إثراء ثايروتروبس الغدة النخامية للفئران من فئران الغدة الدرقية القصور باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة المعتمدة على CD90

ملخص

يصف هذا البروتوكول إثراء الثايروتروبس من غدد الغدة النخامية البالغة في فئران بالغة تحت قصور الغدة الدرقية باستخدام التفكك الإنزيمي وفرز الخلايا المنشط بالفلورة المعتمدة على CD90، مما يمكن من إجراء تحليلات جزيئية لاحقة وزراعة أولية قصيرة الأمد لمجموعة خلايا غنية بالثروتروب.

الملخص

الثايروتروبس هي خلايا متخصصة في الغدة النخامية الأمامية تفرز هرمون تحفيز الغدة الدرقية (TSH) وتنظم نشاط الغدة الدرقية. يتم تنظيم إفراز TSH إيجابيا بواسطة هرمون إفراز الغدة الدرقية في منطقة تحت المهاد، وينظم سلبيا بواسطة هرمونات الغدة الدرقية المنتشرة. تشكل الثايروتروبس جزءا صغيرا فقط من خلايا الغدة النخامية (~5٪)، مما يعقد الجهود لعزل ودراسة فسيولوجيتها. هنا، نصف نهجا معززا لعزل الثايروتروبس عن الفئران البالغة التي تعاني من قصور الغدة الدرقية. تم تحفيز قصور الغدة الدرقية لتوسيع مجموعة الثايروتروب قبل التفكك الإنزيمي للغدة النخامية الأمامية وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة باستخدام مستضد سطح CD90.2. أدى معالجة الغدد النخامية الأمامية من اثني عشر فأرا إلى إنتاج حوالي 1.5 ×^{10 خلايا} إيجابية CD90.2 غنية بتعبير RNA رسول Tshb . مثلت خلايا CD90.2 الموجبة حوالي 25٪ من خلايا الغدة النخامية الأمامية وأظهرت تعبيرا أعلى بحوالي خمسة أضعاف عن الخلايا سالبة CD90.2، مما يشير إلى تخصيب كبير للثايروتروب. ظلت الخلايا المعزولة قابلة للحياة في الزراعة قصيرة الأمد واحتفظت بالاستجابة لعلاج الثلاثي يودوثيرونين. يتيح هذا البروتوكول إثراء وزراعة ثايروتروب الفئران للتحليل الجزيئي اللاحق، والترجمة، وفوق الجينوم، والفسيولوجيا.

المقدمة

الغدة النخامية هي عضو غدد صماء يقع في قاعدة الدماغ ويمارس السيطرة الهرمية على التوازن الهرموني. يتم تنظيم نشاطه بواسطة إشارات تحت المهاد التي تحفز أو تثبط إنتاج هرمونات الغدة النخامية، والتي بدورها تحكم وظيفة الأعضاء الصماء الطرفية. تحتوي الغدة على مجموعة غير متجانسة وديناميكية من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية/السلفية والخلايا المنتجة للهرمونات^{المتمايزة 1}. استجابة للضغط أو الإصابات الفسيولوجية، يمكن للخلايا الجذعية/السلفية في الغدة النخامية أن تنشط، وتجدد ذاتيا، وتتمازه إلى عدة سلالات تفرز هرمونات^2،3. هيكليا، تنظم الغدة النخامية إلى فصين رئيسيين: الفص الخلفي (PL)، المكون من الغدة النخابية والأطراف العصبية الإفرازية التي تفرز الأوكسيتوسين والفاسوبريسين، والفص الأمامي (AL)، الذي يحتوي على أنواع متخصصة من الخلايا الصماء تفرز هرمون النمو، البرولاكتين، هرمون محفز الغدة الدرقية (TSH)، هرمون الأدرينوكورتيكوتروبيك، وهرمون محفز الجريبات الغدد التناسلية (FSH) وهرمون اللوتيين (LH). تحتوي الغدة النخامية الأمامية أيضا على أنواع خلايا غير هرمونية، مثل خلايا الجريبات النخامية الموجبة S100B، وخلايا البطانة، والبيريسيت، التي تدعم وظيفة الغدد الصماء^4،5،6. تحتوي القوارض أيضا على ميلانوتروفيات داخل الفص الوسيط للغدة النخامية ^7,8.

الاهتمام بوظيفة الغدة النخامية والتمايز والتطور دفع إلى تطوير عدة بروتوكولات تهدف إلى عزل الخلايا الجذعية والخلايا السلفية للغدة النخامية البالغة في نماذج القوارض. تستخدم الفئران بشكل متكرر في أبحاث فسيولوجيا الغدة النخامية لأن غددها النخامية الأكبر تنتج أعدادا أكبر من الخلايا وتحسن التعافي ^{أثناء معالجة} الأنسجة^. على النقيض من ذلك، لا يزال عزل خلايا الغدة النخامية عن الفئران تحديا تقنيا، والبروتوكولات الموحدة محدودة. توفر البروتوكولات الحديثة التي تستخدم تجمعات الخلايا الجذعية/السلفية للغدة النخامية البالغة أدوات مفيدة لنمذجة تطور ووظيفة الغدة النخامية¹⁰؛ ومع ذلك، لا تسمح هذه الأنظمة بعد بالعزل المباشر لمجموعات خلايا صماء محددة. من بين أنواع الخلايا المنتجة للهرمونات في الغدة النخامية الأمامية، تعد الثايروتروبس المنظمين الرئيسيين لمحور تحت المهاد–الغدة النخامية–الغدة الدرقية (HPT)، حيث تتحكم في تخليق وإفراز هرمون الغدة الدرقية (TH) في الثدييات. TSH الناتج عن الثايروتروبس هو بروتين جليكوبروتين غير متجانس يتكون من وحدة فرعية α مشتركة (مشفرة بواسطة CGA ومشتركة مع FSH وLH) ووحدة فرعية β (مشفرة بواسطة Tshb)، والتي تمنح خصوصية المستقبلات. هذه الخلايا حساسة للغاية لمستويات الثلاثي يودوثيرونين (T3) والثيروكسين (T4) المنتشرة. تتوسع مجموعة الثايروتروب عندما تكون مستويات T3 و T4 منخفضة أثناء قصور الغدة الدرقية وتنكمش أثناء فرط نشاط الغدة الدرقية من خلال آلية التغذية الراجعة السلبية الكلاسيكية ^11,12,13.

على الرغم من دورها الفسيولوجي الأساسي، تظل الثيروتروبس صعبة الدراسة لأنها تشكل جزءا صغيرا فقط من خلايا الغدة النخامية الأمامية (حوالي 5٪) وتشارك الخصائص الظاهرية مع تجمعات الغدد الصماء الأخرى. هذا الندرة، إلى جانب غياب نماذج متينة في المختبر، أدى إلى حد من التحقيقات الميكانيكية لتنظيم الثايروتروب والتحكم في محاور HPT. يمثل خط خلايا الورم TαT1 ^{نموذجا شائعا} الاستخدام الشائع مثل الثيروتروب 14، لكنه لا يعكس الاستجابات الفسيولوجية بالكامل؛ على وجه الخصوص، غالبا ما يكون من الصعب تقييم كبت Tshb المعتمد على T3 بسبب انخفاض مستوى النسخ الأساسي¹⁵. وبالتالي، اعتمدت العديد من الدراسات على خطوط خلايا غير ثايروتروب مثل HEK293، COS، CV1، GH3، أو JEG3 التي تعبر عن تراكيب Tshb مختلفة¹⁵. ومع ذلك، فإن هذه أنظمة غير متجانسة يمكن أن تسبب تشوهات تنظيمية غير فسيولوجية، بما في ذلك التأثيرات التي تحركها العمود الفقري البلازميدي بدلا من آليات النسخ الداخلية.

هنا، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل الثايروتروب عن غدة الغدة النخامية في الفأر البالغ، مقتبسا من طريقة سابقة في فئران⁹، وتم تحسينه لتناسب الحجم الأصغر ومحتوى الغدة النخامية الأقل في الغدة النخامية في الفأر. تم إدخال عدة تعديلات رئيسية لتعزيز إنتاجية الخلايا التي تعبر عن Tshb وضمان التحليل الموثوق في مرحلة ما بعد التيار. يستفيد البروتوكول من تعبير المستضد السطحي CD90، وهو علامة سطحية غنية بالثايروتروب. CD90 (المعروف أيضا باسم THY1) هو بروتين غشائي مرتبط بالجليكوزيل فوسفاتيديلينوسيتول^16,17 يتوسط إشارات الجوكستاكرين من خلال تفاعلات غير نموذجية مع رابطة إنتغرين β2 (ITGB2). على الرغم من أن CD90 يرتبط عادة بمجموعات الخلايا المناعية والخلايا العصبية، إلا أن الدراسات السابقة في النسخ النصي حددت وجود تثيب Thy1 في الثايروتروب. تحدث إشارات الاتصال المعتمدة على THY1 في أنواع خلايا متنوعة، بما في ذلك الخلايا المكونة للدم، والخلايا التائية، والأرومات الليفية، والخلايا البطانية، والعصبونات، حيث تنظم الالتصاق، والهجرة، والموت المبرمج، وكبح الأورام، والتليف^{18، 19، 20}.

ومن المهم أن التحليل التفصيلي الأحادي الخلية للغدة النخامية الأمامية للجرذان حدد Thy1 كواحد من أكثر الجينات المرتبطة بالالتصاق تعبيرا في الثيروتروبس⁵، مما يشير إلى أن THY1 هو علامة سطحية غنية بالثيروتروبيت. علاوة على ذلك، تشير مجموعات بيانات تسلسل حمض الريبونوكلييك أحادي الخلية (RNA) للفأر المتاحة للجمهور إلى أن تعبير Thy1/CD90 أغنى بثايروتروبس^22,23. ومع ذلك، فإن تعبيره ليس مقتصرا تماما على هذه السلالة، حيث يمكن اكتشافه في مجموعات فرعية من خلايا سلالة PIT1، بما في ذلك السوماتوتروبات واللاكتوتروبات، بالإضافة إلى مجموعات شبيهة بالسلف. أظهرت الدراسات النسبية لخلية واحدة تداخلا كبيرا في النسخ بين خلايا الغدة النخامية من سلالة PIT1، بما في ذلك تحديد مجموعة مشتركة من السلف المبكر ل PIT1 قادرة على توليد السوماتوتروبيت، واللاكتوتروبيس، والثايروتروبيس²⁴. وبالمثل، لا يحدد Thy1/CD90 حصريا مجموعة الثيروتروب بل يمكن استخدامه لإثراء الثيروتروب للفئران. استنادا إلى هذه النتائج، يوفر استخدام الأجسام المضادة الموجهة ل THY1 في استراتيجيتنا للعزل طريقة فعالة لإثراء الثريروتروب بعد التوسع الناتج عن قصور الغدة الدرقية، ويمكن من إجراء دراسات وظيفية، بما في ذلك تقييم الاستجابات الهرمونية لتسمور 3.

يبدأ البروتوكول بتغذية فئران النوع البري C57BL/6 بنظام غذائي منخفض اليود وتثبيط وظيفة الغدة الدرقية باستخدام الميثيمازول (MMI) وبيركلورات البوتاسيوم (KClO₄) في مياه الشرب²⁵. يسبب هذا العلاج قصور كبير في الغدة الدرقية خلال أسبوع واحد ويوسع عدد الثايروتروب المعبر عن Tshb في الغدة النخامية الأمامية. تخضع الخلايا المنتجة ل TSH تحت ظروف قصور الغدة الدرقية لتكيفات فسيولوجية ومورفولوجية كبيرة، بما في ذلك فرط التنصج، التضخم، وفرة السيتوبلازم المفجوج، والعمليات السيتوبلازمية البارزة، والليسوسومات المتضخمة، مما يعكس التكيف مع غياب تغذية راجعة TH 26,27,28. لذا، يمكن استخدام تحفيز قصور الغدة الدرقية كاستراتيجية لتوسيع مجموعة الثروتروب.

بعد تحفيز قصور الغدة الدرقية، تخدر الفئران بالإيزوفلوران وتتعرض لتروية القلب باستخدام محلول ملحي مخزن ب HEPES خالي من Ca²⁺/^{Mg 2+} لتعظيم بقاء الخلايا أثناء تفكك الأنسجة. بعد الحصاد، تخضع الغدة النخامية الأمامية لهضم إنزيمي لطيف لتوليد تعليق خلوي واحد يحتضن بأجسام مضادة مضادة لCD90.2 متصنبة ب فيكوإيريثرين-سيانين 7 متقارن لإثراء الثيروتروبس عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). يتم جمع الخلايا الموسومة بعد ذلك إما في وسط نمو لزراعة قصيرة الأمد أو في ترايزول لاستخراج الحمض النووي الريبي. للتحقق من استراتيجية الإثراء، تم قياس تعبير الحمض النووي الريبي الرسول Tshb في مجموعات مرتبة ووجد أنه غني بدرجة عالية في الخلايا الإيجابية ل CD90. تدعم هذه الطريقة مجموعة واسعة من التطبيقات اللاحقة في الفئران، بما في ذلك تحليل التعبير الجيني، والتحليلات الترانسكريبتومية وفوق الجينية، والاختبارات عالية الإنتاجية، والزراعة الخلوية الأولية، وتوفر منصة قيمة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تقوم عليها وظيفة الثيريروتروب وتنظيم محور HPT.

البروتوكول

يصف هذا البروتوكول عزل الثايروتروبس من AL في غدد الغدة النخامية التي تم تقسيمها حديثا من فئران بالغة بعد أسبوع على الأقل من تحفيز قصور الغدة الدرقية. تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية والمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في فرع جامعة تكساس الطبي على جميع إجراءات الحيوانات.

تم تجميع الفئران الذكور والإناث خلال التجارب لأنه لم تلاحظ فروق تعتمد على الجنس في إنتاج الثيروتروب أو التحليلات اللاحقة. تم استخدام حوالي 12 فأرا في كل تجربة، رغم أنه يمكن معالجة مجموعات أكبر تصل إلى 20 حيوانا عن طريق تكبير جميع أحجام المواد بشكل نسبي.

يعتمد العزل الناجح على التروية السريعة والمتسقة، وتقليل وقت التشريح، والإزالة الكاملة لل PL، وتغطية عالية الكثافة للخلايا الأولية. أقصى وقت معالجة موصى به بين القتل الرحيم، والتروية، وتشريح الغدة النخامية، وبدء الهضم الإنزيمي كان 6 ساعات. تم طلاء الخلايا بكثافة تتراوح بين 2.0–2.5 × 10⁵ خلايا لكل بئر بعمق 0.7 سم^مربع (مساحة سطح بئر واحد في شريحة زجاجية ذات 8 آبار). كان مطلوبا لا يقل عن صلاحية 95٪ لدعم زراعة الثايروتروب قصيرة الأمد.

تم تجهيز جميع الكواشف المستخدمة لتوليد التعليق أحادي الخلية تحت ظروف معقمة. تم تعقيم أسطح العمل بنسبة 70٪ إيثانول، وتم تعقيم أجهزة التشريح قبل الاستخدام، وتم تنفيذ جميع خطوات تحضير زراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنية المعقمة. تم توحيد هذا البروتوكول ل 12 حيوانا. قم بقياس جميع أحجام المواد الكيميائية بشكل متناسب عند استخدام عدد مختلف من الفئران. راجع جدول المواد لجميع المواد الكيميائية والمواد الاستهلاكية والمعدات.

خلال تحفيز قصور الغدة الدرقية، تم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض عند 20°C–24°C و40٪–60٪ رطوبة نسبية مع دورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة وإمكانية الوصول إلى الطعام والماء. تم إيواء الحيوانات في مجموعات (حتى ثلاثة فئران في كل قفص) في أقفاص مهواة بشكل فردي تحتوي على فراش قياسي وإثراء بيئي، بما في ذلك مواد التعشيش والمأوى. تم تأكيد نجاح تحفيز قصور الغدة الدرقية من خلال قياس تعبير دييوديناز يودوثيرونين الكبدي (Dio1). اعتبر انخفاض لا يقل عن 50٪ في تعبير الحمض النووي الريبي الرسول (mRNA) لديO1 مقارنة بفئران التحكم في الغدة الدرقية مؤشرا على نجاح تحفيز قصور الغدة الدرقية.

1. تحفيز قصور الغدة الدرقية في فئران C57BL/6

ملاحظة: قم بإجراء هذا الإجراء لمدة 7–10 أيام لتحفيز قصور الغدة الدرقية في الجسم الحي من خلال نظام غذائي يفتقر إلى اليود وتثبيط وظيفة الغدة الدرقية كيميائيا. انظر الشكل 1A لتصميم التجارب والشكل 1B للتحقق من صحة تحفيز قصور الغدة الدرقية.

الشكل 1. تحفيز قصور الغدة الدرقية في فئران C57BL/6. (أ) تمثيل تخطيطي لسير العمل التجريبي المستخدم لتحفيز قصور الغدة الدرقية في الفئران البالغة C57BL/6. تلقت الفئران 0.05٪ ميثيمازول (MMI) و0.1٪ بيركلورات البوتاسيوم (KClO₄) في مياه الشرب مع نظام غذائي يفتقر إلى اليود لمدة 7 أيام قبل عزل الغدة النخامية الأمامية. (ب) تحليل تفاعل بوليميراز متسلسل كمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR) لتعبير حمض الريبونوكليك الرسولي (mRNA) في فئران الغدة الدرقية العظيمة وقصور الغدة الدرقية. تم استخدام السيكلوفيلين A (CyA) كجين مرجعي. تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD) (n = 6 لكل مجموعة). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t الخاص بطالب. **P < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. جهز مياه الشرب MMI/KClO₄
   1. قم بإذابة 1 جرام MMI و2 جرام KClO₄ في 2 لتر من الماء المصفى.
   2. حرك المحلول في درجة حرارة الغرفة (20°C–25°C) لمدة ساعة حتى يذوب تماما.
      تحذير: MMI وKClO₄ هما مواد كيميائية خطيرة. ارتد قفازات، ومعطف مختبر، وحماية للعيون أثناء التحضير والتعامل.
      ملاحظة: يثبط MMI تنظيم اليوديد، بينما KClO₄ يمنع امتصاص اليوديد عبر ناقل الصوديوم-يوديد²⁵. استبدل محلول الشرب كل يومين للحفاظ على الجرعة الصحيحة وتقليل التلوث الناتج عن الفراش وحطام الطعام ونمو الميكروبات. إذا لم تستخدم فورا، خزن المحلول في حاوية مقاومة للضوء محكمة الإغلاق عند درجة حرارة 4°C لمدة تصل إلى 14 يوما.
2. تحفيز قصور الغدة الدرقية
   1. احتضن فئران ذكور أو إناث C57BL/6 بعمر 8 أسابيع في مجموعات من ثلاثة حيوانات تصل إلى ثلاثة حيوانات في كل قفص تحت ظروف سكن خالية من اليود.
      ملاحظة: فئران المنزل تحت ظروف خالية من الممرضات بدرجة حرارة تتراوح بين 20°C–24°C ورطوبة نسبية بين 40٪–60٪ مع دورة إضاءة 12 ساعة و12 ساعة مظلمة وإمكانية الوصول إلى الطعام والماء. الحفاظ على الحيوانات في أقفاص مهواة بشكل فردي تحتوي على فراش قياسي وإثراء بيئي، بما في ذلك مواد التعشيش والمأوى. اعتاد على الحيوانات لمدة 3 أيام قبل بدء العلاج. يبيت الذكر والإناث بشكل منفصل. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا، تكونت مجموعة الغدة الدرقية من ستة ذكور وست إناث محتجزين في أقفاص منفصلة، بينما تكونت مجموعة قصور الغدة الدرقية من ستة ذكور وست إناث في أقفاص منفصلة. تجمع ALs من الفئران الذكور والإناث ضمن نفس مجموعة العلاج أثناء تحضير الخلية لأنه لم تلاحظ فروق تعتمد على الجنس في إنتاج الثيروتروب أو التحليلات اللاحقة.
   2. أطعم الفئران نظاما غذائيا ناقصا باليود بحكم الرضا لمدة 7–10 أيام.
      ملاحظة: ابدأ النظام الغذائي الناقص لليود وعلاج MMI/KClO₄ في نفس الوقت.
   3. توفير مياه شرب تحتوي على 0.05٪ MMI و0.1٪ KClO₄ بحرية طوال فترة المعالجة.
      ملاحظة: استمر في العلاج حتى القتل الرحيم. راقب وزن الجسم، وكمية الطعام، وكمية الماء، والعلامات الطبية يوميا خلال فترة تحفيز قصور الغدة الدرقية. عادة ما يرتبط التحفيز الناجح لقصور الغدة الدرقية بانخفاض زيادة الوزن وعلامات سريرية مثل انخفاض النشاط أو تشوه الفراء مقارنة بحالات التحكم في الغدة الدرقية. تنتج فترات الحث التي تستمر سبعة أيام وعشرة أيام كفاءة مماثلة في إثراء الثيروتروب بنفس القدر.

2. تروية القلب وتشريح AL

ملاحظة: قم بإجراء هذا الإجراء في حوالي 15 دقيقة لكل فأر لتعظيم بقاء الأنسجة والحفاظ على سلامة الخلايا أثناء عزل الغدة النخامية.

1. تحضير محلول التروية والتجميع
   1. حضر محلول ملحي مخزن ب HEPES (HBSS) بدون Ca²⁺ و Mg²⁺
      1. اجمع بين 667 مل من 0.9٪ NaCl، و20 مل من 1 M HEPES، و313 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لتحضير 1 لتر من HBSS المحضر خصيصا بدون Ca²⁺ وMg²⁺.
      2. قم بتعقيم المحلول وخزنها عند 4°C حتى الاستخدام.
   2. حضر HBSS الهيبارين بدون Ca²⁺ و Mg²⁺
      1. أضف 27 ميكرولتر من صوديوم إينوكسبارين (محلول مخزوني 100 ملغ/مل) إلى 50 مل من محلول HBSS المحضر خصيصا بدون Ca²⁺ و^{Mg 2+}.
   3. تحضير وسيط الجمع (CM)
      1. اجمع بين متوسط Eagle المعدل من Dulbecco بسعة 440 مل، و50 مل مصل البقر الجنيني المعطل بالحرارة (FBS)، و4 ملليمول L-جلوتامين، و10 مل من 1 M HEPES إلى حجم نهائي يبلغ 500 مل.
      2. قم بتعقيم المحلول باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر وخزنه عند 4°C لمدة تصل إلى شهر.
         ملاحظة: جهز 50 مل أليكوت تحت خزانة السلامة البيولوجية قبل التخزين لتقليل التلوث.
      3. سخن ال CM إلى 20°C–25°C قبل الاستخدام.
   4. تعقيم أدوات التشريح
      1. قم بتعقيم المقص، الملقط، الملقط، حاملات الإبر، ملقط القزحية، ملاعق الجراحة، ومجسات العزل باستخدام 75٪ إيثانول قبل الاستخدام.
         ملاحظة: اترك الأجهزة تجف تماما في الهواء بعد تعقيم الإيثانول قبل ملامسة الأنسجة.
2. قم بتروية القلب
   1. تخدير الفأر بعمق باستخدام الإيزوفلوران الذي يوصل بنسبة 100٪ أكسجين. تحفز التخدير في غرفة تحتوي على 5٪ إيزوفلوران والحفاظ على التخدير عبر مخروط أنف بنسبة 3٪ إيزوفلوران مع مراقبة مستمرة وإزالة غازات النفايات.
      تحذير: قم بإجراء إجراءات تخدير الأيزوفلوران وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية واستخدام أنظمة التنظيف المناسبة لتقليل التعرض للاستنشاق.
   2. أكد التخدير الكامل بالتحقق من غياب رد فعل سحب الدواسة باستخدام قرص إصبع القدم.
   3. رش الحيوان بنسبة 75٪ إيثانول وضعه على مرحلة التروية داخل صينية التجميع.
   4. ثبت الأطراف لكشف منطقة الصفاق.
   5. افتح التجويف الصدري بعناية مع تجنب تلف الأعضاء الرئيسية والأوعية الدموية.
   6. اقطع على طول الأضلاع لتشكيل غطاء صدري، ثم اطو الغطاء فوق الرأس، وتثبيته بجهاز تدفئة الدم.
   7. ثبت القلب باستخدام مشبك وأدخل إبرة عيار 23 في قمة البطين الأيسر.
   8. وصل الإبرة بمضخة بريستالتيكية باستخدام أنابيب سيليكون.
   9. ابدأ التروية باستخدام HBSS الهيباريني بدون Ca²⁺ و^{Mg 2+} محفوظين في درجة حرارة الغرفة.
   10. قم بشق الأذين الأيمن مباشرة بعد بدء التروية للسماح بالتصريف.
   11. قم بإنفاق الحيوان لمدة 5 دقائق بمعدل تدفق 3 مل/دقيقة.
       ملاحظة: تأكد من نجاح التروية من خلال ملاحظة شحوب الكبد المرئي.
3. عزل AL
   1. اقطع رأس الفأر فورا بعد التروية.
   2. إزالة فروة الرأس وعظام الجمجمة باستخدام مقص دقيق وملقط لكشف الدماغ.
   3. أدخل ملعقة جراحية بين الدماغ والجمجمة.
   4. ارفع الدماغ بلطف واقطع التصالب البصري.
   5. قم بإزالة الغشاء السحاوي الرقيق (الجافة الأم) الذي يغطي الغدة النخامية تحت المجهر المجسم باستخدام ملقط دقيق.
   6. قم بتحليل وتخلص من PL بعناية كما هو موضح في الشكل 2A.
      ملاحظة: حدد النسيج الوردي الأكبر الموجود في الخلفية. حدد النسيج الشفاف الأبيض الأصغر الموجود في الظهر.
   7. قم بقص الأنسجة الضامة المحيطة والأغشية السحائية المتبقية باستخدام مسبار غير حاد لتحسين الوصول إلى AL.
   8. أمسك الحمض الصناعي بملقط غير حاد وانقله إلى أنبوب بولي بروبيلين بسعة 15 مل يحتوي على 1.8 مل سنتر سم.
      ملاحظة: جمع ALs من 12 حيوانا في نفس أنبوب الجمع.
   9. احتفظ بالعينة في درجة حرارة الغرفة حتى تكتمل جميع عمليات التشريح.
      ملاحظة: لا تتجاوز 3 ساعات بين جمع الأنسجة وبدء الهضم الإنزيمي لتقليل فقدان القدرة على العيش في الخلايا.
4. تأكيد تحفيز قصور الغدة الدرقية
   1. اجمع عينة صغيرة من الكبد (حوالي 50 ملغ) من كل فأر.
   2. قم بقياس تعبير mRNA في كبد Dio1 بواسطة تفاعل بوليميراز متسلسل في الوقت الحقيقي بالنسخ العكسي وقارنه مع عناصر التحكم غير المعالجة في الغدة الدرقية (الشكل 1B).
      ملاحظة: عرف التحفيز الناجح لقصور الغدة الدرقية بأنه تقليل لا يقل عن 50٪ في تعبير DiO1 الكبدي مقارنة بعناصر التحكم في علاج الغدة الدرقية السرية. يرتبط تعبير Dio1 إيجابيا بمستويات TH المتداولة²⁹؛ لذلك، يؤكد انخفاض تعبير Dio1 نجاح تحفيز قصور الغدة الدرقية.
5. إعادة جمع الأنسجة
   1. كرر الخطوات 2.2–2.4. حتى يتم جمع ALs من 12 فأرا.
   2. تابع فورا إلى الخطوة 3.

الشكل 2. تحضير تعليق خلية واحدة من الغدة النخامية الأمامية للفأر. (أ) سير العمل الذي يوضح تشريح الفص الأمامي (AL)، والتفكك الإنزيمي، وتحضير تعليق خلية واحدة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). يشمل سير العمل إزالة الفص الخلفي، هضم الكولاجيناز، هضم حمض التربسين–إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)، والترشيح قبل تحليل FACS. (ب) صور تمثيلية لتلوين صبغات الصلاحية والعد الآلي للخلايا النخامية الأمامية المفكككة من فئران الغدة الدرقية السرية وقصور الغدة الدرقية. يتم الإشارة إلى إجمالي العائد الخلوي وتركيز الخلايا الصالحة للحياة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (C) توزيع أقطار خلايا الغدة النخامية الأمامية بعد تفكك الأنسجة والتحضير لتحليل FACS في المراحل النهائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. 

3. تحضير تعليق خلية واحدة من AL الفأر

ملاحظة: قم بإجراء هذا الإجراء في حوالي 60 دقيقة لتوليد تعليق خلية واحدة من نسيج الغدة النخامية الأمامية.

1. تحضير محاليل الهضم الإنزيمية
   1. تحضير محلول كولاجناز بنسبة 2٪
      1. قم بإذابة 100 ملغ من الكولاجناز من كلوستريديوم هيستوليتيكوم (>125 وحدة هضم كولاجناز/ملغ صلب) في 4.9 مل ddH₂O.
      2. أضف 100 ميكرولتر من 1 متر HEPES للحصول على حجم نهائي يبلغ 5 مل.
      3. تعقيم المحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
      4. أليكوت المحلول في حجمات 200 ميكرولتر وتخزينها عند −30°م لمدة تصل إلى شهرين.
         ملاحظة: تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان. لا تعيد استخدام أليكوات الكولاجيناز المذابة.
   2. تحضير حمض التريبسين–إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) بنسبة 0.25٪
      1. اخلط 1 مل من 0.5٪ تريبسين–EDTA مع 1 مل من HBSS بدون Ca²⁺ و Mg²⁺.
      2. خزن المحلول عند 4°C حتى الاستخدام.
         ملاحظة: استخدم محلول التربسين–EDTA المخفف في يوم التحضير. لا تخزن أو تعيد استخدام التريبسين–EDTA المخفف.
2. قم بإجراء هضم الكولاجيناز
   1. أضف 200 ميكرولتر من محلول الكولاجناز بنسبة 2٪ إلى أنسجة AL المجمعة.
   2. اخلط النسيج بلطف عن طريق التوصيل باستخدام ماكينة صغيرة من نوع P1000 مزودة بأطراف منخفضة الاحتفاظ.
   3. حضن التعليق في حمام ماء بزاوية 37°C لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: حافظ على غطاء الأنبوب مغلقا أثناء الحضانة لتقليل التلوث.
   4. انقر على الأنبوب بلطف كل 5 دقائق أثناء الحضانة.
3. قم بهضم ديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I)
   1. أضف 5 ميكرولتر DNase I (1 U/μL) مباشرة إلى التعليق دون إزالة السوبرناتان.
   2. انقر على الأنبوب بلطف 10 مرات لخلط المحلول.
   3. احتضن التعليق عند 37°C لمدة 5 دقائق.
4. الحبيبات في الأنسجة
   1. قم بجهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. أزل السوبرناتانت بحذر باستخدام ماصة بحجم 1 مل.
      ملاحظة: اترك حوالي 50 ميكرولتر من السائل المتبقي فوق الحبيبة أثناء إزالة المادة الفائقة لتقليل فقدان الخلية.
5. إجراء هضم التربسين
   1. أضف 2 مل من 0.25٪ تريبسين–EDTA إلى الحبيبة.
   2. حضن التعليق عند 37°C لمدة 10–15 دقيقة حتى لا تبقى شظايا نسيجية سليمة ظاهرة.
      ملاحظة: لا تتجاوز 15 دقيقة لتجنب الهضم المفرط للأنسجة وتقليل صلاحية الخلايا.
6. أوقف الهضم الإنزيمي وتفكك الأنسجة عن الواقع
   1. أضف 2 مل سم مكعب لإيقاف التريبسين.
   2. قم بتقليص التعليق بلطف للأعلى والأسفل 10–20 مرة باستخدام ميكروبايبت مضبوطة على 1 مل حتى لا تبقى شظايا نسيج مرئية.
      ملاحظة: استخدم رؤوس الماصات منخفضة الاحتجاز أثناء التفكك الميكانيكي. تعليق خلية واحدة مقبول هو تعليق موحد منخفض اللزوجة يحتوي في الغالب على خلايا منفردة مع تجمعات أو حطام مرئي قليل، ≤5٪–10٪ تجمعات بالفحص المجهري باستخدام استبعاد تريبان بلو).
7. اجمع نظام التعليق أحادي الخلية
   1. قم بجهاز الطرد المركزي في نظام التعليق عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. أزل السوبرناتينت بحذر.
   3. تابع فورا إلى الخطوة 4.
      ملاحظة: ابدأ التلوين خلال 15 دقيقة من تحضير التعليق بخلية واحدة، وأكمل فرز الخلايا خلال ساعة واحدة كلما أمكن. حافظ على الخلايا على الجليد خلال هذه الفترة لتقليل فقدان القدرة على البقاء.

4. التلوين لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة

ملاحظة: قم بإجراء هذا الإجراء خلال حوالي 60 دقيقة لصبغ الخلايا النخامية الأمامية المفكككة لعلاج FACS للخلايا الموجبة CD90.

1. جهز تعليق الخلية
   1. أضف 350 ميكرولتر من محلول تلوين يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS، 1×) يحتوي على 2٪ FBS و0.09٪ أزيد الصوديوم إلى حبيبات الخلية.
   2. أعد تعليق الحبيبة بلطف عن طريق التوصيل بأنبوب لأعلى وأسفل 10 مرات باستخدام ميكروبايبت P1000 مزود بأطراف منخفضة الاحتجاز للحصول على تعليق خلية واحدة.
   3. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي منخفض الارتباط بسعة 1.5 مل.
2. تحديد تركيز الخلية وقابليتها للبقاء
   1. قم بإزالة أليكوت 5 ميكرولتر من التعليق لعد الخلايا.
   2. اخلط ال aliquot مع صبغة قابلة للحياة بسعة 5 ميكرولتر.
   3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط في عداد الخلايا الآلي.
      ملاحظة: انتقل إلى نظام FACS عندما تكون صلاحية الخلية ≥85٪ كما يحددها استبعاد صبغة القابلية للبقاء وعندما تلاحظ أقل كمية من الحطام وتراكمات الخلايا.
   4. تأكد أن تركيز الخلايا الكلي هو حوالي 1 × 10⁷ خلايا/مل لعينات الغدة الدرقية السرية و2 ×^{10 7} خلايا/مل لعينات قصور الغدة الدرقية (الشكل 2B). توزيع حجم الخلايا بعد التفكك موضح في الشكل 2C.
3. إعداد ضوابط التعويض
   1. انقل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى مخزن تلوين بسعة 300 ميكرولتر.
   2. قسم نظام التعليق إلى ثلاثة أليكوات بسعة 100 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 1.5 مل منفصلة.
   3. جهز الضوابط التالية: (1) الضابط غير المصبوغ، (2) التحكم باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) فقط، و(3) التحكم في فيكوإيريثرين-سيانين 7 (PE-Cy7) CD90.2 فقط.
4. صبغ الخلايا
   1. أضف 3 ميكرولتر من الأجسام المضادة ل CD90.2 المترافقة PE-Cy7 إلى 300 ميكرولتر من تعليق الخلية.
      ملاحظة: تم تحديد تركيز الأجسام المضادة من خلال تجارب معايرة سابقة. وفر التخفيف النهائي بنسبة 1:100 فصلا مثاليا بين المجموعات الإيجابية والسلبية مع تقليل التلوين الخلفي.
   2. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى جهاز التحكم في تعويض CD90.2 للحصول على تخفيف نهائي قدره 1:100.
   3. حضن جميع العينات على الثلج في الظلام لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: اخلط العينات بلطف كل 10 دقائق أثناء الحضانة للحفاظ على التلوين المتجانس.
5. اغسل الخلايا الملطخة
   1. أضف 1 مل من محلول التلوين البارد لكل أنبوب.
   2. قم بعمل الطرد المركزي للعينات عند 210 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا، قم بتعطيل فرامل الطرد المركزي لتقليل اضطراب حبيبات الخلية أثناء التباطؤ.
   3. أزل السوبرناتينت وتخلص منه بحذر.
6. أعد تعليق الخلايا الملونة
   1. أعد تعليق تعليق الخلية الرئيسية في مخزن تلوين بسعة 300 ميكرولتر.
      ملاحظة: أضف PI فورا قبل الفرز إلى تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل.
   2. أعد تعليق كل وحدة تحكم تعويض في مخزن تلوين بسعة 100 ميكرولتر.
7. فلتر تعليق الخلية
   1. قم بترشيح تعليق الخلية عبر أنبوب قياس خلوي تدفق مزود بمصفاة خلية بقطر 35 ميكرومتر مباشرة قبل الفرز.
8. تابع إلى فرز الخلايا المنشطة بالفلورة
   1. تابع فورا إلى الخطوة 5 وفرز الخلايا الملونة باستخدام جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

5. استراتيجية البوابات والفرز في FACS

ملاحظة: قم بإجراء هذا الإجراء في حوالي 60 دقيقة لعزل الثيروتروبس الإيجابية ل CD90.2 القابلة للحياة بواسطة FACS.

1. تكوين فرز الخلايا
   1. قم بتركيب فوهة بحجم 100 ميكرومتر على جهاز فرز الخلية.
   2. اضبط ضغط الغلاف على 20 رطل لكل بوصة مربعة.
      ملاحظة: استخدم سائل غمد معقم قائم على PBS محفوظا في درجة حرارة الغرفة.
2. إجراء مراقبة جودة الآلات
   1. قم بإجراء إجراءات مراقبة جودة الأجهزة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل الحصول على العينة.
      ملاحظة: قد تستخدم سير عمل مراقبة الجودة المعادلة التي توصي بها الشركة المصنعة على أجهزة فرز الخلايا البديلة.
   2. تحقق من تأخير السقوط وثبات التدفق باستخدام خرز المعايرة.
3. إجراء تعويض التألق
   1. احصل على عناصر تحكم تعويض بلون واحد.
   2. قم بتعويض الفلورة قبل البوابة والفرز.
      ملاحظة: حسب التعويض باستخدام أدوات تحكم غير مصبوغة وذات صبغة واحدة. تحقق من مصفوفات التعويض وعدلها يدويا قبل الفرز عند الحاجة.
4. حدد استراتيجية البوابة
   1. استبعد الحطام باستخدام معاملات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي (الشكل 3A,B).
   2. اربط خلايا مفردة باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي مقابل مساحة التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الجانبي مقابل مساحة التشتت الجانبي (الشكل 3A,B).
   3. استبعد الخلايا الميتة عن طريق إغلاق الخلايا السلبية للPI.
   4. خلايا Gate CD90.2 الإيجابية لإثراء الثروتروب.
      ملاحظة: عرف الخلايا الموجبة ل CD90.2 كأحداث تظهر شدة فلورية تزيد عن 10³ في قناة كشف CD90 (الشكل 3C–F).
5. جهز أنابيب الجمع
   1. جهز أنابيب الجمع وفقا للتطبيق المقصود في المراحل النهائية.
      ملاحظة: املأ أنابيب الجمع منخفضة الاحتفاظ مسبقا إما بمادة تحليل QIAzol بسعة 1 مل لعزل الحمض النووي الريبي أو ب Medium 199 مع 10٪ مصل أبقار جنيني مخروط بالفحم لتطبيقات زراعة الخلايا.
6. قم بفرز الثيروتروبس الموجب CD90.2
   1. فرز الخلايا المفردة الموجبة CD90.2 في أنابيب تجميع.
   2. جمع الخلايا لتحليل الحمض النووي الريبي
      1. اجمع الخلايا مباشرة في مادة تحليل بحجم 1 مل.
      2. قم بعمل دوامة في الأنابيب لمدة دقيقة واحدة لتحليل الخلايا.
      3. جمد العينات فورا على الثلج الجاف.
      4. تخزين العينات عند −80°C حتى استخراج RNA.
   3. جمع الخلايا للزراعة الأولية
      1. اجمع الخلايا في وسط زراعة مع 10٪ مصل أبقار جنيني مقشر بالفحم و1٪ بنسلين-ستربتومايسين.
      2. زرع الخلايا في شرائح حجرة زجاجية ذات 8 آبار بكثافة لا تقل عن 2 ×^{10 أو 5} خلايا/بئر في حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر.
      3. زراعة الخلايا لمدة تصل إلى 72 ساعة عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
         ملاحظة: يشار إلى الأداء المقبول للزراعة من خلال التصاق الخلوي المرئي خلال 24 ساعة، وكفاءة التثبيت حوالي 60٪–80٪، وقابلية البقاء ≥70٪–80٪ بعد 72 ساعة.
      4. أضف 100 نانومتر T3 إلى وسط الزراعة عند الحاجة.
         ملاحظة: ابدأ علاج T3 بعد تثبيت الخلية، عادة بعد 24 ساعة من الطبق، وحافظ على المعالجة حتى جمع العينة عند 72 ساعة. جهز محلول T3 في 40 ملليمولار NaOH وتضمين عناصر التحكم المعالجة بالمركبات بنفس تركيز المذيب النهائي.
         ملاحظة: مصل الفحم الخالي من الفحم يحافظ على بيئة زراعة خالية من TH ويحسن الكشف عن الكبت المعتمد على T3 لتعبير Tshb الناتج عن التجريب.

الشكل 3. استراتيجية بوابات FACS والتحقق من إثراء الثايروتروب. (أ، ب) استراتيجية البوابات التسلسلية المستخدمة لعزل الخلايا النخامية الأمامية المفردة القابلة للحياة. تشمل البوابات استبعاد الحطام باستخدام مساحة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A)، والتمييز بين الفرد باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) مقابل FSC-A وارتفاع التشتت الجانبي (SSC-H) مقابل SSC-A، واستبعاد الخلايا الميتة الإيجابية ليوديد البروبيديوم (PI). (C–F) مخططات FACS التمثيلية تظهر تحديد وتثريب مجموعات الخلايا الإيجابية ل CD90.2 وCD90.2 السلبية باستخدام جسم مضاد مضاد لمادة فيكوإيريثرين-سيانين 7 (PE-Cy7) مضاد CD90.2 متقارب. (G–I) التحقق من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR) لتخصيب الثايروتروب في مجموعات الخلايا المفترضة. الاختصارات: FSC-A، منطقة التشتت الأمامية؛ SSC-A، منطقة تشتت جانبية؛ FSC-H، ارتفاع التشتت الأمامي؛ SSC-H، ارتفاع تشتت الجانب؛ PI، يوديد البروبيديوم؛ PE-Cy7، فيكويريثرين–سيانين 7؛ NT، غير معالج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. تحليل التعبير الجيني لmRNA Tshb في الخلايا الإيجابية ل CD90 مقابل خلايا CD90 السلبية من خلال تفاعل بوليميراز متسلسل في الوقت الحقيقي

ملاحظة: قم بإجراء هذه العملية في حوالي 5 ساعات لقياس تعبير mRNA ل Tshb في مجموعات الخلايا الفرزة.

1. جمع الخلايا المفترزة لاستخراج الحمض النووي الريبي
   1. اجمع أعدادا متساوية من الخلايا الموجبة CD90 وخلايا CD90 السلبية (2.5 × 10⁵ خلايا) في أنابيب منفصلة بسعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من مادة التحليل السائلة.
2. تحليل الخلايا
   1. قم بعمل دوامة على العينات بقوة لمدة دقيقة واحدة لتحليل الخلايا بالكامل ووضعها على الثلج.
      ملاحظة: تخزين العينات المفحلة عند −80°C قبل استخراج الحمض النووي الريبي إذا لزم الأمر.
3. استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي
   1. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المرفقة مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: قم بإجراء هضم DNase أثناء التنقية باستخدام DNase I الخالي من RNase وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة بقايا حمض الديوكسي ريبونوكليك الجينومي (DNA) قبل الفرش.
   2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: استخدم عينات بنسبة A260/A280 تقريبا بين 1.8–2.1 ونسبة A260/A230 أكبر من 1.8 لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA).
4. تخليق cDNA
   1. تخليق cDNA من إجمالي RNA بحجم 100 نانوغرام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المرفقة مع مجموعة تخليق cDNA للسلسلة الأولى.
      ملاحظة: استخدم بادئات أوليغو(dT) أثناء تخليق cDNA.
   2. حضر خليط القالب والبرايمر وفقا للجدول 1.
   3. اخلط الكواشف بلطف واستخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينة من أسفل الأنبوب.
   4. قم بتغيير طبيعة خليط القالب والبرايمر عند 65°C لمدة 10 دقائق.
   5. برد العينات فورا على الثلج.
   6. تحضير خليط تفاعل النسخ العكسي وفقا للجدول 2 للحصول على حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: جهز خليط رئيسي عن طريق ضرب أحجام الكواشف المدرجة في الجدول 2 في إجمالي عدد العينات وإضافة 10٪ زيادة إضافية لمراعاة تغير الماصات.
   7. اخلط التفاعل بلطف دون دوامة وقم بعمل الطرد المركزي لفترة وجيزة.
   8. حضن التفاعل عند 50°C لمدة 60 دقيقة.
   9. أوقف التفاعل عند 85°C لمدة 5 دقائق.
   10. قم بتبريد العينات على الثلج.
   11. الانتقال مباشرة إلى تفاعل بوليميراز الكم العكسي (RT-qPCR) أو تخزين cDNA عند −30°C حتى الاستخدام.
       ملاحظة: يمكن تخزين cDNA عند −30°C لمدة تصل إلى 6 أشهر تحت ظروف خالية من النوكليز. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
       ملاحظة: قم بتنفيذ خطوات تخليق الحمض النووي في جهاز دورة حرارية مزود بغطاء مسخن لتقليل التبخر.
5. تحضير خليط تفاعل RT-qPCR
   1. جهز خليط تفاعل RT-qPCR وفقا للجدول 3.
6. تحميل لوحة RT-qPCR
   1. أضف خليط تفاعل RT-qPCR بسعة 9 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة بحجم 96 بئر.
   2. أضف قالب cDNA بحجم 1 ميكرولتر يتوافق مع المنتج المنسوخ العكسي الناتج من 5 نانوغرام من إجمالي RNA المدخل.
   3. اخلط العينات بلطف واستخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
7. أداء RT-qPCR
   1. قم بإجراء RT-qPCR وفقا لتعليمات الشركة المرفقة مع مزيج SYBR Green Master.
      ملاحظة: استخدم خطوة إزالة الطبيعة الأولية بمقدار 95°C لمدة دقيقتين تليها 40 دورة من 95°C لمدة 5 ثوان و60°C لمدة 30 ثانية. احصل على التألق في نهاية كل خطوة تمديد. إجراء تحليل منحنى الصهر من 65°م إلى 95°م بزيادات 0.5°C للتحقق من تضخيم المنتج الواحد.
8. تطبيع تعبير Tshb
   1. تطبيع تعبير Tshb إلى تعبير السيكلوفيلين A (CyA) باستخدام طريقة ΔCt.
      ملاحظة: تحقق من استقرار CyA قبل التحليل بتأكيد التفاوت الأدنى في Ct عبر المجموعات التجريبية.
9. حساب التعبير الجيني النسبي
   1. حساب التعبير النسبي ل Tshb في الخلايا الإيجابية ل CD90 مقارنة بالخلايا سالبة CD90 باستخدام طريقة 2^−ΔΔCt .
      ملاحظة: أجر تحليل RT-qPCR باستخدام ثماني عينات بيولوجية، كل منها تم تحليلها في تفاعلات تقنية مكررة (الشكل 3G–I).

المادة الكيميائية	الحجم	الكمية/التركيز النهائي
إجمالي الحمض النووي الريبي	المتغير	100 نانوغرام
برايمر أوليغو(dT)18 مثبت (50 بيومول/ميكرولتر)	1 ميكرولتر	2.5 ميكرومولار
مياه من درجة PCR	المتغير	اضبط إلى حجم إجمالي 13 ميكرولتر
المجموع	13 ميكرولتر	—

الجدول 1: تحضير خليط القالب والبرايمر لتخليق حمض الديوكسي ريبونوكليك التكميلي. المواد التفاعلية، الحجم، والكميات النهائية المستخدمة لتحضير خليط القالب والبرايمر لتخليق حمض الديوكسي ريبونوكليك التكميلي (cDNA). احتوى كل تفاعل على 100 نانوغرام من حمض الريبونوكلييك الكلي (RNA)، وبرايمر أوليغو (dT)18 مثبت، وماء تفاعل متسلسل بوليميراز (PCR) معدل إلى حجم نهائي 13 ميكرولتر. تشير تركيز 2.5 ميكرومولار المبلغ عنه إلى تركيز البرايمر في خليط القالب والبرايمر بسعة 13 ميكرولتر قبل إضافة مكونات تفاعل النسخ العكسي.

المادة الكيميائية	الحجم	الكمية/التركيز النهائي
مخزن تفاعل النسخ العكسي بجهاز النسخ (5×)	4 ميكرولتر	1×
مثبط RNase الواقي (40 وحدة وحدة لكل ميكرولتر)	0.5 ميكرولتر	20 U
خليط الديوكسي نيوكليوتيد (10 مللي مولار لكل منهما)	2 ميكرولتر	1 مللي مول لكل واحد
إنزاز النسخ العكسي للناسخ (20 وحدة وحدة لكل ميكرولتر)	0.5 ميكرولتر	10 U
خليط القالب والبرايمر (الجدول 1)	13 ميكرولتر	—
المجموع	20 ميكرولتر	—

الجدول 2: خليط تفاعل النسخ العكسي لتخليق حمض الديوكسي ريبونوكليك التكميلي. المواد التفاعلية، الحجم، والتركيزات النهائية المستخدمة في تخليق حمض الديوكسي ريبونوكليك التكميلي (cDNA) على السلسلة الأولى. كان حجم التفاعل النهائي 20 ميكرولتر. تشير تركيزات ثلاثي الفوسفات المعروفة لنيوكسينيوكليوتيد (1 ملليمولار لكل منها) إلى التركيزات النهائية في خليط التفاعل الكامل.

المادة الكيميائية	الحجم	الكمية/التركيز النهائي
باورتراك SYBR جرين ماستر ميكس (2×)	5 ميكرولتر	1×
تمشيط الأوليجونكليوتيدات الأمامية والعكسية Tshb (انظر جدول المواد)	0.5 ميكرولتر	400 نانومتر
مياه من درجة PCR	3.5 ميكرولتر	ضبط حجم تفاعل 9 ميكرولتر
حجم التفاعل الكلي الفرعي	9 ميكرولتر	—
قالب cDNA	1 ميكرولتر	5 نانوغرام
حجم التفاعل النهائي	10 ميكرولتر	—

الجدول 3: تحضير خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي. الكواشف، الحجم، والتركيزات النهائية المستخدمة في تضخيم تفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR) لحمض الريبونوكلييك الرسول Tshb (mRNA). كان حجم خليط التفاعل قبل إضافة القالب 9 ميكرولتر. أضف قالب حمض الديوكسي ريبونوكليك التكميلي (cDNA) بمقدار 1 ميكرولتر قبل التضخيم مباشرة للحصول على حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.

النتائج

تم علاج اثني عشر فأرا عمرها 8 أسابيع بتصنيف C57BL/6 (6 ذكور و6 إناث) بعدوى MMI وKClO₄ في مياه الشرب مع نظام غذائي يفتقر إلى اليود لمدة أسبوع لتحفيز قصور الغدة الدرقية (الشكل 1A). تم قياس تعبير mRNA من النوع الأول في الكبد في فئران الغدة الدرقية السرية وقصور الغدة الدرقية لتأكيد نجاح تحفيز قصور الغدة الدرقية²⁹. أظهرت فئران قصور الغدة الدرقية انخفاضا يقارب 60٪ في تعبير mRNA ثنائي الدرجة الأولى الكبدي مقارنة بعناصر التح...

المناقشة

يوفر بروتوكول FACS المعتمد على CD90 الموضح هنا طريقة قابلة للتكرار لإثراء الثيروتروبس الأولي من نسيج الغدة النخامية للفأر البالغ مع الحفاظ على الاستجابة الهرمونية. تعالج هذه الطريقة قيدا تقنيا طويل الأمد في دراسة بيولوجيا الثايروتروب وتنظيم محور HPT. تاريخيا، اعتمدت الدراسات حول تنظيم الثايروتروب بشكل كبير على خط خلايا TαT1؛ ومع ذلك، تظهر خلايا TαT1 تعبيرا منخفضا جدا في قاعدة Tshb ولا تظهر باستمرار قمع T3 القانوني، مما يحد من أهميتها الفسيولوجية 14,15,20....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.22 µm filter	Corning	430769	لتعقيم وسط التجميع
0.22 µm syringe filter	Pall Life Sciences	PN4602	لتعقيم الكولاجيناز
0.5% Trypsin–EDTA	Gibco	15400-054	لتفكيك الخلايا
1.5 mL low-binding microcentrifuge tubes	Invitrogen	AM12450	لتلطيخ FACS
15 mL polypropylene tubes	Falcon	352097	لتجميع الفص الأمامي وتفكيك الخلايا
23-gauge needle	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	لبرمون القلب
8-well glass chamber slide	Millipore	PEZGS0816	لزراعة ما بعد FACS
Accudrop beads	BD Biosciences	345249	لضبط تأخير النقاط أثناء FACS
Anti-mouse PE-Cy7 anti-CD90.2 antibody	Invitrogen	25-0902-82	لتلطيخ FACS
Automated cell counter	DeNovix	s-10700	لعدّ الخلايا
Charcoal-stripped fetal bovine serum	Gibco	12676029	لزراعة الثيروتروبين بعد FACS
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	لتفكيك الخلايا
Collection pan	Standard laboratory dissection tray	N/A	لبرمون القلب
Custom-prepared HEPES-buffered saline solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+	N/A	N/A	للبرمون وتفكيك الخلايا
Cyclophilin A (CyA) oligonucleotide primer forward	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	لـ RT-qPCR
Cyclophilin A (CyA) oligonucleotide primer reverse	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	لـ RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	للوسط التجميع
DNase I solution	Promega	M6101	لتفكيك الخلايا
Enoxaparin sodium injection	Sandoz	0781-3119-64	للبرمون
Fetal bovine serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	للوسط التجميع
Flow cytometry staining buffer	Invitrogen	00-4222-26	لتلطيخ FACS
Hemostat	Fine Science Tools	13008-12	لتثبيت التجويف الصدري
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	للوسط التجميع
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	لتحضير HBSS
Iodine-deficient diet	Envigo	TD.95007	لإحداث قصور الغدة الدرقية في الجسم الحي
Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07	لتقطيع الغدة النخامية
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-017-25	للتخدير
L-glutamine	Gibco	35050-061	للوسط التجميع
Medium 199	Gibco	11150-059	لزراعة ما بعد FACS
Methimazole (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	لإحداث قصور الغدة الدرقية في الجسم الحي
MicroAmp Fast 96-well reaction plate	Applied Biosystems	4346907	لـ RT-qPCR
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140122	لزراعة ما بعد FACS
Peristaltic pump	Fisher Scientific	GP1000	لبرمون القلب
Potassium perchlorate (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	لإحداث قصور الغدة الدرقية في الجسم الحي
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	لـ RT-qPCR
Propidium iodide	eBioscience	00-6990-50	لتلطيخ القابلية للحياة أثناء FACS
QIAzol lysis reagent	Qiagen	79306	لاستخراج RNA
Silicone tubing	Cole-Parmer	EW-96410-13	لبرمون القلب
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745T	لتقطيع الفص الأمامي
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600	لـ RT-qPCR
Surgical spoon	Fine Science Tools	10090-13	لرفع الدماغ أثناء تعرض الغدة النخامية
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001	لتحضير cDNA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	لعدّ الخلايا
Tshb oligonucleotide primer forward	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	لـ RT-qPCR
Tshb oligonucleotide primer reverse	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	لـ RT-qPCR
Water bath	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	للهضم الأنزيمي