تدمج هذه الدراسة بين مجموعات البيانات العامة، والتحقق من صحة الأنسجة المزدوجة، ومقاييس هجرة الخلايا، والتنبؤ بالشبكة المستهدفة، وتحليل البصمة المناعية لتقييم miR-192-5p في سرطان القولون والمستقيم. وتسلط النتائج الضوء على التضارب بين بيانات التعبير في TCGA/GDC ونتائج qRT-PCR المحلية، وتحذر من المبالغة في تفسير أهميته التشخيصية والتنبؤية والوظيفية والمتعلقة بالمناعة.
مقالة بحثية
الأهمية السريرية، ومشهد الارتشاح المناعي، وتحليل الشبكة الوظيفية لـ miR-192-5p في سرطان القولون والمستقيم
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعتبر سرطان القولون والمستقيم (CRC) ورماً خبيثاً غير متجانس، حيث قد تساهم جزيئات microRNA في تطور الورم واكتشاف المؤشرات الحيوية. قيمت هذه الدراسة الأهمية السريرية، والارتباطات المناعية، والشبكة الوظيفية لـ miR-192-5p في سرطان القولون والمستقيم من خلال دمج تحليلات المعلوماتية الحيوية من TCGA/GDC و GEO، والتحقق من خلال qRT-PCR للأنسجة المقترنة، وتوقع الأهداف، وتحليل البصمة المناعية، وتجارب التئام الجروح في خلايا HT29. شملت إعادة تحليل بيانات miRNA-seq من TCGA/GDC ما مجموعه 616 عينة ورمية و11 عينة طبيعية من COADREAD، وأظهرت إشارة hsa-mir-192 على مستوى قاعدة البيانات أعلى في العينات الورمية مقارنة بالعينات الطبيعية (Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). ولوحظ الاتجاه ذاته في 11 حالة مقترنة من TCGA (متوسط الفرق بين الورم والطبيعي = 3.13 log2[RPM + 1]، Wilcoxon p = 0.0029)، بينما دعم تحليل qRT-PCR المحلي في الأنسجة السريرية المقترنة وجود تعبير منخفض لـ miR-192-5p الناضج في أنسجة سرطان القولون والمستقيم. وأظهر تحليل ROC القائم على TCGA فصلاً قوياً بين الورم والأنسجة الطبيعية، ولكن أكدت تحليلات إعادة أخذ العينات المتوازنة واستبعاد عينة طبيعية واحدة (leave-one-normal-out) ضرورة تفسير هذه النتيجة بحذر نظراً لمحدودية عدد العينات الطبيعية. واقترح التحليل المرضي السريري وجود ارتباطات مع مرحلة N والعمر في مجموعة TCGA، بينما لم تكن مرحلة T ومرحلة M ذات دلالة إحصائية في الجدول الملخص، ولم يظهر تحليل البقاء الإجمالي ارتباطاً إنذارياً ذا دلالة. ووفرت تحليلات الجينات المحورية المرشحة باستخدام RNA-seq من TCGA أدلة استكشافية حول التعبير والارتباط والبقاء، ولكنها لم تثبت استهدافاً مباشراً لـ miR-192-5p. وأظهر تحليل البصمة المناعية ارتباطات غير متجانسة وضعيفة في الغالب. ومن الناحية الوظيفية، أدى ترانسفكشن محاكي miR-192-5p إلى تقليل التئام الجروح في خلايا HT29. وتشير هذه النتائج إلى أن miR-192-5p ذو صلة بيولوجية بسرطان القولون والمستقيم، إلا أن اتجاه تعبيره وتفسيره السريري يعتمدان على المنصة المستخدمة ويتطلبان مزيداً من التحقق التجريبي.
المقدمة
يُعد سرطان القولون والمستقيم (CRC) أحد أكثر الأورام الخبيثة شيوعاً في جميع أنحاء العالم، ولا يزال سبباً رئيسياً للوفيات المرتبطة بالسرطان1,2. وعلى الرغم من أن تنظير القولون، والاختبار الكيميائي المناعي للبراز، واختبار مثيلة SEPT9، وعلامات الورم الجوالة، والتنميط الجزيئي قد أدت إلى تحسين الكشف عن سرطان القولون والمستقيم وإدارته سريرياً3,4، إلا أنه لا يزال هناك تباين كبير في بيولوجيا الورم، والاستجابة للعلاج، ونتائج المرضى5,6,7. لذا، فإن المؤشرات الحيوية التي تساعد في توصيف بيولوجيا سرطان القولون والمستقيم قد تساهم في تصنيف المخاطر وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر تخصصاً لكل مريض8.
تعد الحموض النووية الريبوزية الميكروية (miRNAs) جزيئات صغيرة من الحمض النووي الريبوزي غير المشفر، يتراوح طولها تقريبًا بين 19–24 نيوكليوتيدة، وتعمل على تنظيم التعبير الجيني بشكل أساسي من خلال آليات ما بعد النسخ9. ويمكن أن يؤثر خلل تنظيم تعبير miRNA على تكاثر الخلايا السرطانية، وهجرتها، وغزوها، والموت الخلوي المبرمج، والتفاعلات المناعية، والاستجابة للعلاج10. وقد أُشير إلى أن miR-192-5p يعمل بطريقة تعتمد على السياق في مختلف الأمراض والسرطانات، حيث يرتبط إما بخصائص محفزة للأورام أو مثبطة لها بناءً على نوع النسيج، والخلفية الجزيئية، والنظام التجريبي11,12,13,14,15,16. وفي سرطان القولون والمستقيم (CRC)، أفادت الدراسات السابقة بوجود ملفات تعريف متغيرة لـ miRNA في العينات السريرية وتنظيم وظيفي للأنماط الظاهرية الخبيثة في خلايا سرطان القولون12,14,15. ومع ذلك، قد لا تظهر تحليلات قواعد البيانات العامة دائمًا نفس اتجاه التعبير، كما تتطلب الأهمية السريرية، وشبكة الأهداف، والارتباطات المناعية لـ miR-192-5p في سرطان القولون والمستقيم تقييمًا دقيقًا.
قامت الدراسة الحالية بتقييم miR-192-5p في سرطان القولون والمستقيم (CRC) من خلال دمج التحليلات المعلوماتية الحيوية لـ TCGA/GDC و GEO، والتحقق بواسطة qRT-PCR في أنسجة سريرية مزدوجة، ومقايسات الهجرة في المختبر، والتنبؤ بالجينات المستهدفة المرشحة، وإثراء المسارات، وتحليل ارتباط البصمة المناعية. استندت الدراسة إلى فرضية أن miR-192-5p الناضج قد يكون منخفض التعبير في أنسجة CRC وقد يمارس تأثيراً كابحاً للأورام. وبما أن إشارة miRNA-seq المعاد تحليلها من TCGA/GDC أظهرت اتجاه تعبير معاكساً، فقد تم تفسير النتائج على أنها استكشافية وتعتمد على المنصة المستخدمة بدلاً من كونها نمط تعبير واحداً وحاسماً.
البروتوكول
أُجريت هذه الدراسة وفقاً لإعلان هلسنكي. وقد منحت لجنة الأخلاقيات في جامعة منغوليا الداخلية الطبية الموافقة على الدراسة في 21 أكتوبر 2021. كما تم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من جميع المشاركين الذين شملتهم الدراسة.
جمع العينات السريرية
تم جمع عينات مزدوجة من سرطان القولون والمستقيم (CRC) والأنسجة غير السرطانية المجاورة من 45 مريضاً خضعوا لاستئصال جذري في الفترة ما بين ديسمبر 2017 وفبراير 2020. لم يتلقَّ أي من المرضى علاجاً إشعاعياً أو كيماوياً قبل الجراحة، كما تم استبعاد المرضى الذين يعانون من أورام خبيثة أخرى. جُمعت الأنسجة غير السرطانية المجاورة من مسافة لا تقل عن 5 cm من حافة الورم. جُمدت العينات فوراً بعد الاستئصال الجراحي وحُفظت في النيتروجين السائل حتى استخلاص الـ RNA. شملت المجموعة 27 مريضاً و18 مريضة؛ وكان 13 مريضاً دون سن 60 عاماً، بينما كان 32 مريضاً في سن 60 عاماً أو أكثر. شملت المتغيرات العيادية المرضية قطر الورم، ومرحلة TNM، والتمايز، والخثرة الورمية الوعائية، والنقائل العقدية اللمفاوية، ومستوى CEA قبل الجراحة.
جمع البيانات العامة ومعالجتها المسبقة
تم الحصول على بيانات miRNA-seq وRNA-seq والبيانات السريرية المتاحة للوصول المفتوح لـ TCGA-COAD وTCGA-READ من بوابة Genomic Data Commons. تم تحديد عينات الأورام الأولية وعينات الأنسجة الصلبة الطبيعية وفقاً لنوع العينة في GDC. استُبعدت عينات الأورام النقيلية والمتكررة من تحليل التعبير التفاضلي بين الورم والأنسجة الطبيعية. بالنسبة لملفات miRNA-seq الخاصة بـ TCGA، كان الإدخال المكتشف على مستوى قاعدة البيانات لهذا التحليل هو hsa-mir-192؛ وحُللت قيم التعبير كـ log2(RPM + 1)، حيث تشير RPM إلى عدد القراءات لكل مليون من قراءات miRNA المحددة. أُجريت تحليلات الورم والأنسجة الطبيعية غير المقترنة والمقترنة عند توفر عينات متطابقة. استُخدمت مجموعات بيانات GEO ذات الرموز GSE89076 وGSE156355 لفحص الجينات المستهدفة المرشحة. فُحصت الجينات ذات التعبير التفاضلي من GEO باستخدام قيمة p المعدلة < 0.05 والقيمة المطلقة لـ log2 fold-change ≥ 2. وتم التحقق من اتساق أسماء مجموعات البيانات في جميع أنحاء المخطوطة.
التحليلات التشخيصية والكلينيكوباثولوجية وتحليلات البقاء على قيد الحياة
تم استخدام تحليل خصائص تشغيل المستقبل (ROC) لتقييم الفصل الاستكشافي بين الأورام والأنسجة الطبيعية في مجموعات TCGA-COAD وTCGA-READ، والمجموعة المدمجة COADREAD. ونظراً لصغر عدد العينات الطبيعية، تم إجراء تحليلات حساسية إضافية، شملت إعادة أخذ عينات متوازنة بين الأورام والأنسجة الطبيعية بـ 5,000 تكرار، وتحليل استبعاد عينة طبيعية واحدة (leave-one-normal-out). وبالنسبة لتحليلات الارتباط السريري المرضي، تم تقسيم عينات الورم الأولية إلى مجموعات ذات تعبير مرتفع ومنخفض بناءً على متوسط مستوى تعبير TCGA miR-192. كُررت التحليلات للمجموعة المدمجة COADREAD ولـ COAD وREAD بشكل منفصل عندما سمح حجم العينة بذلك. كما تم تقييم البقاء على قيد الحياة بشكل عام باستخدام تحليل Kaplan-Meier مع اختبار log-rank وانحدار Cox أحادي المتغير. وقد تم عرض التحليلات التشخيصية والسريرية المرضية وتحليلات البقاء على قيد الحياة بشكل منفصل لتجنب المبالغة في الاستنتاجات الإنذارية.
تحليلات الجينات المستهدفة المرشحة والجينات المركزية
تم تحديد الجينات المستهدفة المرشحة من خلال دمج تنبؤات miRWalk مع الجينات ذات التعبير التفاضلي المستمدة من GSE89076 وGSE156355. وقد تم الاحتفاظ بالتقاطع بين هذه المصادر الثلاثة لإجراء التحليلات الاستكشافية اللاحقة. كما تم بناء شبكة تفاعلات البروتين-بروتين باستخدام STRING، واختيرت الجينات المركزية (hub genes) بناءً على درجة العقدة واتصال الوحدة باستخدام تحليلات cytoHubba وMCODE المعتمدة على Cytoscape. وتم تقييم الجينات المركزية المختارة (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3, and KIF5C) بشكل أكبر باستخدام بيانات TCGA RNA-seq. ولخصت التحليلات الاستكشافية التكميلية فروق التعبير بين الأنسجة الورمية والطبيعية، وارتباطات Spearman مع تعبير TCGA miR-192، والارتباطات مع معدلات البقاء الإجمالية. واعتُبرت هذه الجينات أهدافاً مرشحة فقط؛ ولم يتم استنتاج أي ارتباط مباشر أو تأثير إنقاذي أو تنظيم على مستوى البروتين اللاحق من البيانات المعلوماتية الحيوية.
تحليل إثراء GO وKEGG
تم إجراء تحليلات الإثراء باستخدام هستولوجيا الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) لمجموعة الجينات المرشحة ونماذج الشبكة ذات الدلالة. وقد تم تقسيم مصطلحات GO إلى فئات العمليات البيولوجية، والمكونات الخلوية، والوظائف الجزيئية. واعتبرت نتائج الإثراء التي كانت قيمة p فيها < 0.05 ذات دلالة إحصائية، وفُسرت على أنها إشارات لمسارات تولد فرضيات وليست آليات مثبتة تجريبياً.
استخلاص الـ RNA وتحليل qRT-PCR
تم استخلاص RNA الكلي من 45 عينة مزدوجة من سرطان القولون والمستقيم (CRC) والأنسجة غير السرطانية المجاورة باستخدام كاشف TRIzol وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تقييم نقاوة وتركيز RNA باستخدام القياس الطيفي، واستُخدمت العينات التي تراوحت قيم A260/A280 فيها بين 1.8 و2.1 في عملية النسخ العكسي. أُجري تفاعل qRT-PCR باستخدام نظام النسخ العكسي لـ miRNA وكواشف miRNA qPCR القائمة على SYBR Green من شركة TransGen Biotech. نُفذ النسخ العكسي وتضخيم qPCR وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة للكواشف. أُجري كل تفاعل qRT-PCR في ثلاث مكررات تقنية. استُخدم RNU6B كمرجع داخلي. كانت بادئات miR-192-5p هي 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (أمامية) و5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (عكسية). وكانت بادئات RNU6B هي 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (أمامية) و5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (عكسية). استُخدم تحليل منحنى الانصهار لتقييم خصوصية التضخيم عندما كانت منصة qPCR تدعم ذلك. حُسب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt. وحُللت نتائج الورم والأنسجة المجاورة المزدوجة كقياسات سريرية مزدوجة.
زراعة الخلايا والترانسفكشن
تم الحصول على خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HT29 من المخزون الخلوي لمختبر المؤلفين، وتم التحقق من هويتها والتأكد من خلوها من تلوث الميكوبلازما. استُنبتت خلايا HT29 في وسط McCoy's 5A مضافاً إليه 10% مصل جنين البقر، و100 U/mL بنسلين، و100 µg/mL ستريبتومايسين عند درجة حرارة 37 oC في جو يحتوي على 5% CO2. تم تمرير الخلايا عندما وصلت نسبة تلاقيها إلى 80% تقريباً. تم شراء محاكيات miR-192-5p وأوليغونوكليوتيد التحكم السلبي con238 من شركة Sangon Biotech (شنغهاي، الصين) واستُخدما في عملية عفن عابر. زُرعت خلايا HT29 في أطباق ذات 6 آبار، وأُجري لها عفن عندما وصلت الكثافة الخلوية إلى 20–30% تقريباً، باستخدام تركيز نهائي للأوليغونوكليوتيد قدره 50 nM وبروتوكول عفن يعتمد على الدهون تم تنفيذه وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة للكاشف. اتبعت النسبة الدقيقة للكاشف إلى الأوليغونوكليوتيد وكمية الكاشف البروتوكول الموصى به من الشركة المصنعة والمستخدم في سجلات مختبر المؤلفين. حُضنت الخلايا مع معقدات العفن تحت ظروف استنبات قياسية، وأُجريت عمليات التصوير بعد العفن واختبارات التئام الجروح وفقاً للجدول الزمني التجريبي. تضمنت الدراسة الحالية بيانات خلايا HT29 فقط.
مقايسة التئام الجروح
تم استزراع خلايا HT29 المنقولة جينياً في أطباق ذات 6 عيون، وحُضنت حتى تشكلت طبقة أحادية متصلة. تم إنشاء خدش خطي باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 µL، وأزيلت الخلايا المنفصلة عن طريق الغسل بمحلول PBS. استُبدل الوسط بعد ذلك بوسط خالٍ من المصل لتقليل التأثيرات المرتبطة بالتكاثر أثناء تقييم الهجرة. تم التقاط صور للجرح عند 0 h و24 h و48 h. أُجري اختبار التئام الجروح في ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، وقِيست عدة حقول مجهرية لكل مجموعة ونقطة زمنية. تم قياس عرض الجرح كمياً من الصور المجهرية باستخدام برنامج لتحليل الصور؛ ولم تكن نسخة البرنامج الدقيقة المستخدمة في القياسات الأصلية متاحة في السجلات المصدرية. حُسب معدل التئام الجروح وفق المعادلة: [(عرض الجرح عند 0 h - عرض الجرح عند النقطة الزمنية المحددة) / عرض الجرح عند 0 h] × 100%. ونظراً لأن بيانات المخطوطة المتاحة لا تتضمن تجربة منفصلة للتحكم في التكاثر، فقد فُسرت نتائج التئام الجروح على أنها مرتبطة بالهجرة، ولكن دون استبعاد تام لتأثيرات التكاثر.
تحليل ارتباط البصمة المناعية
أُعيد تقييم الارتباط بين تعبير miR-192 في قاعدة بيانات TCGA والبصمات المرتبطة بالمناعة باستخدام بيانات RNA-seq للأورام الأولية. شمل تحليل ارتباط درجة البصمة إجمالي 425 عينة ورمية ذات بيانات miRNA وRNA-seq متطابقة. أظهر تعبير miR-192 ارتباطات سلبية ضعيفة ولكنها ذات دلالة إحصائية مع العديد من البصمات المناعية بعد تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب، بما في ذلك خلايا Tfh (rho = -0.205, FDR = 0.00049)، والخلايا التغصنية المنشطة (rho = -0.186, FDR = 0.00098)، وخلايا Treg (rho = -0.185, FDR = 0.00098)، والخلايا التغصنية البلازمية (rho = -0.169, FDR = 0.0027)، والبلعميات (rho = -0.149, FDR = 0.0092). كما لُوحظ وجود ارتباطات إيجابية بشكل أساسي لبصمات الخلايا الحمضية (rho = 0.139, FDR = 0.0155) وبصمات خلايا Th17 (rho = 0.121, FDR = 0.0296). وتشير هذه النتائج إلى وجود ارتباطات مناعية غير متجانسة وضعيفة عموماً، بدلاً من وجود نمط موحد من الارتشاح المناعي الإيجابي.
التحليل الإحصائي
أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برامج GraphPad Prism 9.0 و SPSS 25.0 و R software 3.6.3. ولُخصت المتغيرات المستمرة في شكل متوسط ± انحراف معياري أو وسيط مع المدى الربيعي، حسبما كان مناسباً. وحُللت مقارنات الأنسجة المزدوجة باستخدام الاختبارات المزدوجة عندما تمت مطابقة عينات الورم والأنسجة المجاورة. واستُخدمت الاختبارات غير المعلمية عندما لم تتحقق افتراضات التوزيع الطبيعي. كما استُخدمت منحنيات ROC، وإعادة أخذ العينات المتوازنة، وتحليل استبعاد حالة طبيعية واحدة (leave-one-normal-out) للتمييز التشخيصي الاستكشافي؛ واستُخدمت اختبارات مربع كاي (Chi-square) للارتباطات السريرية المرضية الفئوية؛ ونماذج log-rank و Cox لتحليلات البقاء؛ وارتباط سبيرمان (Spearman correlation) لتحليلات المناعة والجينات المركزية (hub-gene). واعتُبرت قيمة p < 0.05 ثنائية الجانب ذات دلالة إحصائية، مع تسجيل تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ لارتباطات التوقيع المناعي.
النتائج
تحليل التعبير في مجموعات البيانات العامة والأنسجة السريرية المقترنة
أعيد تقييم نمط تعبير miR-192 باستخدام بيانات miRNA-seq من TCGA-COAD وTCGA-READ المستمدة من GDC (الشكل 1). في هذه الملفات، تم تعيين الإدخال على مستوى قاعدة البيانات على أنه hsa-mir-192 بدلاً من تعيينه مباشرة كنوع hsa-miR-192-5p الناضج؛ وبناءً عليه، فُسرت نتيجة قاعدة البيانات العامة هذه على أنها إشارة TCGA لـ miR-192. في مجموعة COADREAD المجمعة، تم تحليل 616 ورماً أولياً و11 عينة طبيعية من الأنسجة الصلبة. وأظهرت عينات الأورام تعبيراً أعلى لـ miR-192 مقارنة بالعينات الطبيعية (الوسيط 16.05 مقابل 13.46 log2[RPM + 1]، وقيمة Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). ولوحظ نفس الاتجاه المتمثل في زيادة التعبير في الأورام في COAD وحده (455 ورماً و8 عينات طبيعية، p = 9.89 x 10-8) وفي READ وحده (161 ورماً و3 عينات طبيعية، p = 1.94 x 10-5). كما أظهر تحليل TCGA المقترن تعبيراً أعلى في الأورام في 11 حالة متطابقة (الوسيط لفرق الورم-الطبيعي = 3.13 log2[RPM + 1]، وقيمة Wilcoxon p = 0.0029). وظلت هذه النتائج متضاربة مع نتيجة qRT-PCR المقترنة المحلية، والتي دعمت انخفاض تعبير miR-192-5p الناضج في أنسجة CRC (الشكل 2).
الأداء التشخيصي والارتباطات المرضية السريرية
تكرر تحليل ROC بناءً على بيانات TCGA باستخدام تعريف التمييز بين العينات الورمية والعينات الطبيعية الموضح أعلاه (الشكل 3). بلغت قيمة AUC نحو 0.968 لمجموعة COADREAD المدمجة، و0.947 لـ COAD وحده، و0.994 لـ READ وحده. وأسفرت عملية إعادة أخذ العينات المتوازنة الإضافية عن قيم وسيطة لـ AUC بلغت 0.983 لـ COADREAD، و0.984 لـ COAD، و1.000 لـ READ؛ ومع ذلك، كانت فترات الثقة 95% واسعة لكل من COADREAD (0.868–1.000) وCOAD (0.781–1.000)، كما اشتملت مجموعة READ على ثلاث عينات طبيعية فقط. وأظهر تحليل استبعاد عينة واحدة (Leave-one-out) للعينات الطبيعية أيضاً أن تقدير ROC كان حساساً لصغر حجم المجموعة الطبيعية. وبناءً على ذلك، تم الاحتفاظ بنتيجة ROC كدليل استكشافي فقط على الفصل بين الورم والأنسجة الطبيعية، وليس كدليل كافٍ ليكون مؤشراً حيوياً للتشخيص السريري. وأظهر تحليل الارتباط العيادي المرضي بناءً على وسيط تعبير miR-192 في TCGA ارتباطات معنوية مع مرحلة N (p = 0.019) والعمر (p = 0.004)، بينما لم تكن مرحلة T (p = 0.110) ومرحلة M (p = 0.932) معنوية (الجدول 1).
تحليل البقاء
لم يدعم تحليل البقاء الإجمالي وجود ارتباط إنذاري ملحوظ للتعبير عن miR-192 في بيانات TCGA لسرطان القولون والمستقيم CRC (الشكل 3). وفي مجموعة COADREAD المدمجة، لم تكن مقارنة Kaplan-Meier المعتمدة على القطع الوسيط ذات دلالة إحصائية (log-rank p = 0.857)، كما أظهر تحليل انحدار Cox أحادي المتغير عدم وجود ارتباط ملحوظ (HR = 0.934 لكل وحدة تعبير log2، p = 0.374). ولوحظ الاستنتاج نفسه في COAD (log-rank p = 0.889؛ Cox p = 0.493) وREAD (log-rank p = 0.807؛ Cox p = 0.716). وبناءً عليه، فإن البيانات لا تدعم الادعاء بأن miR-192 يمثل مؤشراً حيوياً إنذارياً قوياً في سرطان القولون والمستقيم CRC.
الجينات المستهدفة المرشحة والإثراء الوظيفي
تم إجراء تحليل الجينات المستهدفة المرشحة من خلال دمج تنبؤات miRWalk مع الجينات ذات التعبير التفاضلي من مجموعات بيانات GEO وهي GSE89076 وGSE156355. وقد حدد هذا الفرز 93 جيناً مرشحاً لتحليلات الشبكة والإثراء اللاحقة (الشكل 4). وأبقى تحليل التفاعل البروتيني على KIF20A، وTPX2، وCDCA5، وCCNB1، وCDK1، وPLP1، وNRXN1، وGRIK3، وKIF5C كجينات مركزية استكشافية (الشكل 5). وأظهر تحليل حساسية RNA-seq من TCGA أن KIF20A، وTPX2، وCDCA5، وCCNB1، وCDK1 كانت أعلى في الأنسجة الورمية منها في الأنسجة الطبيعية، بينما كانت PLP1، وNRXN1، وGRIK3، وKIF5C أقل في الأنسجة الورمية. وكان تحليل الارتباط مع تعبير miR-192 في TCGA مختلطاً؛ حيث أظهرت CDCA5 وCCNB1 وCDK1 ارتباطات إيجابية، بينما أظهرت PLP1 وNRXN1 وKIF5C ارتباطات سلبية. وسلط تحليل الإثراء الضوء على مصطلحات ممثلة تتعلق باستقلاب الأدوية بواسطة سيتوكروم P450، واستقلاب المواد الغريبة بواسطة سيتوكروم P450، واستقلاب الريتينول، والمصطلحات المتعلقة بالتشابك العصبي الجلوتاماتي، وتنظيم ما قبل التشابك (الشكل 6). تدعم هذه النتائج الأهمية البيولوجية لشبكة الجينات المركزية ولكنها لا تثبت استهدافاً مباشراً لـ miR-192-5p.
مقايسة هجرة الخلايا
تم إجراء عفن (transfection) لخلايا HT29 باستخدام محاكيات miR-192 لتقييم التأثيرات الوظيفية لزيادة تنظيم miR-192. وأكد الفحص بالمجهر الفلوري نجاح عملية العفن في مجموعات محاكي miR-192-5p ومجموعات العفن الضابطة السلبية (الشكل 7). وفي اختبار التئام الجروح، كان معدل هجرة خلايا HT29 التي تم عفنها بـ miR-192 أقل من معدل هجرة خلايا HT29 غير المعفنة والخلايا المعفنة بالضابط السلبي عند كل من 24 h و 48 h (الشكل 8). ففي غضون 24 h، بلغ معدل الهجرة 9.75 +/- 2.43% في المجموعة المعفنة بـ miR-192 مقارنة بـ 15.69 +/- 3.47% في المجموعة غير المعفنة و 15.45 +/- 3.92% في المجموعة الضابطة السلبية (P = 0.010). وعند 48 h، بلغ معدل الهجرة 20.04 +/- 2.54% في المجموعة المعفنة بـ miR-192 مقارنة بـ 26.84 +/- 7.65% و 27.98 +/- 6.78% في المجموعتين الضابطتين، على التوالي (P = 0.021). وتشير هذه النتائج إلى أن زيادة تنظيم miR-192 تثبط هجرة خلايا HT29 في المختبر (in vitro).
تحليل ارتباط البصمة المناعية
أُعيد تقييم الارتباط بين تعبير miR-192 في TCGA والبصمات المرتبطة بالمناعة باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) للأورام الأولية (الشكل 9). شمل تحليل ارتباط درجة البصمة ما مجموعه 425 عينة ورمية ذات بيانات متطابقة من miRNA وRNA-seq. أظهر تعبير miR-192 ارتباطات سلبية ضعيفة مع بصمات خلايا مناعية متعددة، بما في ذلك خلايا Tfh (rho = -0.205, p = 2.15e-05)، والخلايا الشجيرية المنشطة (rho = -0.186, p = 0.00011)، وخلايا Treg (rho = -0.185, p = 0.00013)، والخلايا الشجيرية البلازمية (rho = -0.169, p = 0.00046)، والبلاعم (rho = -0.149, p = 0.0020)، وخلايا Tcm (rho = -0.136, p = 0.0050)، وخلايا NK CD56bright (rho = -0.132, p = 0.0065)، وخلايا Tem (rho = -0.129, p = 0.0078). كما لوحظت ارتباطات إيجابية ضعيفة لبصمات الخلايا الحمضية (rho = 0.139, p = 0.0040) وخلايا Th17 (rho = 0.121, p = 0.0129). وبناءً على ذلك، يبدو الارتباط المناعي لـ miR-192 في سرطان القولون والمستقيم (CRC) متباينًا، ولا ينبغي وصفه بأنه إيجابي بشكل موحد عبر جميع الرشاحات المناعية.
توافر البيانات
تتوفر مجموعات البيانات العامة التي تم تحليلها في هذه الدراسة من بوابة GDC/TCGA وقاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO) تحت أرقام الوصول GSE89076 و GSE156355. تتوفر تحليلات المختبر الجاف وعمليات إعادة التحليل التي تم إجراؤها خلال هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1. أما البيانات التجريبية الأساسية التي تدعم تحليلات qRT-PCR والتئام الجروح، بما في ذلك قيم Ct الخام لـ qRT-PCR، وقياسات عرض الجرح، وصور المجهر الأصلية، والبيانات التجريبية ذات الصلة، فهي متوفرة في المجلد التكميلي 1.
الشكل 1: نظرة عامة على تعبير miR-192 في مختلف أنواع السرطانات في قاعدة بيانات TCGA. يمثل المحور السيني اختصارات الأورام، ويمثل المحور الصادي التعبير النسبي لـ miR-192. يشير اللون الأزرق إلى الأنسجة الطبيعية، واللون الأحمر إلى أنسجة الورم. ويتم الإشارة إلى الدلالة الإحصائية كما يلي: * = p < 0.05، ** = p < 0.01، *** = p < 0.001؛ NS = غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تعبير miR-192/miR-192-5p في مجموعات بيانات سرطان القولون والمستقيم (CRC) والأنسجة المقترنة. (أ) تحليل miRNA-seq من TCGA/GDC يظهر إشارة hsa-mir-192 على مستوى قاعدة البيانات أعلى في عينات أورام CRC منها في العينات الطبيعية. (ب) تحليل qRT-PCR لعينات أنسجة محلية مقترنة يظهر تعبيراً أقل لـ miR-192-5p الناضج في أنسجة CRC مقارنة بالأنسجة غير السرطانية المجاورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3تحليلات تشخيصية وبقائية استكشافية بناءً على تعبير hsa-mir-192 في أطلس جينوم السرطان (TCGA). (أ–جمنحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة. لم يدعم تحليل البقاء وجود ارتباط إنذاري ذي دلالة إحصائية.دمنحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) للتمييز بين الورم والأنسجة الطبيعية في مجموعة TCGA. يجب تفسير المساحة تحت المنحنى (AUC) بحذر نظرًا لقلة عدد العينات الطبيعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: فحص الجينات المستهدفة المرشحة وتحليل التفاعل البروتيني. (A) مخطط فين يوضح التداخل بين توقعات أهداف miRNA والجينات ذات التعبير المتباين من GSE89076 وGSE156355. (B) شبكة التفاعل بين البروتينات لـ 93 جيناً مرشحاً. تمثل العقد الجينات، بينما تمثل الحواف الارتباطات الجينية المتوقعة أو المنسقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: فحص الجينات المركزية من شبكة الأهداف المرشحة. (A,B) وحدات الشبكة التي تم تحديدها من خلال فحص الوحدات. (C) ترتيب الجينات المركزية بناءً على اتصال الشبكة. (D) الأهداف المركزية المرشحة التي تم الاحتفاظ بها بعد دمج الفحص القائم على الوحدات والدرجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: مصطلحات إثراء GO وKEGG المختارة للجينات المرشحة ووحدات الشبكة ذات الدلالة. يلخص المخطط الفقاعي الوظائف والمسارات البيولوجية المثرية والممثلة. وتعد نتائج الإثراء استكشافية وتتطلب تحققاً تجريبياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: صور ترانسفكشن خلايا HT29. (أ) خلايا HT29 نموذجية. (ب) صورة فلورية لخلايا HT29 تم ترانسفكشنها بمحاكي miR-192-5p. (ج) صورة فلورية لخلايا HT29 تم ترانسفكشنها بضابط سلبي con238. شريط المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: مقايسة التئام الجروح في خلايا HT29. (أ) صور تمثيلية للخدش عند 0 h و 24 h و 48 h في خلايا HT29 غير منقولة، وخلايا HT29 منقولة بـ miR-192-5p mimic، وخلايا HT29 منقولة بـ con238. (ب) تقدير كمي لمعدلات التئام الجروح عند 24 h و 48 h، موضحة كنسب مئوية. شريط المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9: الارتباط بين تعبير miR-192 في قاعدة بيانات TCGA ودرجات البصمة المناعية في عينات أورام CRC. أظهر التحليل ارتباطات مناعية غير متجانسة، مع وجود العديد من الارتباطات السلبية الضعيفة، وارتباطات إيجابية، خاصة بالنسبة لبصمات الخلايا الحمضية (eosinophil) وخلايا Th17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الخصائص | تعبير منخفض لـ TCGA miR-192 | تعبير مرتفع لـ TCGA miR-192 | القيمة الاحتمالية p value | الطريقة |
| n | 308 | 308 | ||
| مرحلة T، العدد (٪) | 0.11 | اختبار مربع كاي Chisq.test | ||
| T1 | 9 (1.5%) | 11 (1.8%) | ||
| T2 | 44 (7.2%) | 59 (9.6%) | ||
| T3 | 209 (34.1%) | 211 (34.4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4.4%) | ||
| مرحلة N، العدد (٪) | 0.019 | اختبار مربع كاي Chisq.test | ||
| N0 | 156 (25.5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14.4%) | 63 (10.3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8.8%) | ||
| مرحلة M، العدد (٪) | 0.932 | اختبار مربع كاي Chisq.test | ||
| M0 | 214 (39.9%) | 234 (43.7%) | ||
| M1 | 41 (7.6%) | 47 (8.8%) | ||
| العمر، الوسيط (IQR) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0.004 | اختبار ويلكوكسون Wilcoxon |
جدول 1: الارتباط بين مجموعات تعبير miR-192 في TCGA والخصائص السريرية المرضية في CRC. تم تحديد مجموعات التعبير العالي والمنخفض بناءً على متوسط مستوى تعبير miR-192 في TCGA. في الجدول الملخص، كانت مرحلة N والعمر ذوي دلالة إحصائية، بينما لم تكن مرحلة T ومرحلة M ذات دلالة إحصائية.
الجدول التكميلي 1: نتائج إعادة التحليل المختبري الجاف التي تم إنتاجها لهذه الدراسة. يتضمن دفتر العمل مقارنات التعبير الجيني لـ TCGA/GDC، وتحليلات حساسية ROC المتوازنة، وتحليلات استبعاد عينة طبيعية واحدة، وتحليلات الارتباط العيادي المرضي، وتحليلات البقاء، وملخصات تعبير وارتباط الجينات المركزية، ونتائج ارتباط التوقيع المناعي.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المجلد التكميلي 1: البيانات التجريبية الخام الداعمة لتجارب qRT-PCR، وترصيف الخلايا، والتئام الجروح.تتضمن هذه الملفات قيم Ct الأصلية لـ qRT-PCR، وبيانات قياس التدفق الخلوي/الترصيف، وقياسات عرض الجرح، وصور مجهرية ممثلة استُخدمت في التحليلات المعروضة في المخطوطة.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
قيمت هذه الدراسة الأهمية السريرية والبيولوجية لـ miR-192-5p في سرطان القولون والمستقيم (CRC) من خلال الجمع بين تحليل مجموعات البيانات العامة، والتحقق من الأنسجة المحلية، والتنبؤ بشبكة الأهداف، وتحليل البصمة المناعية، وتجارب الهجرة في المختبر. استخدمت التحليلات تعريفات عينات TCGA التي تم التحقق منها، وفصلت بين سرطان القولون (COAD) وسرطان المستقيم (READ) حيثما أمكن، واستخدمت قيم miRNA بصيغة log2(RPM + 1)، وميزت بين المقارنات المزدوجة وغير المزدوجة، واختبرت متانة منحنى ROC، وأضافت تحليلات حساسية RNA-seq للجينات المركزية. وتتمثل النتيجة المركزية في أن إشارة miR-192 في قاعدة بيانات TCGA/GDC العامة ونتيجة qRT-PCR لـ miR-192-5p الناضج محلياً تشيران إلى اتجاهات تعبير متضادة، مما يؤكد الحاجة إلى التمييز بين تعليقات السلائف على مستوى قاعدة البيانات وقياسات miRNA الناضجة9,11.
لا ينبغي تفسير هذا التعارض فقط بناءً على تفاوت أحجام العينات. فقد كانت مجموعة الأنسجة الطبيعية في TCGA صغيرة، ولكن التحليلات غير المقترنة، والمقترنة، وتلك الخاصة بـ COAD فقط وREAD فقط، أظهرت جميعها نفس الاتجاه نحو ارتفاع المستوى في الورم في TCGA/GDC. وقد تساهم عدة عوامل في ذلك، بما في ذلك الاختلافات في مصدر العينة، ومنصات التسلسل مقابل منصات qRT-PCR، وتوصيف hsa-mir-192 على مستوى قاعدة البيانات مقابل قياس hsa-miR-192-5p الناضج، ومعالجة RNA، ونقاوة الورم، وتعريف الأنسجة المجاورة، وخصائص السكان. وقد تم التأكيد على مخاوف مماثلة بشأن تفسير المؤشرات الحيوية وعدم تجانس الورم في دراسات سرطان القولون والمستقيم (CRC)5,6,7,8. وبناءً على ذلك، تدعم النتائج تفسيراً لـ miR-192-5p في CRC يعتمد على السياق والمنصة المستخدمة، بدلاً من وجود اتجاه تعبير عالمي واحد.
يجب أيضاً تفسير التحليل التشخيصي بحذر. ورغم أن تحليل ROC المستند إلى TCGA قد أعطى قيمة AUC عالية، إلا أن المقارنة تضمنت عينات أورام أكثر بكثير من العينات الطبيعية، حيث توفرت 11 عينة طبيعية فقط في مجموعة COADREAD المدمجة. ولا يزال إعادة أخذ العينات المتوازنة يُظهر قيم AUC وسيطة عالية، ولكن الفواصل كانت واسعة لأن كل مقارنة متوازنة كانت مقيدة بصغر حجم المجموعة الطبيعية. وبالتالي، فإن نتيجة ROC تدعم الفصل الاستكشافي بين الورم والأنسجة الطبيعية ضمن TCGA/GDC، ولكنها غير كافية لإثبات أن miR-192-5p يعمل كمؤشر حيوي تشخيصي سريري. ويتفق هذا التفسير مع التمييز العام بين إشارات المؤشرات الحيوية الاستكشافية والمؤشرات الحيوية التشخيصية أو الإنذارية المعتمدة سريرياً4,8.
لم يُظهر تحليل البقاء على قيد الحياة وجود ارتباط معنوي بين تعبير miR-192 والبقاء الإجمالي على قيد الحياة في حالات COADREAD أو COAD أو READ. في التحليل الحالي، قد يرتبط miR-192 بمتغيرات إكلينيكية مرضية مختارة، ولكن البيانات المتاحة لا تدعم استنتاجاً قوياً باعتباره مؤشراً حيوياً إنذارياً. ويُعد هذا التمييز مهماً لأن المؤشرات الحيوية الإنذارية تتطلب أدلة على أن حالة المؤشر ترتبط بالنتيجة بشكل مستقل وقابل للتكرار عبر السياقات ذات الصلة سريرياً8.
يوفر اختبار التئام الجروح في المختبر (in vitro) دليلاً وظيفياً على أن زيادة تنظيم miR-192 يمكن أن تقلل من هجرة خلايا HT29. وتتسق هذه النتيجة مع الوظيفة المثبطة المحتملة للأورام في خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC) ومع اتجاه نتائج qRT-PCR المحلية. كما دعمت أعمال سابقة أدوار جزيئات miRNAs، بما في ذلك المسارات المرتبطة بـ miR-192، في تنظيم الانتقال الظهاري المتوسطي (epithelial-to-mesenchymal transition)، ومصير الخلية، والأنماط الظاهرية المرتبطة بالهجرة15,16,17. ومع ذلك، لا تزال البيانات الوظيفية غير مكتملة. وسيكون من الضروري إجراء المزيد من التحقق المختبري لدعم نموذج ميكانيكي مثبط للأورام، بما في ذلك تكرار عمليات عفن الخلايا (transfections) في خط خلوي واحد على الأقل إضافي من خلايا سرطان القولون والمستقيم، وضوابط التكاثر لاختبارات التئام الجروح، واختبارات الهجرة/الغزو باستخدام Transwell، والتحقق من الأهداف المحددة باستخدام اختبار لوسيفيراز المزدوج (dual-luciferase)، وقياسات mRNA والبروتينات المستهدفة، وتجارب الإنقاذ (rescue experiments).
يجب اعتبار تحليل الجينات المركزية (hub-gene) بمثابة وسيلة لتوليد الفرضيات. وقد أظهرت البيانات التكميلية لـ TCGA RNA-seq فروقاً قوية في التعبير بين الأورام والأنسجة الطبيعية للجينات المركزية المتبقية، ولكن ارتباطاتها مع miR-192 كانت مختلطة. حيث ارتبطت عدة جينات للدورة الخلوية، بما في ذلك CDCA5 وCCNB1 وCDK1، ارتباطاً إيجابياً بدلاً من سلبياً مع miR-192، وهو ما لا يتوافق مع نموذج بسيط ومباشر لكبح الـ miRNA للهدف. وفي المقابل، أظهرت PLP1 وNRXN1 وKIF5C ارتباطات سلبية. تدعم هذه النتائج الأهمية البيولوجية للشبكة، ولكنها تشير إلى أنه لا يمكن استنتاج الاستهداف المباشر دون التحقق باستخدام لوسيفيراز (luciferase)، ومستوى البروتين، وتجارب الإنقاذ (rescue validation). يتفق هذا التفسير الحذر مع الطبيعة الاستكشافية لتحليلات شبكة الأهداف الحاسوبية (in silico)10,11.
كما يدعم التحليل المناعي ضرورة التفسير الحذر. أظهرت درجات التوقيع المناعي لـ RNA-seq في الورم أن تعبير miR-192 كان مرتبطاً سلبياً بعدة توقيعات مناعية، ومرتبطاً إيجابياً بشكل أساسي بتوقيعات الخلايا الحمضية (eosinophil) وخلايا Th17. كانت معظم هذه الارتباطات ضعيفة، حتى بعد تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ. ونظراً لأن طرق التوقيع المناعي تستنتج إثراء المسارات أو حالة الخلايا من بيانات التعبير الكلي، فإن هذه النتائج يجب أن تُعتبر استكشافية وتتطلب التحقق منها باستخدام طرق متعامدة لتحديد الملفات المناعية13.
تنطوي هذه الدراسة على عدة قيود. أولاً، كانت مجموعة التحقق المحلية صغيرة نسبياً ومستمدة من مركز واحد. ثانياً، استخدم تحليل مجموعة البيانات العامة والتحقق المحلي بواسطة qRT-PCR منصات ومستويات قياس مختلفة. ثالثاً، كانت عينات miRNA-seq الطبيعية من TCGA قليلة، مما حدّ من الاستنتاج التشخيصي. رابعاً، كانت تحليلات الجينات المحورية والاستجابة المناعية حاسوبية وتتطلب تحققاً تجريبياً. خامساً، اقتصرت التجارب الوظيفية المتاحة على بيانات التئام الجروح في خلايا HT29. وتبرر هذه القيود تقديم الدراسة كتحليل استكشافي متكامل بدلاً من تقديمها كدليل قطعي على أن miR-192-5p هو مؤشر حيوي تشخيصي أو إنذاري أو ميكانيكي معتمد في CRC6,8.
باختصار، يبدو أن miR-192-5p ذو صلة بيولوجية بسرطان القولون والمستقيم (CRC)، إلا أن نمط تعبيره والتفسير السريري له يتسمان بالتعقيد. أظهر تحليل TCGA/GDC إشارة أعلى لـ miR-192 في عينات أورام CRC، بينما أظهر تحليل qRT-PCR في مجموعة محلية من الأنسجة المقترنة تعبيراً أدنى لـ miR-192-5p الناضج. وأشار تحليل ROC إلى فصل استكشافي بين الورم والأنسجة الطبيعية، ولكنه كان محدوداً بسبب صغر حجم المجموعة الطبيعية في TCGA. ولم يُلاحظ أي ارتباط معنوي مع البقاء على قيد الحياة بشكل عام. وتوفر تحليلات الجينات المركزية (Hub-gene) والتحليلات المناعية أدلة تساعد في صياغة الفرضيات، كما تشير بيانات التئام الجروح في خلايا HT29 إلى أن زيادة تنظيم miR-192-5p قد تقلل من هجرة الخلايا. لذا، هناك حاجة إلى مجموعات مستقلة إضافية وتجارب مخبرية مستهدفة قبل اعتبار miR-192-5p مؤشراً حيوياً تشخيصياً أو إنذارياً أو ميكانيكياً معتمداً في سرطان القولون والمستقيم.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
يتوجه المؤلفون بالشكر إلى مختبر التشخيص الجزيئي للأورام بجامعة منغوليا الداخلية الطبية على الدعم الفني. تم دعم هذا العمل من خلال مشروع البحث العلمي التابع للجنة الصحة ببلدية يانتشينغ (منحة رقم YK2023101)، والتي قامت أيضاً بتمويل رسوم معالجة المقالة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25%+2:60 trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-054-1 | هضم/تمرير الخلايا |
| 10% ammonium persulfate | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8090 | كاشف SDS-PAGE |
| 10% sodium dodecyl sulfate | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SIS1070 | كاشف SDS-PAGE |
| 4x protein loading buffer | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1016 | تحضير عينة البروتين |
| مجمد فائق انخفاض الحرارة -80 C | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | تخزين العينات |
| كاشف Anti-Myc لإزالة الميكوبلازما | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | P-CMR-001 | تطهير الميكوبلازما |
| مجموعات بادئات ARL2 و BATF2 و MEN1 و beta-actin | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | بادئات mRNA qPCR |
| قارئ أطباق دقيقة أوتوماتيكي | PerkinElmer, USA | VICTOR Nivo | قياس الامتصاصية |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | تقدير كمية البروتين |
| خزانة سلامة بيولوجية / بنش نظيف | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | زراعة الخلايا في ظروف معقمة |
| غرفة عد الخلايا / مقياس كرات الدم | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd. | http://www.shqiujing.net/ | عد الخلايا |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Biosharp | BS350B | اختبار تكاثر الخلايا/السمية الخلوية |
| دوارق زراعة الخلايا، وأطباق الزراعة، وأنابيب الطرد المركزي، ورؤوس الماصات | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | مستهلكات عامة لزراعة الخلايا |
| طقم الكشف عن دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm | تحليل دورة الخلية/موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي |
| حضانة خلايا CO2 | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | زراعة الخلايا |
| أوليغونوكليوتيد con238 للتحكم السلبي | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | التحكم في عفن الخلايا (transfection) |
| برنامج Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | تصوير الوحدة الشبكية والجينات المركزية |
| مقلب مغناطيسي حراري رقمي | Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | تحضير المحاليل |
| فرن تجفيف بنفخ هواء حراري كهربائي | Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd. | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | دعم التجفيف/التعقيم |
| نظام الرحلان الكهربائي | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN 3 Cell | الرحلان الكهربائي للهلام |
| نظام النقل الكهربائي | Hoefer | TE77XP | نقل البروتين |
| مصل جنين البقر | Biological Industries | 04-001-1ACS | مكمل لزراعة الخلايا |
| جهاز قياس التدفق الخلوي | ACEA Biosciences | NovoCyte | قياس التدفق الخلوي |
| مجهر مقلوب فلوري | Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd. | https://www.sunny-instrument.com/en | تصوير الخلايا والجروح |
| بوابة GDC/TCGA | National Cancer Institute | Open-access database | بيانات عامة لـ miRNA-seq و RNA-seq والبيانات السريرية |
| قاعدة بيانات GEO | National Center for Biotechnology Information | GSE89076 and GSE156355 | مجموعات بيانات التعبير الجيني العامة |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9 | التحليل الإحصائي والرسم البياني |
| جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة | Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | تحضير العينات |
| خلايا HT29 | Authors' laboratory cell stock | Not applicable | خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري |
| برنامج تحليل الصور | ImageJ | Not applicable | تقدير عرض الجرح كمياً |
| نظام التصوير | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon-5200 | تصوير الهلام/اللطخة |
| نظام IncuCyte S3 للمراقبة الديناميكية للخلايا والتحليل الوظيفي | Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd. | IncuCyte S3 | تصوير الخلايا الحية/التحليل الوظيفي |
| حمام مائي حراري ذكي | Leica | HI1210 | حضن تحت التحكم في درجة الحرارة |
| الفيروسات البطيئة (Lentivirus) وكاشف العدوى | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | نقل الجينات المستقر للخلايا |
| ماصات يدوية | Gilson | PIPETMAN P | التعامل مع السوائل |
| وسط McCoy's 5A الأساسي | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150710 | وسط زراعة خلايا HT29 |
| جهاز طرد مركزي طبي | Zhuhai manufacturer not specified | 3200 | تحضير العينات |
| ثلاجة-مجمد طبي | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | تخزين الكواشف/العينات |
| ركيزة Meilunbio Fixer Supersensitive ECL Chemiluminescence | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | MA0186 | كشف اللطخة المناعية |
| جهاز طرد مركزي صغير | Beijing DLAB Scientific Co., Ltd. | https://www.dlabsci.com/ | تحضير العينات |
| مجموعات بادئات miR-192-5p و U6 | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | Custom synthesized | بادئات miRNA qPCR |
| محاكي miR-192-5p | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | أوليغونوكليوتيد لعفن الخلايا العابر |
| miRcute Enhanced miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | KR211 | النسخ العكسي لـ miRNA |
| miRcute Enhanced miRNA Fluorescence Quantitation Kit (SYBR Green FP) | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | FP411 | miRNA qPCR |
| miRWalk | Public database | Web database | قاعدة بيانات التنبؤ بأهداف miRNA |
| غشاء نيتروسليلوز | Millipore | HATF00010 | غشاء نقل البروتين |
| حليب جاف خالي الدسم | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8340 | كاشف حجب لللطخة المناعية |
| أنسجة سرطان القولون والمستقيم المتزاوجة والأنسجة المجاورة غير السرطانية | Authors' institution | Not applicable | عينات سريرية |
| أنابيب PCR | Corning | PCR-02-C | إعداد PCR/qRT-PCR |
| محلول بنسيلين-ستريبتومايسين | Biological Industries | 03-031-1B | مضاد حيوي لزراعة الخلايا |
| PerfectStart Uni RT&qPCR Kit | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | AUQ-01 | النسخ العكسي لـ mRNA و qPCR |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | محلول غسيل الخلايا |
| مؤشر بروتين مصبوغ مسبقاً | Fermentas | 26619 | مؤشر الوزن الجزيئي للبروتين |
| نظام تحضير المياه النقية | China Moer | Not available | تحضير المياه النقية |
| بوروميسين (Puromycin) | Phygene | PH1143 | اختيار الخلايا المنقولة جينياً |
| برنامج R | R Foundation for Statistical Computing | Version 3.6.3 | التحليل الإحصائي والمعلوماتية الحيوية |
| محلول نقل سريع | Crisbio | Not applicable | النقل الكهربائي للبروتين |
| نظام PCR الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي | Applied Biosystems (ABI), USA | Not available | كشف qRT-PCR |
| محلول RIPA لتحليل الخلايا | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 | استخلاص البروتين |
| أنابيب طرد مركزي دقيقة خالية من RNase | Corning | 3208 | التعامل مع RNA |
| وسط حفظ الخلايا بالتبريد الخالي من المصل | New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | حفظ الخلايا بالتبريد |
| SPSS Statistics | IBM | Version 25 | التحليل الإحصائي |
| مخفف أجسام مضادة مستقر | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Not applicable | تخفيف الأجسام المضادة الأولية/الثانوية |
| رؤوس ماصات معقمة | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | TP-10-C | أداة خدش التئام الجروح |
| قاعدة بيانات STRING | STRING Consortium | Web database | تحليل شبكة تفاعل البروتينات |
| TEMED | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8090 | كاشف SDS-PAGE |
| TransZol Up | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | ET111-01 | استخلاص RNA |
| محلول Tris-HCl المنظم، pH 6.8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1020 | محلول منظم لهلام التجميع في SDS-PAGE |
| محلول Tris-HCl المنظم، pH 8.8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1010 | محلول منظم لهلام الفصل في SDS-PAGE |
| Tween-20 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8220 | كاشف غسيل لللطخة المناعية |
| معقم بخاري بالضغط الرأسي | Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp. | BXM-30R | التعقيم |
المراجع
- Sung, H. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 69 (1), 7-34 (2019).
- Issa, I. A., Noureddine, M. Colorectal cancer screening: an updated review of the available options. World J Gastroenterol. 23 (28), 5086-5096 (2017).
- Song, L., Jia, J., Peng, X., Xiao, W., Li, Y. The performance of the SEPT9 gene methylation assay and a comparison with other CRC screening tests: a meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 3032 (2017).
- Linnekamp, J. F., Wang, X., Medema, J. P., Vermeulen, L. Colorectal cancer heterogeneity and targeted therapy: a case for molecular disease subtypes. Cancer Res. 75 (2), 245-249 (2015).
- Sveen, A., Kopetz, S., Lothe, R. A. Biomarker-guided therapy for colorectal cancer: strength in complexity. Nat Rev Clin Oncol. 17 (1), 11-32 (2020).
- Whiffin, N. et al. Identification of susceptibility loci for colorectal cancer in a genome-wide meta-analysis. Hum Mol Genet. 23 (17), 4729-4737 (2014).
- Ballman, K. V. Biomarker: predictive or prognostic? J Clin Oncol. 33 (33), 3968-3971 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Forterre, A., Komuro, H., Aminova, S., Harada, M. A comprehensive review of cancer microRNA therapeutic delivery strategies. Cancers (Basel). 12 (7), 1852 (2020).
- Ren, F. J., Yao, Y., Cai, X. Y., Fang, G. Y. Emerging role of miR-192-5p in human diseases. Front Pharmacol. 12, 614068 (2021).
- Nagy, Z. B. et al. Colorectal adenoma and carcinoma specific miRNA profiles in biopsy and their expression in plasma specimens. Clin Epigenetics. 9, 22 (2017).
- Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14 (1), 7 (2013).
- Staiteieh, S. A. et al. Study of microRNA expression profiling as biomarkers for colorectal cancer patients in Lebanon. Mol Clin Oncol. 16 (2), 39 (2022).
- Przygodzka, P. et al. Regulation of miRNAs by Snail during epithelial-to-mesenchymal transition in HT29 colon cancer cells. Sci Rep. 9 (1), 2165 (2019).
- Sun, C. Y., Zhang, X. P., Wang, W. Coordination of miR-192 and miR-22 in p53-mediated cell fate decision. Int J Mol Sci. 20 (19), 4768 (2019).
- Zhao, L., Wang, B., Sun, L., Sun, B., Li, Y. Association of miR-192-5p with atherosclerosis and its effect on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Mol Biotechnol. 63 (12), 1244-1251 (2021).