نموذج تكوين الأوعية ثلاثية الأبعاد قائم على خرزات الحامل الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذج تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد قائم على خرزات الحامل الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية. يسمح الاختبار برؤية مباشرة لنمو البطانة وتكوين البنية الشبيهة باللومن، ويمكن تطبيقه على دراسات آليات التنشيط الوعائي والتدخلات العلاجية.

الملخص

تكوين الأوعية الدموية هو عملية بيولوجية متعددة الخطوات تشمل تنشيط الخلايا البطانية، الهجرة، التمديد، تكوين التجويف، التفرع، والانقراض. تعد أنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية مفيدة للتقييم الأولي للأدوية أو الجينات أو ظروف الزرعة، لكنها لا تعكس بشكل كاف التنظيم المكاني لتكون الشكل البطاني داخل مصفوفة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد. يصف البروتوكول الحالي اختبار تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد قائم على خرزات الحاملة الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs). يتم أولا زرع HUVECs على خرزات حاملة دقيقة تحمل كولاجين خنازير من النوع الأول المقترن كيميائيا بحمض ثم تدمج في مصفوفة الغشاء القاعدي. يتم بعد ذلك زرع الأرومات الليفية المخاطية الفموية فوق الهلام لتوفير دعم باراكرين لإنبات بطانة البطانة وتكوين البنية الشبيهة بالأوعية الدموية. يتم استبدال وسط الزراعة كل يومين، ويتم مراقبة سلوك الإنبات والأنماط الظاهرية المسببة للأوعية بواسطة المجهر المقلوب. في ظروف الزراعة المناسبة، تظهر براعم البطانة خلال عدة أيام، تليها تكوين هياكل شبيهة باللومن ووصلات بين البراعم. توفر هذه الطريقة منصة مريحة وقابلة للتكرار للدراسات المختبرية لتشكل البطانة ويمكن تطبيقها أيضا في دراسات التلاعب الجيني، والتدخل الدوائي، ونمذجة الأمراض.

المقدمة

إنبات بطانة البطانة هو حدث رئيسي في تكون الأوعية الدموية ويتضمن ظهور وهجرة وتكاثر ومحاذاة خلايا البطانة من البنى الوعائية الموجودة مسبقا، يتبع ذلك تكوين التلومين وإنشاء شبكات وعائية مترابطة^تشبه الأوعية الدموية ^1,2. على الرغم من أن أنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية واختبارات تكوين الأنابيب المعتمدة على الجل بسيطة تقنيا، إلا أنها محدودة في قدرتها على إعادة تشكيل الخلايا البطانية المكانية ضمن بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد ^3,4. اختبار الإنبات الكلاسيكي المعتمد على خرزات الحاملة الدقيقة يعيد إنتاج عدة مراحل من تكوين الأوعية الدموية في المختبر، بما في ذلك إنبات البطانة، والتمديد، وتكوين التجويف، وتجميع الشبكة، ولذلك أصبح طريقة مستخدمة على نطاق واسع في أبحاث تكوين الأوعية.

في هذا البروتوكول، تم إنشاء نموذج إنبات ثلاثي الأبعاد قائم على خرزات الحاملة الدقيقة باستخدام خلايا بطانة الوريد السري البشري الطبيعية. استنادا إلى اختبارات إنبات خرز الحامل الدقيقة بطانة البطانة ^5,6,7 المبلغ عنها سابقا، تحافظ هذه الطريقة على الإطار الأساسي لطلاء الخلايا البطانية على خرز الحاملة الدقيقة، مع تضمين في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، وزراعة طبقة الأورام الليفية، مع استبدال مصفوفة الغشاء القاعدي بجل الفيبرين التقليدي لتبسيط العملية وتسهيل التصوير الروتيني. تم اختيار مصفوفة الغشاء القاعدي في هذا البروتوكول المعدل لأسباب عملية وبيولوجية متعددة. تجريبيا، يوفر مصفوفة ثلاثية الأبعاد جاهزة للاستخدام تسمح بتكوين الجل السريع، وتثبيت الخرز البسيط، والمراقبة المجهرية الروتينية المريحة دون خطوات البلمرة الإضافية المطلوبة لتحضير جل الفيبرين. بيولوجيا، تحتوي مصفوفة الغشاء القاعدي على مكونات مصفوفة خارج الخلية تدعم التصاق الخلايا البطانية، والهجرة، وتمدد البراعم، وتكوين البنية الشبيهة باللومين. لذلك، فإن هذا التعديل مناسب للدراسات التي تتطلب التصور المباشر لسلوك الإنبات البطانية، ومقارنة الأنماط الظاهرية المسببة للأوعية، وتقييم التدخلات الدوائية أو الجينية في بيئة الزراعة ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك، نظرا لاختلاف مصفوفة الغشاء القاعدي عن هلام الفيبرين في تركيب المصفوفة، والخصائص الميكانيكية، وقابلية التحلل، والإشارات النشطة الحيوية، يجب تفسير الاختبار الحالي كنموذج معدل للنمو القائم على خرزات الحامل الدقيق بدلا من كونه بديلا مباشرا للاختبار الكلاسيكي القائم على الفيبرين. قد تؤثر هذه الاختلافات المتعلقة بالمصفوفة على حركية الإنبات، واستقرار التجويف، وشكل الشبكة، ويجب أخذها في الاعتبار عند مقارنة النتائج عبر أنظمة تكوين الأوعية ثلاثية الأبعاد المختلفة. هذا النموذج مناسب لمراقبة سلوك الانتقال البطاني في ثلاثة أبعاد ويمكن تطبيقه بشكل أكبر على دراسات التدخل الدوائي، والتلاعب الجيني، والآليات الوراثية.

البروتوكول

تم عزل وزراعة خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول من أنسجة الحبل السري البشري التي جمعت من قسم التوليد، مستشفى الشعب الأول في مقاطعة يونان. تم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المتبرعين قبل جمع العينات. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تتضمن مواد مشتقة من الإنسان من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى الشعب الأول في مقاطعة يونان (رقم الموافقة. KHLL2023-KY198). تم توفير الأرومات الليفية الفموية البشرية (HOMFs) بلطف من قبل مجموعة البحث التابعة للدكتورة جييمي تشاي في مستشفى الأسنان المرتبط بجامعة كونمينغ الطبية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الخلايا

1. زراعة خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs) في وسط نمو خلايا البطانة مع إضافة مصل بقري جنيني إضافي (FBS) إلى تركيز نهائي 10٪ عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. يجب أن تكون الخلايا المستخدمة في الفحص خالية من التلوث، وتظهر نموا مستقرا، وتكون في مرحلة النمو اللوغاريتمي. استخدم الخلايا في المقطع 4–6.
2. زراعة الأرومات الليفية الفموية المخاطية البشرية (HOMFs) في وسط قاعدي عالي الجلوكوز مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. استخدم الخلايا في المقطع 4–6.
3. قبل طلاء خرز الحاملة الدقيقة، تأكد من أن كلا النوعين من الخلية عند التقاء مناسب. تجنب التزاوج المفرط في الزراعة أو الهضم الإنزيمي المفرط، لأنها قد تؤثر سلبا على البراعم اللاحقة.

2. تحضير خرز الحامل الدقيق

1. رطب 0.5 جرام من حبيبات الحاملة الدقيقة الجافة في 50 مل من PBS لمدة لا تقل عن 3 ساعات. بعد الغسيل، أعد تعليق الخرزات في 50 مل من PBS للحصول على تعليق خرزات الحامل الدقيق 10 ملغ/مل، وهو ما يعادل حوالي 3 × 10⁴ خرز/مل.
2. انقل التعليق إلى زجاجة زجاجية مزينة بالسيليكون، ثم قم بتعقيمه عن طريق التعقيم عند 115 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتخزينه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. قبل طلاء الخلايا البطانية، أزل محلول التخزين واغسل الخرزات باستخدام PBS معقم. نظم الخرزات في وسط نمو الخلايا البطانية عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
4. أعد تعليق الخرز المتساوي بلطف مباشرة قبل الاستخدام لتجنب الترسيب وتجمع الخرز.
5. قبل طلاء الخلية، افحص كمية صغيرة من تعليق الخرز تحت المجهر المقلوب. استمر فقط عندما تكون الخرزات مرطبة بالكامل، معلقة بشكل متساو، وخالية من التجمعات المرئية أو الجزيئات المجزأة.

3. تغطية خلايا البطانة على خرز الحاملة الدقيقة

1. فصل HUVECs باستخدام التربسين وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو الخلايا البطانية.
2. غط خرزات الحاملة الدقيقة بكثافة 1500 خلية لكل خرزة. اخلط 3 × 10⁶ HUVECs مع 2000 خرزة حاملة دقيقة في وسط نمو الخلايا البطانية بحجم 1.5 مل.
3. انقل خليط الخلية وخرزات الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وحضن لمدة 12 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا. خلال فترة الحضانة الكاملة التي تستمر 12 ساعة، قلب الأنبوب بلطف مرة كل 20 دقيقة للحفاظ على الاتصال الكافي بين الخلايا والخرزات ولتعزيز الارتباط البطاني بشكل منتظم.
4. بعد 12 ساعة، انقل الخرزات المطلية إلى قارورة^{زراعة خلايا} بحجم 2 سم تحتوي على 4 مل من وسط نمو الخلايا البطانية واستمر في الحضانة طوال الليل للسماح بالالتصاق القوي لخلايا البطانة بسطح خرزة الحامل الدقيقة.
5. قبل التضمين، افحص الخرزات المطلية الممثلة تحت مجهر مقلوب. تابع إلى تضمين المصفوفة فقط عندما تظهر أكثر من 80٪ من الخرزات الفحصة طبقة خلايا بطانية مستمرة وموحدة نسبيا على سطح الخرزة، مع وجود خلايا عائمة حرة قليلة، وعدم وجود تجمعات خلوية واضحة، وعدم تجمع شديد للخرز. لا ينبغي استخدام الخرز ذات الطلاء غير المتساوي أو مجموعات الخلايا الكبيرة أو التجمع الواسع للتضمين.
6. إذا التصقت الخرزات بأسفل القارورة، اهز القارورة بلطف لتحريرها. تجنب الحفر القوي، الذي قد يسبب تجمع الخرزات أو انفصال الخلايا.

4. تضمين الخرزات المطلية في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

1. انقل الخرزات الحاملة الدقيقة المغطاة بالخلايا البطانية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل ودع الخرزات تستقر بالجاذبية. أزل الوسط الزائد وأضف كمية مناسبة من الوسط الطازج.
2. اخلط تعليق خرزات الحاملة الدقيقة مع مصفوفة الغشاء القاعدي المبردة مسبقا بنسبة 1:1 (v/v) للحصول على تركيز نهائي للخرزات يبلغ 500 خرز/مل.
3. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الصفوفة إلى مركز كل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئرا، مما يسمح للخليط بتكوين قطرة هلام قبة واحدة دون ملامسة جدار البئر. اخلط نظام التعليق بلطف قبل الصرف وتجنب إدخال فقاعات هواء.
4. اترك لوحة 24 بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بالتجليل الأولي وتثبيت قطرة الهلام. ثم حضن اللوح بشكل عمودي عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة، تليها حضانة إضافية لمدة 15 دقيقة في الوضع المقلوب لضمان التجلي الكامل وتكوين الجل الصحيح.
5. بعد أن يتصلب الجل تماما، انتقل فورا إلى زراعة طبقة الألياف الليفية.

5. ثقافة التراكب الليفي

1. أعد تعليق 3 × 10⁴ من الخلايا الليفية الفموية البشرية (HOMFs) في 1 مل من وسط نمو الخلايا البطانية وأضف تعليق الخلية بلطف على طول جدار كل بئر، مما يسمح للخلايا بالتوزيع على سطح الهلام دون تعطيل قبة الجل مباشرة.
2. استمر الحضانة في وسط نمو خلايا البطانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. تستخدم الخلايا الليفية الفموية البشرية كخلايا داعمة لأنها توفر إشارات باراكرين مشتقة من السترومال تعزز تمديد براعم البطانة، واستقرارها، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية في نظام الزراعة ثلاثي الأبعاد.

6. صيانة الزراعة والمراقبة المجهرية

1. استبدل وسيط الزراعة كل يومين. أثناء تغييرات الوسط، قم بسحب الوسط المستهلك ببطء وأضف وسط زراعة طازج على طول جدار البئر لتجنب إزعاج الهلام.
2. راقب الثقافات يوميا أو كل يومين تحت مجهر مقلوب باستخدام وضع المجال الساطع أو وضع تباين الطور. للتحليل الكمي الطولي، اختر عدة مجالات رؤية في كل بئر في اليوم السابع وصور نفس الحقول المحددة مسبقا في اليومين 9 و11.
3. في ظروف الزراعة المثلى، يلاحظ عادة إنبات بطانة بطانة الرحم بشكل واضح في الأيام 4–6، وتظهر هياكل شبيهة باللومن في الأيام 5–7، وتتشكل شبكات شبيهة بالأوعية الدقيقة المترابطة تدريجيا بعد اليوم السابع.
4. عرف الانتشار الناجح بأنه وجود امتدادات متعددة بطانية تنمو شعاعيا من سطح الخرزة إلى المصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة. يجب عد البرعم فقط عندما يمتد بوضوح إلى ما وراء سطح الخرزة ويبقى متصلا بطبقة الخلية البطانية المرتبطة بالخرزة.
5. عرف تكوين البنية الشبيهة باللومن بأنه ظهور هياكل بطانية مطوية مع مساحة مركزية واضحة مرئية أو شكل يشبه الأنبوب. تعرف الاتصالات بين البراعم بأنها تلامسات مباشرة أو هياكل مستمرة تتكون بين البراعم المتجاورة.
6. يجب اعتبار الزراعة التي تعاني من موت خلوي واسع، أو تجمع شديد للخرزات، أو اضطراب بنية الهلام، أو وفقاعات وفيرة، أو انهيار مصفوفة، أو فقط بروزات خلايا قصيرة وغير منتظمة دون المستوى المثالي وتستبعد من التحليل الكمي.

7. اكتساب الصور والتحليل الكمي

1. اختر عدة حقول رؤية في كل بئر في اليوم السابع واحصل على صور من نفس الحقول المحددة مسبقا في اليومين 9 و11. يجب جمع الصور باستخدام نفس الإعدادات للتكبير، والتعريض، وظروف التصوير في جميع الأوقات الزمنية نفسها.
2. قم بقياس عدد البراعم لكل خرزة حاملة دقيقة والمنطقة الوعائية.
   1. لقياس المنطقة الوعائية، استخدم برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. افتح الصورة المكتسبة وحدد يدويا حدود المنطقة الوعائية محل الاهتمام (ROI) باستخدام أداة الاختيار المضلعة أو اليدوية الحرة. أضف العائد على الاستثمار المحدد إلى مدير العائد على الاستثمار.
   2. للتصور، استخدم إضافة تصور منطقة الاهتمام لعرض العائد على الاستثمار الموضح. تمكين قياس المنطقة في إعدادات القياس وقياس العائد على الاستثمار المختار للحصول على المنطقة الوعائية. طبق نفس إعدادات التحليل على جميع الصور.
   3. لتحليل معدل الأوعية الدموية، استخدم المنطقة الوعائية في اليوم السابع كأساس للجسم، وحساب التغير النسبي في المنطقة الوعائية في اليومين 9 و11.
3. عد عدد البراعم الفردية بشكل مستقل بواسطة ثلاثة مراقبين، واستخدم القيمة المتوسطة للتحليل.

النتائج

تكوين الأوعية الدموية في نموذج HUVEC ثلاثي الأبعاد

في المزارع التي تم تأسيسها بنجاح، توزع خلايا البطانة بشكل موحد على سطح خرزات الحاملة الدقيقة، ولا يلاحظ تجمع واضح للخرزات. أظهرت الملاحظة الديناميكية نمو البطانة التدريجي وتكوين شبكة شبيهة بالأوعية الدقيقة في الأيام 7 و9 و11 (الشكل 1A). أكد التحليل الكمي بشكل أكبر الاستجابة التقدمية الوعائية المنشأة في هذا النموذج. باستخدام اليوم السابع كأساس محدد، تم تعيين معدل الأوعية المنشأة إلى 0٪ في اليوم السابع ووصل إلى 66.94٪ ± 18.49٪ في اليوم التاسع و169.51٪ ± 100.83٪ في اليوم الحادي عشر، مما يشير إلى توسع تدريجي للمنطقة الوعائية أثناء الزراعة (الشكل 1B). أظهر التصوير التمثيلي للمجال الساطع أن براعم البطانة ظهرت شعاعيا من سطح الخرزة إلى المصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة بعد 7 أيام من الزراعة (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك، قدم المجهر الكونفوكلي نظرة عامة على الشكل الكلي والتنظيم المكاني لنظام الزراعة ثلاثي الأبعاد (الشكل 1D). كان متوسط عدد البراعم لكل خرزة حاملة دقيقة 31.3 براعم لكل خرزة، استنادا إلى عد مستقل من ثلاثة مراقبين (الشكل 1E). تشير هذه النتائج إلى أن النموذج يدعم نمو البطانة البطانية، والتمديد، والشكل الشبيه باللومين، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية في بيئة ثلاثية الأبعاد.

النتائج غير المثالية في نموذج HUVEC ثلاثي الأبعاد

في الزراعة الفاشلة أو غير المثالية، قد تلاحظ عدة شذوذات مميزة، بما في ذلك موت الخلايا (الشكل 2A)، تمزق خرزات الحامل الدقيق (الشكل 2B)، تجمع الخلايا غير الطبيعي على سطح الخرزة (الشكل 2C)، تكوين فقاعات واسع النطاق داخل الجل (الشكل 2D)، انهيار محلي للمصفوفة (الشكل 2E)، كثافة خرز مرتفعة جدا (الشكل 2F)، طلاء الخلايا غير المتساوي على خرزات الحامل الدقيقة (الشكل 2G))، وتجمع الخرز (الشكل 2H)، وإما عدم وجود نمو واضح أو تكوين البراعم محدود فقط (الشكل 2I,J). تشير هذه الشذوذات إلى أن نجاح إنشاء النموذج قد يتأثر بعدم كفاية بقاء الخلايا، أو تغطية الخلايا غير الكافية، أو التحكم غير السليم في درجة حرارة مصفوفة الغشاء القاعدي، أو إعادة التعليق المفرطة، أو اضطراب الجل أثناء استبدال الوسط.

الشكل 1: تكوين الأوعية الدموية في نموذج HUVEC ثلاثي الأبعاد. (أ) التقييم الديناميكي لتكون الأوعية الدموية في نموذج HUVEC ثلاثي الأبعاد في الأيام 7 و9 و11. تم التقاط الصور باستخدام تكبير 20×. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) تحليل كمي لمعدل التنشيط الوعائي. تم تعريف معدل التنشيط بأنه التغير النسبي في المنطقة الوعائية مع مرور الوقت في الأيام 7 و9 و11، باستخدام اليوم السابع كأساس لليوم. تم حسابها كالتالي: معدل الأوعية الدموية = [(المنطقة الوعائية في النقطة الزمنية المحددة − المنطقة الوعائية في اليوم السابع) / المنطقة الوعائية في اليوم السابع] × 100٪. تعرض بيانات معدل التنشيط الوعائي كمتوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة. (ج) صورة تمثيلية لنمو البطانة في ال HUVEC بعد 7 أيام من الزراعة. تم التقاط الصورة باستخدام تكبير 20×. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (D) صورة عامة كونفوكية تظهر الشكل العام لنظام الزراعة ثلاثي الأبعاد. تم التقاط الصورة باستخدام مسح ضوئي بمعدل 4×. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (E) تحليل كمي لعدد البراعم في HUVECs. تم عد عدد البراعم بشكل مستقل من قبل ثلاثة مراقبين، واستخدم متوسط القيمة للتحليل. لم تجر أي مقارنة إحصائية لهذه التحليلات الكمية الوصفية. البنى التي تظهر في هذا الشكل مشتقة من خرز الحامل الدقيق المغطى ب HUVEC؛ تم استخدام خلايا HOMF كخلايا داعمة للتراكب ولم يتم تصنيفها بشكل خاص في الصور. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: النتائج غير المثالية في نموذج HUVEC ثلاثي الأبعاد. (أ) موت الخلية. كما هو موضح بالسهم الأبيض، تظهر الخلايا كحطام مثقب، ويصبح سطح خرزة الحامل الدقيقة أملسة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) تمزق خرزة الحامل الدقيقة، كما هو موضح بالسهم الأبيض. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C) تجمع الخلايا على سطح خرزة الحامل الدقيقة. كما يشير السهم الأبيض، تظهر الخلايا مظهرا متجمعا يشبه الخرزة. شريط القياس = 50 ميكرومتر. (D) تكون فقاعات واسع داخل الهلام، كما يشير السهم الأبيض. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (E) الانهيار المحلي للمصفوفة، كما هو موضح بالسهم الأبيض. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (F) كثافة خرزات الحاملة الدقيقة العالية جدا. شريط القياس = 10 ميكرومتر. (G) طبقة خلايا غير متساوية على خرزة الحامل الدقيقة. كما هو موضح بالسهم الأبيض، يبقى أحد جانبي سطح الخرز أملسة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (H) تجمع الخرز. شريط القشرة = 50 ميكرومتر. (I,J) لا توجد انبعاث واضحة أو فقط تكوين براعم محدود. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: رسم تخطيطي لسير العمل التجريبي. (أ) تحضير HUVECs، وHOMFs، وخرز الحاملة الدقيقة التي تحمل كولاجين خنازير من النوع الأول المقترن كيميائيا بحمض تحت ظروف مناسبة قبل إعداد الاختبار. (ب) خلط HUVECs مع حبيبات الحاملة الدقيقة المحضرة لتعزيز ارتباط الخلايا البطانية بسطح الخرزة. (ج) حضانة بطبقة خرز مع انعكاس لطيف كل 20 دقيقة لمدة 12 ساعة لتعزيز التصاق الموحد لخلايا البطانة. (د) نقل الخرزات المطلية إلى قارورة زراعة لمزيد من الحضانة للسماح بالارتباط القوي لخلايا البطانة بسطح خرزة الحاملة الدقيقة. (ه) تضمين خرز الحامل الدقيق المغطى ب HUVEC في مصفوفة الغشاء القاعدي، تليها زرع حبات HOMF فوق الجل لتوفير دعم باراكرين مشتق من السترومال لنمو البطانة وإعادة تشكيل الأوعية الدموية. (و) الملاحظة المجهرية والتحليل الكمي لنمو البطانة، وتكوين البنية الشبيهة باللومن، والروابط بين البراعم، وعدد البراعم، والمنطقة الوعائية في الأيام 7 و9 و11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يصف البروتوكول الحالي نموذجا معدلا لنمو بطانة البطانة ثلاثي الأبعاد يعتمد على خرز الحاملة الدقيقة. يوفر الشكل 3 نظرة عامة تخطيطية على سير العمل التجريبي. تم تكييف البروتوكول من اختبار تكوين الأوعية الدموية الكلاسيكي الذي أبلغ عنه ناكاتسو وهيوز وتم تحسينه لتحقيق أهداف الدراسة الحالية ^8,9. في النظام الكلاسيكي، تغلف خلايا البطانة على خرز ميكرو حامل مغطاة بالكولاجين، وتدمج في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، وتزرع معا مع الأرومات الليفية لدعم الإنبات، والتمديد، وتكوين التجويف، والتشريح الشبيه بالأوعية الدموية ^7,10. في هذا البروتوكول، تم استخدام مصفوفة غشاء قاعدي بدلا من جل الفيبرين، واستخدمت الخلايا الليفية الفموية البشرية كخلايا داعمة، مما أسس نظام زراعة ثلاثي الأبعاد مناسب لمراقبة سلوك الأوعية الوعائية البطانية في المختبر. البنى التي تظهر في الصور الممثلة مشتقة من خرز الحاملة الدقيقة المغطاة ب HUVEC، بينما تزرع الخلايا الليفية الفموية البشرية كخلايا داعمة تراكب وليست موسومة بشكل خاص في هذه الصور.

ميزة مهمة لهذا البروتوكول هي استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي بدلا من نظام هلام الفيبرين الكلاسيكي. تجريبيا، تبسط مصفوفة الغشاء القاعدي إعداد الاختبار لأنها جاهزة للاستخدام، وتخضع لتجلية سريعة تعتمد على درجة الحرارة، وتسمح بتثبيت خرز الحامل الدقيق المغطى بالخلايا البطانية بسهولة دون الحاجة إلى تحضير منفصل للفيبرينوجين أو الثرومبين أو الأبروتينين. تجعل هذه الميزة البروتوكول بسيطا نسبيا ومناسبا للمراقبة المجهرية الروتينية. ومع ذلك، يغير هذا التعديل أيضا البيئة الدقيقة البيولوجية للاختبار. على عكس هلام الفيبرين، تحتوي مصفوفة الغشاء الأساسي على مكونات مصفوفة خارج خلايا مرتبطة بالغشاء القاعدي وإشارات حيوية نشطة قد تؤثر على التصاق البطانة، والهجرة، وتمدد البراعم، والشكل الشبيه باللومن، وإعادة تشكيل الشبكة. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤثر الاختلافات في صلابة المصفوفة، وقابليتها للتحلل، وتركيب الروابط على حركية البراعم وشكل الشبكة. لذلك، يجب تفسير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الاختبار المعدل كنتائج لنموذج نبات خرزات الحامل الدقيقة المعتمد على مصفوفة الغشاء القاعدي بدلا من كونها مكافئا مباشرا للاختبار الأصلي القائم على الفيبرين.

يعتمد تأسيس هذا النموذج بنجاح على عدة خطوات حاسمة. يعد طلاء الخلايا البطانية الموحدة على سطح خرزة الحامل الدقيقة ضروريا لبدء وتمدد البراعم بشكل منتظم. قد يؤدي الطلاء غير الكافي أو غير المتساو إلى انخفاض عدد البراعم، وضعف النمو الاتجاهي، وانخفاض قابلية التكرار. تشكل الجل المستقر هو عامل رئيسي آخر لأداء الاختبار. أثناء تحضير وتثبيت المصفوفة، قد يؤدي التحكم غير السليم في درجة الحرارة إلى التجلي المبكر، أو توزيع غير متساو للخرز، أو تكوين فقاعات، وكلها قد تتداخل مع نمو البطانة. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب الأرومات الليفية الداعمة توفير إشارات باراكرين مستمرة تعزز نمو البراعم واستقرارها. لذلك، فإن التحكم الدقيق في هذه الخطوات ضروري للحصول على نتائج مستقرة وقابلة للتكرار.

قد تحسن عدة مقاييس من اتساق الاختبار. يمكن استخدام النتائج التمثيلية غير المثلى المعروضة في الشكل 2 كمؤشرات عملية لحل المشكلة. قد ينتج موت الخلايا بشكل واسع النطاق عن ضعف قدرة الخلايا، أو فرط هضم أثناء انفصال الخلية، أو رقم ممر غير مناسب، أو تأخر استبدال الوسط؛ لذلك، ينصح باستخدام خلايا بطانية صحية في المرحلة اللوغاريتمية والهضم الإنزيمي اللطيف. قد يكون تمزق خرزات الحاملة الدقيقة أو تجمع الخرزات ناتجا عن الحفر القوي، أو التحريك الميكانيكي المفرط، أو إعادة تعليق الخرزات بشكل غير كاف، ويمكن تقليله من خلال الخلط اللطيف والتعامل الحذر أثناء تحضير وطلاء الخرز. عادة ما تشير طبقة الخلايا البطانية غير المتساوية أو تجمعات الخلايا الكبيرة على سطح الخرزة إلى خلط غير كاف، أو كثافة زائدة للخلايا، أو عدم كفاية تلامس الخلايا مع الخلايا خلال فترة الطلاء؛ في هذه الحالة، يجب عكس تعليق خرزة الخلية بلطف على فترات منتظمة وفحصه قبل التثبيت. تكون الفقاعات وانهيار المصفوفة المحلية غالبا ما يرتبطان بالتعامل غير الصحيح مع المصفوفة، أو التجليف المبكر، أو اضطراب الهلام أثناء إضافة أو استبدال الوسط؛ إبقاء المصفوفة على الثلج قبل الاستخدام، وتجنب فقاعات الهواء أثناء الصرف، والسماح بالتجليل الكامل، وإضافة وسط ببطء على طول جدار البئر يمكن أن يقلل من هذه المشاكل. قد تعكس الثقافات التي لا تظهر انبعاتا واضحا أو مجرد تكوين محدود للبراعم ضعف التصاق الخلايا البطانية، أو ضعف القدرة على العيش الخلوي، أو ضعف الدعم المستخرج من الأرواح الليفية، أو تكوين مصفوفة غير مستقر، ويجب استبعادها من التحليل الكمي.

مقارنة باختبارات تكوين الأنابيب ثنائية الأبعاد التقليدية، يقوم هذا النموذج ثلاثي الأبعاد القائم على خرزات الحامل الدقيقة بإعادة تلخيص السلوك المكاني لخلايا البطانة داخل مصفوفة خارج الخلية بشكل أكثر فعالية ويسمح بتصور نمو البطانة، والتمديد، وتكوين البنية الشبيهة باللومن، وتجميع الشبكة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر بيئة الزراعة ثلاثية الأبعاد ظروفا تشبه أكثر توزيع العناصر الغذائية والإشارات في الجسم الحي ^11,12. مقارنة بأنظمة رقائق الأوعية الدموية الميكروفلويدية الدقيقة، التي غالبا ما تكون متطلبة تقنيا ومكلفة، فإن هذه الطريقة بسيطة نسبيا، قابلة للتكرار، وفعالة من حيث التكلفة، مما يجعلها مناسبة جدا للدراسات الروتينية في المختبرات لتكوين الأوعية.

أحد القيود المهمة لهذا البروتوكول هو استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي كبديل لنظام هلام الفيبرين الكلاسيكي. لهذا السبب، يجب اعتبار الاختبار الحالي نسخة معدلة من نموذج إنبات خرزات الحامل الدقيقة البطانية السابقة وليس تكرارا مباشرا للطريقة الأصلية القائمة على الفيبرين. نظرا لاختلاف المصفوفات المختلفة في التركيب والخصائص الميكانيكية وسلوك التحلل، فقد تؤثر على حركية النبت، واستقرار التجويف، وشكل شبكة الأوعية الدموية 13,14,15. لذلك، يجب الحذر عند مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النموذج مع تلك التي تم إنشاؤها باستخدام أنظمة تقليدية قائمة على الفيبرين.

لهذا النموذج تطبيقات محتملة تتجاوز ملاحظة إنبات البطانة القاعدية. يمكن أيضا تكييفها لدراسات التدخل الدوائي، وتجارب الإفراط في التعبير الجيني أو التقليل من الجينات، وتحليل مسارات الإشارات، والتحقيقات في الأنماط البطانية المرتبطة بالأمراض^16,17. مع المزيد من التحسين، قد يكون هذا الاختبار ثلاثي الأبعاد للنمو منصة موثوقة في المخبر لدراسة آليات تطور الأوعية الدموية والاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف تكوين الأوعية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Clear, nuclease-free
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Conical-bottom, sterile, bag-packed
24-well cell culture plate	Haier	612003	Flat-bottom, tissue culture-treated, individually wrapped, for adherent cell culture
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Disposable slide for automated cell counter, 50 slides/box
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Used for cell culture at 37 °C with 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Dry powder; collagen-coated dextran microcarrier beads
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Region-of-interest visualization plugin used for displaying outlined vascularized areas
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM basic (1×), containing 4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Endothelial cell culture medium supplemented with additional FBS to a final concentration of 10% before use
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualified, single-use format, Australia origin, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Primary fibroblasts isolated from human oral mucosa; kindly provided by another laboratory
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Primary endothelial cells isolated from human umbilical veins; no catalog number
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-source software; version 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	For bright-field, phase-contrast, and fluorescence imaging
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	For confocal imaging;model not specified
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	High concentration (HC), phenol red-free, LDEV-free, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicillin-streptomycin solution for cell culture, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, vented cap, tissue culture-treated, for adherent cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	0.25% trypsin-EDTA solution, 100 mL