يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ينتشر طور DNA-FISH لتمييز الحمض النووي خارج الكروموسوم عن المناطق المتجانسة في خطوط الخلايا السرطانية البشرية

390 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

أغسطس 4, 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

نبلغ عن بروتوكول انتشار الطور الميتا DNA-FISH الذي يكتشف بصريا عدد نسخ الموقع وموقعه داخل الجينوم. يتيح هذا النهج من حل حالات التضخيم في خلية واحدة، خاصة في خطوط الخلايا السرطانية التي تحتوي على حمض نووي خارج الكروموسوم ومناطق التلوين المتجانسة.

الملخص

يحدد تسلسل الجينوم الكامل تضخيم الحمض النووي البؤري بدقة زوج القاعدة، لكنه لا يستطيع تحديد ما إذا كانت التسلسلات المضخمة موجودة على الحمض النووي خارج الكروموسوم (ecDNA، المعروف أيضا بالدقائق المزدوجة) أو ضمن مناطق التلوين المتجانسة المتكاملة الكروموسومية (HSRs). تظل انتشارات الطور الفائق في التهجين الميضعي للحمض النووي (DNA-FISH) المعيار الذهبي لتمييز هذه الحالات في التضخيم عند دقة خلية واحدة. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لانتشار الطور الفوقي DNA-FISH باستخدام خطوط خلايا السرطان البشرية، ويشمل زراعة الخلايا، توقف الطور الميتافي، العلاج بنقص التوتر، التثبيت، انتشار الكروموسومات، تهجين المجسات الفلورية، والتصوير الفلوري. يتضمن البروتوكول خطوات مراقبة جودة وسيطة للتحقق من نجاح التشتت الكروموسومي وتحسين جودة انتشار الطور الفوقي، مما يجعل سير العمل متاحا للمختبرات التي لا تملك خبرة متخصصة في علم الوراثة الخلوية. تظهر النتائج تصورا واضحا لحالات تضخيم ecDNA وHSR باستخدام مجسات خاصة بالموقع وتوضح العيوب التقنية الشائعة التي يمكن أن تؤثر على التفسير. يوفر هذا البروتوكول نهجا قويا وقابلا للتكرار لدراسة التنظيم الهيكلي لتضخيم الجينات المسرحية في خلايا السرطان.

المقدمة

الجينوم البشري منظم ليس فقط حسب تسلسله، بل أيضا حسب بنيته، والتغيرات في التسلسل أو البنية يمكن أن تؤدي إلى السرطان 1,2,3,4. تضخيم الجينات المسرطمة موجود في حوالي 40٪ من جميع الأورام، حيث يساهم في بدء الورم، ونموه، وانتشاره، ومقاومة الأدوية5. في بعض الحالات، تحمل الجينات المسرمة المضخمة على الحمض النووي خارج الكروموسوم (ecDNAs، وتسمى أيضا الدقائق المزدوجة)، وهي عناصر دائرية ذاتية التكاثر وثنائية السلسلة تقع خارج الكروموسومات الخطية 6,7,8,9. الحمض النووي الكبير (ecDNA) هو مئات الكيلوبازات إلى القواعد الضخمة بحجم10,11. وبسبب نقص السنتروميرات، فهي تتفرق بشكل غير متماثل أثناء الانقسام الميتوزي، مما يؤدي إلى ما يصل إلى 100+ نسخة في نواة واحدة 12,13,14,15,16,17,18. هذا الفصل غير المتساو يولد تباين في عدد النسخ عبر الخلايا الابنية، مما يدفع تطور الأورام السريع ونتائج المرضى السيئة17,19.

توجد ecDNAs في علاقة ديناميكية مع مناطق التلوين المتجانسة (HSRs) (الشكل 1A)8,18. ال HSRs هي تضخيم مركزي داخل الكروموسومات يمكن أن تنشأ من خلال إعادة دمج ecDNA في موقع واحد في الجينوم 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. هاتان الحالتان، ecDNAs وHSRs، يمكن أن يتداخلان، مما يكشف أن تضخيم الجين الأورامي هو مرن هيكلي24، 25، 32، 33. لهذا التحويل الداخلي أهمية علاجية لأن ECDNA يمكنها الانتقال إلى حالة HSR في وجود الأدوية32، 33، 34، 35، 36، 37، 38. الخلايا التي تمر بهذا الانتقال إلى حالة HSR تصبح مقاومة للدواء تحت ضغط علاجي33. يبدو أيضا أن الهرمونات السريعة أكثر شيوعا في الأورام الخبيثة مقارنة بالأورام الحميدة. على الرغم من أهميتها السريرية، لا تستهدف أي استراتيجيات معتمدة من إدارة الغذاء والدواء حالة تسريع سرعة البشرة، جزئيا لأن طرق التمييز بين هذه الهياكل الضخمة لا تزال غير مستغلة بشكل كاف.

على الرغم من أن حالات ecDNA وHSR لهما عواقب سريرية مميزة، إلا أن طرق التسلسل الحالية لا يمكنها التمييز بينهما بشكل موثوق. يحدد تسلسل الجينوم الكامل (WGS) الآن المناطق المضخمة بدقة زوج الأساس40. كان WGS ذا قيمة في تحديد تركيب التسلسل لعناصر ecDNA وHSRs، ولكن على حساب الدقة المكانية. على عكس الأساليب الخلوية التقليدية، لا يمكن ل WGS وحده تحديد ما إذا كان التسلسل المضخم موجودا على ecDNA أو مدمج في كروموسوم كHSR 41,42,43. وبالتالي، تظل الطرق التي تحافظ على السياق المكاني للتضخيم ضرورية لفهم بيولوجيا هذه الحالات المختلفة.

على مدى الأربعين عاما الماضية، كانت انتشارات الطور الفوقي بالفلورة في الحمض النووي DNA-FISH المعيار الذهبي لتحديد وتمييز حالات تضخيم ecDNA وHSR 42,44,45,46. في الواقع، تم تحديد وتوصيف ecDNA وHSR لأول مرة من خلال تحليلات خلاوية قائمة على الطور الفوقي 7,47. قبل الاستخدام الواسع للمجسات الفلورية، كان يتم التهجين في الموقع باستخدام مجسات DNA مصنفة إشعاعيا، والتي استخدمت أيضا لرؤية ecDNA وHSRs48,49. مع تزايد شعبية WGS، أصبحت انتشارات الطور الفوقي DNA-FISH أقل شيوعا. تنتشر العديد من جوانب سير العمل عبر الأدبيات الوراثية الخلوية، وعادة ما تحتفظ البروتوكولات المحسنة داخل مجموعات بحثية فردية أو مختبرات علم الوراثة الخلوية التي تعامل الطريقة كنوعخاص من 50,51. هنا، نصف بروتوكول انتشار الطور الفوقي DNA-FISH لحل حالة التضخيم بصريا على مستوى الخلية الواحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا البشرية وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. إيقاف الخلايا في الطور الفوقي باستخدام الكولسيميد (N-ميثيل-N-دي أسيتيل-كولشيسين)

  1. ابدأ بحوالي 2.0 × 106–2.0 × 107 خلايا سرطانية أو خلايا مزروعة أخرى. قلة الخلايا ستؤدي إلى انتشار ميتاطور أقل، بينما قد يؤدي عدد الخلايا الكبير إلى عدم التثبيت بشكل كاف.
  2. تحديد الوقت المناسب لحضانة الكولسيميد للنظام التجريبي. يؤثر وقت الحضانة على عدد الانتشارات الميتاطورية التي تم الحصول عليها وطول الكروموسومات، وتختلف الظروف المثلى بين أنواع الخلايا.
    ملاحظة: تؤدي أوقات الحضانة الأقصر إلى توقف عدد أقل من الخلايا في مرحلة التحول الفوقية وقت الجمع. فترات الحضانة الأطول تنتج كروموسومات أكثر تكثفا بأذرع أقصر، مما يجعل التحليل أكثر صعوبة. بالنسبة لخطوط الخلايا السرطانية التي يبلغ وقت تضاعفها تقريبا 24 ساعة، تنتج فترات الحضانة التي تتراوح من 45 دقيقة إلى الليل انتشارات ميتاطور مناسبة. تحسين وقت الحضانة للخلايا ذات أوقات الضعف البطيئة. حضانة لمدة ساعتين عادة ما تكون كافية لإنتاج عدد كاف من انتشارات الطور الفوقي بأطوال كروموسومات مناسبة للتحليل.
  3. احسب كمية الكولسيميد المطلوبة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرولتر/مل في وسط زراعة الخلايا المناسب.
    ملاحظة: حافظ على الخلايا في النمو اللوغاريتمي عن طريق تمريرها أو زرعها قبل توقف الطور الميتافوري على الأقل 24 ساعة. عالج الخلايا بالكولسيميد عندما تصل الزراعة إلى 70٪–90٪ تلتقي الآن.
  4. قم بتخفيف محلول كولسيميد بنسبة 1:1 بماء فائق النقاء المعقم. أضف الحجم المناسب إلى الزراعة وحضن لمدة 45 دقيقة حتى طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا.

2. حصاد الخلايا

  1. حضر مثبت كارنوي الطازج (3:1 الميثانول: حمض الخليك). حافظ على المثبت على التجميد طوال عملية التثبيت.
  2. حضر محلول طازج بوزن 0.075 متر كيلو سي لتر وسخنه في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  3. اجمع الخلايا كحبيبات وسجل عدد الخلايا. استخدم هذه القيمة لحساب حجم إعادة التعليق النهائي.
    ملاحظة: فصل الخلايا الملتصقة عن طريق التريبسين. نقل خلايا التعليق مباشرة إلى أنابيب طرد مركزي بسعة 15 مل. التخلص من الوسائط التي تحتوي على كولسيميد وكولسميد وفقا لإرشادات النفايات الخطرة المؤسسية.
  4. اغسل الخلايا ب PBS.
  5. أعد تعليق الخلايا بلطف في 10 مل من حرارة 0.075 ميل كيلو سيلتر وامزج بعكس لطيف. يؤدي هذا العلاج المنخفض التوتر إلى تورم الخلايا، مما يسمح لها بتمزق وتشتت الكروموسومات أثناء تحضير الشريحة.
  6. حضن الخلايا في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. أضف ببطء 2 مل من مثبت كارنوي البارد جدا مع خلط التعليق بلطف عن طريق الانقلاب.
  8. اترك الخلايا تدوم لمدة 5 دقائق.
  9. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  10. استنشق السوبرناتانت بحذر أو أزلها باستخدام ماصة.
  11. أضف ببطء 10 مل من مثبت كارنوي البارد بكميات 0.5 مل مع خلط خفيف بعد كل إضافة.
  12. دع الخلايا تقف لمدة 10 دقائق عند RT.
  13. الطرد المركزي عند 650 × جرام لمدة 5 دقائق في RT.
  14. كرر الخطوات 2.10–2.13 مرتين
  15. خلال الغسل النهائي، اترك الخلايا معلقة في مثبت كارنوي.
    توقف: تخزين نظام التعليق الثابت عند −20 درجة مئوية أو انتقل فورا إلى القسم 3.
    ملاحظة: بالنسبة للعينات التي تحتوي على أقل من حوالي 3 × 10إلى 6 خلايا، قم بالتثبيت في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل بدلا من الأنابيب المخروطية الأكبر. تقليل أحجام 0.075 مليون كيلو سي لتر وقوة تثبيت كارنوي 10 أضعاف مع الحفاظ على جميع أوقات الحضانة ودرجات الحرارة وظروف الطرد المركزي.

3. سقوط الطاولة

  1. استرجع العينة من −20 درجة مئوية وذوبها إلى RT.
  2. الطرد المركزي عند 800 × جرام لمدة 7 دقائق في RT.
  3. ضع علامة على شرائح الزجاج وضعها على الثلج.
  4. باستخدام عدد الخلايا الذي تم الحصول عليه قبل التثبيت، احسب حجم مثبت كارنوي المطلوب لإعادة تعليق الحبيبة بتركيز نهائي يقارب 5 × 106 خلايا/مل. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المادة الفائقة بعناية باستخدام ماصة، مع ترك الحجم المحسوب للمثبت فوق الحبيبة.
  5. أعد تعليق الخلايا الثابتة في مثبت كارنوي باستخدام ماصة P1000.
  6. نقل حوالي 300 ميكرولتر من نظام التعليق الثابت الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
  7. أعد تعليق العينة جيدا باستخدام ماصة P200 عن طريق التوصيل لأعلى وأسفل عدة مرات.
  8. استنشاق 60 ميكرولتر من الخلايا المعلقة باستخدام مزاة P200.
  9. امسك طرف الماصة على ارتفاع حوالي متر واحد فوق شريحة الزجاج على الثلج وصوب نحو مركز الشريحة.
  10. قم بقطرة واحدة من تعليق الخلية ببطء على السلايد.
    ملاحظة: ضع علامة على موقع السقوط على حافة الشريحة بعلامة مقاومة للإيثانول لتسهيل التعرف عليها خلال الخطوات التالية.
  11. دع الخلايا تجف على الثلج لمدة 10 دقائق.
  12. ضع الشرائح على حاضنة منزلقات عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  13. أزل الشرائح باستخدام الملقط واتركها تبرد عند اللمس.
  14. افحص الشرائح باستخدام مجهر تباين الطور بهدف 10× أو 20×. تأكيد وجود عدة انتشارات ميتاطورية متفرقة جيدا دون تداخل مفرط.

4. معالجة الشريحة مسبقا

  1. جهز برطمانات كوبلن لخطوات الغسيل
    1. حضر كل كاشف طازجا: 70٪ حمض الأسيتيك (40 مل)، PBS (40 مل)، PBS (45 مل)، 70٪ إيثانول (40 مل)، 85٪ إيثانول (40 مل)، و100٪ إيثانول (40 مل).
  2. ضع شرائح الزجاج في حمض الأسيتيك 70٪ لمدة دقيقتين.
  3. ضع شرائح الزجاج في 40 مل من PBS لمدة 30 ثانية.
  4. ضع شرائح الزجاج في 45 مل من PBS لمدة 5 دقائق.
  5. جفف الزجاج بشكل متسلسل بمحلول 70٪، 85٪، و100٪ إيثانول لمدة دقيقة لكل منها.
  6. جفف الشرائح في الهواء عند RT لمدة 10 دقائق.

5. جهز المسبار

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مجسات DNA-FISH الخاصة بالمواقع التجارية المتوفرة تجاريا وتتهجين إلى منطقة جينومية ذات اهتمام.

  1. اختر مسبارا يستهدف الموقع المضخم ليتم فحصه. قم بإذابة المجس ومخزن التهجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اسمح للمجس بالوصول إلى RT قبل الاستخدام.
  2. جهز خليط مجسات يحتوي على 1 ميكرولتر من المجس و4 ميكرولتر من مخزن التهجين لكل شريحة زجاجية.
    ملاحظة: قد يعتمد التركيز الأمثل للمسبار على الشركة المصنعة والمجس. تم تحسين التركيز المحدد هنا وفقا للمجسات المستخدمة في هذه الدراسة. ومع ذلك، قم بتحسين تركيز المجس لكل موقع جديد.
  3. ضع 5 ميكرولتر من خليط المجس/محلول التهجين على مركز كل نقطة سقوط على شريحة الزجاج.
    ملاحظة: المجسات حساسة للضوء. قلل من تعرض الضوء طوال بقية العملية عن طريق تخزين الشرائح في درج مظلم بين الخطوات وأثناء معالجة شرائح أخرى.
  4. ضع غطاء غطاء فوق العينة بعناية.
  5. أغلق حواف الغطاء بالأسمنت المطاطي.
  6. ضع شرائح الزجاج في غرفة رطبة.
  7. قم بتهجين المجس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. السماح بالتهجين يستمر طوال الليل (12–18 ساعة).

6. الغسولات بعد التهجين، التلوين المضاد، التركيب، والتصوير

  1. جهز برطمانات كوبلن لخطوات الغسيل
    1. حضر كل مادة كيميائية طازجة: 2× SSC (40 مل)، 0.4× SSC (40 مل)، 70٪ إيثانول (40 مل)، 85٪ إيثانول (40 مل)، 100٪ إيثانول (40 مل)، وPBS (45 مل).
    2. حضر وتخزين SSC كمحلول مخزون 20× (3 M NaCl، 0.3 M سترات الصوديوم، pH 7.0). لتحضير 1 لتر، قم بإذابة 175.3 جرام من NaCl و88.2 جرام من سترات الصوديوم في 1 لتر من الماء فائق النقي. قم بتخفيف المخزون لتحضير حلول عمل 2× SSC و0.4× SSC حسب الحاجة.
  2. سخن محلول SSC 0.4× إلى 72 درجة مئوية في حمام ماء.
  3. قم بإزالة شرائح الزجاج من الحجرة الرطبة وإزالة الأسمنت المطاطي بعناية.
  4. ضع شرائح الزجاج في 2× SSC لمدة دقيقتين عند RT. أزل الأغطية بعناية.
  5. ضع شرائح الزجاج في درجة حرارة 0.4× SSC المسخنة مسبقا على 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  6. ضع شرائح الزجاج في 2× SSC لمدة دقيقة واحدة عند RT.
  7. جفف الزجاج بشكل متسلسل بمحلول 70٪، 85٪، و100٪ إيثانول لمدة دقيقة لكل منها.
  8. جفف السلايدات في الهواء عند RT لمدة 10 دقائق في الظلام.
  9. قم بتخفيف 1 ملغ/مل DAPI 1:1000 في PBS إلى حجم نهائي 1 مل.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذا العليكوات عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  10. مدارا بمقدار 10 ميكرولتر من DAPI المخفف على كل شريحة زجاجية في موقع السقوط المحدد.
  11. ضع غطاء غطاء بعناية فوق العينة لضمان انتشار محلول DAPI بشكل متساو.
  12. احتضن الزلاجات في الظلام لمدة 5–10 دقائق.
  13. ضع شرائح الزجاج في PBS لمدة 30 ثانية.
  14. أزل الأغطية.
  15. ضع شرائح الزجاج في PBS لمدة دقيقتين.
  16. جفف شرائح الزجاج عن طريق غمسها لفترة وجيزة في 70٪، 85٪، و100٪ إيثانول لمدة تقارب 10 ثوان لكل منها.
  17. جفف السلايدات في الهواء عند RT لمدة 10 دقائق في الظلام.
  18. أضف 15 ميكرولتر من وسط التثبيت إلى كل شريحة زجاجية، ثم ضع غطاء منزلق فوقه.
  19. دع وسط التثبيت ينتشر بشكل متساو، ثم امسح بلطف أي فائض.
  20. أغلقي حواف غطاء الغطاء بطلاء الأظافر.
  21. اتركي طلاء الأظافر ليجف لمدة 15 دقيقة عند RT في الظلام.
    توقف: تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأمد.
  22. تخيل الشرائح.
    ملاحظة: تم التقاط الصور باستخدام مجهر فلوري مقلوب بهدف غمر زيتي بزاوية 60×.
  23. اجمع عدة مكدسات z لكل قناة فلورية لالتقاط الإشارة عبر عمق انتشار الطور الميتا.
  24. قم بفك تشكيل أكوام الصور باستخدام خوارزمية تقدير الاحتمالية القصوى لتعزيز وضوح الإشارة وتقليل الفلورة خارج نطاق التركيز.
  25. قم بمعالجة وتحليل الصور النهائية في ImageJ، واختر المستوى البؤري الأمثل لكل انتشار ميتا في الطور قبل التحليل اللاحق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ينتج هذا البروتوكول (الشكل 1B) كروموسومات ميتاطورية نظيفة، متفرقة جيدا، وسليمة مناسبة للتحليل الخلوي، مع رؤية الكروموسومات وإشارات DNA-FISH بوضوح بواسطة المجهر الفلوري. يعد استخدام مجهر الحقل الساطع/التباين الطور بتكبير منخفض (10× أو 20×) خطوة مهمة في مراقبة الجودة للتحقق من أن النوى قد انفجرت وتشتت الكروموسومات (الشكل 2). يجب أن يؤدي التثبيت الناجح وسقوط الطاولة إلى انتشار الطور الميتافوري موزع جيدا مع عدة انفجارات كروموسومات م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من مزاياها المثبتة، فإن انتشارات الطور الميتافوري DNA-FISH غير مستخدمة بشكل كاف في عصر WGS. التنظيم الفيزيائي للحمض النووي المضخم له أهمية وظيفية، حيث يمكنه التأثير على السلوك البيولوجي اللاحق والاستجابة العلاجية 61,62,63,64. يمكن أن توجد جينات أوراك مضخمة فوكليات على ecDNA أو داخل HSRs، وهاتان الحالتان للتضخيم ليستا متكافئتين وظيفيا 14,65,66,67.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل من قبل R00HG011467 NIH وCPRIIT RR23004 إلى G.S.E. وقد تم دعم التصوير لهذا المشروع من قبل مركز المجهر المتكامل في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (P30 DK056338، P30 CA125123، S10OD030414). يشكر المؤلفون الدكتور بافل ستانكيفيتش على نصائحه في البداية. كما يشكر المؤلفون الدكتور بول ميشيل (جامعة ستانفورد) على توفير خطوط خلايا GBM39ec وGBM39hsr.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15-mL conical centrifugeأي مصدرNAالطرد المركزي. 
15-mL conical tubesأي مصدرNAجمع الخلايا.
200 proof ethanolأي مصدرNAخطوات الغسل. 
Acetic Acid, glacial, 99.7%Millipore Sigma695092مثبت كارنوي وخطوات غسل الشريحة.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087تركيب الشريحة بعد الانتهاء من إعداد الشريحة
Biological safety cabinet with vaccum outletأي مصدرNAتخزين المواد الكيميائية.
Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)Millipore Sigma10295892001يرتبط بالتوبيولين، يوقف الخلايا في المرحلة الاستوائية.
Coplin jarsأي مصدرNAخطوات الغسل. 
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Milipore SigmaD8417-1MGصبغة فلورية للحمض النووي.
EGFR/CON7 FISH probe Empire GenomicsEGFR-CHR07مسبار فلوريسنت محدد للموضع. 
Elmer's rubber cementأي مصدرNAللحفاظ على الشريحة الزجاجية في مكانها أثناء تهجين المسبار الليلي.
Ethanol resistant permanent markerأي مصدرNAتوصيف الشريحة.
Fluorescent microscopeأي مصدرNAتصوير الشريحة. 
Glass Cover Slip, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780تهجين المسبار على الشريحة.
Glass Slide, precleanedVWR48311-703لإسقاط انتشارات المرحلة الاستوائية وإجراء التهجين الفلوري للحمض النووي.
Humidified CO2 Incubatorأي مصدرNAحضانة الخلايا الحية.
Hybridization BufferEmpire GenomicsHyb-Bufferالمحلول المستخدم مع المسبار. 
Ice bucketأي مصدرNAللحفاظ على مثبت كارنوي بارد. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640Gتضخم الخلايا قبل التثبيت. 
Methanol, 99.9%, HPLC gradeMillipore Sigma1060351000للمثبت كارنوي. 
Microcentrifugeأي مصدرNAالطرد المركزي. 
Microcentrifuge tubesأي مصدرNAللخلايا أثناء التثبيت، ولتحضير المسبار. 
MYC / SE 8 ProbeLeicaKI-10106مسبار فلوريسنت محدد للموضع. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023خطوات الغسل. 
Phase contrast microscopeأي مصدرNAتصوير انتشارات المرحلة الاستوائية فور إسقاطها
Pipette tipsأي مصدرNAالاستخلاص.
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888للمحلول المعياري لـ SSC.
Sodium citrateMillipore Sigma567446للمحلول المعياري لـ SSC.
Sterile ultrapure waterأي مصدرNAخطوات الغسل. 
ThermoBrite programmable slide incubatorأي مصدرNAحضانة الشريحة.
Tongsأي مصدرNAلخطوات غسل الشريحة. 
Water bathأي مصدرNAلحضانة KCl. 

المراجع

  1. Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006;22:447-455.
  2. Bagci O, Kurtgöz S. Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. N Am J Med Sci. 2015;7:341-346.
  3. Schimke RT, et al. Gene amplification and drug resistance in cultured animal cells. Cancer Treat Rev. 1984;11:9-17.
  4. Baker TM, Waise S, Tarabichi M, Van Loo P. Aneuploidy and complex genomic rearrangements in cancer evolution. Nat Cancer. 2024;5:228-239.
  5. Ohshima K, et al. Integrated analysis of gene expression and copy number identified potential cancer driver genes with amplification-dependent overexpression in 1,454 solid tumors. Sci Rep. 2017;7:641.
  6. Pecorino LT, Verhaak RGW, Henssen A, Mischel PS. Extrachromosomal DNA (ecDNA): An origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50:1911-1920.
  7. Cox D, Yuncken C, Spriggs AI. Minute chromatin bodies in malignant tumours of childhood. Lancet. 1965;286:55-58.
  8. Kohl NE, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell. 1983;35:359-367.
  9. Giollant M, et al. Characterization of double minute chromosomes' DNA content in a human high-grade astrocytoma cell line using comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 1996;98:265-270.
  10. Stephens PJ, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144:27-40.
  11. Zhang CZ, et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015;522:179-184.
  12. Lange JT, et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 2022;54:1527-1533.
  13. Turner KM, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543:122-125.
  14. Wu S, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575:699-703.
  15. Deshpande V, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 2019;10:392.
  16. Levan A, Levan G. Have double minutes functioning centromeres? Hereditas. 1978;88:81-92.
  17. Stöber MC, et al. Intercellular extrachromosomal DNA copy-number heterogeneity drives neuroblastoma cell state diversity. Cell Rep. 2024;43:114711.
  18. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Amplified dihydrofolate reductase genes in unstably methotrexate-resistant cells are associated with double minute chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:5669-5673.
  19. Kim H, et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 2020;52:891-897.
  20. Schlesinger HR, et al. Establishment and characterization of human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1976;36:3094-3100.
  21. Balaban-Malenbaum G, Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science. 1977;198:739-741.
  22. Gilbert F, et al. Homogeneously staining region in a retinoblastoma cell line: Relevance to tumor initiation and progression. J Natl Cancer Inst. 1981;67:301-306.
  23. Quinn LA, Moore GE, Morgan RT, Woods LK. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979;39:4914-4924.
  24. Montgomery KT, Biedler JL, Spengler BA, Melera PW. Specific DNA sequence amplification in human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:5724-5728.
  25. Singer MJ, et al. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7921-7926.
  26. Shimizu N. Gene amplification and the extrachromosomal circular DNA. Genes (Basel). 2021;12:1533.
  27. Carroll SM, et al. Double minute chromosomes can be produced from precursors derived from a chromosomal deletion. Mol Cell Biol. 1988;8:1525-1533.
  28. Alitalo K, et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:1707-1711.
  29. George DL, Powers VE. Amplified DNA sequences in Y1 mouse adrenal tumor cells: Association with double minutes and localization to a homogeneously staining chromosomal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1597-1601.
  30. Storlazzi CT, et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome Res. 2010;20:1198-1206.
  31. Biedler JL, Meyers MB, Spengler BA. Homogeneously staining regions and double minute chromosomes, prevalent cytogenetic abnormalities of human neuroblastoma cells. In: Fedoroff S, Hertz L, editors. Advances in Cellular Neurobiology. Academic Press; New York, NY; 1983. p. 267-307.
  32. Shoshani O, et al. Chromothripsis drives the evolution of gene amplification in cancer. Nature. 2021;591:137-141.
  33. Nathanson DA, et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 2014;343:72-76.
  34. Song K, et al. Plasticity of extrachromosomal and intrachromosomal BRAF amplifications in overcoming targeted therapy dosage challenges. Cancer Discov. 2022;12:1046-1069.
  35. Kang X, et al. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with the DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025;188:3405-3421.e27.
  36. Pommier Y, Nussenzweig A, Takeda S, Austin C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:407-427.
  37. Coquelle A, et al. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. Cell. 1997;89:215-225.
  38. Coquelle A, et al. A new role for hypoxia in tumor progression: Induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex double minutes and homogeneously staining regions. Mol Cell. 1998;2:259-265.
  39. Mandahl N, Mertens F, Mitelman F. Gene amplification in neoplasia: A cytogenetic survey of 80,131 cases. Genes Chromosomes Cancer. 2024;63:e23214.
  40. Roepman P, et al. Clinical validation of whole genome sequencing for cancer diagnostics. J Mol Diagn. 2021;23:816-833.
  41. Ho SS, Urban AE, Mills RE. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet. 2020;21:171-189.
  42. Rajkumar U, et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 2019;21:428-435.
  43. Purshouse K, Pollard SM, Bickmore WA. Imaging extrachromosomal DNA (ecDNA) in cancer. Histochem Cell Biol. 2024;162:53-64.
  44. Shapiro DN, et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization: Diagnostic utility for neuroblastoma. Am J Pathol. 1993;142:1339-1346.
  45. Krupina K, et al. Chromothripsis and ecDNA initiated by N4BP2 nuclease fragmentation of cytoplasm-exposed chromosomes. Science. 2025;390:1156-1163.
  46. Trask BJ, Hamlin JL. Early dihydrofolate reductase gene amplification events in CHO cells usually occur on the same chromosome arm as the original locus. Genes Dev. 1989;3:1913-1925.
  47. Biedler JL, Spengler BA. A novel chromosome abnormality in human neuroblastoma and antifolate-resistant Chinese hamster cell lines in culture. J Natl Cancer Inst. 1976;57:683-695.
  48. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:5553-5556.
  49. Gapski GR, et al. Synthesis of a fluorescent derivative of amethopterin. J Med Chem. 1975;18:526-528.
  50. Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromosome preparation. In: Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. Pergamon Press; 1989. p. 4-45.
  51. Moorhead PS, et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960;20:613-616.
  52. Ohara H, Terasima T. Colcemid effects on mitotic synchrony and synchronized cells. Cell Struct Funct. 1976;1:187-195.
  53. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Loss and stabilization of amplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol Cell Biol. 1981;1:1084-1093.
  54. Marsden CG, Dragon JA, Wallace SS, Sweasy JB. Base excision repair variants in cancer. Methods Enzymol. 2017;591:119-157.
  55. Nichols A, et al. Chromosomal tethering and mitotic transcription promote ecDNA nuclear inheritance. Mol Cell. 2025;85:2839-2853.e8.
  56. Henegariu O, et al. Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging, and gradual denaturing. Cytometry. 2001;43:101-109.
  57. Lichter P, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 1988;80:224-234.
  58. Pinkel D, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:9138-9142.
  59. Sumner AT, Evans HJ, Buckland RA. New technique for distinguishing between human chromosomes. Nature New Biol. 1971;232:31-32.
  60. Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. 2014;e50203.
  61. Cavalli G, Misteli T. Functional implications of genome topology. Nat Struct Mol Biol. 2013;20:290-299.
  62. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: The genomic organization of cellular differentiation. Genes Dev. 2004;18:1371-1384.
  63. Sehgal P, Chaturvedi P. Chromatin and cancer: Implications of disrupted chromatin organization in tumorigenesis and its diversification. Cancers (Basel). 2023;15:466.
  64. Misteli T. Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell. 2007;128:787-800.
  65. Zhu Y, et al. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39:694-707.
  66. Hung KL, et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 2021;600:731-736.
  67. Taghbalout A, et al. Extrachromosomal DNA associates with nuclear condensates and reorganizes chromatin structures to enhance oncogenic transcription. Cancer Cell. 2025;43:2191-2205.e6.
  68. Hsu TC, Pomerat CM. Mammalian chromosomes in vitro: II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. J Hered. 1953;44:23-30.
  69. Erwin GS, Bhimsaria D, Eguchi A, Ansari AZ. Mapping polyamide-DNA interactions in human cells reveals a new design strategy for effective targeting of genomic sites. Angew Chem. 2014;126:10288-10292.
  70. Erwin GS, et al. Synthetic genome readers target clustered binding sites across diverse chromatin states. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E7418-7427.
  71. Erwin GS, et al. Synthetic transcription elongation factors license transcription across repressive chromatin. Science. 2017;358:1617-1622.
  72. Erwin GS, et al. Recurrent repeat expansions in human cancer genomes. Nature. 2023;613:96-102.
  73. Shimizu N, Kanda T, Wahl GM. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 1996;12:65-71.
  74. Jaworski JJ, et al. ecDNA replication is disorganized and vulnerable to replication stress. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf711.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

علم الأحياءالعدد 234العدد 234قيمة فارغةالعددالتهجين الموضعي المتألقانتشار الطور الاستوائيكروموسومالحمض النووي خارج الكروموسوماتمنطقة التلوين المتجانسHSRالنمط النوويتضخيم الجينات
ينتشر طور DNA-FISH لتمييز الحمض النووي خارج الكروموسوم عن المناطق المتجانسة في خطوط الخلايا السرطانية البشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.