جهاز محمول لمعالجة اللعاب المسبق لتحسين اكتشاف الكورتيزول

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة معالجة سريعة قبل اللعاب لتحسين اكتشاف الكورتيزول. يستخدم جهاز ترشيح محمول باليد لإزالة الموسينات والمواد المتداخلة الأخرى مع الحفاظ على التحليل المستهدف. يظهر اللعاب المعالج مسبقا تدفقا في الشعيرات الدموية، مما يتيح أداء أكثر اتساقا وقابلية للتكرار في الاختبار.

الملخص

يوفر كشف الكورتيزول اللعابي بديلا غير جراحي للتحليل المعتمد على الدم. ومع ذلك، لا يزال تطبيقه العملي محدودا بسبب اللزوجة الجوهرية لللعاب ووجود مكونات متداخلة. على وجه الخصوص، تعيق الموسينات وبروتينات اللعاب تدفق الشعيرات الدموية وتؤثر على موثوقية اختبارات التدفق الجانبي اللاحقة (LFAs)، مما يستلزم استراتيجيات علاج أولية فعالة وسهلة الوصول. هنا، نقدم جهاز معالجة مسبقة لللعاب المحمول، يسمى SaliFilter، للكشف عن الكورتيزول في نقطة الرعاية. يستخدم الجهاز آلية ترشيح تزيل بشكل انتقائي المكونات المتداخلة ذات الوزن الجزيئي العالي مع السماح بمرور جزيئات صغيرة، بما في ذلك الكورتيزول. يعمل بضغط يدوي بسيط، مما يتيح معالجة سريعة للعينات (~2 دقيقة) دون الحاجة إلى معدات خارجية، مما يجعله مناسبا للإعدادات اللامركزية. تم تقييم أداء الجهاز باستخدام قياسات العكارة، وقياس كمية البروتين، وSDS-PAGE، التي أكدت إزالة فعالة من الموسين وبروتينات اللعاب. أظهرت العينات المعالجة تدفقا شعريا معينا، مما أدى إلى تشغيل LFA مستقر وموثوق. أظهر التحليل الكمي تحسنا في قابلية تكرار الإشارة، وحقق اكتشاف الكورتيزول حدا للكشف بمقدار 1.47 نانوغرام مل⁻¹ على نطاقات تركيز ذات صلة سريرية. يضع هذا البروتوكول استراتيجية فعالة لعلاج اللعاب قبل الحساسية والموثوقية دون المساس بسلامة التحليل السليم. يوفر النهج المقترح حلا عمليا ومحمولا للتشخيصات القائمة على اللعاب، مع إمكانية تطبيقه في اختبار نقاط الرعاية والمراقبة الذاتية.

المقدمة

الكورتيزول، وهو هرمون جلوكوكورتيكويد يفرزه قشرة الغدة الكظرية، يعد علامة حيوية رئيسية لتقييم الإجهاد الفسيولوجي ^1,2. يمكن قياسه في عدة سوائل بيولوجية، بما في ذلك المصل، والبلازما، والبول، والسائل الخلالي، واللعاب، مع كون الدم واللعاب الأكثر استخداما في الممارسة السريرية³. على الرغم من أن القياسات المعتمدة على الدم توفر معلومات كمية موثوقة، إلا أنها تتطلب تدخيلا جراحيا وطاقما مدربا، مما يحد من ملاءمتها للمراقبة المتكررة أو الطولية ^4,5,6. على النقيض من ذلك، يوفر قياس الكورتيزول اللعابي بديلا غير جراحي ومريح، يتيح تطبيقات في نقطة الرعاية والمراقبة الذاتية^7،8. ومن الجدير بالذكر أن مستويات الكورتيزول اللعابي ترتبط ارتباطا وثيقا بتركيزات الدم، مما يدعم اللعاب كعينة بديلة موثوقة⁹. ومع ذلك، فإن اللزوجة الداخلية لللعاب ووجود مكونات متداخلة تعيق الأداء التحليلي بشكل كبير، مما يستلزم معالجة فعالة قبل التحليل^10،11،12.

تم استكشاف استراتيجيات مختلفة قبل العلاج لمواجهة هذه التحديات. يستخدم الطرد المركزي على نطاق واسع لإزالة المكونات الكبيرة مثل الموسينات والبروتينات والحطام الخلوي. ومع ذلك، يتطلب معدات مختبرية ضخمة وخطوات معالجة متعددة، مما يحد من قابليته للتطبيق في البيئات اللامركزية^13,14. يمكن أن يقلل التخفيف باستخدام محاليل العزل من اللزوجة ويحسن^تدفق العينة. ومع ذلك، فإنه يقلل في الوقت نفسه من تركيز التحليلات، مما يضر بحساسية التحليل. ونتيجة لذلك، تظل الأساليب الحالية غير كافية لتطبيقات نقاط الرعاية، حيث يكون المعالجة السريعة وخالية من المعدات والحفاظ على المحللات المستهدفة أمرا ضروريا.

لتجاوز هذه القيود، طورنا جهاز SaliFilter، وهو جهاز محمول لمعالجة اللعاب قبل اللعاب مصمم خصيصا للكشف عن الكورتيزول في نقطة الرعاية. يستخدم الجهاز آلية ترشيح تزيل بشكل انتقائي المواد المتداخلة ذات الوزن الجزيئي العالي مع السماح بمرور جزيئات صغيرة، بما في ذلك الكورتيزول¹⁶. عند تشغيله يدويا، يتيح الجهاز معالجة سريعة وسهلة الاستخدام دون الحاجة إلى أجهزة خارجية. من خلال إزالة المكونات المتداخلة، يحسن هذا النهج تدفق الشعيرات الدموية في اختبارات التدفق الجانبي، مما يعزز الموثوقية التحليلية. يصف هذا البروتوكول تصنيع الجهاز وتطبيقه في المعالجة المبدئية السريعة لللعاب قبل اكتشاف الكورتيزول باستخدام اختبارات التدفق الجانبي.

البروتوكول

تم استخدام لعاب بشري مجمع تم الحصول عليه تجاريا وغير محدد الهوية في هذه الدراسة. لم يتم تجنيد أي مشاركين بشريين، ولم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقيات المؤسسات.

1. تحضير عينة اللعاب

1. وجه المشاركين بالامتناع عن الأكل أو الشرب لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل جمع العينات.
2. جهز عينة اللعاب وفقا لتعليمات المورد.
   ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة لعاب بشري مجمع تجاري للتحقق على مستوى البروتوكول.
3. اخلط عينة اللعاب بلطف قبل الاستخدام لضمان التجانس.
4. تخزين عينات اللعاب عند 4 درجات مئوية واستخدمها ضمن فترة التخزين الموصى بها من المورد.

2. تحضير الغشية المغطاة ب RBCM (الشكل 1أ)

1. عزل RBCM من الدم الكامل وفقا لبروتوكول¹⁶ المبلغ عنه سابقا.
   1. استخدم الدم الكامل البشري الذي تم الحصول عليه تجاريا ومضاد تخثر باستخدام K2EDTA كمصدر لسرطان الدم الدموي (RBCM).
   2. قم بعمل طرد مركزي للدم الكامل عند 800 × جرام لمدة 5 دقائق واجمع جزء كريات الدم الحمراء بعد إزالة البلازما وطبقة البوفي.
   3. اغسل حبيبات خلايا الدم الحمراء المعزولة ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي بارد 1× فوسفات (PBS) باستخدام خلط يدوي لطيف.
   4. أعد تعليق حبيبات الدم الحمراء المغسولة في طبقة باردة جدا 0.25× PBS لمدة 30 دقيقة لتحفيز تحلل الدم.
   5. فصل الهيموغلوبين الحر عن طريق طرد التعليق المتحلل عند 20,000 × جرام لمدة 30 دقيقة وجمع حبيبات RBCM.
   6. اغسل الحبيبة المجمعة ثلاث مرات إضافية باستخدام PBS 0.25× وتخزين الحبيبة الوردية الفاتحة على درجة حرارة −80 درجة مئوية حتى استخدام آخر.
2. جهز غشاء بولي إيثير سلفون (PES) بحجم مسام 30 نانومتر وقطر 13 مم.
3. وضع 100 ميكرولتر من محلول RBCM بنسبة 2٪ (مع جهت/ضبط) على جانب واحد من غشاء PES. افرد المحلول بلطف أو وزعه باتجاه الأسفل حتى يبلل سطح الغشاء بالكامل بالكامل.
4. حضن الغشاء عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لضمان الطلاء والتجفيف المتساو.
5. خزن الغشاء المغطى بدرجة حرارة الغرفة واستخدمه خلال 15 يوما بعد التحضير¹⁷.
   ملاحظة: تم وصف التوصيف التفصيلي لغشاء PES المغطى ب RBCM في دراستنا^{السابقة 16}.

3. تصنيع جهاز SaliFilter (الشكل 1B)

1. ضع الغشاء المطلي ب RBCM في حامل الفلتر المخصص.
2. قم بتجميع الجهاز عن طريق توصيل مكونات المدخل والمخرج بأمان.
3. قم بتوصيل حقنة بسعة 1 مل إلى مدخل الجهاز.
   تحذير: تأكد من أن جميع المكونات محكمة الإغلاق لمنع التسرب أثناء التشغيل.

4. معالجة اللعاب المبدئية

1. حمل 500 ميكرولتر من اللعاب في الحقنة المتصلة بجهاز SaliFilter.
2. اضغط يدويا لطيفا لتمرير عينة اللعاب عبر الغشاء (~ دقيقتين).
3. اجمع اللعاب المعالج مسبقا من المخرج.
4. استخدم العينة المعالجة مسبقا فورا أو خزنها عند 4 درجات مئوية حتى إجراء تحليلي إضافي.

5. تحليل SDS-PAGE لبروتينات اللعاب

1. اخلط 15 ميكرولتر من العينة مع 5 ميكرولتر من مخزن العينة Laemmli.
2. قم بتحميل الخليط في آبار منفصلة من جل SDS-PAGE بنسبة 8٪.
3. قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 150 فولت لمدة 40 دقيقة.
4. صبغ الجل بلون أزرق كومسي لمدة ساعتين.
5. قم بإزالة صبغة الجل في ماء مقطر طوال الليل.
6. التقط صورا للجل باستخدام هاتف ذكي أو نظام تصوير.

6. كشف الكورتيزول باستخدام اختبار التدفق الجانبي (LFA)

1. ضع 150 ميكرولتر من اللعاب المعالج مسبقا على وسادة العينة في شريط LFA.
2. دع العينة تنتقل على طول الشريط لمدة 10 دقائق.
3. التقط صورا لنتائج الاختبار باستخدام الهاتف الذكي أو نظام التصوير.
4. افتح صورة LFA في ImageJ واستخدم صورة > اللون > تقسيم القنوات لفصل قنوات RGB.
5. استخدم صورة القناة الخضراء لتحليل شدة خطوط الاختبار.
6. اختر منطقة اهتمام مستطيلة (ROI) بحجم 100 × 10 بكسل تغطي خط الاختبار وطبق نفس حجم العائد على العائد على جميع صور الشريط.
7. قس متوسط قيمة الشدة لعائد الاستثمارات في خط الاختبار. اختر منطقة غشاء فارغ مجاورة بنفس حجم العائد على الاستثمار وقس شدة الخلفية.
8. احسب شدة خط الاختبار المعدل كما يلي: شدة الاختبار المطبعة = شدة خط الاختبار − شدة الخلفية.

7. التحليل الإحصائي

1. تقديم البيانات الكمية كمتوسط ± انحراف معياري (SD)، ما لم يذكر خلاف ذلك. عرف أشرطة الخطأ ك SD.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، تمثل جميع القيم المبلغ عنها N تكرارات تقنية تم تنفيذها باستخدام حصص من اللعاب البشري المجمع تجاريا.
2. إجراء تحليل الانحدار الخطي باستخدام قيم شدة خط الاختبار المطبعة التي تم الحصول عليها من تركيزات الكورتيزول 0–8 نانوغرام ملليتر⁻¹ وحساب معامل التحديد (R²) من المنحنى الملاءم.
3. احسب حد الكشف (LOD) باستخدام المعادلة التالية: LOD = 3.3 × SE / |ميل|، حيث SE هو الخطأ القياسي للتقاطع y و |الميل| هي القيمة المطلقة للميل المستخرج من معادلة الانحدار الخطي. استخدم القيمة المطلقة للمنحدر لأن المنافسة في LFA تنتج منحدرا سالبا.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، لم تجرى أي اختبارات إحصائية استدلالية، ولم تطبق أي معايير دلالة.

النتائج

يتطلب العلاج المسبق الفعال لللعاب إزالة المكونات المتداخلة، بما في ذلك الميوسينات والبروتينات، التي تؤثر على الأداء التحليلي في مرحلة لاحقة. تم تقييم قدرة الترشيح في SaliFilter أولا من خلال مقارنة تغيرات العكارة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعات جمع اللعاب التجارية (الشكل 2A). أظهر اللعاب غير المعالج عكارة عالية، في حين بدت العينات المعالجة ب SaliFilter واضحة بشكل واضح، مما يشير إلى إزالة فعالة من الموصين والمكونات المعلقة. على النقيض من ذلك، أظهر...

المناقشة

توفر التشخيصات المعتمدة على اللعاب بديلا غير جراحي لتحليل الدم. ومع ذلك، فقد تم تقييدها بشكل أوسع بسبب اللزوجة الداخلية لللعاب ووجود مكونات متداخلة مثل الميوسينات والبروتينات. هذه العوامل تعطل تدفق الشعيرات الدموية وتؤثر على أداء المنصات التحليلية البسيطة، بما في ذلك LFAs، مما يستلزم معالجة فعالة مسبقة للعينة.

في هذه الدراسة، نثبت أن جهاز الترشيح المحمول المقترح، SaliFilter، يزيل بفعالية المواد المتداخلة ذات الوزن الجزيئي العالي مع الحفاظ على محللات أهداف صغير...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اللعاب الاصطناعي	Solarbio، الصين	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية	5000006	لاختبار براديورد
Coomassie blue	Abcam، المملكة المتحدة	ab119211	لرؤية نطاق البروتين
Cortisol ELISA Kit	Abcam، المملكة المتحدة	ab154996
Cortisol LFA	داخلي
Hot plate	Daihan Scientific، جمهورية كوريا
Hydrocortisone (Cortisol)	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	PHR1014
Laemmli sample buffer	GenDEPOT، الولايات المتحدة الأمريكية	L1200-001	لتحلل البروتين قبل SDS-PAGE
Membrane holder	GVS Filter Technology	1220950	حامل قطره 13 ملم
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية	1658000	لإلكتروسفوريز الجل
Mucin	Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكية	M2378
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية		لاختبار البروتين
PES membranes	STERLITECH، الولايات المتحدة الأمريكية	PES00313100	PES غشاء مقاس 0.03 ميكرون، 13 ملم
Phosphate-buffered saline (PBS)	DUKSAN، جمهورية كوريا	LB004
Pooled Human Saliva	Innovative Research Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية	IRHUSL5ML
RBCM	داخلي
Resolving Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية	1610798	لتحضير الجل المحلول
Salivette Cortisol	SARSTEDT، ألمانيا	51.1534.500	مجموعة تجميع اللعاب
Stacking Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية	1610799	لتحضير الجل المتدرج
Super•SAL™	Oasis Diagnostics، الولايات المتحدة الأمريكية	SSAL-601	مجموعة تجميع اللعاب
Syringe	koreavaccine، جمهورية كوريا		حجم 1 مل
TEMED	Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية	1610800	لبلمرة الأكريلاميد