يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تعديل N6-ميثيلادينوزين في Rab27A يعزز هشاشة العظام من خلال التأثير على تمايز الخلايا العظمية في نموذج الفأر المبيض الذي تم استئصال المبيض

50 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71964

⸱

أغسطس 11, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يعزز YTHDC1 تصدير السيتوبلازم ل Rab27A المعدل ب m6A، بينما IGF2BP2 يثبت Rab27A في السيتوبلازم، مما يعزز تمايز الخلايا العظمية ويساهم في هشاشة العظام.

الملخص

لقد جذب تطوير علاجات جديدة لهشاشة العظام اهتماما متزايدا. يتم رفع تنظيمات Rab27A أثناء تمايز العظم، وقد برز تعديل N6-ميثيلادينوزين (m6A) كمنظم إيبيجيني مهم في أمراض العظام. تنبأت التحليلات الحيوية بأن Rab27A يحتوي على عدة مواقع تعديل m6A ويتفاعل مع عدة بروتينات مرتبطة ب m6A. أجريت تجارب إسقاطية لتقييم دور Rab27A في تمايز الخلايا العظمية وهشاشة العظام باستخدام نموذج فأر تم استئصال المبيض (OVX). أدى استنزاف Rab27A إلى تخفيف هشاشة العظام وزاد نسبة تكوين العظم من 14.73٪ إلى 28.13٪ (P < 0.05) في فئران OVX. أظهر اختبار Western blotting وPCR الكمي أن إزالة Rab27A قللت من تعبير البروتين والmRNA لعلامات الفصول العظمية TRAP وNFATc1 وc-FOS، مما أدى إلى كبح تمايز الخلايا العظمية للبلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMMs) التي تحفزها عامل محفز مستعمرة البلعم (M-CSF) ومنشط مستقبلات العامل النووي-ليغاند κB (RANKL). أظهر تلوين TRAP أيضا أن استنزاف Rab27A خفض بشكل ملحوظ نشاط TRAP من 24.1٪ إلى 12.9٪ (P < 0.01) بعد تحفيز M-CSF وRANKL. أكدت اختبارات التقرب المناعي للحمض النووي الريبي تفاعلات بين Rab27A وبروتينات قارئ m6A YTHDC1 و IGF2BP2. أظهرت التجزئة النووية والخلوية أن YTHDC1 يسهل تصدير السيتوبلازم لجهاز Rab27A المعدل ب m6A. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت تحليلات q-PCR وWestern Blot أن تقليل YTHDC1 أو IGF2BP2 يقلل من تعبير Rab27A ويقلل من تعبير TRAP وNFATc1 وc-FOS، مما يثبط تمايز الخلايا العظمية الناتج عن M-CSF وRANKL. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن تصدير السيتوبلازم بوساطة YTHDC1 والتثبيت IGF2BP2 لمعدل Rab27A ب m6A يعزز تمايز الخلايا العظمية ويساهم في فقدان العظم في نموذج الفأر OVX.

المقدمة

هشاشة العظام (OP) هي اضطراب هيكلي شائع يتميز بتدهور البنية الدقيقة للعظام وانخفاض كثافة المعادن العظمية، مما يؤدي إلى زيادة خطر الكسور في جميع أنحاءالعالم 1,2,3. تحدث الكسور العظمية بشكل شائع في الساعد وعظم العضد والورك والعمود الفقري، وهي شائعة بشكل خاص بين كبار السن. هذه الشقوق تؤثر بشكل كبير على جودة الحياة وتفرض أعباء جسدية ونفسية واجتماعية واقتصادية كبيرة على المرضى وعائلاتهم وأنظمة الرعاية الصحية3. وبالتالي، تظل الوقاية من هشاشة العظام وإدارتها وعلاجها أولوية رئيسية للصحة السريرية والصحية.

تم تطوير مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات العلاجية لهشاشة العظام ويمكن تصنيفها عموما إلى فئتين: عوامل تكوين العظام والعلاجات المضادة للامتصاص4،5. تشمل الأدوية التقليدية المضادة للامتصاص البيسفوسفونات، والرالوكسيفين، والسترونتيوم رانيلات، بينما تشمل العوامل الأحدث دينوسوماب، أوداناكاتيب، وساراكاتينيب. تشمل علاجات تكوين العظام هرمون الغدة الجار درقية (PTH 1–84)، بينما تخضع عدة مرشحات إضافية مثل MK-5442 وAMG 785 وBHQ 880 لتطوير سريري5. على الرغم من أن هذه العلاجات قد تكون فعالة، إلا أن العديد منها مرتبط بآثار جانبية كبيرة، أو فعالية محدودة على المدى الطويل، أو قيود على الاستخدام المطول 4,6,7,8,9. على سبيل المثال، قد يؤثر الإعطاء طويل الأمد للأمينوبيسفوسفونات والدينوسوماب على إعادة تشكيل العظام الطبيعي5. لذلك، يظل تحديد أهداف علاجية أكثر أمانا وفعالية هدفا مهما في أبحاث هشاشة العظام.

تعد بروتينات راب منظمين رئيسيين لحركة الحويصلات داخل الخلايا وإشارات الخلايا، وتشارك في عمليات بيولوجية متنوعة، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والالتام الذاتي، وتنظيم الهيكل الخلوي10. في السنوات الأخيرة، تم توجيه اهتمام متزايد إلى أدوار بروتينات عائلة راب في استقلاب العظام وهشاشة العظام. تم الإبلاغ عن أن Rab44 ينظم تمايز الخلايا العظمية من خلال تعديل إشارات Ca2⁺ داخل الخلية وتنشيط العامل النووي لخلايا T المنشطة 1 (NFATc1) في منشط المستقبلات للبلاعم المعالجة ب RANKL (RANKL). الخلايا العظمية هي خلايا متعددة النوى مشتقة من سلف سلالة البلاعم وتلعب أدوارا أساسية في امتصاص العظام وتوازن الهيكلالعظمي 12,13,14,15,16,17,18,19. لذلك، فإن فهم الآليات الجزيئية التي تحكم تمايز الخلايا العظمية أمر بالغ الأهمية لتطوير طرق علاجية جديدة لهشاشة العظام.

يعد Rab27A عضوا مهما في عائلة Rab GTPase ويعبر عنه على نطاق واسع في الخلايا الإفرازية والخلايا المناعية. يلعب دورا محوريا في نقل الحويصلات، والإخراج الخلوي، والإشارات داخل الخلية 20,21,22,23,24,25,26,27. أظهرت دراسات سابقة أن Rab27A ينظم إزالة حبيبات الإيوزينوفيل أثناء التهاب مجرى الهواء ويتحكم في حركة الحويصلات المرتبطة بنشاط أوكسيداز NADPH في البلعم المنشطة20.23. ومن الجدير بالذكر أن الأدلة المتراكمة تشير إلى أن تعبير Rab27A يرفع بشكل كبير أثناء تمايز الخلايا العظمية. أفاد شيمادا-سوغاوارا وآخرون أن تعبير Rab27A يزداد أثناء تمايز البلعم المشتقة من نخاع العظم (BMMs) إلى أوركيكاست، مما يشير إلى دور محتمل في تكوين الخلايا العظمية28. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن Rab27A قد يؤثر على تكوين ووظيفة الأروسيوكلاسيت من خلال تنظيم حركة الحويصلات ومسارات الإشارات داخل الخلايا28,29.

يعد N6-ميثيلادينوزين (m6A) أكثر تعديل داخلي وفرة في الحمض النووي الريبي الرسول حقيقي النواة والحمض النووي غير المشفر، ويعمل كمنظم حاسم لعملية أيض الحمض النووي الريبي وتعبير الجينات. باعتباره أول تعديل mRNA تم تحديده في الثدييات، فقد تم ربط m6A بالعديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك استقرار الحمض الريبي، والربط، والنقل، والترجمة. أظهر وانغ وآخرون أن تعديلات m6A، التي تحدث عادة ضمن زخارف تسلسلية محفوظة، يتم التعرف عليها بواسطة البروتينات التي تحتوي على مجال YTH وتساهم في تنظيم استقرار mRNA والأيض30. علاوة على ذلك، تم ربط تعديل m6A بوظائف بيولوجية متنوعة، بما في ذلك استقرار الجينوم، وتنظيم النسخ، وتنظيم الكروماتين، وتطور السرطان، والاستجابات المناعية. كما سلطت الدراسات الحديثة الضوء على أدوار مهمة لإشارات m6A في الأمراض المتعلقة بالعظام وهشاشة العظام32.

من بين بروتينات قارئ m6A، يعمل YTHDC1 كقارئ نووي ينظم معالجة الحمض النووي الريبي وتصدير النواة، بينما يقوم بروتين ربط mRNA 2 (IGF2BP2) بعامل نمو شبيه بالأنسولين بتثبيت النسخ المعدلة ب m6A في السيتوبلازم. أظهر تشين وآخرون أن YTHDC1 يعزز التصدير النووي ل circNSUN2 المعدل ب m6A، والذي يتفاعل لاحقا مع IGF2BP2 لتثبيت mRNA في HMGA2 وتعزيز انتشار سرطان القولون والمستقيم33. تشير هذه النتائج إلى أن التنظيم المنسق من قبل YTHDC1 و IGF2BP2 قد يمثل آلية عامة تتحكم في مصير النسخ المعدلة ب m6A.

بحثت هذه الدراسة في مواقع تعديل m6A المتوقعة داخل mRNA في Rab27A وفحصت تفاعلاته مع YTHDC1 و IGF2BP2. وجد أن YTHDC1 يسهل تصدير نسخ Rab27A المعدلة ب m6A نوويا، بينما IGF2BP2 يتفاعل مع Rab27A في السيتوبلازم ويعزز استقراره. من خلال هذه الآلية التنظيمية، عزز Rab27A تمايز الخلايا العظمية وساهم في تطور هشاشة العظام. تحدد النتائج مجتمعة مسارا تنظيميا معتمدا على m6A لم يكن معروفا سابقا يشمل YTHDC1 و IGF2BP2 وRab27A في تمايز الروسيوكلاست. توفر هذه النتائج رؤى جديدة حول المرض الجزيئي لهشاشة العظام وقد تسهل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف تنظيم Rab27A بوساطة m6A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة حماية واستخدام الحيوان في المستشفى التابع لجامعة ساوثويست الطبية (رقم الموافقة 2024-Ethics-042). أجريت جميع التجارب وفقا لإرشادات ARRIVE، وقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 والإرشادات المرتبطة به، وتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU، والدليل الوطني للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (منشور NIH رقم 8023، معدل 1978). تم توزيع الفئران عشوائيا على مجموعات تجريبية، وتم إخفاء تسلسل التخصيص عن الباحث. تم إجراء جميع عمليات جمع البيانات والتحليلات، بما في ذلك التقييم الأنسيجي، وتحليل الصور بالتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، والتحليلات الإحصائية، بواسطة باحثين أعمى عن تخصيص المجموعات. لم يتم استبعاد أي حيوانات أو عينات من التحليلات. جميع المواد الكيميائية والمعدات والبرمجيات وغيرها من الموارد المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. بناء نموذج استئصال المبيض (OVX)

تم استخدام أربع وعشرين فأرا برية من النوع البري C57BL/6 بعمر 8 أسابيع لوضع نموذج لهشاشة العظام. بعد فترة تأقلم مدتها أسبوع واحد، تم تصنيف الفئران عشوائيا إلى مجموعة شام أو مجموعة OVX. تم تأسيس نموذج OVX من خلال استئصال المبيض الثنائي كما هو موصوف سابقا34,35. خضعت الفئران التي أجريت عمليات صناعية للتعرض الجراحي للمبايض دون إزالتها.

لتوصيل الجينات داخل الفخذ، تم حقن ناقلات الفيروسات العدسية التي تعبر عن sh-Rab27A أو sh-NC بعد 7 أيام من جراحة OVX كما تم الإبلاغ سابقاعن 36,37. باختصار، تم حقن جزيئات الفيروسية العدسية المركزة (1 × 10إلى 6 وحدات تحويل/مل) في عظم الفخذ عبر مسار الرضفة باستخدام إبرة عيار 22 تحت التخدير. تلقى كل فأر 20 ميكرولتر من تعليق الفيروسات العدسية. تم خياطة الشق لاحقا، وتمت مراقبة الحيوانات طوال فترة التعافي.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض محددة. تم جمع عينات عظم الفخذ بعد 8 أسابيع من الجراحة. تم استخدام ما لا يقل عن ستة فئران في كل مجموعة للتحليلات النسيجية واستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين.

2. تصوير الميكرو-CT داخل الجسم الحي

تم إجراء تصوير مقطعي دقيق (ميكرو-CT) لتقييم شكل عظم الترابيكولار. تم فحص عظم الساق الأيمن لكل فأر في الجسم الحي قبل جراحة OVX في عمر 14 أسبوعا. كانت الفحوصات المتابعة تجرى أسبوعيا حتى عمر 22 أسبوعا. تم تضمين ما لا يقل عن ستة فئران في كل مجموعة ضمن تحليل الميكرو-CT.

تم تخدير الفئران باستخدام صوديوم بنتوباربيتال داخل الصفاق (50 ملغ/كجم من وزن الجسم). تم تأكيد التخدير الكافي من خلال غياب رد فعل قرص القدم ومراقبة معدل التنفس باستمرار، وتم الحفاظ عليه طوال عملية التصوير. تم إجراء جميع إجراءات القتل الرحيم وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد، وإرشادات رفاهية الحيوانات المؤسسية، واللوائح الوطنية الخاصة بالقتل الرحيم للحيوانات المختبرية.

في عمر 24 أسبوعا، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد التخدير العميق، وتم جمع كلا عظمتي الظنبوب للفحص خارج الجسم باستخدام نفس بروتوكول التصوير. شملت معلمات المسح حجم فوكسل 10.4 ميكرومتر، جهد 55 كيلو فولت، تيار 145 ميكروأمبير، مجال رؤية 32 مم، 1500/750 عينة لكل إسقاط، وزمن دمج 100 مللي ثانية.

تمت معالجة الصور باستخدام خوارزمية تصحيح تصلب شعاعي متعدد الحدود من الدرجة الثالثة معايرة على فانتوم 1200 ملغ HA/cm3 . تم قياس نسبة حجم العظم (BV/TV)، وسماكة الترابيكولار (Tb.Th)، وعدد الترابيكولار (Tb.N) في الميتافيزيه الفخذي البعيد الواقع على بعد 1.0 مم قريب من صفيحة النمو.

3. نقل البلازميدات

تم توليد بلازميدات sh-Rab27A و sh-NC واستخدامها لإنتاج فيروسات العدس. تم نقل بلازميدات تغليف لينتيفيرال وتركيبات shRNA معا إلى خلايا HEK293T وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحديد عيار الفيروسات قبل الإعطاء داخل الفخذ كما وصف سابقا36. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

4. تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE)

تم تثبيت عينات الفخذ في 4٪ بارافورمالديهيد لمدة 24 ساعة، وتم إزالة الكالسيات ب 10٪ EDTA لمدة 4 أسابيع، وتم تحميها بالتبريد في 30٪ سكروز/PBS، وغرست في البارافين، وقطعت بسمك 5 ميكرومتر. تم صبغ مقاطع الأنسجة بالهيماتوكسيلين والإيوزين وفحصها باستخدام المجهر الضوئي. تم تحليل ما لا يقل عن ستة فئران لكل مجموعة.

5. صبغ فوسفاتاز حمض مقاوم للتارترات (TRAP)

تم إجراء تلوين TRAP لمقاطع الفخذ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة38. تم تقييم نشاط TRAP في البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMMs) باستخدام اختبار تلوين TRAP. تم تعريف الخلايا العظمية الناضجة بأنها خلايا متعددة النوى إيجابية ل TRAP تحتوي على ما لا يقل عن ثلاثة أنوى. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة، كل منها يحتوي على ثلاث نسخ تقنية.

6. Q-PCR

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مادة ترايزول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تصنيع الحمض النووي التكميلي باستخدام إناز النسخ العكسي وخضع لعلاج PCR كمي في الوقت الحقيقي باستخدام كيمياء SYBR Green. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة، كل منها يحتوي على ثلاث نسخ تقنية.

كانت تسلسلات التمهيد كما يلي:

RAB27A: F، TTCCTGCTTGTGTTCGACCT; R، GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

فخ: F، TGTTGACAGCGGTCCATCTA؛ R، CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F، GGTGCTGTGTGGCCATAACT; R, GCGGGAAAGGTGTATCTCAA

C-FOS: F، تاكتاككات CCAGCGA؛ R، GCTGTCACCGTGGGGATATAA

YTHDC1: F، GAAGTGGGAAGCTCTGCATCAG؛ R، TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F، GACTACCCCGACCAGAACTG; R، GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-أكتين: F، GGGAAATCGTGGGGGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. البلوط الغربي

تم تحلل الخلايا أو الأنسجة باستخدام محلول RIPA المكملون بمثبطات البروتيز. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار برادفورد. تم فصل كميات متساوية من البروتين (20 ميكروغرام) بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية بولي فينيليدين فلوريد (PVDF) أو النيتروسيلولوز. تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدهون بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وحضنتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد TRAP، NFATc1، c-FOS، Rab27A، YTHDC1، IGF2BP2، أو β-أكتين. بعد الغسل، تم حضن الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام إجراءات الكشف القياسية. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

8. زراعة الخلايا

تم عزل البلعم المشتقة من نخاع العظم (BMMs) كما تم وصفهاسابقا 39. تم زراعة خلايا نخاع العظم المأخوذة من عظم الفأر خلال الليل في وسط أساسي α الحد الأدنى مع مكمل ب 10٪ من مصل البقر الجنيني، وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم 30 نانوغرام/مل (M-CSF)، و1٪ بنسلين/ستربتوميسين عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂. تم جمع الخلايا غير الملتصقة وزراعتها في نظام خلوي خلوي يحتوي على 30 نانوغرام/مل m-csf. بعد 3 أيام، تم جمع الخلايا الملتصقة كوحدات BMM وزراعة إضافية بوجود 30 نانوغرام/مل m-csf و50 نانوغرام/مل لمنشط مستقبلات للعامل النووي-κB (RANKL) لمدة 72 ساعة لتحفيز تمايز العظام.

9. تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)

تم تصنيع وتحويل الحمض النووي الريبي الصغيرة المتداخلة (siRNAs) باستخدام مادة تحويل دهنية حسب تعليمات الشركة المصنعة. تم زرع الخلايا بكثافة 2 × 10إلى 4 خلايا لكل بئر في صفائح بستة آبار قبل النقل. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

كانت تسلسلات الأهداف كما يلي:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. الفلورة المناعية

تم تثبيت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 20 دقيقة وتم تثبيتها بنسبة 0.1٪ ترايتون X-100 لمدة 10 دقائق. بعد الحجب باستخدام ألبومين مصل بقري بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة، تم حضان الخلايا بأجسام مضادة أولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

بعد الغسيل، تم تطبيق أجسام مضادة ثانوية متقاربة بالفلوروفور لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تلوين النوى بتقنية DAPI، وتم التقاط الصور باستخدام المجهر الكونفوكلي. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

11. الانفصال النووي عن السيتوبلازم

تم عزل الكسور النووية والسيتوبلازمية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحلل الخلايا على الثلج لمدة 10 دقائق ثم تم طرد مركزها عند 500 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم جمع المادة الفائقة التي تحتوي على المكونات السيتوبلازمية، بينما تم غسل ومعالجة الحبيبات التي تحتوي على النوى بشكل منفصل.

12. التفاعل المناعي المرتبط بالبروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي (RIP)

تم إجراء اختبارات التكرار المناعي للحمض النووي الريبي (RIP) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، تم تفكيك الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي، تم حضن السوبرناتورات طوال الليل بالأجسام المضادة وخرز الأغاروز البروتيني A/G. بعد الغسيل، تم تحليل البروتينات المقابلة المناعية بواسطة الضربة الغربية، وتحليل الحمض النووي الريبي المناعي المتوافق باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

13. اختبار استقرار mRNA راب27A

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي عند النقاط الزمنية المحددة IGF2BP2 الإسقاط. تم إجراء النسخ العكسي وPCR الكمي في الوقت الحقيقي لاحقا. تم تطبيع مستويات mRNA في Rab27A إلى مجموعة si-NC المقابلة عند 0 ساعة. تم إجراء ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

14. التحليل الإحصائي

تم إجراء جميع التجارب بشكل مستقل باستخدام ما لا يقل عن ثلاث نسخ بيولوجية. بالنسبة لاختبارات q-PCR، وتداخل RNA، وتلوين TRAP، وWestern Blutting، وغيرها من الفحوصات القائمة على الخلية، تضمن كل نسخة بيولوجية ثلاث نسخ تقنية ما لم يذكر خلاف ذلك. تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD).

تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام GraphPad Prism الإصدار 9.0 وبرنامج SPSS. تم إجراء مقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب ذو الذيلين. تم تحليل المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) تلاها اختبار المقارنة المتعددة بعد الحدث لتوكي لتعديل المقارنات المتعددة. تم اعتبار قيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خفض Rab27A قلل من هشاشة العظام في الجسم الحي.

لدراسة دور Rab27A في هشاشة العظام، تم إجراء إزالة الضرر من Rab27A في نموذج فأر تم استئصال المبيض (OVX) تم تأسيسه باستخدام الطرق المذكورة سابقا34,40. يتم تلخيص التصميم العام للدراسة في الشكل 1. أظهر تحليل التصوير المقطعي الدقيق المحوسوب أن كثافة المعادن العظمية، ونسبة حجم العظم (BV/TV)، وسماكة الترابيكو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تلعب تمايز الخلايا العظمية أدوارا أساسية في إعادة تشكيل العظام، وامتصاص العظام، وإصلاح الكسور، وتوازن الهيكل العظمي12˒15�17�18˒42�43. النشاط المفرط للعظم هو أحد العوامل الرئيسية في هشاشة العظام، مما يجعل تحديد المسارات التنظيمية التي تتحكم في تمايز الخلايا العظمية هدفا بحثيا مهما. أظهرت عدة علاجات مضادة للامتصاص تستهدف وظيفة الأكسيوكلاست فعالية س...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من مشروع التعاون الاستراتيجي العلمي والتكنولوجي بين مستشفى شعب بنغتشو وجامعة الطب في الجنوب الغربي (منحة رقم 2023PZXNYD01) لليان تانغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

المراجع

  1. Kanis JA. Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis: synopsis of a WHO report. WHO Study Group. Osteoporos Int. 1994;4(6):368-81.
  2. Leslie WD, Morin SN. Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis, risk assessment, and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2014;26(4):440-6.
  3. Chen P, Li Z, Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China: a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health. 2016;16(1):1039. doi: 10.1186/s12889-016-3712-7.
  4. Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis. Lancet. 2006;367(9527):2010-8.
  5. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 2011;377(9773):1276-87.
  6. Bone HG, et al. 10 years of denosumab treatment in postmenopausal women with osteoporosis: results from the phase 3 randomised FREEDOM trial and open-label extension. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(7):513-23.
  7. Siris ES, et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. Am J Med. 2009;122(2 Suppl):S3-13.
  8. Cheung EYN, Tan KCB, Cheung CL, Kung AWC. Osteoporosis in East Asia: Current issues in assessment and management. Osteoporos Sarcopenia. 2016;2(3):118-33.
  9. Kohno N, et al. Zoledronic acid significantly reduces skeletal complications compared with placebo in Japanese women with bone metastases from breast cancer: a randomized, placebo-controlled trial. J Clin Oncol. 2005;23(15):3314-21.
  10. Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25.
  11. Yamaguchi Y, et al. Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation. Cell Mol Life Sci. 2018;75(1):33-48.
  12. Xiang Q, et al. Beyond resorption: osteoclasts as drivers of bone formation. Cell Regen. 2024;13(1):22. doi: 10.1186/s13619-024-00205-0.
  13. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science. 2000;289(5484):1504-8.
  14. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev. 1992;13(1):66-80.
  15. Durdan MM, Azaria RD, Weivoda MM. Novel insights into the coupling of osteoclasts and resorption to bone formation. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:4-13.
  16. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003;423(6937):337-42.
  17. Tosun B, et al. Osteoclasts and Macrophages-Their Role in Bone Marrow Cavity Formation During Mouse Embryonic Development. J Bone Miner Res. 2022;37(9):1761-74.
  18. Xie H, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-8.
  19. Hattner R, Epker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodelling. Nature. 1965;206(983):489-90.
  20. Kim JD, et al. An essential role for Rab27a GTPase in eosinophil exocytosis. J Leukoc Biol. 2013;94(6):1265-74.
  21. Goishi K, Mizuno K, Nakanishi H, Sasaki T. Involvement of Rab27 in antigen-induced histamine release from rat basophilic leukemia 2H3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;324(1):294-301.
  22. Johnson JL, et al. Munc13-4 restricts motility of Rab27a-expressing vesicles to facilitate lipopolysaccharide-induced priming of exocytosis in neutrophils. J Biol Chem. 2011;286(7):5647-56.
  23. Ejlerskov P, et al. NADPH oxidase is internalized by clathrin-coated pits and localizes to a Rab27A/B GTPase-regulated secretory compartment in activated macrophages. J Biol Chem. 2012;287(7):4835-52.
  24. Kariya Y, et al. Rab27a and Rab27b are involved in stimulation-dependent RANKL release from secretory lysosomes in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2011;26(4):689-703.
  25. Johnson JL, et al. Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms. Traffic. 2010;11(4):533-47.
  26. Yokoyama K, et al. Rab27a negatively regulates phagocytosis by prolongation of the actin-coating stage around phagosomes. J Biol Chem. 2011;286(7):5375-82.
  27. Jancic C, et al. Rab27a regulates phagosomal pH and NADPH oxidase recruitment to dendritic cell phagosomes. Nat Cell Biol. 2007;9(4):367-78.
  28. Shimada-Sugawara M, et al. Rab27A regulates transport of cell surface receptors modulating multinucleation and lysosome-related organelles in osteoclasts. Sci Rep. 2015;5:9620. doi: 10.1038/srep09620.
  29. Johnson JL, et al. Vesicular trafficking through cortical actin during exocytosis is regulated by the Rab27a effector JFC1/Slp1 and the RhoA-GTPase-activating protein Gem-interacting protein. Mol Biol Cell. 2012;23(10):1902-16.
  30. Wang X, et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 2014;505(7481):117-20.
  31. Boulias K, Greer EL. Biological roles of adenine methylation in RNA. Nat Rev Genet. 2023;24(3):143-60.
  32. Wu Y, et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun. 2018;9(1):4772. doi: 10.1038/s41467-018-06898-4.
  33. Chen RX, et al. N(6)-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):4695. doi: 10.1038/s41467-019-12651-2.
  34. Wu X, et al. Caffeic acid 3,4-dihydroxy-phenethyl ester suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss through inhibition of mitogen-activated protein kinase/activator protein 1 and Ca2+-nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 signaling pathways. J Bone Miner Res. 2012;27(6):1298-308.
  35. Luo J, et al. Regulation of bone formation and remodeling by G-protein-coupled receptor 48. Development. 2009;136(16):2747-56.
  36. Jing H, et al. Epigenetic inhibition of Wnt pathway suppresses osteogenic differentiation of BMSCs during osteoporosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):176. doi: 10.1038/s41419-017-0231-0.
  37. Yang C, et al. TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss. Autophagy. 2022;18(12):2817-29.
  38. Blumer MJ, et al. Role of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in long bone development. Mech Dev. 2012;129(5-8):162-76.
  39. Sakai E, et al. Suppression of RANKL-dependent heme oxygenase-1 is required for high mobility group box 1 release and osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 2012;113(2):486-98.
  40. Roberts BC, et al. PTH(1-34) treatment and/or mechanical loading have different osteogenic effects on the trabecular and cortical bone in the ovariectomized C57BL/6 mouse. Sci Rep. 2020;10(1):8889. doi: 10.1038/s41598-020-65921-1.
  41. Roundtree IA, et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs. Elife. 2017;6. doi: 10.7554/eLife.31311.
  42. Flick LM, et al. Effects of receptor activator of NFkappaB (RANK) signaling blockade on fracture healing. J Orthop Res. 2003;21(4):676-84.
  43. Takeyama K, Chatani M, Takano Y, Kudo A. In-vivo. imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts. Dev Biol. 2014;394(2):292-304.
  44. Yamada H, et al. Effects of 16-month treatment with the cathepsin K inhibitor ONO-5334 on bone markers, mineral density, strength and histomorphometry in ovariectomized cynomolgus monkeys. Bone. 2016;86:43-52.
  45. McClung MR, et al. Odanacatib for the treatment of postmenopausal osteoporosis: results of the LOFT multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial and LOFT Extension study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(12):899-911.
  46. Tao R, et al. Advances in immune mechanisms and developing immune-targeted therapies for osteoporosis: A systematic review. Pharmacol Res. 2025;218:107835. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107835.
  47. Qi Z, Luo J, Xiao Z, Yang D. Functional roles of immune cells in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1698283. doi: 10.3389/fimmu.2025.1698283.
  48. Krzewski K, Cullinane AR. Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders. Exp Cell Res. 2013;319(15):2360-7.
  49. Adnani L, et al. Immune cell infiltration into brain tumor microenvironment is mediated by Rab27-regulated vascular wall integrity. Sci Adv. 2025;11(21):eadr6940. doi: 10.1126/sciadv.adr6940.
  50. Brauer N, et al. Immunodeficiency with susceptibility to lymphoma with complex genotype affecting energy metabolism (FBP1, ACAD9) and vesicle trafficking (RAB27A). Front Immunol. 2023;14:1151166. doi: 10.3389/fimmu.2023.1151166.
  51. Ramadass M, Catz SD. Molecular mechanisms regulating secretory organelles and endosomes in neutrophils and their implications for inflammation. Immunol Rev. 2016;273(1):249-65.
  52. Menasche G, et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. 2000;25(2):173-6.
  53. Prashar A, Schnettger L, Bernard EM, Gutierrez MG. Rab GTPases in Immunity and Inflammation. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:435. doi: 10.3389/fcimb.2017.00435.
  54. Stinchcombe JC, et al. Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J Cell Biol. 2001;152(4):825-34.
  55. Catz SD. The role of Rab27a in the regulation of neutrophil function. Cell Microbiol. 2014;16(9):1301-10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

البلعميات النخاعيةصبغ TRAPلطخة ويسترنYTHDC1IGF2BP2
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.