز دون طرق مكملة. على الرغم من أن وسم Tau-SLP لم يغير بشكل كبير امتصاص أو تجمع التاو في دراستناالمرافقة 24، إلا أن العلامات الخارجية قد تؤثر على سلوك بروتينات أخرى. لذلك، يجب استكمال نتائج الاختبار باستخدام طرق متعامدة ومقارنتها مع تحضيرات تاو غير الموسومة حيثما أمكن. قيد إضافي هو أن هذا الاختبار يستخدم أنواع تاو SLP المؤتلفة بدلا من التاو الداخلي أو التجمعات المرضية المشتقة من المرضى. بينما يوفر تاو 2N4R المؤتلف ركيزة تجريبية قابلة للتكرار، إلا أنه لا يعيد تماما التباين الداخلي (أي التعديلات بعد الترجمة) لأنواع التاو المعزولة من أدمغة المرضى البشريين. توجد العديد من البروتوكولات لفوروستة البروتين التاو المؤتلف في المختبر ويمكن دمجها بسهولة في هذا السير العملي. يمكن أيضا تكييف هذه المنصة لدراسة التاو الداخلي؛ وهذا يتطلب استخدام الهندسة الوراثية لدمج تسلسل علامات النطق واللغة في موقع التاو (MAPT).

من المهم أن تفسير تقليل الإشارة على أنه تحلل يعتمد على إزالة فعالة للتاو خارج الخلوي والسطحي، على سبيل المثال، من خلال التريبسينية أو خطوات التجريد المكافئة. قد تحدث نتائج سلبية كاذبة إذا لم يتم تحقيق إزالة فعالة. كما أن فقدان الإشارة الظاهري الذي قد يفسر على أنه إيجابي كاذب لتدهور التاو ممكن أيضا. قد ينشأ ذلك من انفصال الخلية أو موتها، أو إفراز تاو-SLP، أو انقسام بروتيوليكي يفصل النطق عن التاو دون أن يتدهور البروتين. وبناء عليه، يجب تفسير انخفاض التوهج على أنه انخفاض في وفرة التاو-SLP داخل الخلية بدلا من قياسات مباشرة لتحلل الليسوسوم. لتحديد تغيرات الإشارة بشكل أكثر تحديدا إلى تدهور الليسوسوم، يوصى باستخدام استراتيجيات تحقق متعامدة. قد تشمل هذه الاضطرابات الدوائية في وظيفة الليسوسوم، مثل العلاج بالبافيلوميسين A1 أو LLOMe (الشكل 3)، بالإضافة إلى تصاميم تجريبية بنظام النبض لتحليل حركيات الامتصاص مقابل التحلل.

مرونة هذا الاختبار تجعله مناسبا جدا لفحص آليات التحكم في امتصاص التاو، وحركة التاو داخل الخلية، وتحلله، وكذلك لفحص المعدلات الدوائية أو الجينية لإزالة التاو في الأنظمة الخلوية البشرية. على الرغم من أن ذلك يظهر هنا في الخلايا الدبقية الدقيقة المشتقة من iPSC، إلا أن المنصة قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 4)، مما يتيح تطبيقا واسعا عبر نماذج بيولوجيا التاو والأمراض التنكسية العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر وأنواع التاوواعتات الأولية والثانوية الأخرى. نظرا لأن هذا الاختبار يعتمد على التعرض خارج الخلوي ل Tau-SLP والكشف القائم على التويض، يجب أن يكون قابلا للتكيف بسهولة مع الخلايا النجمية أو الخلايا الأولية التسوة أو خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام، رغم أن تحسين ظروف الامتصاص قد يكون ضروريا. بشكل جماعي، يوفر هذا النهج أداة قوية لتحليل المسارات الخلوية المشاركة في البروتين وتعزيز الفهم الآلي لعمليات الأمراض التنكسية العصبية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (AG064116، AG077672)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AccutaseThermo ScientificA1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231
DMEM/F-12, HEPESThermo Scientific11330057
DoxycyclineClontech631311
DPBSThermo Scientific14-190-250
GlutaMAXThermo Scientific35050061
Graphing SoftwareGraphPad Prism (أو مماثل)n/a
Human GM-CSFThermo Scientific300-03
KnockOut DMEMThermo Scientific10829018
Luminescent Plate ReaderSpectraMax i3x (أو مماثل) - Molecular Devicesn/a
Microcentrifuge TubesFisher Scientific02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, WhiteGreiner675075
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection SystemPromegaN3030
Poly-L-Lysine hydrobromide Fisher ScientificICN15017750
Recombinant Human IL-34Thermo Scientific200-34
Recombinant Human M-CSFThermo Scientific300-25
Recombinant Human TGF-β1Thermo Scientific100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture PlatesFisher ScientificFB012927
Tau-HiBiT proteinIn housen/aبروتين Tau مع علامة VSGWRLFKKIS الببتيد
Trypsin InhibitorSigma AldrichT9128
Trypsin-EDTAThermo Scientific5-200-072
Y-27632 dihydrochlorideBio-techne1254

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 Nano Glo HiBiT
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة