يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قوة وإطالة إشارة TCR في تنشيط وتمايز خلايا T من نوع CD8+ الأولية في الفئران: نهج معياري في المختبر

150 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

أغسطس 25, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة منهجية لتنشيط خلايا CD8 الساذجة الأولية المستخلصة من الفئران+ خلايا T باستخدام نهج تحفيز متدرج لمستقبلات الخلايا T، مما يتيح تحليلاً شاملاً لتكاثر وتنشيط وإنتاج السيتوكينات في خلايا CD8+ خلايا T عبر كثافات إشارات مستقبلات الخلايا T المختلفة.

الملخص

تُعد شدة ومدة إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) من المحددات الحاسمة لتنشيط الخلايا التائية CD8⁺ وتكاثرها وتمايزها الوظيفي. ومع ذلك، لا تزال النماذج المختبرية الموحدة التي تقارن بشكل منهجي كيف تشكل مدخلات إشارات TCR المختلفة مصير الخلايا التائية محدودة. تقدم هذه الدراسة طريقة قابلة للتكرار لتنشيط الخلايا التائية الأولية للفئران في المختبر باستخدام anti-CD3 المرتبط بالطبق وanti-CD28 الذائب، مع تدعيمها بإنترلوكين-2 (IL-2)، وتفحص كيف يؤثر تعديل تركيز anti-CD3 (قوة الإشارة) ووقت التحفيز (مدة الإشارة) على نتائج تنشيط الخلايا التائية. نفصل هنا بروتوكولاً لعزل الخلايا التائية الساذجة من فئران C57BL/6، يليه تحفيز عبر مجموعة من تركيزات anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) ومدد زمنية (6–48 h). أجرينا تحليلاً باستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم التأشير المبكر الناجم عن TCR عبر البروتين الريبوسومي S6 المفسفر (p-S6) داخل الخلايا كمؤشر على نشاط معقد mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1)، ثم قيمنا الأحداث اللاحقة بما في ذلك علامات التنشيط السطحية (CD69, CD25, ICOS, PD-1)، والتكاثر الخلوي عبر تخفيف صبغة تتبع التكاثر البنفسجية (CTV)، والتعبير عن الجزيئات المؤثرة (Granzyme B, TNF-α) كمؤشرات على التمايز الوظيفي. توفر هذه الطريقة دليلاً مرئياً واضحاً وخطوة بخطوة لتنفيذ تحفيزات الخلايا التائية القابلة للتكرار، مما يمكن الباحثين من تحليل كيف توجه بارامترات إشارات TCR المحددة قرارات مصير الخلايا التائية. لا يدعم هذا النهج الدراسات الميكانيكية لتنشيط الخلايا التائية وتمايزها فحسب، بل يوفر أيضاً منصة لتحسين تهيئة الخلايا التائية للعلاج المناعي التبني واختبارات التحفيز الأولي في المختبر. ومن خلال دمج العرض المرئي مع شرح مفصل للبروتوكول، سيعزز هذا البروتوكول الشفافية المنهجية والقابلية للتكرار في أبحاث مناعة الخلايا التائية.

المقدمة

تعد الخلايا التائية ضرورية للاستجابات المناعية الواقية ضد المسببات المرضية والأورام. ويتم الحفاظ على الخلايا التائية الساذجة بنشاط في حالة من السكون لضمان بقائها واستمراريتها على المدى الطويل1. وعند تحفيزها بالمستضد، تخرج الخلايا التائية من حالة السكون، وتخضع للتوسع النسيلي والتمايز الوظيفي2. وتعمل إشارات مستقبل الخلايا التائية (TCR) كعملية أساسية لبدء الاستجابات المناعية التكيفية وتنظيمها3. فعند التعرف النوعي على جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير والببتيد (pMHC) المعروضة على سطح الخلايا المقدمة للمستضد (APCs)، يتم تحفيز سلسلة من أحداث نقل الإشارة، مما يؤدي إلى التوسع النسيلي والتمايز الوظيفي للخلايا التائية4,5,6.

تلعب شدة تحفيز مستقبِل الخلايا التائية (TCR)، والتي تحددها عوامل رئيسية تشمل ألفة المستضد، وقوة الارتباط (avidity)، والتركيز، دوراً حاسماً في التحكم في حجم تنشيط الخلايا التائية، واكتساب الوظائف المؤثرة، ومسار التمايز نحو مجموعات فرعية متميزة من الخلايا التائية المؤثرة أو الذاكرة7,8,9. تعتمد النماذج المختبرية الحالية لاستقصاء تنشيط الخلايا التائية المعتمد على TCR بشكل أساسي على أجسام مضادة anti-CD3 وanti-CD28 مرتبطة بالأطباق أو مقترنة بحبيبات، والتي توفر إشارات ربط TCR وإشارات تحفيز مشتركة في آن واحد10,11. وعلى الرغم من استخدام هذه الأنظمة على نطاق واسع، إلا أنها عادةً ما تستخدم تركيزاً واحداً فقط، وغالباً ما يكون تركيزاً مشبعاً، من الجسم المضاد anti-CD3، مما يسمح فقط بإجراء مقارنة ثنائية (كل شيء أو لا شيء) لتنشيط الخلايا التائية، بدلاً من رصد النطاق الديناميكي لقوة إشارات TCR التي يمكن تحقيقها من خلال تدرج معاير من المحفزات12,13.

يوفر البروتوكول الموصوف هنا نظامًا قياسيًا وقابلًا للتكرار في المختبر (in vitro) لتقييم كيفية تعديل قوة إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) المتدرجة للتنشيط والتكاثر والأنماط الظاهرية الوظيفية لخلايا T الأولية من نوع CD8+ في الفئران، وذلك باستخدام تدرجات معايرة من anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) وتركيز ثابت من anti-CD28 (1 µg/mL). يعتمد هذا النهج على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات الذي يرصد كل من التأشير العلوي (upstream signaling) —عن طريق بروتين S6 الريبوسومي المفسفر داخل الخلايا (p-S6) كقراءة لنشاط معقد mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1)— والنتائج الخلوية النهائية، بما في ذلك التكاثر الذي يتم تتبعه عبر تخفيف CTV، وعلامات التنشيط السطحية (CD69، CD25، ومستقبل التنشيط المشترك للخلايا التائية القابل للاستحثاث [ICOS]، وبروتين الموت الخلوي المبرمج 1 [PD-1])، والتعبير عن الجزيئات المؤثرة (Granzyme B، وعامل نخر الورم ألفا [TNF-α])، وذلك على مدار فترة زمنية تتراوح من 6 إلى 48 h.

يعتمد البروتوكول الخاص بنا على استخدام تراكيز متدرجة من أجسام مضادة لـ anti-CD3 مثبتة على الطبق لتعديل كثافة التحفيز بدقة، وبذلك يحاكي تباين ألفة ارتباط TCR الملحوظ في الظروف الفسيولوجية. وتحقق هذه الطريقة كفاءة عالية في الربط المتقاطع لـ TCR وتنشيطاً قوياً للخلايا التائية الأولية في حالة الراحة. كما يضمن إجراء الطلاء الموحد توزيعاً متسقاً للأجسام المضادة على سطح الطبق، مما يؤدي إلى تحفيز متماثل للخلايا ضمن الدفعة الواحدة وقابلية ممتازة لتكرار التجربة. ويوفر هذا التنسيق نهجاً فعالاً من حيث التكلفة وبسيطاً من الناحية التشغيلية لتنشيط الخلايا التائية.

ومع ذلك، يجب الإقرار ببعض القيود المتعلقة بهذا النهج؛ حيث يختلف التحفيز الذي يتم بواسطة أجسام مضادة لـ anti-CD3/CD28 بشكل ملحوظ عن السياق الفسيولوجي داخل الجسم الحي. وعلى الرغم من أن الطرق التجريبية التي تستخدم فقط أجساماً مضادة محفزة لـ anti-CD3 وanti-CD28 لتقييم تنشيط الخلايا التائية يمكن أن توفر قراءات فعالة للتنشيط، إلا أنها تخفق في محاكاة التفاعلات بين الخلايا المقدمة للمستضد والخلايا التائية بشكل كامل، بالإضافة إلى البيئة الدقيقة التحفيزية المشتركة التي تحدث في الظروف الفسيولوجية14.

على الرغم من هذه القيود، يوفر هذا البروتوكول منصة منهجية وقابلة للتكرار تعمل كأداة قيمة ومتاحة لاستقصاء استجابات الخلايا التائية المعتمدة على قوة إشارة TCR، ويمكن أن تكون مكملة لنماذج أكثر تعقيداً ومحددة للمستضدات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة.

1. تحضير الكواشف والأطباق

  1. قم بتحضير anti-CD3 المرتبط بالطبق في PBS معقم بتركيزات 0.1، و0.5، و1، و5، و10 µg/mL.
  2. أضف 50 µL من محلول طلاء anti-CD3 في كل بئر من أطباق ذات 96 بئر وقاع مسطح.
  3. أغلق الأطباق بغشاء إحكام وقم بحضنها طوال الليل عند 4 °C.
  4. اشفط محلول الطلاء واغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 µL من PBS معقم قبل إضافة الخلايا.

2. عزل خلايا T النائفة من نوع CD8+ من طحال الفأر

  1. اختر ذكور فئران C57BL/6 بعمر 6–8 أسابيع (تم شراؤها من شركة Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) وقم بقتلها رحيماً عن طريق استنشاق CO2  يليه خلع الرقبة. يتم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات أمراض محددة مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة والوصول الحر إلى الطعام والماء. يتم استخدام 3 فئران كحد أدنى لكل تجربة مستقلة.
  2. قم بشق الصفاق بعناية باستخدام مقص جراحي لكشف الطحال، ثم أمسك بالطحال واستخرجه باستخدام ملقط، وضعه في طبق تجميع يحتوي على وسط RPMI 1640 مبرد مسبقاً ومضاف إليه 2% مصل جنين البقر (FBS) (R2). حافظ على الطبق فوق الثلج حتى عملية التفكيك.
    ملاحظة: اجمع جميع جثث الحيوانات ونفايات المزارع الخلوية في أكياس المخاطر البيولوجية المخصصة وقم بتعقيمها في الموصدة (autoclave) عند 121 °C لمدة 20 دقيقة قبل التخلص منها.
  3. انقل الطحال من طبق التجميع إلى طبق سعة 60 مم يحتوي على 3 mL من محلول تحلل ammonium-chloride-potassium (ACK) بتركيز 1 ×.
  4. قم بتحضير معلق خلوي أحادي عن طريق هرس الطحال بلطف عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 µm باستخدام مكبس حقنة سعة 3 mL.
  5. قم بحضن المعلق لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم أضف 3 mL من وسط R2 المبرد مسبقاً لمعادلة محلول تحلل ammonium-chloride-potassium (ACK).
  6. انقل المعلق الخلوي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL وقم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
  7. بعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 10 mL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي (PBS مع 2% FBS).
  8. قم بتصفية المعلق عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 µm في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 mL، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
    ملاحظة: يجب حذف أزيد الصوديوم من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي للحفاظ على حيوية الخلايا من أجل المقايسات الوظيفية. يجب حفظ جميع العينات عند 4 °C وتحليلها فوراً.
  9. اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب الخلوي في 200 µL من كوكتيل أجسام مضادة مرتبطة بالبيوتين لكل طحال فأر (يحتوي على anti-CD16/32 (Fc block)، و anti-TER-119، و anti-CD19، و anti-CD4، و anti-B220، و anti-NK1.1، و anti-Ly-6G، و anti-CD11b، و anti-CD11c، و anti-CD49b، و anti-CD44 و anti-F4/80).
  10. قم بالتحضين على الثلج لمدة 25 دقيقة مع قلب الأنبوب بلطف كل 5 دقائق لضمان الخلط التام.
  11. اغسل الخلايا بحجم كبير من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي، وقم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق وتخلص من السائل الطافي.
  12. أعد تعليق الراسب في نفس حجم محلول صبغ قياس التدفق الخلوي المستخدم في كوكتيل الأجسام المضادة المرتبطة بالبيوتين، وأضف حبيبات مغناطيسية مغلفة بالستربتافيدين بنصف ذلك الحجم، وقم بالتحضين على الثلج لمدة 15 دقيقة مع قلب الأنبوب بلطف كل 5 دقائق لضمان الخلط التام.
  13. قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة، وضعه على حامل مغناطيسي لمدة 2–3 دقائق، وانقل السائل الطافي بعناية (خلايا CD8+ T الساذجة المخصبة) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 mL.
  14. اغسل الخلايا المجموعة مرة واحدة بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي، وقم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 500 × g لمدة 5 دقائق.
  15. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في RPMI 1640 مضاف إليه 10% FBS (R10) للتطبيقات اللاحقة.

3. وسم صبغة تتبع التكاثر البنفسجية (CTV) لتتبع التكاثر

  1. قم بتحضير محلول العمل CTV بتركيز 2 × طازج (10 µM) مباشرة قبل الاستخدام. اخلط المحلول المخزون من CTV بتركيز 5 mM (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) جيداً باستخدام جهاز الرج (vortex)، ثم خففه further باستخدام PBS معقم للحصول على تركيز نهائي قدره 10 µM.
    تنبيه: تعامل مع المحلول المخزون من CTV (المحضر في DMSO) باستخدام قفازات نتريل داخل خزانة استخلاص الأدخنة، لأن DMSO يسهل امتصاص المركبات السامة عبر الجلد. تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد.
  2. أعد تعليق نصف الخلايا التائية Naive CD8+ T المعزولة في PBS مبرد مسبقاً بكثافة 8 × 107 cells/mL.
  3. أضف بسرعة حجماً مساوياً من محلول العمل 2 × CTV (10 µM) إلى معلق الخلايا واخلط جيداً عن طريق الماصة، ليكون التركيز النهائي لـ CTV هو 5 µM.
  4. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 20 min، مع قلب الأنابيب بلطف كل 5 min لضمان الخلط التام.
  5. أضف 5 أحجام من وسط الزرع (الذي يحتوي على 10% FBS على الأقل) إلى الخلايا، وحضنها لمدة 5 min على الثلج لإزالة أي صبغة حرة.
  6. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 × g لمدة 5 min، وأعد تعليق الراسب في وسط R10 كامل مدفأ مسبقاً ومكمل بـ anti-CD28 (التركيز النهائي: 1 µg/mL) و IL-2 (التركيز النهائي: 10 ng/mL).
  7. أضف 250 µL من معلق الخلايا (الذي يحتوي على 6 × 105cells) إلى كل بئر من أطباق 96-well المطلية مسبقاً.
  8. ازرع الخلايا عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة تصل إلى 48 h.

4. الكشف عن CTV باستخدام قياس التدفق الخلوي

  1. جمع الخلايا في طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً عند الساعات 6 و 36 و 48. يتم الطرد المركزي بسرعة 500 × g لمدة 5 min والغسل مرتين باستخدام محلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  2. لصبغ السطح، تُحضن الخلايا مع 50 µL من خليط أجسام مضادة يحتوي على anti-CD8، وصبغة حيوية قابلة للتثبيت، و anti-CD44 لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
    ملاحظة: تُجمع جميع السوائل الطافية التي تحتوي على أجسام مضادة مقترنة بفلوروفور في حاويات نفايات مخصصة مضاف إليها 0.5% من sodium hypochlorite للتطهير، ويتم التخلص منها وفقاً لبروتوكولات النفايات البيولوجية الخطرة المؤسسية.
  3. تُغسل الخلايا مرتين بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي وتعاد تعليقها في 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي تمهيداً لعملية القياس بجهاز قياس التدفق الخلوي.
  4. تُقاس العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي المجهز بثلاثة ليزرات. يتم تحضير أنابيب تحكم ذات لون واحد باستخدام خلايا مصبوغة لضبط معاملات التعويض (compensation parameters).
  5. تُطبق استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy) التالية: استبعاد الحطام الخلوي عن طريق تحديد البوابات بناءً على التشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SSC)، والتخلص من الخلايا المزدوجة عن طريق تحديد البوابات للخلية المفردة (singlet gating)، واختيار خلايا CD8+ T الحية (السالبة لصبغة الحيوية القابلة للتثبيت) للتحليل.
  6. يتم جمع ما لا يقل عن 1 × 104 من أحداث خلايا CD8+ T المحددة لكل عينة. تُحلل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي، ويتم حساب نسبة الخلايا التي خضعت لانقسام واحد أو أكثر باستخدام وحدة تحليل التكاثر.

5. الصبغ السطحي والخلوي الباطني للتنشيط ونقل الإشارة

  1. أعد تعليق النصف الآخر من خلايا T الساذجة CD8+ في وسط R10 مضاف إليه anti-CD28 بتركيز 1 µg/mL و IL-2 بتركيز 10 ng/mL وبكثافة 2.4 × 106 cells/mL.
  2. أضف 250 µL من معلق الخلايا (6 × 105 cells) إلى كل بئر من أطباق الـ 96 بئر المغلفة مسبقاً.
  3. ازرع الخلايا عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة تصل إلى 48 h.
  4. في النقاط الزمنية المحددة (6، 10، 12، 24، و 36 h)، اجمع الخلايا في طبق 96 بئر ذو قاع مستدير.
    ملاحظة: تهدف نقطة 6 h إلى رصد إشارات TCR المبكرة (phospho-S6) و CD69؛ ويتم تقييم الأخير أيضاً عند 12، 24، و 36 h لرصد حركيته الكاملة. يتم مراقبة CD25 و PD-1 و ICOS عند 10، 12، 24، و 36 h؛ أما نقطة 48 h فقد خُصصت لقياس التكاثر (القسم 4) والكشف عن السيتوكينات (القسم 6).
  5. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وأعد تعليق راسب الخلايا في 200 µL من منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  6. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min واسحب السائل الطافي. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 µL من منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  7. للتلوين السطحي، قم بتحضين الخلايا مع 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة يحتوي على anti-CD69 و anti-CD25 و anti-CD8 و anti-PD-1 و anti-ICOS وصبغة حيوية قابلة للتثبيت لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  8. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام منظم تلوين قياس التدفق الخلوي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
  9. أعد تعليق راسب الخلايا في 200 µL من 1% paraformaldehyde، وثبّت الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 15 min.
    تنبيه: قم بإجراء جميع الخطوات التي تتضمن paraformaldehyde داخل خزانة استخلاص الأدخنة لمنع استنشاق الأبخرة. اجمع كافة النفايات السائلة التي تحتوي على المثبت في حاوية منفصلة مخصصة للتخلص من المواد الكيميائية الخطرة.
  10. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min واغسل مرة واحدة باستخدام منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  11. قم بتدفئة 5 × lyse/fix buffer مسبقاً في درجة حرارة الغرفة (RT) وحضّر محلول عمل بتركيز 1 × باستخدام ماء مقطر.
  12. أضف 200 µL من محلول العمل (1 × lyse/fix buffer) إلى كل بئر، وحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 30 min.
  13. اغسل مرتين باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب. أعد تعليق الراسب باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب وحضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 10 min.
  14. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وتخلص من السوائل الطافية.
  15. للتلوين داخل الخلوي، قم بتحضين الخلايا مع 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة يحتوي على anti-p-S6 لمدة 60 min في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
  16. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب.
  17. لتلوين الأجسام المضادة الثانوية، قم بتحضين الخلايا مع 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة يحتوي على جسم مضاد ثانوي anti-rabbit لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  18. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب واغسل مرة واحدة باستخدام منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  19. أعد تعليق راسب الخلايا في 200 µL من منظم تلوين قياس التدفق الخلوي واجمع العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي نفسه.
  20. طبق استراتيجية تحديد البوابات (gating) نفسها الموصوفة في القسم 4.5 واجمع ما لا يقل عن 1 × 104 من خلايا T CD8+ لكل عينة.
  21. حلل متوسط شدة الفلورة (MFI) لكل علامة باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.

6. حجب وكشف السيتوكينات داخل الخلايا

  1. قبل الحصاد بـ 5 h، أضف 100 µL لكل بئر من وسط R10 الطازج المكمل بـ PMA (50 ng/mL)، وionomycin (1 µg/mL)، ومثبطات نقل البروتين (monensin) (1:1000)، ومثبطات نقل البروتين (المعتمدة على brefeldin A) (1:1000). اخلط بلطف وأعد الأطباق إلى الحاضنة عند 37 °C لمنع إفراز السيتوكينات والسماح بتراكمها داخل الخلايا.
  2. في النقطة الزمنية المطلوبة، اجمع الخلايا في طبق ذو قاع مستدير بـ 96 بئراً.
  3. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وأعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  4. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min واسحب السائل الطافي. اغسل مرتين باستخدام 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  5. لصبغ العلامات السطحية، حضن الخلايا مع 50 µL من مزيج أجسام مضادة يحتوي على anti-CD44 و anti-CD8 وصبغة حيوية قابلة للتثبيت لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  6. اغسل ثلاث مرات بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
  7. قم بنفاذ الخلايا بإضافة 200 µL من محلول التثبيت والنفاذ والحضن لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
    تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن محلول التثبيت والنفاذ (الذي يحتوي على paraformaldehyde) في خزانة استخلاص الأدخنة لمنع استنشاق الأبخرة. اجمع كل النفايات السائلة التي تحتوي على المثبت في حاوية منفصلة مخصصة للتخلص من المواد الكيميائية الخطرة.
  8. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وتخلص من السائل الطافي في نفايات المواد الكيميائية الخطرة.
  9. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × من محلول غسيل/نفاذ.
  10. لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا، حضن الخلايا مع 50 µL من مزيج أجسام مضادة يحتوي على anti-TNF-α و anti-Granzyme B لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  11. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × من محلول غسيل/نفاذ لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة، ثم أجرِ غسلة نهائية واحدة بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  12. أعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي واجمع العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي نفسه.
  13. طبق استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy) نفسها كما هو موضح في القسم 4.5 واجمع ما لا يقل عن 1 × 104 من خلايا CD8+ T لكل عينة. حلل نسبة الإيجابية و MFI لكل علامة باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لبحث تأثيرات شدات تحفيز anti-CD3 المختلفة على تنشيط الخلايا التائية، قمنا بعزل الخلايا الطحالية الفأرية وتنقية خلايا CD8+ T للزراعة في المختبر، ثم أجرينا مقايسات تنشيط الخلايا التائية وتحليل قياس التدفق الخلوي. ولتحليل البيانات، تم أولاً تحديد الخلايا اللمفاوية باستخدام مزيج من FSC-A وSSC-A، يليه تحديد الخلايا المفردة عبر FSC-H وFSC-W، ثم SSC-H مع SSC-W. وتم بعد ذلك تحديد خلايا CD8+ T الحية باستخدام CD8 مدمجاً مع صبغة حيوية قابلة للتثبيت للتحليلات اللاحقة (الشكل 1A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول طريقة منهجية وقابلة للتكرار لدراسة استجابات الخلايا التائية المعتمدة على قوة إشارة مستقبل الخلايا التائية (TCR). تتيح استراتيجية الطلاء المتدرج بـ anti-CD3 تحكماً دقيقاً في شدة التحفيز، مما يمكن الباحثين من تحليل العلاقة الكمية بين مدخلات TCR والنتائج الوظيفية اللاحقة. وتتضمن النقاط الإجرائية الرئيسية تنقية الخلايا التائية الساذجة CD8⁺، والتحكم الدقيق في تدرج تركيز طلاء anti-CD3، والتقييس الصارم لعدد الخلايا في كل بئر. ولضمان إمكانية مقارنة البيانات عبر التجارب، نوصي أيضاً باستخدام إعدادات أجهزة ومصفو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم T2394504, LY) وصندوق بدء أبحاث كبير العلماء الخاص بـ Lilin Ye (رقم R2045, LY).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب مخروطي سعة 15 مللابجيك (Labgic)CD-002-15Aأنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل
بارافورمالدهيد 4%BeyotimeP0099مثبت مائي بتركيز 4% لحفظ الخلايا قبل التلوين
طبق بقطر 60 مملابجيك (Labgic)12211طبق زراعة خلايا مقاس 60 مم
70 µm مصفاة خلايالابجيك (Labgic)BS-70-CS70 µm مصفاة شبكية من النايلون لتحضير معلقات الخلايا المفردة
لوح ذو 96 بئراً بقاع مستديرBeyotimeFPT016لوحة ذات قاع مستدير بـ 96 بئراً لاستزراع الخلايا وتلوينها
محلول ACK لتحليل الخلاياBeyotimeC3702محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء القائم على كلوريد الأمونيوم
مضاد CD25 للفأرBiolegend101910جسم مضاد لـ CD25 الفأري مقترن بـ APC، مستنسخ 3C7، لقياس التدفق الخلوي
مضاد CD28 للفئرانBio X CellBE0015-1جسم مضاد منقى لـ CD28 الفأري، النسيلة 37.51، للتحفيز المشترك للخلايا التائية
مضاد CD3 للفئرانBio X CellBP0001-1جسم مضاد منقى مضاد لـ CD3 الفأريε جسم مضاد، مستنسخ 145-2C11، لتنشيط الخلايا التائية
مضاد CD69 للفأرBD Biosciences553237جسم مضاد لـ CD69 الفأري مقترن بـ PE لصبغ مؤشر التنشيط
مضاد CD8 للفئرانInvitrogen17-0081-82جسم مضاد لـ CD8a الفأري مقترن بـ APC، مستنسخ 53-6.7، لتقنية قياس التدفق الخلوي
مضاد GZMB للفئرانBiolegend372212جسم مضاد لـ granzyme B البشري/الفأري مقترن بـ PerCP/Cyanine5.5، مستنسخ QA16A02، لقياس التدفق الخلوي داخل الخلوي
مضاد ICOS للفئرانBD Biosciences565886جسم مضاد لـ ICOS (CD278) للفئران مقترن بـ BV421 لتقنية قياس التدفق الخلوي
مضاد PD-1 للفئرانBiolegend135220جسم مضاد لـ PD-1 (CD279) الفأري المقترن بـ BV605، مستنسخ 29F.1A12، مخصص لقياس التدفق الخلوي
مضاد عامل نخر الورم الفأري (anti-mouse TNF)αInvitrogen46-7321-82جسم مضاد لـ TNF الفأري مقترن بـ PerCP-eFluor 710α جسم مضاد، النسيلة MP6-XT22، لقياس التدفق الخلوي داخل الخلوي
مضاد CD44 للفأر/الإنسانBiolegend103030جسم مضاد لـ CD44 الفأري/البشري مقترن بـ PE/Cyanine7، المستنسخ IM7، مخصص لقياس التدفق الخلوي
بيوتين مضاد لـ CD11b الفأريBiolegend101204جسم مضاد anti-mouse CD11b مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse CD11cBiolegend117304جسم مضاد لـ CD11c الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
biotin anti-mouse CD16/32Biolegend156604جسم مضاد لـ CD16/32 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ CD19 الفأريBiolegend115504جسم مضاد لـ CD19 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse CD4Biolegend100508جسم مضاد لـ CD4 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
مضاد CD44 للفئران الموّسم بالبيوتينBiolegend103004جسم مضاد لـ CD44 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ CD45R الفأريBiolegend103204جسم مضاد لـ CD45R/B220 الخاص بالفأر مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ CD49b الفأريInvitrogen13-5971-85جسم مضاد لـ CD49b الفأري مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
بيوتين مضاد للفأر F4/80Biolegend123106جسم مضاد F4/80 المضاد للفئران المقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse Ly6GBiolegend127604جسم مضاد لـ Ly6G الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ NK1.1 الفأريBiolegend108704جسم مضاد NK1.1 مضاد للفئران مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse TER119Biolegend116204جسم مضاد TER-119 المضاد للفئران والمقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
فئران من سلالة C57BL/6شركة Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.نظرًا لعدم توفر نص مصدري للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.6–فئران ذكور تبلغ من العمر 8 أسابيع استخدمت في التجارب
ثاني أكسيد الكربون (CO₂2حضّانةThermo Fisher3120ثاني أكسيد الكربون المرطب (Humidified CO2)2 حضّانة لاستنبات الخلايا الثديية
صبغة CellTrace VioletInvitrogenC34557صبغة فلورية بنفسجية لمراقبة تكاثر الخلايا
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650ثنائي ميثيل سلفوكسيد؛ مذيب لتحضير المحاليل القياسية للكواشف
جسم مضاد ثانوي من الحمار مضاد لـ IgG (H+L) من الأرنب، ممتز شديد التقاطع، Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206جسم مضاد ثانوي من نوع IgG (H+L) من الحمار مضاد للأرنب مقترن بـ Alexa Fluor 488
محلول منظم من الفوسفات المتوازن المنزوع البروتين (D-PBS)VivaCell BiosciencesC3590-0500دالبوكو’محلول ملحي منظم بالفوسفات للغسيل وتحضير الكواشف
مصل جنين البقر (FBS)GibcoC11995500BTمكمل المصل لوسط استزراع الخلايا الثديية
صبغة حيوية قابلة للتثبيتInvitrogen65-0865-14صبغة حيوية قابلة للتثبيت لاستبعاد الخلايا الميتة أثناء قياس التدفق الخلوي
محلول التثبيت والنفاذيةBD Biosciences51-2090KZكاشف التثبيت والنفاذية للتلوين داخل الخلوي
صفيحة 96 بئراً ذات قاع مسطحلابجيك (Labgic)11510طبق مسطح القاع بـ 96 بئراً لاستزراع الخلايا ومقايسات التحفيز
جهاز قياس التدفق الخلويBD Biosciencesليزر LSRFortessa-3جهاز قياس التدفق الخلوي بثلاثة ليزرات للاستحواذ على الفلورة متعددة الألوان
سدادة جولجيBD Biosciences51-2301KZمثبط نقل البروتين القائم على بريفيلدين أ (Brefeldin A) لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا
إيقاف جهاز جولجيBD Biosciences51-2092KZمثبط نقل البروتين القائم على المونينسين لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا
ملح كالسيوم أيونوميسينسيجماI3909-1MLناقل أيونات الكالسيوم المستخدم مع PMA لتحفيز الخلايا
محلول نفاذية/غسيل منظمBD Biosciences51-20911KZمحلول النفاذية والغسل للتلوين داخل الخلوي
محلول Phosflow Lyse/Fix المنظمBD Biosciences5580495× محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء وتثبيت الكريات البيضاء في آن واحد
منظم الغسيل والنفاذية Phosflow IBD Biosciences557885منظم نفاذية قائم على الميثانول لصبغ البروتينات المفسفرة داخل الخلوية
جسم مضاد أحادي النسيلة من الأرنب لبروتين S6 الريبوزومي المفسفر (Ser235/236) (D57.2.2E)إشارات الخلايا4858Sجسم مضاد أحادي النسيلة من الأرانب لبروتين S6 الريبوسومي المفسفر (Ser235/236)، النسيلة D57.2.2E
PMAسيجماP1585-1MGفوربول 12-ميريستات 13-أسيتات؛ منشط يستخدم لتحفيز الخلايا خارج الجسم الحي
إنترلوكين-2 المؤتلف للفئرانGibco200-02-50UGإنترلوكين-2 المأشوب للفئران لاستزراع الخلايا التائية وتوسيعها
RPMI 1640لايف لاب (Life-Lab)AC01L064وسط Roswell Park Memorial Institute 1640 لزراعة الخلايا الثديية
حبيبات الستربتافيدين المغناطيسيةقندس22307خرزات مغناطيسية مغلفة بالستريبتاديفين لاستنفاد الخلايا القائم على الأجسام المضادة المرتبطة بالبيوتين
محلول صبغ التدفق الخلوييرجى تقديم النص المراد ترجمته.يرجى تزويدي بالنص المصدر الذي ترغب في ترجمته. بصفتي مترجمًا متخصصًا في محتوى JoVE العلمي والتعليمي، أنا جاهز لتحويل النصوص من الإنجليزية إلى العربية بدقة أكاديمية، مع الالتزام التام بالمصطلحات العلمية المعتمدة والسياق البحثي الموجه للأكاديميين والممارسين الصحيين والطلاب.محلول صبغ قياس التدفق الخلوي؛ لم يتم توفير المورد أو تركيبة التحضير
غشاء المختبر Parafilm Mأمكور (Amcor)PM996غشاء مختبري مرن ذاتي الإغلاق لسد الأطباق والأنابيب وأوعية المزارع الخلوية
محلول التحلل والتثبيتBD Biosciences5580495× محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء وتثبيت كرات الدم البيضاء في آن واحد
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1برنامج، الإصدار 10.8.1، لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

المراجع

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا T من نوع CD8+التحفيز في المختبرالتحفيز باستخدام anti-CD3التحفيز المشترك باستخدام anti-CD28قياس التدفق الخلويعزل خلايا T الساذجةنشاط mTORC1تمايز خلايا T

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.