نموذج تكوين الأوعية ثلاثية الأبعاد قائم على خرزات الحامل الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذج تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد قائم على خرزات الحامل الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية. يسمح الاختبار برؤية مباشرة لنمو البطانة وتكوين البنية الشبيهة باللومن، ويمكن تطبيقه على دراسات آليات التنشيط الوعائي والتدخلات العلاجية.

الملخص

تكوين الأوعية الدموية هو عملية بيولوجية متعددة الخطوات تشمل تنشيط الخلايا البطانية، الهجرة، التمديد، تكوين التجويف، التفرع، والانقراض. تعد أنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية مفيدة للتقييم الأولي للأدوية أو الجينات أو ظروف الزرعة، لكنها لا تعكس بشكل كاف التنظيم المكاني لتكون الشكل البطاني داخل مصفوفة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد. يصف البروتوكول الحالي اختبار تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد قائم على خرزات الحاملة الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs). يتم أولا زرع HUVECs على خرزات حاملة دقيقة تحمل كولاجين خنازير من النوع الأول المقترن كيميائيا بحمض ثم تدمج في مصفوفة الغشاء القاعدي. يتم بعد ذلك زرع الأرومات الليفية المخاطية الفموية فوق الهلام لتوفير دعم باراكرين لإنبات بطانة البطانة وتكوين البنية الشبيهة بالأوعية الدموية. يتم استبدال وسط الزراعة كل يومين، ويتم مراقبة سلوك الإنبات والأنماط الظاهرية المسببة للأوعية بواسطة المجهر المقلوب. في ظروف الزراعة المناسبة، تظهر براعم البطانة خلال عدة أيام، تليها تكوين هياكل شبيهة باللومن ووصلات بين البراعم. توفر هذه الطريقة منصة مريحة وقابلة للتكرار للدراسات المختبرية لتشكل البطانة ويمكن تطبيقها أيضا في دراسات التلاعب الجيني، والتدخل الدوائي، ونمذجة الأمراض.

المقدمة

إنبات بطانة البطانة هو حدث رئيسي في تكون الأوعية الدموية ويتضمن ظهور وهجرة وتكاثر ومحاذاة خلايا البطانة من البنى الوعائية الموجودة مسبقا، يتبع ذلك تكوين التلومين وإنشاء شبكات وعائية مترابطة^تشبه الأوعية الدموية ^1,2. على الرغم من أن أنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية واختبارات تكوين الأنابيب المعتمدة على الجل بسيطة تقنيا، إلا أنها محدودة في قدرتها على إعادة تشكيل الخلايا البطانية المكانية ضمن بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد ^3,4. اختبار الإنبات الكلاسيكي المعتمد على خرزات الحاملة الدقيقة يعيد إنتاج عدة مراحل من تكوين الأوعية الدموية في المختبر، بما في ذلك إنبات البطانة، والتمديد، وتكوين التجويف، وتجميع الشبكة، ولذلك أصبح طريقة مستخدمة على نطاق واسع في أبحاث تكوين الأوعية.

في هذا البروتوكول، تم إنشاء نموذج إنبات ثلاثي الأبعاد قائم على خرزات الحاملة الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الوريد السري البشري الطبيعية. استنادا إلى اختبارات إنبات خرز الحامل الدقيقة بطانة البطانة ^5,6,7 المبلغ عنها سابقا، تحافظ هذه الطريقة على الإطار الأساسي لطلاء الخلايا البطانية على خرز الحاملة الدقيقة، مع تضمين في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، وزراعة طبقة الأورام الليفية، مع استبدال مصفوفة الغشاء القاعدي بجل الفيبرين التقليدي لتبسيط العملية وتسهيل التصوير الروتيني. تم اختيار مصفوفة الغشاء القاعدي في هذا البروتوكول المعدل لأسباب عملية وبيولوجية متعددة. تجريبيا، يوفر مصفوفة ثلاثية الأبعاد جاهزة للاستخدام تسمح بتكوين الجل السريع، وتثبيت الخرز البسيط، والمراقبة المجهرية الروتينية المريحة دون خطوات البلمرة الإضافية المطلوبة لتحضير جل الفيبرين. بيولوجيا، تحتوي مصفوفة الغشاء القاعدي على مكونات مصفوفة خارج الخلية تدعم التصاق الخلايا البطانية، والهجرة، وتمدد البراعم، وتكوين البنية الشبيهة باللومين. لذلك، فإن هذا التعديل مناسب للدراسات التي تتطلب التصور المباشر لسلوك الإنبات البطانية، ومقارنة الأنماط الظاهرية المسببة للأوعية، وتقييم التدخلات الدوائية أو الجينية في بيئة الزراعة ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك، نظرا لاختلاف مصفوفة الغشاء القاعدي عن هلام الفيبرين في تركيب المصفوفة، والخصائص الميكانيكية، وقابلية التحلل، والإشارات النشطة الحيوية، يجب تفسير الاختبار الحالي كنموذج معدل للنمو القائم على خرزات الحامل الدقيق بدلا من كونه بديلا مباشرا للاختبار الكلاسيكي القائم على الفيبرين. قد تؤثر هذه الاختلافات المتعلقة بالمصفوفة على حركية الإنبات، واستقرار التجويف، وشكل الشبكة، ويجب أخذها في الاعتبار عند مقارنة النتائج عبر أنظمة تكوين الأوعية ثلاثية الأبعاد المختلفة. هذا النموذج مناسب لمراقبة سلوك الانتقال البطاني في ثلاثة أبعاد ويمكن تطبيقه بشكل أكبر على دراسات التدخل الدوائي، والتلاعب الجيني، والآليات الوراثية.

البروتوكول

تم عزل وزراعة خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول من أنسجة الحبل السري البشري التي جمعت من قسم التوليد، مستشفى الشعب الأول في مقاطعة يونان. تم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المتبرعين قبل جمع العينات. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تتضمن مواد مشتقة من الإنسان من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى الشعب الأول في مقاطعة يونان (رقم الموافقة. KHLL2023-KY198). تم توفير الأرومات الليفية الفموية البشرية (HOMFs) بلطف من قبل مجموعة البحث التابعة للدكتورة جييمي تشاي في مستشفى الأسنان المرتبط بجامعة كونمينغ الطبية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الخلايا

1. زراعة خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs) في وسط نمو خلايا البطانة مع إضافة مصل بقري جنيني إضافي (FBS) إلى تركيز نهائي 10٪ عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. يجب أن تكون الخلايا المستخدمة في الفحص خالية من التلوث، وتظهر نموا مستقرا، وتكون في مرحلة النمو اللوغاريتمي. استخدم الخلايا في المقطع 4–6.
2. زراعة الأرومات الليفية الفموية المخاطية البشرية (HOMFs) في وسط قاعدي عالي الجلوكوز مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. استخدم الخلايا في المقطع 4–6.
3. قبل طلاء خرز الحاملة الدقيقة، تأكد من أن كلا النوعين من الخلية عند التقاء مناسب. تجنب التزاوج المفرط في الزراعة أو الهضم الإنزيمي المفرط، لأنها قد تؤثر سلبا على البراعم اللاحقة.

2. تحضير خرز الحامل الدقيق

1. رطب 0.5 جرام من حبيبات الحاملة الدقيقة الجافة في 50 مل من PBS لمدة لا تقل عن 3 ساعات. بعد الغسيل، أعد تعليق الخرزات في 50 مل من PBS للحصول على تعليق خرزات الحامل الدقيق 10 ملغ/مل، وهو ما يعادل حوالي 3 × 10⁴ خرز/مل.
2. انقل التعليق إلى زجاجة زجاجية مزينة بالسيليكون، ثم قم بتعقيمه عن طريق التعقيم عند 115 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتخزينه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. قبل طلاء الخلايا البطانية، أزل محلول التخزين واغسل الخرزات باستخدام PBS معقم. نظم الخرزات في وسط نمو الخلايا البطانية عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
4. أعد تعليق الخرز المتساوي بلطف مباشرة قبل الاستخدام لتجنب الترسيب وتجمع الخرز.
5. قبل طلاء الخلية، افحص كمية صغيرة من تعليق الخرز تحت المجهر المقلوب. استمر فقط عندما تكون الخرزات مرطبة بالكامل، معلقة بشكل متساو، وخالية من التجمعات المرئية أو الجزيئات المجزأة.

3. تغطية خلايا البطانة على خرز الحاملة الدقيقة

1. فصل HUVECs باستخدام التربسين وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو الخلايا البطانية.
2. غط خرزات الحاملة الدقيقة بكثافة 1500 خلية لكل خرزة. اخلط 3 × 10⁶ HUVECs مع 2000 خرزة حاملة دقيقة في وسط نمو الخلايا البطانية بحجم 1.5 مل.
3. انقل خليط الخلية وخرزات الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وحضن لمدة 12 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا. خلال فترة الحضانة الكاملة التي تستمر 12 ساعة، قلب الأنبوب بلطف مرة كل 20 دقيقة للحفاظ على الاتصال الكافي بين الخلايا والخرزات ولتعزيز الارتباط البطاني بشكل منتظم.
4. بعد 12 ساعة، انقل الخرزات المطلية إلى قارورة^{زراعة خلايا} بحجم 2 سم تحتوي على 4 مل من وسط نمو الخلايا البطانية واستمر في الحضانة طوال الليل للسماح بالالتصاق القوي لخلايا البطانة بسطح خرزة الحامل الدقيقة.
5. قبل التضمين، افحص الخرزات المطلية الممثلة تحت مجهر مقلوب. تابع إلى تضمين المصفوفة فقط عندما تظهر أكثر من 80٪ من الخرزات الفحصة طبقة خلايا بطانية مستمرة وموحدة نسبيا على سطح الخرزة، مع وجود خلايا عائمة حرة قليلة، وعدم وجود تجمعات خلوية واضحة، وعدم تجمع شديد للخرز. لا ينبغي استخدام الخرز ذات الطلاء غير المتساوي أو مجموعات الخلايا الكبيرة أو التجمع الواسع للتضمين.
6. إذا التصقت الخرزات بأسفل القارورة، اهز القارورة بلطف لتحريرها. تجنب الحفر القوي، الذي قد يسبب تجمع الخرزات أو انفصال الخلايا.

4. تضمين الخرزات المطلية في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

1. انقل الخرزات الحاملة الدقيقة المغطاة بالخلايا البطانية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل ودع الخرزات تستقر بالجاذبية. أزل الوسط الزائد وأضف كمية مناسبة من الوسط الطازج.
2. اخلط تعليق خرزات الحاملة الدقيقة مع مصفوفة الغشاء القاعدي المبردة مسبقا بنسبة 1:1 (v/v) للحصول على تركيز نهائي للخرزات يبلغ 500 خرز/مل.
3. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الصفوفة إلى مركز كل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئرا، مما يسمح للخليط بتكوين قطرة هلام قبة واحدة دون ملامسة جدار البئر. اخلط نظام التعليق بلطف قبل الصرف وتجنب إدخال فقاعات هواء.
4. اترك لوحة 24 بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بالتجليل الأولي وتثبيت قطرة الهلام. ثم حضن اللوح بشكل عمودي عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة، تليها حضانة إضافية لمدة 15 دقيقة في الوضع المقلوب لضمان التجلي الكامل وتكوين الجل الصحيح.
5. بعد أن يتصلب الجل تماما، انتقل فورا إلى زراعة طبقة الألياف الليفية.

5. ثقافة التراكب الليفي

1. أعد تعليق 3 × 10⁴ من الخلايا الليفية الفموية البشرية (HOMFs) في 1 مل من وسط نمو الخلايا البطانية وأضف تعليق الخلية بلطف على طول جدار كل بئر، مما يسمح للخلايا بالتوزيع على سطح الهلام دون تعطيل قبة الجل مباشرة.
2. استمر الحضانة في وسط نمو خلايا البطانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. تستخدم الخلايا الليفية الفموية البشرية كخلايا داعمة لأنها توفر إشارات باراكرين مشتقة من السترومال تعزز تمديد براعم البطانة، واستقرارها، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية في نظام الزراعة ثلاثي الأبعاد.

6. صيانة الزراعة والمراقبة المجهرية

1. استبدل وسيط الزراعة كل يومين. أثناء تغييرات الوسط، قم بسحب الوسط المستهلك ببطء وأضف وسط زراعة طازج على طول جدار البئر لتجنب إزعاج الهلام.
2. راقب الثقافات يوميا أو كل يومين تحت مجهر مقلوب باستخدام وضع المجال الساطع أو وضع تباين الطور. للتحليل الكمي الطولي، اختر عدة مجالات رؤية في كل بئر في اليوم السابع وصور نفس الحقول المحددة مسبقا في اليومين 9 و11.
3. في ظروف الزراعة المثلى، يلاحظ عادة إنبات بطانة بطانة الرحم بشكل واضح في الأيام 4–6، وتظهر هياكل شبيهة باللومن في الأيام 5–7، وتتشكل شبكات شبيهة بالأوعية الدقيقة المترابطة تدريجيا بعد اليوم السابع.
4. عرف الانتشار الناجح بأنه وجود امتدادات متعددة بطانية تنمو شعاعيا من سطح الخرزة إلى المصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة. يجب عد البرعم فقط عندما يمتد بوضوح إلى ما وراء سطح الخرزة ويبقى متصلا بطبقة الخلية البطانية المرتبطة بالخرزة.
5. عرف تكوين البنية الشبيهة باللومن بأنه ظهور هياكل بطانية مطوية مع مساحة مركزية واضحة مرئية أو شكل يشبه الأنبوب. تعرف الاتصالات بين البراعم بأنها تلامسات مباشرة أو هياكل مستمرة تتكون بين البراعم المتجاورة.
6. يجب اعتبار الزراعة التي تعاني من موت خلوي واسع، أو تجمع شديد للخرزات، أو اضطراب بنية الهلام، أو وفقاعات وفيرة، أو انهيار مصفوفة، أو فقط بروزات خلايا قصيرة وغير منتظمة دون المستوى المثالي وتستبعد من التحليل الكمي.

7. اكتساب الصور والتحليل الكمي

1. اختر عدة حقول رؤية في كل بئر في اليوم السابع واحصل على صور من نفس الحقول المحددة مسبقا في اليومين 9 و11. يجب جمع الصور باستخدام نفس الإعدادات للتكبير، والتعريض، وظروف التصوير في جميع الأوقات الزمنية نفسها.
2. قم بقياس عدد البراعم لكل خرزة حاملة دقيقة والمنطقة الوعائية.
   1. لقياس المنطقة الوعائية، استخدم برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. افتح الصورة المكتسبة وحدد يدويا حدود المنطقة الوعائية محل الاهتمام (ROI) باستخدام أداة الاختيار المضلعة أو اليدوية الحرة. أضف العائد على الاستثمار المحدد إلى مدير العائد على الاستثمار.
   2. للتصور، استخدم إضافة تصور منطقة الاهتمام لعرض العائد على الاستثمار الموضح. تمكين قياس المنطقة في إعدادات القياس وقياس العائد على الاستثمار المختار للحصول على المنطقة الوعائية. طبق نفس إعدادات التحليل على جميع الصور.
   3. لتحليل معدل الأوعية الدموية، استخدم المنطقة الوعائية في اليوم السابع كأساس للجسم، وحساب التغير النسبي في المنطقة الوعائية في اليومين 9 و11.
3. عد عدد البراعم الفردية بشكل مستقل بواسطة ثلاثة مراقبين، واستخدم القيمة المتوسطة للتحليل.

النتائج

تكوين الأوعية الدموية في نموذج HUVEC ثلاثي الأبعاد

في المزارع التي تم تأسيسها بنجاح، توزع خلايا البطانة بشكل موحد على سطح خرزات الحاملة الدقيقة، ولا يلاحظ تجمع واضح للخرزات. أظهرت الملاحظة الديناميكية نمو البطانة التدريجي وتكوين شبكة شبيهة بالأوعية الدقيقة في الأيام 7 و9 و11 (الشكل 1A). أكد التحليل الكمي بشكل أكبر الاستجابة التقدمية الوعائية المنشأة في هذا النموذج. باستخدام اليوم السابع كأساس محدد، تم تعيين معدل ا...

المناقشة

يصف البروتوكول الحالي نموذجا معدلا لنمو بطانة البطانة ثلاثي الأبعاد يعتمد على خرز الحاملة الدقيقة. يوفر الشكل 3 نظرة عامة تخطيطية على سير العمل التجريبي. تم تكييف البروتوكول من اختبار تكوين الأوعية الدموية الكلاسيكي الذي أبلغ عنه ناكاتسو وهيوز وتم تحسينه لتحقيق أهداف الدراسة الحالية ^8,9. في النظام الكلاسيكي، تغلف خلايا البطانة على خرز ميكرو حامل مغطاة بالكولاجين، وتدمج في مصفوفة ثلاثية الأبعا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Clear, nuclease-free
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Conical-bottom, sterile, bag-packed
24-well cell culture plate	Haier	612003	Flat-bottom, tissue culture-treated, individually wrapped, for adherent cell culture
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Disposable slide for automated cell counter, 50 slides/box
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Used for cell culture at 37 °C with 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Dry powder; collagen-coated dextran microcarrier beads
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Region-of-interest visualization plugin used for displaying outlined vascularized areas
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM basic (1×), containing 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Endothelial cell culture medium supplemented with additional FBS to a final concentration of 10% before use
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualified, single-use format, Australia origin, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Primary fibroblasts isolated from human oral mucosa; kindly provided by another laboratory
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Primary endothelial cells isolated from human umbilical veins; no catalog number
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-source software; version 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	For bright-field, phase-contrast, and fluorescence imaging
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	For confocal imaging;model not specified
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	High concentration (HC), phenol red-free, LDEV-free, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicillin-streptomycin solution for cell culture, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, vented cap, tissue culture-treated, for adherent cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	0.25% trypsin-EDTA solution, 100 mL