قياس تأثيرات المركبات الدوائية على شكل الميتوكوندريا في نماذج شيخوخة الفئران

ملخص

يصف هذا البروتوكول طرق قياس تأثير الأدوية التي تعطى عبر مضخات أسموزية صغيرة قابلة للزرع على شكل الميتوكوندريا في نماذج الفئران المتقدمة في السن. يتم إجراء تصوير كونفوكلي فائق الدقة ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) لكبد الفئران، وتم تطوير خط أنابيب للتقسيم غير المتحيز، والتصنيف، والتحليل الكمي لهياكل الميتوكوندريا.

الملخص

يمكن أن يساهم تراكم الضرر الجزيئي المرتبط بالشيخوخة في تغيرات في شكل الميتوكوندريا وخلل الأيض، خاصة في الأنسجة ذات الاستهلاك العالي للطاقة. المركبات الدوائية التي تحسن خلل الأيض وتعيد الأشكال الميتوكوندرية الصحية والشابة قد تمثل بذلك طرقا فعالة لتمديد فترة الصحة (أي الجزء من عمر الفرد الذي يحمل عبء الأمراض المزمنة المرتبطة بالشيخوخة) في الثدييات. هنا، تم وصف طرق إجراء زرع المضخات الأسموزية تحت الجلد في الفئران المسنة لتوصيل مستقر للمركبات الدوائية الكارهة للماء. بعد ذلك، يتم تثبيت الأنسجة، وتقسيمها بالتبريد، وتلوينها، وتصويرها باستخدام مجهر الضوء الكونفوكلي فائق الدقة. وأخيرا، يتم تقديم خط أنابيب آلي للتقسيم ثلاثي الأبعاد، والتصنيف، والقياس الكمي لهياكل الميتوكوندريا. لذا، قد تكون هذه الطرق مفيدة لتقييم التغيرات الكمي في بنية الميتوكوندريا ثلاثية الأبعاد في الأنسجة المختلفة عبر عمر الفأر. علاوة على ذلك، قد تساعد هذه التقنيات في التعرف المتكرر على الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة التي تخفف من خلل الأيض المرتبط بالشيخوخة.

المقدمة

الميتوكوندريا هي عضيات مزدوجة مرتبطة بالغشاء وتنظم مكانيا وزمانيا لتتناسب مع المتطلبات الأيضية الحالية لخلية المضيف وأنسجها¹. تتشكل وتنظم التداخلات في الغشاء الداخلي، والتي تسمى الكريستاي، من خلال تنسيق ديناميكي بين الفوسفوليبيدات الغشية الداخلية غير ثنائية الطبقة مثل كارديوليبين وفوسفاتيديل إيثانولامين، وصفوف من دايمرات ATP سينثاز عند أطراف الكريستا، أوليغومرات الارتباط بالقلبيات في ضمور بصري 1 (OPA1) الشبيه بالدينامين في قمة الكريستاي، ومجمعات موقع الاتصال الميتوكوندري ونظام تنظيم الكريستاي (MICOS) عند التقاطعات¹. تقوم هذه الهياكل الغشائية الداخلية بتقسيم الميتوكوندريا إلى وحدات وظيفية فردية² وتوفر مساحة سطح أكبر يمكن أن تتجمع عليها المركبات التنفسية المنتجة لجهد الميتوكوندريا عبر الغشاء¹. باعتبارها عضيات ديناميكية ذات وظائف خلوية ثانوية مرتبطة بالإشارات المبوتة³، وCa²⁺ ونوع الأكسجين التفاعلي³، وتخليق الدهون⁴، فإن الهياكل الشكلية للمیتوكوندريا حساسة للغاية للتغيرات البيئية مثل انخفاض توفر الأكسجين⁵ وزيادة إطلاق Ca²⁺ من الشبكة الإندوبلازمية ^6,7.

تساهم تراكم الضرر الجزيئي في تغييرات في بنية ووظيفة الميتوكوندريا خلال سن^{الثامنة}. أظهرت الدراسات الرائدة بالتصوير المقطعي بالإلكترون البارد (cryo-ET) التي أجرتها مجموعة كولبرانت عبر عدة كائنات نموذجية وجود ارتباط واضح بين كثافة الكريستا وقدرتها على التنفس، بالإضافة إلى انخفاض يعتمد على العمر في كثافة الكريستا وفقدان ديمرات ATP synthase ^9,10. علاوة على ذلك، يمكن أن تنتج تغيرات في حجم الميتوكوندريا عن ضعف ديناميكيات الانشطار والاندماج¹¹، وزيادة تراكم الدهون¹²، وزيادة التورم¹³. في العضلات العظمية، يمكن التنبؤ بدقة ب VO₂ max، وهو مؤشر قوي على متوسط العمر المتوقع^14,15، بناء على درجة تجزئة الميتوكوندريا بين العضلات الميتوكوندرية وكثافة الكريستاي¹⁶.

ليس من المستغرب أن التغيرات الهيكلية والوظيفية المرتبطة بالشيخوخة في الميتوكوندريا يمكن أن تساهم في نشوء عدة أمراض مزمنة 17,18,19,20. يرتبط تزايد تجزئة الميتوكوندريا والتغيرات في تكوين الميتوكوندريا البيولوجي وشكلها بكل من مرض الزهايمر^ومرض باركنسون. تؤدي هذه التغيرات إلى اضطرابات في مجمعات الفسفرة التأكسدية، مما يعيق توليد القوة الدافعة للبروتون ويؤدي إلى إنتاج مفرط لأنواع الأكسجين التفاعلي 20,21,22. في اضطرابات القلب المرتبطة بالشيخوخة وفشل القلب، يساهم زيادة تجزئة الميتوكوندريا، والتورم، والتهوية، وفقدان كثافة الكريستا في انخفاض إنتاج ATP^23,24. قد تكون هذه التغيرات الهيكلية مرتبطة جزئيا بتغير معالجة Ca²⁺ للميتوكوندريا وزيادة نشاط مسام الانتقال النفاذية 6,7,13,25. وباعتباره منظما محتملا للانقسام الفموتي، فإن الفتح المفرط لمسمة انتقال النفاذية أثناء التقدم في العمر قد يكون مدرا ويؤدي إلى موت الخلايا غير المنضبط¹³. وأخيرا، من المعروف أن العجز المرتبط بالشيخوخة في أيض الدهون الميتوكوندرية والانقسام الفموي يمكن أن يساهم أيضا في تطور مرض الكبد الدهني غير الكحولي²⁶. على وجه الخصوص، ثبت أن التعقيم الكبدي يصاحبه زيادة في الإجهاد التأكسدي وزيادة تكوين هياكل ميتوكوندرية شبيهة بالدونات ^3,27.

وبالتالي، هناك اهتمام كبير بتطوير علاجات تستهدف التدهور المرتبط بالشيخوخة في وظيفة الميتوكوندريا لتحسين جودة حياة الأفراد الذين يعانون من أمراض مزمنة معينة. الفورزينيتي (إيلاميبريتايد)، ببتيد تفاعلي مع الدهون يخفف من جهد سطح الغشاء الداخلي²⁸ ويزيد من توليد ATP الميتوكوندري^29,30، أصبح مؤخرا أول دواء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج متلازمة بارت. متلازمة بارث هي اضطراب مرتبط ب X حيث تساهم عيوب في إعادة تشكيل القلب في القلب، وضعف العضلات الهيكلية، والوفيات المبكرة³¹. على الرغم من أن العلاج قصير الأمد فشل في تحقيق تغييرات ملحوظة في العمر البيولوجي للعضلات لدى الفئران المسنة³²، إلا أن علاج الإيلامبريتايد أظهر تحسنا متكررا في المعايير الوظيفية للشيخوخة، مثل نسبة انبعاث القلب والإجهاد الطولي العالمي^32,33، وإرهاق العضلات وتوليد القوة 33,34,35، والضعف³². أظهر يوروليثين A، وهو نوع من الإيلاجيتانين المستخرج من الأمعاء ويسبب الانقسام الميتوفاجي³⁶، تحسنا سريريا في تحمل وقوة العضلات الهوائية^37,38، بالإضافة إلى تأثيرات إيجابية على اضطرابات القلب في نماذج الفئران والفئران المسنة لفشل القلب المستحث³⁹. الميتفورمين، وهو دواء مضاد للسكري ثبت أنه يتفاعل مع المجمع I⁴⁰، اقترح أيضا أنه يعمل كمحاكي جزئي لتقييد السعرات^{الحرارية 41,42}. ومع ذلك، بينما ارتبط علاج الميتفورمين بانخفاض خطر السرطان وتراجع معرفي متأخر في البيانات الوبائية السابقة^43,44، فإن تأثيراته على الصحة وعمر المرضى غير المصابين بالسكري لا^{تزال سؤالا} مفتوحا. أخيرا، يمكن للعلاج بنيكوتيناميد ريبوسيد، وهو مقدمة NAD+، أن يرفع من تنظيم تكوين الميتوكوندريا البيولوجي واستجابة البروتين المفتوح للميتوكوندريا لتحسين توليد الطاقة 46,47,48,49، لكن علاجه طويل الأمد في فئران UM-HET3 لم يكن له تأثير كبير على متوسط عمر الفأر أو النسبة المئوية^{90 50}.

هنا، توصف طرق لتحضير أنسجة من فئران مسنة معالجة بمركبات دوائية لتصوير كونفوكالي فائق الدقة لمورفولوجيا الميتوكوندريا. تم إثبات نجاح زرع مضخات أسموزية صغيرة لتوصيل الدواء بشكل مستمر في الفئران، وتم تحليل الكبد لتحديد تأثيرات العلاج على بنية الغشاء الخارجي. أخيرا، يتم تقديم خط تحليل للقياس الكمي غير المتحيز والقابل للتكرار لحجم الميتوكوندريا ومساحة السطح والكروية، بالإضافة إلى تصنيف الميتوكوندريا إلى هياكل مختلفة. لذا، فإن هذه الطرق قابلة للتطبيق على دراسة التغيرات في شكل الميتوكوندريا عبر عمر الثدييات وعلى تحديد المركبات الدوائية التي قد تخفف من التدهورات المرتبطة بالشيخوخة في صحة الأيض.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات البحثية وفقا للإرشادات المؤسسية لاستخدام الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة عليها من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى بريغهام والنساء وكلية الطب بجامعة هارفارد بموجب البروتوكول رقم 2016N000368. ينبغي للباحثين المهتمين بتطبيق هذا البروتوكول في دول أخرى استشارة هيئاتهم المؤسسية والتنظيمية المحلية لضمان الامتثال للوائح رفاهية الحيوان المعمول بها.

1. انغراس مضخة الأسموزية تحت الجلد

ملاحظة: يجب إجراء جراحات الحيوانات فقط من قبل موظفين ذوي خبرة وتدريب، ويجب توخي العناية الكبيرة لتقليل التوتر و/أو معاناة الحيوان. قم بإجراء الإجراءات المتعلقة بالحيوانات البحثية فقط كما هو موضح بدقة في بروتوكولات الحيوانات المعتمدة. يجب أن تلتزم جميع الأبحاث المتعلقة باستخدام الحيوانات بدقة بمعايير 3R – الاستبدال، التخفيف، والتنقيح. يوضح هذا البروتوكول عملية زرع مضخة الأسموزية تحت الجلد، والتي تصنف كإجراء جراحي بسيط. يمكن أيضا إجراء زرع مضخة أسموزية داخل الصفاق، لكن هذا إجراء أكثر تعقيدا ويصنف كإجراء جراحي رئيسي. لذلك، يوصى بإجراء العملية تحت الجلد ما لم يكن هناك مبرر علمي قوي يفضل الزرع داخل الصفاق.

1. ملء المضخات الأسموزية
   ملاحظة: يجب إجراء تحضير محاليل الأدوية وملء المضخات الأسموزية في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنية التعقيم. يجب اختيار نماذج المضخات بناء على حجم الخزان المطلوب وطول تسليم المعالجة. في هذه الدراسة، تم استخدام النموذج 2004 (~200 ميكرولتر حجم خزان، تسليم المعالجة لمدة 4 أسابيع).
   1. تحضير محلول الدواء في مذيب متوافق مع المضخات الأسموزية. راجع https://alzet.com/formulating-the-solution/. استخدم معدل التدفق (μL/h) المدرج على دفعة المضخات الأسموزية المطلوبة لتحديد تركيز الدواء المطلوب لتحقيق الجرعة اليومية المستهدفة.
      ملاحظة: محلول يحتوي على 50٪ v/v DMSO و50٪ v/v PEG₃₀₀ يذيب المركبات الكارهة للماء بشكل مستقر ويتوافق مع المضخات الأسموزية. يجب أن تكون جميع المركبات والمذيبات من الدرجة الصيدلانية عندما يكون ذلك ممكنا.
   2. قم بتعقيم محلول الدواء من خلال فلتر حقن بحجم 0.22 ميكرومتر وحافظ على درجة حرارة الغرفة.
   3. ضع مهدئ تدفق في مضخة وادفعه للأسفل حتى يتناسب مع أنبوب الميكروفوج. لا تضغط على معدل التدفق إلى الأسفل بالكامل.
   4. قم بإجراء توازن تحليلي على أنبوب ميكروفوج فارغ، ثم سجل وزن المضخة الأسموزية.
   5. اربط أنبوب التعبئة بحقنة بسعة 1 مل واسحب على الأقل 1.5 ضعف حجم الخزان في المضخة. قم بإزالة فقاعات الهواء عن طريق سحب المكبس للأسفل، وتحريك الحقنة، ودفعها للأعلى حتى يتكون سائل في أعلى أنبوب التعبئة.
   6. قم بإزالة مراقب التدفق أثناء إبقاء المضخة بشكل مستقيم.
   7. أدخل أنبوب التعبئة من خلال الفتحة في أعلى المضخة حتى لا يستطيع التقدم أكثر.
   8. ادفع المكبس ببطء للأسفل مع إبقاء المضخة في وضع مستقيم. استمر في التعبئة حتى يظهر المحلول عند المقبس. ثم أزل أنبوب الحشو وامسح المحلول الزائد بمسح دقيق.
   9. أدخل جهاز التخفيف حتى يصبح الغطاء مستويا لأعلى المضخة.
   10. أعد المضخة المملوءة إلى أنبوب ميكروفوج وزنه. حدد وزن المحلول وتحقق من أن حجم التعبئة لا يقل عن 90٪ من حجم الخزان (فرق الوزن بالمليغرامات ≈ الحجم بالميكرولتر).
   11. املأ أنبوبا مخروطيا بسعة 15 مل بسعة 5 مل من محلول ملحي معقم 1× فوسفات (PBS) وأضف المضخة المملوءة مسبقا. أغلق بطبقة بارافين وقم بتهيئة المضخة (أو المضخات) عن طريق حضانها عند 37 درجة مئوية للفترة المطلوبة من نموذج مضخات الأسموز. بالنسبة لموديل 2004، هذا هو 40 ساعة.
2. تحضير الميلوكسيكام
   ملاحظة: يجب إجراء ذلك في خزانة سلامة حيوية باستخدام تقنية التعقيم. ميلوكسيكام، وهو دواء مضاد للالتهابات غير ستيرويدي (NSAID)، ليس مادة خاضعة للرقابة لكنه قد يتطلب الحصول على ترخيص مواد خاضعة للرقابة.
   1. باستخدام إبرة 27-G وحقنة Luer-lok بسعة 3 مل، يتم تخفيف مخزون الميلوكسيكام بسعة 5 ملغ/مل إلى 1 ملغ/مل باستخدام PBS معقمة في قارورة زجاجية معقمة بسعة 5 مل. حضر يوم التحضير وخزنها في درجة حرارة الغرفة.
3. تجهيز موقع الجراحة
   ملاحظة: ليس من الضروري إجراء زرع مضخة أوزموزية داخل خزانة السلامة البيولوجية، ولا يمكن الحفاظ على التعقيم أثناء الإجراءات الجراحية. ومع ذلك، يجب على موقع الجراحة الالتزام بمعايير النظافة الصارمة والممارسات المعقمة. يجب أن يكون موقع الجراحة نظيفا، خاليا من الفوضى، وأن يكون فيه حركة مرور قليلة للمشاة. من الناحية المثالية، يوجد موقع تحضير (أي للحلاقة والفرك) وموقع للجراحة (أي لإجراء زرع المضخة).
   1. قم بتعقيم منطقة الجراحة بالكامل بنسبة 70٪ إيثانول وامسح التنظيف بمناشف ورقية.
   2. شغل معقم الزجاج واضبطه على 250 درجة مئوية. اتركها تسخن لمدة 15–30 دقيقة.
   3. شغل جهاز التبخير واضبط وسادة التدفئة على 65٪. اضبط وزن جسم الحيوان واضبط نسبة الإيزوفلوران إلى 3.2٪.
   4. قم بلصق أحد مجسات الحرارة على سطح وسادة التسخين. دع وسادة التدفئة تسخن إلى 35–37 درجة مئوية.
   5. أزل حقنة التبخير. ادفع اللسان الأخضر بالكامل واملأه بالإيزوفلوران عن طريق توصيله بزجاجة إيزوفلوران وسحب المكبس للخلف.
   6. أعد توصيل الحقنة بجهاز التبخير وابدأ الحقنة بتحضير الحقنة.
   7. ضع وسادة تدفئة ثانية تحت قفص حيوان نظيف للتعافي. ضع القفص نصفه على الوسادة ونصف خارج وسادة التدفئة.
4. زرع المضخة
   ملاحظة: يجب تنظيف جميع الأدوات الجراحية وتعقيم جميع الأدوات الجراحية مسبقا. لتعقيم الأدوات الجراحية بين الحيوانات، يمكن استخدام معقم خرز زجاجي. يمكن استخدام هذا فقط لدفعات تصل إلى 5 حيوانات. تأكد من تضمين شريط مؤشر الأوتوكلاف للتحقق من استيفاء معايير التعقيم. تشمل معدات الحماية الشخصية المناسبة معطف مختبر نظيف، وقناع جراحي، وقفازات جراحية معقمة، وغطاء للشعر. الحيوانات التي تخضع للجراحة لا ينبغي أن تكون في نظر الحيوانات الأخرى.
   1. أمسك الفأر من قاعدة الذيل وضعه في غرفة التخدير. قم بفك الأنابيب وشغل تدفق الإيزوفلوران (3.2٪) إلى الحجرة. ضع لوحين من الستائر المعقمة فوق وسادة التدفئة.
   2. انتظر حتى يدور الفأرة على جانبها وراقب تنفسه. عندما يتباطأ التنفس ويصبح مرتخيا، توقف تدفق الإيزوفلوران إلى الحجرة. قم بتثبيت الأنابيب على الحجرة وفك الأنابيب من مخروط الأنف لاستخدامها. ابدأ تدفق الإيزوفلوران (2٪) إلى مخروط الأنف.
   3. استرجع الفأر من الحجرة وضع أنفه في مخروط الأنف على وسادة التدفئة. أضف مرهم العيون لكلتا العينين.
   4. زن الفأر على ميزان ثم عد إلى مخروط الأنف. حدد حجم 1 ملغ/مل ميلوكسيكام الذي سيتم إعطاؤه. للحصول على جرعة 5 ملغ/كجم، اضرب وزن الفأر بالغرامات في 5 للحصول على ميكرولتر من الميلوكسيكام الذي سيتم إعطاؤه.
   5. رش غطاء القارورة بسعة 1 ملغ/مل ميلوكسيكام بنسبة 70٪ إيثانول، وامسح حتى تجف بمسح دقيق. ثم، باستخدام حقنة أنسولين بسعة 0.3 مل، اسحب الحجم الصحيح من الميلوكسيكام. أزل جميع فقاعات الهواء من الحقنة.
   6. امسك/قيد الفأر بيد واحدة، مع ميل الرأس للأسفل. أدخل الإبرة بزاوية 30°–45° في الربع السفلي الأيمن من البطن مع توجيه الحافة للأعلى. قم بسحب السحب للتأكد من المكان الصحيح للإبرة.
   7. إذا لم يلاحظ أي استنشاق، اضغط بسلاسة على المكبس وحقن الميلوكسيكام داخل الصفاق.
   8. أعد الفأرة إلى مخروط الأنف ووسادة التسخين. احلق بالكامل 150٪ من المنطقة المحيطة بموقع الزرع (منتصف إلى أعلى الظهر) باستخدام ماكينة قص جراحية. بعد الانتهاء، قم بتنظيف الشعر بلطف عن الحيوان وتخلص من أول غطاء للدر.
      ملاحظة: الحلاقة النظيفة ضرورية لإجراء الجراحة المعقمة. على الأقل، يجب أن يكون أي شق خاليا تماما من شعر حيواني.
   9. ضع الفأر بحيث يكون رأسه مواجها للجراح. قم بفرك متبادلي باستخدام بوفيدون-يودين و70٪ إيثانول، باستخدام أجهزة تطبيق ذات رؤوس قطنية، ليصبح المجموع 3 تطبيقات. تأكد من البدء في منتصف الشق المخطط له وقم بالدوران للخارج باستخدام المطبقات ذات الأطراف القطنية.
   10. غط الحيوان بستائر جراحية معقمة ومربوطة بالفيناد واستخدم تقنية معقمة صحيحة لارتداء قفازات جراحية.
   11. قبل إجراء أي شقوق، تأكد من فحص ردود فعل الدواسات بدقة عن طريق قرص القدمين بقوة باستخدام ملقط الأنسجة. لا تتابع حتى بعد عدة ضغطات، لا يوجد أي حركة. هذا يؤكد وجود طائرة جراحية للتخدير.
   12. قم بتثبيت الجلد الأوسط بملقط نسيجي وقم بعمل شق بقطر 1 سم عمودي على العمود الفقري باستخدام مقص جراحي صغير من نوع القزحية. لعمل قطع مستقيم، اقطع بالمقص الجراحي من نوع Iris بزاوية 90° إلى الفأرة.
   13. استخدم ملقط دموي صغير داخل الشق لنشر الأنسجة تحت الجلد وإنشاء جيب للمضخة. تأكد من أن جيب المضخة بعيد عن مقدمة الحيوان وموضوعه قليلا إلى جانب واحد من الحيوان. استخدم ملقط الهيموستاتيك لتخفيف الجلد من جميع جوانب الشق.
   14. افتح الشق باستخدام الملقط النسيلي وأدخل المضخة باستخدام ملقط دموي. أدخل المضخة مع إدخال مهدئ التدفق أولا.
       تحذير: يجب إدخال المضخة بحيث تكون بعيدة بما فيه الكفاية عن الشق، أي بحيث لا يكون الجلد المحيط بالشق تحت التوتر. إذا لم يتم وضعه بشكل صحيح، فقد يؤدي ذلك إلى انفصال الجرح. قد تغير المضخة أيضا موضعها أثناء تعافي الحيوان.
   15. باستخدام الملقط النسيج، قم برفع الجلد بلطف واسحب جانبي الجرح معا. بدءا من أحد طرفي الشق، استخدم مشابك المشبك لوضع مشابك ملفوفة بقطر 7 مم على طول الشق بأكمله (قد تكون هناك حاجة إلى 2–4 مشابك).
   16. لأي فجوات في الشق صغيرة جدا بحيث لا يمكن وضعها بواسطة مشبك جرح آخر، ضع كمية صغيرة من لاصق النسيج باستخدام أداة التطبيق المعقمة. اضغط بقوة بالملقط النسجي.
   17. اسحب ومطد الجلد حول الشق بلطف للتأكد من إغلاق الجرح. ثم أغلق تدفق الأيزوفلوران إلى مخروط الأنف واربط الأنابيب المعنية. ضع الفئران في قفص التعافي على وسادة التدفئة.
   18. راقب الفأر بالكامل حتى يستيقظ ويصبح قادرا على التنقل. راقب الحيوانات بشكل متكرر بحثا عن أي علامات ضيق أو ألم، واحتفظ بها معزولة عن الفئران الأخرى حتى تتعافى.
   19. بعد 24 ساعة، أعد إعطاء 5 ملغ/كغ من الميلوكسيكام عبر الحقن داخل الصفاق. (اختياري) للمساعدة في تعافي الحيوانات، قدم مكملات إلكترو-جيل، و/أو ضع الطعام على أرضية القفص.
   20. بعد 10–14 يوما، تخدير الحيوانات مرة أخرى بالإيزوفلوران، وضع مرهم العيون، وإزالة المشابك باستخدام مزيل المشابك.
       ملاحظة: يجب إزالة المشابك بحلول هذه الفترة الزمنية لتجنب نمو الشعر مرة أخرى فوق مشابك الجرح. أيضا، جميع المضخات الأسموزية لها فترة زمنية محددة. تأكد من إزالة المضخات من المضخة أو القتل الرحيم للحيوانات بنهاية فترة الخدمة. لفترات العلاج الطويلة، قد يتم إجراء زراعة مضخات متعددة متتالية على نفس الحيوان.

2. تثبيت، وتضمين، وتقسيم الأنسجة

1. تثبيت الأنسجة
   ملاحظة: يجب أن يتم إجراء جميع إجراءات الحيوانات بواسطة أفراد ذوي خبرة لتقليل التوتر والمعاناة على الحيوان. يجب تنظيف غرفة القتل الرحيم وإلقائها فعليا بين كل حيوان لإزالة أي ثاني أكسيد الكربون المتبقي. لتقليل التوتر، يجب إعدام الحيوانات في أقفاصها المنزلية عندما يكون ذلك ممكنا. وأخيرا، لا ينبغي قتل الحيوانات في مكان قريب من فئران أخرى أو في مرأى منها. الأدوات الجراحية النظيفة مطلوبة للإجراءات غير القابلة للبقاء، لكنها لا تحتاج إلى أن تكون معقمة (أي معقمة التعميم).
   1. ضع الفأرة في غرفة الحث وافتح المنظم حتى يصل مقياس التدفق إلى معدل التدفق المقصود (~40٪–70٪ من حجم الحجرة في الدقيقة).
   2. راقب الفأر طوال العملية، مع التأكد من عدم وجود علامات ضيق مثل القفز. راقب توقف النشاط التنفسي، وحافظ_{على تدفق ثاني} أكسيد الكربون لمدة لا تقل عن دقيقتين بعد توقف النشاط التنفسي. تأكد من أن إجمالي مدة التعرض لثاني أكسيد الكربون_{2 لا} يقل عن 5 دقائق.
   3. استرجع الفأر ونفذ طريقة قتل رحيم ثانوية مثل خلع عنق الرحم.
   4. ثبت أطراف الحيوان على قطعة من رغوة البوليسترين مغطاة بورق الألمنيوم باستخدام إبر 23-G. بلل الفرو برش 70٪ إيثانول.
   5. قم بعمل شق صغير بالقرب من قاعدة البطن واقطع الجلد حتى الرقبة. اتبع نفس الشق لفتح تجويف الجسم وقطع القفص الصدري بحذر.
   6. قم بعمل شقوق على شكل حرف U تبدأ من قاعدة البطن وثبت الجلد بدبوس باستخدام إبر 23-G.
   7. قم بتشريح الأعضاء (الأعضاء) المعنية وضعها في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل مملوء مسبقا ب 5 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). تثبيت على 24 ساعة عند 4 درجات مئوية على شواء مشوار.
      تحذير: حل PFA خطير. تجنب ملامسة الجلد. تشمل معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء التعامل معطف مختبر وقفازات نيتريل ونظارات أمان.
      ملاحظة: إذا كان يجب أن يحقن الدم من الأنسجة، و/أو إذا كان هناك حاجة لتثبيت التروية، قم بإجراء التروية القلبية كما هو موضح سابقا⁵¹. في تثبيت الغمر، كما يتم هنا، قد يستغرق الأمر وقتا حتى ينتشر المثبت عبر الأنسجة، خاصة في القطع الكبيرة من الأنسجة. قد يغير هذا شكل الميتوكوندريا؛ علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي التثبيت على PFA أيضا إلى انكماش الأنسجة⁵².
   8. بعد 24 ساعة، أزل محلول بارافورمالديهايد وشطف الأنسجة بسعة 10 مل من 1× PBS. قم بأداء اللعبة 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة على قطعة شواية.
   9. قم بإزالة PBS واغمر الأنسجة في 10 مل من السكروز بنسبة 30٪ لمدة 48 ساعة على درجة حرارة 4 درجات مئوية على شواء الدوارة. يكتمل تسرب السكروز عندما تغوص الأنسجة.
      ملاحظة: للتحقق من أن المذيب تم توصيله للحيوان، قس الكمية المتبقية في المضخة.
2. تضمين الأنسجة
   ملاحظة: تأكد من تتبع موقع الأنسجة ووضعها في القوالب.
   1. املأ وعاء رغوة من البوليسترين بالثلج الجاف وضع صفيحة معدنية مسطحة فوقها.
   2. ضع القوالب فوق صفيحة معدنية واملأ 2/3–3/4 إلى الأعلى بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) (وسط تثبيت الأنسجة). أحضر أي فقاعات هواء إما إلى السطح أو إلى الزوايا باستخدام ملقط دقيق. لتسريع معدل التجمد، ضع بعض حبيبات الثلج الجاف مباشرة على القوالب.
   3. ضع وسط تثبيت النسيج في قارب وزن وامزج الأنسجة فيه. حاول تجنب حمل أي من محلول السكروز.
   4. بمجرد أن يتجمد وسط النسيج تماما في قاع القالب (يجب أن يكون معتما تماما)، اغمر النسيج داخل القالب بحيث لا يلمس أي جانب من القالب أو السطح. وضعه في الموقع والاتجاه المطلوب.
   5. انتظر حتى يتجمد وسط التثبيت تماما قبل نقل القوالب إلى فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين الأنسجة المدمجة لمدة لا تقل عن 3 أشهر.
3. تقسيم الأنسجة
   ملاحظة: لتقليل التفاوت في سمك القطع من دفعة إلى أخرى، يجب تقسيم جميع الأنسجة التي سيتم تحليلها معا في جلسة واحدة.
   1. استرجع المناديل المدمجة من الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية وضعها في حاوية رغوة بوليسترين مملوءة بالثلج الجاف.
   2. قم بتبريد درجة حرارة غرفة التجميد وحامل العينة إلى -24 درجة مئوية و-25 درجة مئوية على التوالي.
   3. ضع شفرة ميكروتوم جديدة في حامل الشفرة، وأدخل لوح مقاومة الدوران. لتسهيل التنظيف، قم بتبطين غرفة التجميد بمناديل ورقية.
   4. أزل الشاك العينة من غرفة الكريوستات ودفأه إلى درجة حرارة الغرفة.
   5. استخدم شفرة حلاقة لتقطيع كل زاوية من قالب النسيج بعناية. قم بفكه بلطف لإزالة كتلة الوسط المغروسة بالنسيج.
   6. اضغط كتلة النسيج بقوة على الشاك أثناء اللف ذهابا وإيابا. بعد الالتصاق بإحكام، ضع العينة في غرفة التجميد لبضع دقائق لتجمدها.
      ملاحظة: تأكد من وضع كتلة النسيج على الزاوية الصحيحة بحيث يتم تقسيم النسيج في الاتجاه المطلوب.
   7. بمجرد تجميد كتلة الأنسجة بالكامل على تشاك العينة، ضع المربع في حامل التثبيت وشده في مكانه. حرك شفرة الكريوستات بحيث تكون أمام كتلة الأنسجة مباشرة دون لمسها.
   8. اضبط إعداد التقليم على 50 ميكرومتر وابدأ بقص الكتلة حتى يكشف مقطع كامل من النسيج.
   9. قم بإلغاء تحديد إعداد التريم وضبط سمك القسم على 20 ميكرومتر. اقطع بعض الشرائح بهذا السماكة قبل خفض صفيحة مقاومة اللف. اقطع ببطء وسلاسة~80٪–90٪ من القسم قبل التوقف.
   10. ارفع صفيحة مقاومة الدوران. استرجع شريحة زجاجية مشحونة واضغط الجانب المشحون على قسم النسيج في المكان المطلوب.
       ملاحظة: إذا لف قسم الأنسجة بعد رفع صفيحة مقاومة الدوران، استخدم الفرش الدقيقة لفكه.
   11. أزل الشاك من حامل التشاك. أزل التشك من الكريوستات وسخنه إلى درجة حرارة الغرفة. اسحب كتلة الأنسجة من الحوض وأعدها إلى القالب.
   12. لف بورق القصدير لمنع سقوط كتلة الأنسجة من العفن، ثم أعد إلى الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
   13. ضع أقسام الأنسجة المثبتة عند -20 درجة مئوية.
       ملاحظة: (نقطة التوقف) يمكن تخزين أقسام الأنسجة بأمان عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

3. التلوين بالفلورة المناعية

1. استرجع المقطع بالتجميد واتركها تجف لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في الحاضنة.
2. اغسل الشرائح لإزالة الوسط الزائد الداخلي.
   1. جهز 1 لتر من 1× PBS يحتوي على 0.1٪ v/v Triton X-100 (PBS-T)
   2. املأ 3 برطمانات صبغ ب PBS-T.
   3. ضع الشرائح في رف الانزلاقات. اغمر شرائح السحب في جرة التلوين لمدة 10 دقائق. كرر ذلك لثلاث مرات فقط.
3. قم بحجب النسيج من أجل التلوين.
   1. انقر بلطف على كل شريحة على مسح دقيق لتجف. ضع الزلاجات معلقة في صندوق شرائح مع توجيه المنديل للأعلى.
   2. حضر محلول حجب بحجم 20 مل يحتوي على 1× PBS، و0.3٪ v/v Triton X-100، و5٪ بدون ألبومين مصل البقري (BSA).
   3. ضع محلول الانسداد بمقدار 1 مل على كل شريحة للتأكد من تغطية الأنسجة بالكامل.
   4. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
4. حضن الأنسجة بالجسم المضاد الأساسي.
   1. انقر بلطف على كل شريحة على مسح دقيق لتجف. استخدم مناديل دقيقة أخرى لامتصاص السائل المتبقي بين أقسام الأنسجة بلطف بلطف من الخارج.
   2. جهز تخفيفا بنسبة 1:200 من الأجسام المضادة للفأر من الأرنب Tom20 α في محلول حجب (200 ميكرولتر لكل شريحة)
   3. في أسفل صندوق الانزلاقات، ضع مناشف ورقية ورطبها بالكامل بالماء.
   4. ضع الشرائح معلقة في صندوق الشرائح بحيث يكون المنديل مواجها للأعلى. بيبت 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف على كل شريحة، لضمان تغطية الأنسجة بالكامل.
   5. قطع من فيلم البرافين بحجم تقريبا شرائح الغطاء المخصصة للاستخدام. اقطع قطعة واحدة من فيلم البرافين لكل شريحة.
   6. ضع كل قطعة من فيلم البارافين على كل شريحة لتوزيع تخفيف الأجسام المضادة عبر أقسام الأنسجة. أغلق صندوق الانزلاق وحضن الغرفة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
5. اغسل الشرائح بعد الحضانة باستخدام الجسم المضاد الأساسي.
   1. املأ 3 برطمانات صبغ ب PBS-T. استرجع الشرائح وأزل قطع من فيلم البارافين.
   2. ضع الشرائح في رف الانزلاقات. اغمر شرائح السحب في جرة التلوين لمدة 10 دقائق. كرر ذلك لثلاث مرات فقط.
6. حضن الشرائح في الجسم المضاد الثانوي.
   ملاحظة: لتأكيد وضع العلامات المحددة للميتوكوندريا، حضر شريحة واحدة على الأقل من كل مجموعة مصبوغة بالجسم المضاد الثانوي فقط.
   1. انقر بلطف على كل شريحة على مسح دقيق لتجف. استخدم مناديل دقيقة أخرى لامتصاص السائل المتبقي بين أقسام الأنسجة بلطف بلطف من الخارج.
   2. جهز تخفيفا بنسبة 1:200 من الأجسام المضادة أليكسا فلور 568 α الأرانب و5 ميكروغرام/مل 4′,6-دياميدينو-2-فينيل ليندول (DAPI) في محلول حاجز (200 ميكرولتر لكل شريحة).
   3. ضع الشرائح معلقة في صندوق الشرائح بحيث يكون المنديل مواجها للأعلى. بيبت 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف على كل شريحة، لضمان تغطية الأنسجة بالكامل.
   4. قطع من فيلم البرافين بحجم تقريبا شرائح الغطاء المخصصة للاستخدام. اقطع قطعة واحدة من فيلم البرافين لكل شريحة.
   5. ضع قطعة من البارافيلم على كل شريحة لتوزيع تخفيف الأجسام المضادة عبر أقسام الأنسجة. أغلق صندوق الانزلاق واحتضن على درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات، أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
7. اغسل أغطية الدرجات.
   ملاحظة: استخدم ملقط بلاستيك لالتقاط والتعامل مع أغطية الغطاء
   1. ضع أغطية الألواح واحدة تلو الأخرى في كأس مملوء بماء الصنبور الساخن ومنظف للزجاج مثل كونترا 70. غطها بقطعة من فيلم البارافين.
   2. سونيك لمدة 30 دقيقة في جهاز سونيك بحمام.
   3. اشطف عدة مرات بماء الصنبور الساخن. ثم اشطفها عدة مرات أخرى في ماء مقطر مرتين. استخدم سونيكيت لمدة 15 دقيقة في شطف الماء المقطر مرتين الأخير.
   4. ضع أغطية الغطاء في إيثانول بنسبة 70٪ وخزنها. عندما تكون جاهزا لتركيب أغطية الأغبياء، أزلها من الإيثانول بنسبة 70٪ واتركها تجف في غطاء بخاري.
8. اغسل الشرائح بعد الحضانة باستخدام الجسم المضاد الثانوي.
   1. املأ 3 برطمانات صبغ ب PBS-T. استرجع الشرائح وأزل قطع من فيلم البارافين.
   2. ضع الشرائح في رف الانزلاقات. اغمر شرائح السحب في جرة التلوين لمدة 10 دقائق. كرر ذلك لثلاث مرات فقط.
   3. انقر بلطف على كل شريحة على مسح دقيق لتجف. استخدم مناديل دقيقة أخرى لامتصاص السائل المتبقي بين أقسام الأنسجة بلطف بلطف من الخارج.
9. اركب الغطاء الداخلي.
   1. أضف 2–3 قطرات متفرقة بشكل متساو من تركيب مضاد التلاشي على شريحة كهربائية.
   2. لتجنب فقاعات الهواء، استخدم غطاء #1.5 منظف واثبته بزاوية 45° على الشريحة على طول المحور الطولي. قم بإمالة غطاء الغطاء بلطف وببطء نحو المنزلق. كرر ذلك لجميع الشرائح.
   3. دع الزلاجات تجف لمدة 18–60 ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء حمايتها من الضوء.
   4. خزن الزلاجات عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
      ملاحظة: (نقطة التوقف) يمكن تصوير الشرائح إما مباشرة بعد فترة المعالجة، أو حتى شهر واحد عند تخزينها عند 4 درجات مئوية. لا حاجة لإغلاق الحواف. تأكد من استخدام أغطية #1.5 أو #1.5H، لأن السماكات الأخرى ستسبب انحرافا كرويا وقد تقلل من جودة الصورة. لا تستخدم وسائط التثبيت مع DAPI، لأن DAPI لها طيف إثارة وانبعاث واسع. يعتمد وقت التصلب على سمك العينة؛ هنا، 48 ساعة.

4. تصوير فائق الدقة

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول جهاز مسح نقاط ZEISS Airyscan2 من نوع LSM 980 مبني حول جهاز ZEISS Axio Observer Z1 ومزود بأنبوبين متعدد القلويات (PMTs) وكاشف طيفي GaASP 32 قناة، وحاوية بيئية، وهدف تباين تداخل تفاضلي نفطي Plan Apo 63×/1.4 (DIC) III.

1. رتب عملية الاستحواذ.
   1. أضف مسار SR واحد من Airyscan واختر الفلوروفور المناسب.
   2. اختر لوحة 10 إنش ومرشحات تمرير النطاق المناسب للانبعاث.
      ملاحظة: لوحة 10 بوصة مخصصة لهذا المجهر، حيث أنها مزودة أيضا بكواشف الأشعة تحت الحمراء (IR).
   3. اختر الليزر المناسب. اضبط معايير أخذ عينات Nyquist إلى 2 بالنقر على SR (يجب تعديل حجم البكسل إلى 0.05 ميكرومتر).
   4. انقر على زر البث المباشر ومحاذاة كاشف Airyscan (اختر ميزة المحاذاة الحية). اضغط على التوقف بمجرد تحديد الشدة في مركز أيقونة الكاشف وعندما يصبح الكاشف أخضر.
      ملاحظة: إذا تم إعداد كل شيء بشكل صحيح، يجب أن تظهر رسالة على الجانب الأيسر من البرنامج تقول إن "إعدادات Airyscan تم تحسينها بنجاح".
   5. أعد البث المباشر ، واضبط شدة الليزر بحيث يكون هناك إشارة جيدة لكن بدون بكسلات مشبعة (اضغط على مؤشر النطاق). اضغط على التوقف بمجرد تحسينه.
      1. (اختياري) لزيادة الإشارة دون تعديل قوة الليزر، زد الكسب.
2. قم بجمع البيانات.
   1. انقر على z-stack وتحقق من أن حجم الخطوة مضبوط على 0.1 ميكرومتر (عدل إذا لم يكن كذلك).
   2. انقر مباشرة واضبط الحدود السفلية والعليا لمكدس z.
   3. انقر على بدء التجربة.
   4. بعد جمع مجموعة z، اذهب إلى تبويب Airyscan أسفل الصورة واضغط على معالجة 3D. حافظ على اتساق معايير مرشح وينر المزيل للضوضاء المستخدمة هنا عبر النسخ المختلفة ومجموعات المعالجة.
   5. احفظ مكدس Z المعالج من Airyscan.
      ملاحظة: إذا كان يتم استخدام مسارين من Airyscan SR، تأكد من أن المجهر يحول مسارات كل إطار.

5. إنشاء خط أنابيب آلي لقياس شكل الميتوكوندريا

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تطوير خط تحليل صور آلي لقياس الشكل الميتوكوندري ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج ZEISS arivis Pro Software 4.1.2.

1. تحويل ملفات .czi المعالجة بواسطة Airyscan إلى صيغة .sis باستخدام أداة تحويل arivis.
   ملاحظة: إذا كانت الصورة الكاملة كبيرة ووقت المعالجة طويل جدا أثناء تحسين المعلمات، قم بقص منطقة فرعية صغيرة ممثلة من الصورة لاستخدامها كمرجع عمل لتحسين الإعدادات. يجب أن تتضمن هذه الصورة المقطوعة الميتوكوندريا المعزولة جيدا ومناطق ذات كثافة أعلى، بحيث تمثل حقل الصورة الكامل بدقة. بمجرد تحقيق تقسيم مرض على الصورة المقطوعة، يمكن تطبيق خط الأنابيب المحسن على مجموعة الصور الكاملة. سيوفر هذا النهج الوقت بشكل كبير، وسيجعل من السهل تعديل جميع المعايير دون المساس بجودة خط الأنابيب.
2. قم بإعداد وتحسين خط الأنابيب.
   1. افتح صورة ممثلة (مثلا من مجموعة التحكم) في البرنامج.
   2. اختر قناة توم20 المناعية الفلورية كمدخل للتحليل.
   3. طبق خطوة إزالة الضوضاء قبل التقسيم. هنا، تم استخدام خوارزمية تعزيز الجسيمات، بقطر 5.42 وقوة 0.5.
      ملاحظة: مرشح تعزيز الجسيمات هو خوارزمية تحافظ على الهيكل وإزالة الضوضاء مصممة لتضخيم الأجسام المدمجة أو الكروية أو الممدودة مع كبت الضوضاء الخلفية. يعمل عن طريق تعزيز الشدة المحلية عند مقياس مكاني محدد (قطر)، مما يجعله مناسبا بشكل خاص للميتوكوندريا التي تظهر كجزيئات أو أنابيب لامعة ومعزولة على خلفية داكنة. إذا تم ضبط قيمة معامل القطر على أنها صغيرة جدا، فإنها تعزز الضوضاء، بينما القيمة الكبيرة جدا ستدمج الأجسام المجاورة معا. يتحكم معامل القوة في درجة التعزيز، حيث تزيد القيم العالية من تضخيم الإشارة لكنها قد تسبب تشوهات إذا تم ضبطها بشكل مرتفع جدا. ابدأ بالقيم الافتراضية وعدلها أثناء فحص المخرج بصريا في منطقة ممثلة محل اهتمام. تتوفر عدة طرق إزالة الضوضاء في Arvis Pro. التنعيم الغاوسي خيار بسيط وسريع يقلل الضوضاء عالية التردد بشكل موحد لكنه قد يطمس التفاصيل الهيكلية الدقيقة. الترشيح الوسيط أفضل في الحفاظ على الحواف الحادة مع إزالة ضوضاء الملح والفلفل. يفضل تعزيز الجسيمات (المستخدم هنا) عندما يكون الهدف هو اكتشاف الأجسام الفلورية المنفصلة، حيث يضخم بشكل انتقائي الإشارة من هياكل تطابق نطاق الحجم المحدد. بالنسبة للصور التي تتميز بنسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة أو بتنوع كبير في الخلفية، قد يكون من الضروري تمرير إزالة ضوضاء أقوى. يوصى باختبار طريقتين أو ثلاث على نفس الصورة التمثيلية ومقارنة جودة التقسيم في المراحل النهائية.
   4. قم بتقسيم الميتوكوندريا الفردية باستخدام خوارزمية Blob Finder، التي تكتشف الأجسام في الفضاء ثلاثي الأبعاد.
   5. قم بضبط معلمات التقسيم، بما في ذلك حجم الجسم وعتبة الحساسية، وفحص التداخل بصريا بين الأجسام المكتشفة والصورة الخالية من الضوضاء لضمان تقسيم دقيق. هنا، تم استخدام المعايير التالية: قطر 0.244 ميكرومتر، عتبة احتمالية 25٪، وحساسية انقسام 22.22٪، مع ضبط التطبيع على نقطة البداية الأولى.
      ملاحظة: تعتمد معاملات التقسيم على دقة الصورة وحجم الفوكسل. في هذه الدراسة، كانت أبعاد الصورة 1354 × 1354 بكسل مع حجم بكسل XY 0.049 ميكرومتر وحجم فوكسل 0.049 × 0.049 × 0.100 ميكرومتر³.
3. قم باستخراج الميزات ومراقبة الجودة.
   1. استخلاص المعلمات الشكلية لكل جسم مكتشف، بما في ذلك الحجم (^{μm 3})، مساحة السطح (μm²)، والكروية (مساحة سطح كرة بنفس الحجم/مساحة سطح الميتوكوندريا).
   2. تصدير الكائنات المقسمة كملفات TIFF للتحقق البصري.
   3. افتح الملفات المصدرة في FIJI أو arivis ووضعها مع الصورة الأصلية للفحص البصري لدقة التقسيم.
   4. تصدير القياسات الكمية كملفات جداول بيانات فردية لكل عينة.
4. طبق خط الأنابيب.
   1. احفظ خط الأنابيب المحسن. يمكن العثور على مثال على خط أنابيب في الملف التكميلي 1.
   2. طبق خط الأنابيب على صور إضافية من جميع المجموعات التجريبية من الدراسة.
   3. قم بتحسين معلمات التقسيم بشكل تكراري إذا لزم الأمر لضمان أداء متسق عبر جميع مجموعات التجريب.
   4. بعد الانتهاء، قم بتطبيق خط الأنابيب في وضع الدفعة على جميع الصور في الدراسة.
5. إجراء تحليل البيانات
   1. استيراد البيانات المصدرة إلى RStudio (الإصدار 4.3.2) للتحليل الإحصائي.
   2. إذا لم يتم تثبيتها، قم بتثبيت الحزم: readxl، dplyr، tidyr، purrr، ggplot2، ggpubr، patchwork، scales، randomForest، caret، umap، factoextra، RColorBrewer، mclust، outliers، و tidyverse.
   3. رفع السكربت (الملف التكميلي 2) لدمج جميع مجموعات البيانات معا، وتصفية البيانات (انظر أدناه)، ورسم الحجم، ومساحة السطح، وقيم الكروية، وتحليل الميتوكوندريا المقسمة لنسب الأنواع الفرعية لكل عينة لكل عينة.
   4. (اختياري) تصفية الميتوكوندريا المقسمة بناء على الحجم لاستبعاد التشكيلات التجزئية والضوضاء.
      1. لتحديد المرشحات المناسبة، افحص توزيعات الحجم بصريا.
         ملاحظة: أظهرت جميع العينات ارتفاعا واضحا عند أحجام صغيرة جدا (أقل من 0.0003 ميكرومتر^مكعب)، مما يتوافق مع ضوضاء التقسيم بدلا من الميتوكوندريا الحقيقية.
      2. لتحديد الحد الأدنى، قيم احتفاظ الجسيمات عبر عتبات المرشحين (0.0009، 0.003، 0.005، 0.007، و0.01 ميكرومتر³). حدث أكبر انخفاض حاد في عدد الجسيمات تحت 0.003 ميكرومتر^مكعب، مما يشير إلى أن معظم جزيئات الضوضاء تقع ضمن هذا النطاق. أكد الفحص البصري أن 0.003 ميكرومتر³ يتوافق مع الحافة اليمنى لذروة الضوضاء.
      3. بالنسبة للحد الأعلى، تناقص التوزيعات بشكل طبيعي أقل بكثير من 10 ميكرومتر³؛ قم بتعيين هذا الحد لاستبعاد الأجسام الحرفية الكبيرة مثل شبكات الميتوكوندريا المقسمة بشكل مفرط. الترشيح النهائي احتفظ بجسيمات بأحجام تتراوح بين 0.003 و10 ميكرومتر^مكعب.
         ملاحظة: يحسب هذا السكربت قيم وسيطة لكل عينة عبر جميع الميتوكوندريا المكتشفة ويستخدمها كوحدة تحليل. هذا النهج يأخذ في الاعتبار عدم استقلالية الميتوكوندريا الفردية داخل نفس العينة البيولوجية.

النتائج

تم تنفيذ البروتوكول الموضح أعلاه (الشكل 1) على فئران UM-HET3 الذكور البالغة من العمر 20 شهرا. تم إعطاء الفئران إما مركبة (Control) أو كوكتيل إعادة برمجة كيميائي (معالج) باستخدام مضخات أوسموز مصغرة موديل 2004⁵³. ثم تم تقسيم الكبد وتصويرها على مجهر أيريسكان2 الكونفوكال قبل معالجة المكدس z باستخدام خط التحليل.

تمت معالجة وتحليل صور الفلورة ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج ZEISS arivis Pro Software 4.1.2. قبل تقسيم الميتوكوندريا، كان يتم تطبيق خوارزمية تعزيز الجسيمات لإزالة الضوضاء من الصور وإزالة الخلفية، والضوء غير الواضح، والتألق الذاتي، و/أو التألق الناتج عن ارتباط غير محدد. يعزز الجسيمات تضخيم الإشارة بشكل انتقائي من قطر معين. بعد إزالة التوزيعة، تم تقسيم الميتوكوندريا الفردية ثلاثية الأبعاد باستخدام خوارزمية Blob Finder، التي تكتشف الكائنات بناء على أقصى شدة محلية ضمن نطاق حجم محدد. وأخيرا، تقطيم الكائنات يقلل كل شريحة ثنائية الأبعاد إلى صورة ثنائية.

لتوضيح سير عمل التقسيم، يعرض الشكل 2 شرائح بصرية تمثيلية في كل مرحلة من مراحل خط معالجة العينات المتحكم والمعالجة. تظهر صورة الفلورة الخام إشارة Tom20 غير المعالجة، والتي تحتوي على مزيج من فلورة الميتوكوندريا المحددة والخلفية غير المرغوب فيها، وضوء خارج البؤرة، وتوهج ذاتي. بعد تطبيق إزالة الإضاءة بتعزيز الجسيمات، تم تقليل الإشارة الخلفية بشكل كبير، وأصبح الفلورة المتبقية محصورة في هياكل منفصلة ومحددة جيدا (الشكل 2). ينتج عن ذلك تمثيل أنظف لحدود الميتوكوندريا مما يسهل التقسيم الدقيق.

يظهر مخرج تقسيم Blob Finder باللون الأخضر. للتأكد من أن مجموعات z مقسمة بدقة، تم تراكب الشرائح ثنائية الأبعاد الخالية من الضوضاء مع الصور الثنائية المقسمة المرتبطة بها (الشكل 2). إذا تم تحسين عملية التقسيم بشكل كاف، يجب ملاحظة توازنية قوية ومتسقة بين فلورة الميتوكوندريا والأجسام الثنائية. إذا كانت عملية التقسيم تفصل بشكل مفرط (أي تقسيم الميتوكوندريا الفردية إلى عدة أجسام) أو أقل من التقسيم (أي دمج عدة ميتوكوندريا في واحدة)، قم بتعديل معلمات التقسيم. يؤكد الفحص البصري للأجزاء الداخلية التجزئة عالية الجودة: حيث تتزامن الأجسام المكتشفة بدقة مع إشارة الفلورة Tom20 الخالية من الضوضاء، دون أي دليل على التقسيم الزائد، أو حجم الأجسام بشكل كبير، أو دمج غير مناسب للميتوكوندريا المجاورة مكانيا في كائنات واحدة، أو توليد أجسام زائفة في مناطق لا تحتوي على إشارة Tom20. تم تحقيق هذا المستوى من دقة التقسيم بشكل متسق عبر العينات الضابطة والمعالجة، مما يثبت أن معلمات خط الأنابيب المحسنة في برمجيات ZEISS arivis قوية وقابلة للتعميم عبر مجموعات التجريب. معا، تؤكد هذه النتائج صحة نهج التقسيم وتدعم موثوقية القياسات المورفولوجية المستمدة منه.

يمكن قياس الأجسام المقسمة لمعايير الميتوكوندريا مثل الحجم، والكروية، ومساحة السطح (الشكل 3). لأخذ العدد الكبير من الميتوكوندريا التي تم اكتشافها لكل عينة بيولوجية وعدم استقلالية العضيات الفردية داخل الخلية، تم حساب قيم الوسيط لكل عينة واستخدامها كوحدة للمقارنة الإحصائية. تم تقييم الفروق الجماعية باستخدام اختبار ويلكوكسون. أظهرت العينات المعالجة حجما ومساحة سطح ميتوكوندريا أعلى بكثير مقارنة بالضابطين، مما يشير إلى أن إعادة البرمجة الكيميائية تؤدي إلى إعادة تشكيل كبيرة لشكل الميتوكوندريا.

وأخيرا، يمكن تصنيف الميتوكوندريا المجزأة إلى أنواع فرعية مختلفة^54,55 (الشكل 4). تم استخدام طريقة الكوع⁵⁶ لتحديد العدد الأمثل للمجموعات لتجميع k-mean ^57,58 (الشكل 4A). ثم، باستخدام k = 4 عناقود، تم رسم عينات فرعية عشوائية من الميتوكوندريا للمجموعات الضابطة والمعالجة عبر تقريب متعدد الأبعاد الموحد وتقليل أبعاد الإسقاط (UMAP) (الشكل 4B)، ملوونة حسب كل من النوع الفرعي للميتوكوندريا (اليسار) ومجموعة المعالجة (اليمين). وأخيرا، تم رسم نسب كل نوع فرعي ميتوكوندري (الشكل 4C) للمجموعتين الضابطتين والمعالجتين. في مجموعة العلاج، كان هناك عدد أقل من الميتوكوندريا المجزأة ولكن لم يحدث تغيير كبير في نسبة الميتوكوندريا المتصلة بالشبكة أو الممدودة.

الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. تعالج الفئران بالأدوية أو بمركبة لمدة تصل إلى 6 أسابيع باستخدام زرع مضخة أسموزية تحت الجلد (1). بعد العلاج، يتم تثبيت أنسجة الفئران، وتغمر بالسكروز، وتضمينها في مركب OCT، وتقطع بالتجميد (2). ثم تصبغ أقسام الأنسجة بأجسام مضادة ضد Tom20 وأجسام مضادة ثانوية موسومة ب Alexa Fluor 568 (3). يتم جمع مجموعات z فائقة الدقة على مجهر الكونفوكال الماسح Airyscan2 (4)، ويتم تقسيم المكدسات z المعالجة الخالية من الضوضاء في أريفيس لقياس شكل الميتوكوندريا (5). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: خط أنابيب آلي لتقسيم الميتوكوندريا وتحليل الشكل.
شرائح بصرية مفردة تمثيلية من عينات التحكم (اللوحات العلوية) والمعالجة (الألواح السفلية). تظهر إشارة توم20 المناعية الفلورية باللون الرمادي (على اليسار). يتم عرض نفس الصورة بعد إزالة الضوضاء باللون الرمادي، تليها مخرجات التقسيم التي تبرز الأجسام الميتوكوندرية المكتشفة باللون الأخضر. تظهر الصورة المدمجة التداخل بين الإشارة المنقولة عن الضوضاء والأجسام المجزأة. تظهر التركيبات رؤى تكبير أعلى للمناطق المشار إليها، مما يوضح تأثيرات إزالة الضوضاء ودقة التقسيم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: شكل الميتوكوندريا في المجموعات الضابطة والمعالجة. تظهر مخططات الصندوق النطاق الوسيط ± الرباعي لكل قيم وسيطة لكل عينة (n = 10 لكل مجموعة). كل نقطة تمثل عينة بيولوجية واحدة، تلخص كوسيط عبر جميع الميتوكوندريا التي تم اكتشافها داخل تلك العينة. يتم عرض الحجم ومساحة السطح على مقياس_{لوغاريتما 10} . تمت مقارنة المجموعات باستخدام اختبارات ويلكوكسون لمجموع الترتيب. مستويات الدلالة: NP ≥ 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تصنيف مورفومتري غير خاضع للإشراف للأنواع الفرعية الميتوكوندرية. (أ) مخطط المرفق الذي يوضح مجموع المربعات داخل العنقود (WSS) كدالة لعدد العناقيد (k)، محسوب على عينة فرعية عشوائية من 10,000 ميتوكوندريا. تم اختيار نقطة التحول عند k = 4 كعدد مثالي من العناقيد للتحليل اللاحق. (B) (يسار) تقليل أبعاد UMAP للميزات المورفومترية للميتوكوندريا (n = 20,000 ميتوكوندريا مأخوذة عشوائيا)، ملون حسب النوع الفرعي المخصص. تم تحديد أربعة أنواع فرعية مميزة شكليا: مجزأة (صغيرة، كروية عالية)، ممتدة (طويلة، منخفضة كروي)، متصلة بالشبكة (كبيرة، غير منتظمة)، ومتوسطة. (يمين) إسقاط UMAP ملون حسب المجموعة التجريبية (مجموعة التحكم مقابل المعالجة) الذي يظهر توزيع كل مجموعة عبر الفضاء الشكلي. (ج) نسب لكل عينة لكل نوع فرعي ميتوكوندري في كل مجموعة تجريبية. تمثل كل نقطة بيانات عينة بيولوجية واحدة (n = 10 لكل مجموعة). تظهر مخططات الصندوق النطاق والوسيط بين الرباعيين، مع امتداد الشوارب إلى 1.5 ضعف النطاق الربعي. تمت مقارنة نسب الأنواع الفرعية بين المجموعات باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب، وتم تصحيح قيم p للمقارنات المتعددة باستخدام طريقة بنجاميني-هوشبرغ. NS P ≥ 0.05، ****p < 0.0001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: مثال على خط أنابيب arivis. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: سكريبت R لقياس شكل الميتوكوندريا وتجمعات الأنواع الفرعية.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

خطوتان أهم لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح هما (1) إغلاق الشق أثناء زرع المضخة الأسموزية، و(2) تقسيم دقيق. بالنسبة للأول، حرص بشكل خاص على إنشاء جيب تحت الجلد يكون كبيرا بما يكفي للمضخة، لكنه ليس كبيرا جدا بحيث تنزلق المضخة على جانب الحيوان. عند إغلاق الشق، يجب وضع المضخة على مسافة كافية حتى لا تسبب أي توتر على الجلد المحيط، مما قد يؤدي إلى الانفصال. تأكد من شد الجلد المحيط بالشق المغلق من جميع الاتجاهات للتأكد من أن الجرح مغلق بما فيه الكفاية قبل بدء عملية تعافي الحيوان. مشابك الجروح مفيدة لأنها سريعة في التطبيق والإزالة. ومع ذلك، إذا ظهرت أي مشاكل بسبب عدم القدرة على إغلاق الجروح بشكل صحيح، يمكن استخدام غرز متقطعة بدلا من ذلك. بالنسبة للأخير، يتطلب التقسيم الدقيق مقارنة نتائج التقسيم باستمرار مع الصور الممزقة حتى يتم التشابه الكافي في الصور. يجب جمع مجموعات Z من الحيوانات المراقبة والمعالجة باستخدام نفس معايير الجمع ويفضل أن تكون خلال نفس جلسة التصوير. وبالمثل، يجب تطبيق جميع خطوات المعالجة على جميع الصور باستخدام نفس المعلمات بالضبط. يحدد معامل تقسيم القطر الحجم المتوقع للأجسام التي سيتم اكتشافها. نقطة انطلاق جيدة هي متوسط عرض الميتوكوندريا المقاس من بعض الأجسام التي تم فحصها يدويا باستخدام شريحة بصرية واحدة. تتحكم عتبة الاحتمالية في الحد الأدنى من ثقة الكشف المطلوبة لقبول كائن ما. القيم الأقل تزيد الحساسية وتكتشف المزيد من الأجسام، لكن بعض هذه الأجسام قد تكون خاطئة. وعلى العكس، القيم الأعلى تحسن الخصوصية لكنها قد تتسبب في فقدان الأجسام ذات الإشارة الأقل. النطاق الموصى به للبدء هو 25٪–30٪. أخيرا، تتحكم الحساسية المنقسمة في كيفية فصل الأجسام المتلامسة أو المتداخلة بشكل عدواني إلى كائنات فردية. الحساسية المنخفضة للانقسام ستترك الميتوكوندريا متجمعة ككائنات مدمجة واحدة. من ناحية أخرى، يمكن أن تؤدي الحساسية العالية للانقسام إلى انقسام مفرط للميتوكوندريا الممدودة أو المتفرعة إلى شظايا. القيم بين 15٪–30٪ معقولة للدراسات المورفولوجية النموذجية للميتوكوندريا. إذا ظل التقسيم الدقيق صعبا، يمكن إجراء التقسيم باستخدام محلل الميتوكوندريا⁵⁹ في FIJI⁶⁰. تم وصف خط أنابيب شبه آلي لقياس أشكال الميتوكوندريا في كل من الخلايا والأنسجة باستخدام برنامج Huygens Professional وسكريبت بايثون مخصص أيضا،⁶¹.

أحد القيود هو حد الدقة لميكروسكوب الكونفوكال Airyscan2، والذي هو ~150 نانومتر في XY و~350 نانومتر في مستوى Z. يمنع ذلك التصوير عالي الدقة للكريستات الميتوكوندرية، حيث تبين المسافات بين الكريستات الفردية ~40–120 نانومتر 62,63,64. في المقابل، يمكن أن يصل استنزاف الانبعاث المحفز (STED) إلى حدود دقة ~20–50 نانومتر جانبيا، ويمكنه التمييز بوضوح بين الكريستاي الميتوكوندري^{الفردي 62,63,64}. تم تطوير عدة أصباغ STED مؤخرا تسمح بتلوين وتصوير فعال للغشاء الداخلي الميتوكوندري في كل من الخلايا الحية والثابتة 63,64,65. نظرا لأن تحليل أشكال الكريستا قد يمنح رؤى حول الصحة الحيوية للميتوكوندريا¹⁰، فإن مثل هذه البيانات مرغوبة. ومع ذلك، يختلف شكل الميتوكوندريا بشكل كبير بين أنسجة الثدييات وزراعة الخلايا (سيتم مناقشته بتفصيل أدناه)، ولا توجد حاليا منهجية لتلوين الغشاء الداخلي للأنسجة لتصوير وتحليل هياكل الكريستاي بتقنية STED.

يطرح قياس شكل الميتوكوندريا في الأنسجة السليمة تحديات فريدة مقارنة بأنظمة زراعة الخلايا. في الخلايا المزروعة، توزع الميتوكوندريا عادة في جميع أنحاء السيتوبلازم في شبكات منفصلة جيدا مع تداخل ضئيل بين الخلايا. أما في أقسام الأنسجة أو التحضيرات الكاملة، فالخلايا تكون مكتظة بكثافة وحدودها غير محددة جيدا. إذا كان هناك حاجة لتحليل على مستوى الخلية، يجب تضمين علامة فلورية إضافية تستهدف غشاء البلازما أو علامة خاصة بنوع الخلية، إلى جانب خطوة تقسيم مقابلة في خط تحليل الصور لتحديد حدود الخلايا الفردية قبل قياس شكل الميتوكوندريا. الفرق المهم الثاني هو أنه في الخلايا المزروعة، غالبا ما تشكل الميتوكوندريا شبكات شبكية متصلة ومستمرة يسهل رؤيتها وتفسيرها. في الأنسجة، نادرا ما يلاحظ هذا النمط. على سبيل المثال، تظهر الميتوكوندريا من مقاطع الكبد نمطا مثقبا وقضيبا وحزمة يشغل كامل السيتوسول⁶⁶. ومع ذلك، تظهر خلايا الكبد في الثقافة أشكال أنبوبية مع تشكيلات شبكية واضحة⁶⁶. وبالمثل، عند مقارنة الميتوكوندريا من الأنسجة الملساء مع تلك الناتجة عن خلايا العضلات الملساء في الزراعة، تلاحظ اختلافات واضحة في شكلها وأنماط شبكتها⁶⁷. البنية ثلاثية الأبعاد، إلى جانب الفروق الخاصة بنوع الخلايا في توزيع الميتوكوندريا، تجعل الميتوكوندريا في هذه الأنسجة تبدو كنقاط متقطعة وكثيفة أو شظايا قصيرة بدلا من شبكات ممدودة. لذلك، من الضروري تفسير البيانات بحذر عند مقارنة الخصائص الشكلية بين الأنسجة وزراعة الخلايا، حيث قد تعزى الفروق بينهما جزئيا إلى سياق التصوير وليس إلى التنوع البيولوجي الحقيقي.

من أبرز ميزات هذا البروتوكول القدرة على قياس الهياكل الميتوكوندرية في الأنسجة بشكل كمي باستخدام المجهر الضوئي. بينما توجد طرق أخرى لقياس شكل الميتوكوندريا من صور المجهر الضوئي فائقة الدقة، فإن العديد منها مناسب فقط للخلايا في الزرعة. علاوة على ذلك، وعلى عكس طرق التحليل الأخرى، فإن خط الأنابيب المعروض هنا مؤتمت بالكامل، ويقيس أبعاد الميتوكوندريا ونسب الأنواع الفرعية، ويتطلب خبرة قليلة في الترميز لأداء ناجح. تم استخدام المجهر الإلكتروني للمسح/النقل (SEM/TEM) وتقنية التجمد المغناطيسي سابقا لتصوير هياكل الميتوكوندريا في الأنسجة ثنائية وثلاثية الأبعاد^{10، 68، 69}. ومع ذلك، بالنسبة للأولى، هناك مخاوف بشأن الحفاظ على الهياكل الأصلية بعد تثبيت العينة، والجفاف، والتضمين^70,71. علاوة على ذلك، فإن القياس اليدوي لمعلمات الميتوكوندريا في FIJI⁶⁰ هو أحيانا الطريقة المفضلة للتحليل لصور TEM⁷²، والتي تتطلب عملا كبيرا وقد تؤدي إلى تحيز العينة. ومع ذلك، تم وصف طرق التعلم العميق لقياس الشكل الميتوكوندري الآلي من صور TEM مؤخرا^{بمقدار 73,74}. ميزة النهج المعروض هي أنه بمجرد إنشاء خط أنابيب التحليل، يمكنه معالجة الصور دفعة واحدة مع مدخلات مستخدم قليلة أو معدومة. بالنسبة للأخير، يمكن للتجميد عالي الضغط أن يحافظ على هياكل الأنسجة في الظروف شبه الأصلية⁷⁵. ومع ذلك، فإن تجميد العينات بالبرود والإلكتروني، والتقسيم، والطحن، وجمع البيانات، ومعالجة البيانات كلها تتطلب تدريبا مكثفا ومعدات متقدمة للغاية. على النقيض من ذلك، المجهر الكونفوكالي فائق الدقة أكثر سهولة نسبيا ويتطلب تدريبا وموارد أقل لأداء النجاح.

يمكن إجراء عمليات زرع المضخة الأسموزية بأمان في فئران مسنة لتقييم تأثيرات المركبات الدوائية المختلفة على التدهورات المرتبطة بالشيخوخة في الوظائف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعميم الطرق الموضحة هنا على العديد من الأعضاء المختلفة. من المعروف جيدا أن التدهور المرتبط بالشيخوخة في الوظائف الأيضية يساهم في المرض وينشأ من خلل في وظيفة الميتوكوندريا، وهو أحد السمات العامية لسن⁷⁶. علاوة على ذلك، من المفهوم أن الهياكل الميتوكوندرية تؤثر على القدرة الحيوية للميتوكوندريا وحالتها الأيضية^77,78. لذا، قد يساعد التقييم الكمي للمركبات لتأثيرها على بنية الميتوكوندريا أثناء شيخوخة الفئران، باستخدام الطرق الموضحة هنا، في تحديد العلاجات التي يمكن أن تطيل مدة صحة الإنسان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm.
Aluminum foil	Essendant	BWK7112
Analytical balance	Mettler Toledo	MR204
Anti-roll glass plate	Gel Company	LGI70
Arivis Pro Software	ZEISS	Version 4.1.2
Bath sonicator	Branson Ultrasonics	71020-MT
Bovine serum albumin	Research Products International	A30075
Centrifuge tubes, 15 mL	CELLTREAT	229411
Charged microscope slides	Globe Scientific	1358W
Clip remover	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Cotton-tipped applicators	Puritan Medical	25-8061WC
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
Cryostat blades	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Prepare to 5 mg/mL in ddH2O, aliquot, and store at -20 °C protected from light
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip slide staining system	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Embedding molds, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
Ethanol, 200 proof	Decon Labs	V1001
Fenestrated sterile drape sheets	Dukal	20001
Fine forceps	Fine Science Tools	11445-12
Glass bead sterilizer	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Heating pad	CVS	215313
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705
Immersion oil Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Induction chamber	World Precision Instruments	EZ178
Insulin syringes, 0.3 mL	BD	328431
Iris surgical scissors	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL syringes	BD	309628
Luer-Lok 3 mL syringes	BD	309657
Luer-Lok 50 mL syringes	BD	309653
Meloxivet (meloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	CELLTREAT	229443
Microscope slide box	Heathrow Scientific	15994E
Microscope slide cover glass, #1.5, 22 mm ´ 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Non-CO2 incubator	Benchmark Scientific	H2200-H
Non-fenestrated sterile drape sheets	Dukal	20-002
OCT Compound	Sakura Finetek USA Inc	4583
Opthalmic ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572
Osmotic minipumps	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldehyde, 4% w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1´	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES syringe filters, 0.22 µm	CELLTREAT	229747
Povidone iodine 10% USP swabsticks	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Rabbit anti-Tom20 antibody	Novus Biologicals	NBP2-67501
Razor blades, 0.22 mm	VWR	55411-050
Rotator/rotisserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	version 4.3.2
Scale	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific	SS-01
Steam sterilization indicator strips	Crosstex	SIS-250
Sterile glass vials, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Sterile needles, 0.5", 23 G	BD	305145
Sterile needles, 0.5", 27 G	BD	305109
Sterilization pouches	Cardinal Health	92510
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	Prepare a solution of 30% w/v in 1´ PBS
Surgical clippers	3M	9680
Surgical gloves	Cardinal Health	2D73DP75
Tissue forceps	Sklar Surgical Instruments	47-1447
Toploading balance	Cole-Parmer	EW-55000-14
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB