مقالة منهجية

قوة وإطالة إشارة TCR في تنشيط وتمايز خلايا T من نوع CD8+ الأولية في الفئران: نهج معياري في المختبر

83 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

أغسطس 25, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة منهجية لتنشيط خلايا CD8 الساذجة الأولية المستخلصة من الفئران+ خلايا T باستخدام نهج تحفيز متدرج لمستقبلات الخلايا T، مما يتيح تحليلاً شاملاً لتكاثر وتنشيط وإنتاج السيتوكينات في خلايا CD8+ خلايا T عبر كثافات إشارات مستقبلات الخلايا T المختلفة.

الملخص

تُعد شدة ومدة إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) من المحددات الحاسمة لتنشيط الخلايا التائية CD8⁺ وتكاثرها وتمايزها الوظيفي. ومع ذلك، لا تزال النماذج المختبرية الموحدة التي تقارن بشكل منهجي كيف تشكل مدخلات إشارات TCR المختلفة مصير الخلايا التائية محدودة. تقدم هذه الدراسة طريقة قابلة للتكرار لتنشيط الخلايا التائية الأولية للفئران في المختبر باستخدام anti-CD3 المرتبط بالطبق وanti-CD28 الذائب، مع تدعيمها بإنترلوكين-2 (IL-2)، وتفحص كيف يؤثر تعديل تركيز anti-CD3 (قوة الإشارة) ووقت التحفيز (مدة الإشارة) على نتائج تنشيط الخلايا التائية. نفصل هنا بروتوكولاً لعزل الخلايا التائية الساذجة من فئران C57BL/6، يليه تحفيز عبر مجموعة من تركيزات anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) ومدد زمنية (6–48 h). أجرينا تحليلاً باستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم التأشير المبكر الناجم عن TCR عبر البروتين الريبوسومي S6 المفسفر (p-S6) داخل الخلايا كمؤشر على نشاط معقد mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1)، ثم قيمنا الأحداث اللاحقة بما في ذلك علامات التنشيط السطحية (CD69, CD25, ICOS, PD-1)، والتكاثر الخلوي عبر تخفيف صبغة تتبع التكاثر البنفسجية (CTV)، والتعبير عن الجزيئات المؤثرة (Granzyme B, TNF-α) كمؤشرات على التمايز الوظيفي. توفر هذه الطريقة دليلاً مرئياً واضحاً وخطوة بخطوة لتنفيذ تحفيزات الخلايا التائية القابلة للتكرار، مما يمكن الباحثين من تحليل كيف توجه بارامترات إشارات TCR المحددة قرارات مصير الخلايا التائية. لا يدعم هذا النهج الدراسات الميكانيكية لتنشيط الخلايا التائية وتمايزها فحسب، بل يوفر أيضاً منصة لتحسين تهيئة الخلايا التائية للعلاج المناعي التبني واختبارات التحفيز الأولي في المختبر. ومن خلال دمج العرض المرئي مع شرح مفصل للبروتوكول، سيعزز هذا البروتوكول الشفافية المنهجية والقابلية للتكرار في أبحاث مناعة الخلايا التائية.

المقدمة

تعد الخلايا التائية ضرورية للاستجابات المناعية الواقية ضد المسببات المرضية والأورام. ويتم الحفاظ على الخلايا التائية الساذجة بنشاط في حالة من السكون لضمان بقائها واستمراريتها على المدى الطويل1. وعند تحفيزها بالمستضد، تخرج الخلايا التائية من حالة السكون، وتخضع للتوسع النسيلي والتمايز الوظيفي2. وتعمل إشارات مستقبل الخلايا التائية (TCR) كعملية أساسية لبدء الاستجابات المناعية التكيفية وتنظيمها3. فعند التعرف النوعي على جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير والببتيد (pMHC) المعروضة على سطح الخلايا المقدمة للمستضد (APCs)، يتم تحفيز سلسلة من أحداث نقل الإشارة، مما يؤدي إلى التوسع النسيلي والتمايز الوظيفي للخلايا التائية4,5,6.

تلعب شدة تحفيز مستقبِل الخلايا التائية (TCR)، والتي تحددها عوامل رئيسية تشمل ألفة المستضد، وقوة الارتباط (avidity)، والتركيز، دوراً حاسماً في التحكم في حجم تنشيط الخلايا التائية، واكتساب الوظائف المؤثرة، ومسار التمايز نحو مجموعات فرعية متميزة من الخلايا التائية المؤثرة أو الذاكرة7,8,9. تعتمد النماذج المختبرية الحالية لاستقصاء تنشيط الخلايا التائية المعتمد على TCR بشكل أساسي على أجسام مضادة anti-CD3 وanti-CD28 مرتبطة بالأطباق أو مقترنة بحبيبات، والتي توفر إشارات ربط TCR وإشارات تحفيز مشتركة في آن واحد10,11. وعلى الرغم من استخدام هذه الأنظمة على نطاق واسع، إلا أنها عادةً ما تستخدم تركيزاً واحداً فقط، وغالباً ما يكون تركيزاً مشبعاً، من الجسم المضاد anti-CD3، مما يسمح فقط بإجراء مقارنة ثنائية (كل شيء أو لا شيء) لتنشيط الخلايا التائية، بدلاً من رصد النطاق الديناميكي لقوة إشارات TCR التي يمكن تحقيقها من خلال تدرج معاير من المحفزات12,13.

يوفر البروتوكول الموصوف هنا نظامًا قياسيًا وقابلًا للتكرار في المختبر (in vitro) لتقييم كيفية تعديل قوة إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) المتدرجة للتنشيط والتكاثر والأنماط الظاهرية الوظيفية لخلايا T الأولية من نوع CD8+ في الفئران، وذلك باستخدام تدرجات معايرة من anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) وتركيز ثابت من anti-CD28 (1 µg/mL). يعتمد هذا النهج على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات الذي يرصد كل من التأشير العلوي (upstream signaling) —عن طريق بروتين S6 الريبوسومي المفسفر داخل الخلايا (p-S6) كقراءة لنشاط معقد mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1)— والنتائج الخلوية النهائية، بما في ذلك التكاثر الذي يتم تتبعه عبر تخفيف CTV، وعلامات التنشيط السطحية (CD69، CD25، ومستقبل التنشيط المشترك للخلايا التائية القابل للاستحثاث [ICOS]، وبروتين الموت الخلوي المبرمج 1 [PD-1])، والتعبير عن الجزيئات المؤثرة (Granzyme B، وعامل نخر الورم ألفا [TNF-α])، وذلك على مدار فترة زمنية تتراوح من 6 إلى 48 h.

يعتمد البروتوكول الخاص بنا على استخدام تراكيز متدرجة من أجسام مضادة لـ anti-CD3 مثبتة على الطبق لتعديل كثافة التحفيز بدقة، وبذلك يحاكي تباين ألفة ارتباط TCR الملحوظ في الظروف الفسيولوجية. وتحقق هذه الطريقة كفاءة عالية في الربط المتقاطع لـ TCR وتنشيطاً قوياً للخلايا التائية الأولية في حالة الراحة. كما يضمن إجراء الطلاء الموحد توزيعاً متسقاً للأجسام المضادة على سطح الطبق، مما يؤدي إلى تحفيز متماثل للخلايا ضمن الدفعة الواحدة وقابلية ممتازة لتكرار التجربة. ويوفر هذا التنسيق نهجاً فعالاً من حيث التكلفة وبسيطاً من الناحية التشغيلية لتنشيط الخلايا التائية.

ومع ذلك، يجب الإقرار ببعض القيود المتعلقة بهذا النهج؛ حيث يختلف التحفيز الذي يتم بواسطة أجسام مضادة لـ anti-CD3/CD28 بشكل ملحوظ عن السياق الفسيولوجي داخل الجسم الحي. وعلى الرغم من أن الطرق التجريبية التي تستخدم فقط أجساماً مضادة محفزة لـ anti-CD3 وanti-CD28 لتقييم تنشيط الخلايا التائية يمكن أن توفر قراءات فعالة للتنشيط، إلا أنها تخفق في محاكاة التفاعلات بين الخلايا المقدمة للمستضد والخلايا التائية بشكل كامل، بالإضافة إلى البيئة الدقيقة التحفيزية المشتركة التي تحدث في الظروف الفسيولوجية14.

على الرغم من هذه القيود، يوفر هذا البروتوكول منصة منهجية وقابلة للتكرار تعمل كأداة قيمة ومتاحة لاستقصاء استجابات الخلايا التائية المعتمدة على قوة إشارة TCR، ويمكن أن تكون مكملة لنماذج أكثر تعقيداً ومحددة للمستضدات.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة.

1. تحضير الكواشف والأطباق

  1. قم بتحضير anti-CD3 المرتبط بالطبق في PBS معقم بتركيزات 0.1، و0.5، و1، و5، و10 µg/mL.
  2. أضف 50 µL من محلول طلاء anti-CD3 في كل بئر من أطباق ذات 96 بئر وقاع مسطح.
  3. أغلق الأطباق بغشاء إحكام وقم بحضنها طوال الليل عند 4 °C.
  4. اشفط محلول الطلاء واغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 µL من PBS معقم قبل إضافة الخلايا.

2. عزل خلايا T النائفة من نوع CD8+ من طحال الفأر

  1. اختر ذكور فئران C57BL/6 بعمر 6–8 أسابيع (تم شراؤها من شركة Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) وقم بقتلها رحيماً عن طريق استنشاق CO2  يليه خلع الرقبة. يتم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات أمراض محددة مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة والوصول الحر إلى الطعام والماء. يتم استخدام 3 فئران كحد أدنى لكل تجربة مستقلة.
  2. قم بشق الصفاق بعناية باستخدام مقص جراحي لكشف الطحال، ثم أمسك بالطحال واستخرجه باستخدام ملقط، وضعه في طبق تجميع يحتوي على وسط RPMI 1640 مبرد مسبقاً ومضاف إليه 2% مصل جنين البقر (FBS) (R2). حافظ على الطبق فوق الثلج حتى عملية التفكيك.
    ملاحظة: اجمع جميع جثث الحيوانات ونفايات المزارع الخلوية في أكياس المخاطر البيولوجية المخصصة وقم بتعقيمها في الموصدة (autoclave) عند 121 °C لمدة 20 دقيقة قبل التخلص منها.
  3. انقل الطحال من طبق التجميع إلى طبق سعة 60 مم يحتوي على 3 mL من محلول تحلل ammonium-chloride-potassium (ACK) بتركيز 1 ×.
  4. قم بتحضير معلق خلوي أحادي عن طريق هرس الطحال بلطف عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 µm باستخدام مكبس حقنة سعة 3 mL.
  5. قم بحضن المعلق لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم أضف 3 mL من وسط R2 المبرد مسبقاً لمعادلة محلول تحلل ammonium-chloride-potassium (ACK).
  6. انقل المعلق الخلوي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL وقم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
  7. بعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 10 mL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي (PBS مع 2% FBS).
  8. قم بتصفية المعلق عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 µm في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 mL، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
    ملاحظة: يجب حذف أزيد الصوديوم من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي للحفاظ على حيوية الخلايا من أجل المقايسات الوظيفية. يجب حفظ جميع العينات عند 4 °C وتحليلها فوراً.
  9. اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب الخلوي في 200 µL من كوكتيل أجسام مضادة مرتبطة بالبيوتين لكل طحال فأر (يحتوي على anti-CD16/32 (Fc block)، و anti-TER-119، و anti-CD19، و anti-CD4، و anti-B220، و anti-NK1.1، و anti-Ly-6G، و anti-CD11b، و anti-CD11c، و anti-CD49b، و anti-CD44 و anti-F4/80).
  10. قم بالتحضين على الثلج لمدة 25 دقيقة مع قلب الأنبوب بلطف كل 5 دقائق لضمان الخلط التام.
  11. اغسل الخلايا بحجم كبير من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي، وقم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق وتخلص من السائل الطافي.
  12. أعد تعليق الراسب في نفس حجم محلول صبغ قياس التدفق الخلوي المستخدم في كوكتيل الأجسام المضادة المرتبطة بالبيوتين، وأضف حبيبات مغناطيسية مغلفة بالستربتافيدين بنصف ذلك الحجم، وقم بالتحضين على الثلج لمدة 15 دقيقة مع قلب الأنبوب بلطف كل 5 دقائق لضمان الخلط التام.
  13. قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة، وضعه على حامل مغناطيسي لمدة 2–3 دقائق، وانقل السائل الطافي بعناية (خلايا CD8+ T الساذجة المخصبة) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 mL.
  14. اغسل الخلايا المجموعة مرة واحدة بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي، وقم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 500 × g لمدة 5 دقائق.
  15. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في RPMI 1640 مضاف إليه 10% FBS (R10) للتطبيقات اللاحقة.

3. وسم صبغة تتبع التكاثر البنفسجية (CTV) لتتبع التكاثر

  1. قم بتحضير محلول العمل CTV بتركيز 2 × طازج (10 µM) مباشرة قبل الاستخدام. اخلط المحلول المخزون من CTV بتركيز 5 mM (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) جيداً باستخدام جهاز الرج (vortex)، ثم خففه further باستخدام PBS معقم للحصول على تركيز نهائي قدره 10 µM.
    تنبيه: تعامل مع المحلول المخزون من CTV (المحضر في DMSO) باستخدام قفازات نتريل داخل خزانة استخلاص الأدخنة، لأن DMSO يسهل امتصاص المركبات السامة عبر الجلد. تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد.
  2. أعد تعليق نصف الخلايا التائية Naive CD8+ T المعزولة في PBS مبرد مسبقاً بكثافة 8 × 107 cells/mL.
  3. أضف بسرعة حجماً مساوياً من محلول العمل 2 × CTV (10 µM) إلى معلق الخلايا واخلط جيداً عن طريق الماصة، ليكون التركيز النهائي لـ CTV هو 5 µM.
  4. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 20 min، مع قلب الأنابيب بلطف كل 5 min لضمان الخلط التام.
  5. أضف 5 أحجام من وسط الزرع (الذي يحتوي على 10% FBS على الأقل) إلى الخلايا، وحضنها لمدة 5 min على الثلج لإزالة أي صبغة حرة.
  6. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 × g لمدة 5 min، وأعد تعليق الراسب في وسط R10 كامل مدفأ مسبقاً ومكمل بـ anti-CD28 (التركيز النهائي: 1 µg/mL) و IL-2 (التركيز النهائي: 10 ng/mL).
  7. أضف 250 µL من معلق الخلايا (الذي يحتوي على 6 × 105cells) إلى كل بئر من أطباق 96-well المطلية مسبقاً.
  8. ازرع الخلايا عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة تصل إلى 48 h.

4. الكشف عن CTV باستخدام قياس التدفق الخلوي

  1. جمع الخلايا في طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً عند الساعات 6 و 36 و 48. يتم الطرد المركزي بسرعة 500 × g لمدة 5 min والغسل مرتين باستخدام محلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  2. لصبغ السطح، تُحضن الخلايا مع 50 µL من خليط أجسام مضادة يحتوي على anti-CD8، وصبغة حيوية قابلة للتثبيت، و anti-CD44 لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
    ملاحظة: تُجمع جميع السوائل الطافية التي تحتوي على أجسام مضادة مقترنة بفلوروفور في حاويات نفايات مخصصة مضاف إليها 0.5% من sodium hypochlorite للتطهير، ويتم التخلص منها وفقاً لبروتوكولات النفايات البيولوجية الخطرة المؤسسية.
  3. تُغسل الخلايا مرتين بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي وتعاد تعليقها في 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي تمهيداً لعملية القياس بجهاز قياس التدفق الخلوي.
  4. تُقاس العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي المجهز بثلاثة ليزرات. يتم تحضير أنابيب تحكم ذات لون واحد باستخدام خلايا مصبوغة لضبط معاملات التعويض (compensation parameters).
  5. تُطبق استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy) التالية: استبعاد الحطام الخلوي عن طريق تحديد البوابات بناءً على التشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SSC)، والتخلص من الخلايا المزدوجة عن طريق تحديد البوابات للخلية المفردة (singlet gating)، واختيار خلايا CD8+ T الحية (السالبة لصبغة الحيوية القابلة للتثبيت) للتحليل.
  6. يتم جمع ما لا يقل عن 1 × 104 من أحداث خلايا CD8+ T المحددة لكل عينة. تُحلل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي، ويتم حساب نسبة الخلايا التي خضعت لانقسام واحد أو أكثر باستخدام وحدة تحليل التكاثر.

5. الصبغ السطحي والخلوي الباطني للتنشيط ونقل الإشارة

  1. أعد تعليق النصف الآخر من خلايا T الساذجة CD8+ في وسط R10 مضاف إليه anti-CD28 بتركيز 1 µg/mL و IL-2 بتركيز 10 ng/mL وبكثافة 2.4 × 106 cells/mL.
  2. أضف 250 µL من معلق الخلايا (6 × 105 cells) إلى كل بئر من أطباق الـ 96 بئر المغلفة مسبقاً.
  3. ازرع الخلايا عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة تصل إلى 48 h.
  4. في النقاط الزمنية المحددة (6، 10، 12، 24، و 36 h)، اجمع الخلايا في طبق 96 بئر ذو قاع مستدير.
    ملاحظة: تهدف نقطة 6 h إلى رصد إشارات TCR المبكرة (phospho-S6) و CD69؛ ويتم تقييم الأخير أيضاً عند 12، 24، و 36 h لرصد حركيته الكاملة. يتم مراقبة CD25 و PD-1 و ICOS عند 10، 12، 24، و 36 h؛ أما نقطة 48 h فقد خُصصت لقياس التكاثر (القسم 4) والكشف عن السيتوكينات (القسم 6).
  5. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وأعد تعليق راسب الخلايا في 200 µL من منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  6. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min واسحب السائل الطافي. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 µL من منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  7. للتلوين السطحي، قم بتحضين الخلايا مع 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة يحتوي على anti-CD69 و anti-CD25 و anti-CD8 و anti-PD-1 و anti-ICOS وصبغة حيوية قابلة للتثبيت لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  8. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام منظم تلوين قياس التدفق الخلوي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
  9. أعد تعليق راسب الخلايا في 200 µL من 1% paraformaldehyde، وثبّت الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 15 min.
    تنبيه: قم بإجراء جميع الخطوات التي تتضمن paraformaldehyde داخل خزانة استخلاص الأدخنة لمنع استنشاق الأبخرة. اجمع كافة النفايات السائلة التي تحتوي على المثبت في حاوية منفصلة مخصصة للتخلص من المواد الكيميائية الخطرة.
  10. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min واغسل مرة واحدة باستخدام منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  11. قم بتدفئة 5 × lyse/fix buffer مسبقاً في درجة حرارة الغرفة (RT) وحضّر محلول عمل بتركيز 1 × باستخدام ماء مقطر.
  12. أضف 200 µL من محلول العمل (1 × lyse/fix buffer) إلى كل بئر، وحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 30 min.
  13. اغسل مرتين باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب. أعد تعليق الراسب باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب وحضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 10 min.
  14. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وتخلص من السوائل الطافية.
  15. للتلوين داخل الخلوي، قم بتحضين الخلايا مع 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة يحتوي على anti-p-S6 لمدة 60 min في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
  16. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب.
  17. لتلوين الأجسام المضادة الثانوية، قم بتحضين الخلايا مع 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة يحتوي على جسم مضاد ثانوي anti-rabbit لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  18. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × permeabilization/wash buffer المخصص لتلوين الفوسفات-إبيتوب واغسل مرة واحدة باستخدام منظم تلوين قياس التدفق الخلوي.
  19. أعد تعليق راسب الخلايا في 200 µL من منظم تلوين قياس التدفق الخلوي واجمع العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي نفسه.
  20. طبق استراتيجية تحديد البوابات (gating) نفسها الموصوفة في القسم 4.5 واجمع ما لا يقل عن 1 × 104 من خلايا T CD8+ لكل عينة.
  21. حلل متوسط شدة الفلورة (MFI) لكل علامة باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.

6. حجب وكشف السيتوكينات داخل الخلايا

  1. قبل الحصاد بـ 5 h، أضف 100 µL لكل بئر من وسط R10 الطازج المكمل بـ PMA (50 ng/mL)، وionomycin (1 µg/mL)، ومثبطات نقل البروتين (monensin) (1:1000)، ومثبطات نقل البروتين (المعتمدة على brefeldin A) (1:1000). اخلط بلطف وأعد الأطباق إلى الحاضنة عند 37 °C لمنع إفراز السيتوكينات والسماح بتراكمها داخل الخلايا.
  2. في النقطة الزمنية المطلوبة، اجمع الخلايا في طبق ذو قاع مستدير بـ 96 بئراً.
  3. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وأعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  4. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min واسحب السائل الطافي. اغسل مرتين باستخدام 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  5. لصبغ العلامات السطحية، حضن الخلايا مع 50 µL من مزيج أجسام مضادة يحتوي على anti-CD44 و anti-CD8 وصبغة حيوية قابلة للتثبيت لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  6. اغسل ثلاث مرات بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
  7. قم بنفاذ الخلايا بإضافة 200 µL من محلول التثبيت والنفاذ والحضن لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
    تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن محلول التثبيت والنفاذ (الذي يحتوي على paraformaldehyde) في خزانة استخلاص الأدخنة لمنع استنشاق الأبخرة. اجمع كل النفايات السائلة التي تحتوي على المثبت في حاوية منفصلة مخصصة للتخلص من المواد الكيميائية الخطرة.
  8. قم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 1 min وتخلص من السائل الطافي في نفايات المواد الكيميائية الخطرة.
  9. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × من محلول غسيل/نفاذ.
  10. لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا، حضن الخلايا مع 50 µL من مزيج أجسام مضادة يحتوي على anti-TNF-α و anti-Granzyme B لمدة 30 min على الثلج في الظلام.
  11. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 × من محلول غسيل/نفاذ لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة، ثم أجرِ غسلة نهائية واحدة بمحلول صبغ قياس التدفق الخلوي.
  12. أعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من محلول صبغ قياس التدفق الخلوي واجمع العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي نفسه.
  13. طبق استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy) نفسها كما هو موضح في القسم 4.5 واجمع ما لا يقل عن 1 × 104 من خلايا CD8+ T لكل عينة. حلل نسبة الإيجابية و MFI لكل علامة باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.

النتائج

لبحث تأثيرات شدات تحفيز anti-CD3 المختلفة على تنشيط الخلايا التائية، قمنا بعزل الخلايا الطحالية الفأرية وتنقية خلايا CD8+ T للزراعة في المختبر، ثم أجرينا مقايسات تنشيط الخلايا التائية وتحليل قياس التدفق الخلوي. ولتحليل البيانات، تم أولاً تحديد الخلايا اللمفاوية باستخدام مزيج من FSC-A وSSC-A، يليه تحديد الخلايا المفردة عبر FSC-H وFSC-W، ثم SSC-H مع SSC-W. وتم بعد ذلك تحديد خلايا CD8+ T الحية باستخدام CD8 مدمجاً مع صبغة حيوية قابلة للتثبيت للتحليلات اللاحقة (الشكل 1A).

للتحقق من أن نظام التحفيز باستخدام الأجسام المضادة المرتبطة بالطبق ينشط الخلايا التائية بفعالية في المختبر، فحصنا فسفرة البروتين الريبوسومي S6 (p-S6)، وهو مؤشر قراءة معروف لنشاط mTORC1 ونقطة التقاء لمسارات PI3K-mTOR وMEK-ERK MAPK في اتجاه المصب من إشارات TCR15,16. وتماشياً مع هذه النتائج، لاحظنا زيادة تعتمد على الجرعة في مستويات p-S6 بعد 6 ساعات من التحفيز عبر تركيزات متزايدة من anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) (الشكل 1B)، مما يؤكد أن نظام anti-CD3 المرتبط بالطبق ينشط محور TCR-mTORC1-S6 بطريقة تعتمد على قوة الإشارة. يتوافق حدث الفسفرة المبكر هذا مع تفعيل المسارات الاستقلابية المعتمدة على mTORC1 والتي تدعم تكاثر الخلايا التائية وتمايز الخلايا المؤثرة لاحقاً.

تم تقييم تكاثر الخلايا عن طريق قياس تدفق تمديد صبغة CTV بعد تحفيز مستقبلات الخلايا التائية (TCR) بتركيزات متدرجة من مضادات CD3 (0.1–10 µg/mL) في ثلاث نقاط زمنية بعد التحفيز: 6 و36 و48 ساعة. وفي نقطة زمنية مبكرة عند 6 ساعات من إرسال الإشارات، لوحظ تمدد تكاثري ضئيل فقط في جميع ظروف التحفيز. وبحلول الساعة 36، فشلت مجموعة التحفيز بجرعة منخفضة (0.1 µg/mL) في إحداث توسع نسلي ملموس، بينما أظهرت المجموعات ذات الجرعات المتوسطة والعالية قمم تمدد CTV واضحة (5 و10 µg/mL)، مما يشير إلى بدء تقدم الدورة الخلوية. وعند الساعة 48، كانت الأنماط الظاهرية التكاثرية المتباينة عبر تركيزات التحفيز أكثر وضوحاً؛ حيث أدى التحفيز الضعيف لـ TCR (0.1 µg/mL) إلى ظهور 1.25% فقط من الخلايا المتكاثرة مع قمة CTV واحدة غير ممددة، مما يشير إلى تنشيط دون المستوى الأمثل. أما التحفيز المتوسط (1–5 µg/mL) فقد أدى إلى ظهور ثلاث قمم انقسام منفصلة، مع زيادة كسور التكاثر من 70.8% إلى 84.0%. ووصل التحفيز القوي (10 µg/mL) إلى أعلى كسر تكاثري (89.5%)، مظهراً أقصى عدد من أجيال الانقسام ومثبتاً الكشف عن تشبع التكاثر (الشكل 2).

قمنا بعد ذلك بفحص التعبير عن علامات التنشيط المبكرة CD69 وCD25. ومن الملاحظ أن الدراسة الحالية كشفت عن زيادة سريعة ومعتمدة على الجرعة في التعبير عن CD69، وذلك بناءً على متوسط شدة الفلورة (MFI). ففي ظل التحفيز المتوسط والقوي (5 و10 µg/mL)، ارتفع CD69 بسرعة عند 24 h، تلاه انخفاض تدريجي بين 24 و36 h. ومع ذلك، في ظل التحفيز الضعيف (0.1 و0.5 و1 µg/mL)، ارتفع CD69 تدريجياً طوال نافذة التحفيز. ويتوافق ملف التعبير الحركي المذكور أعلاه لـ CD69 مع دوره كعلامة تنشيط مبكرة للخلايا التائية (الشكل 3A)17. ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا أن التعبير عن CD25 أظهر زيادة تدريجية بطريقة معتمدة على الجرعة والوقت (الشكل 3B). وبالاتساق مع الأبحاث السابقة، كانت الزيادة في التعبير عن CD25 أبطأ من زيادة CD69، خاصة عند التحفيز الأمثل18,19.

لمزيد من الاستقصاء حول التأثير التنظيمي لقوة تحفيز TCR على تعبير المستقبلات المثبطة والجزيئات المحفزةร่วม في الخلايا التائية CD8+، قمنا بفحص مستويات تعبير PD-1 و ICOS. يعتمد التعبير القابل للتحفيز لـ PD-1 على تحفيز TCR عالي الكثافة. ففي مجموعة التحفيز منخفض الكثافة (0.5–1 µg/mL)، تم التعبير عن PD-1 بمستوى منخفض طوال فترة التحفيز بأكملها. وفي المقابل، في مجموعة التحفيز متوسطة إلى عالية الكثافة (5–10 µg/mL)، ازداد تعبير PD-1 تدريجياً بدءاً من الساعة 10 وبلغ ذروته عند الساعة 36 (الشكل 4A). كما ارتفع تعبير ICOS وفقاً لزيادة قوة التحفيز ووصل إلى أقصى مستوى له عند 5–10 µg/mL في الساعة 36 (الشكل 4B). تشير هذه النتائج إلى أن تحفيز TCR عالي الكثافة يمكن أن يرفع بشكل ملحوظ من مستويات تعبير PD-1 و ICOS.

أخيرًا، قمنا بفحص القدرة الوظيفية للخلايا التائية المنشطة بعد إعادة التحفيز باستخدام PMA وionomycin عند 24 ساعة و48 ساعة بعد التحفيز. عند 24 ساعة، قمنا بقياس كمية إنتاج TNF-α وGranzyme B، ولاحظنا أن ترددات الخلايا TNF-α+ وGranzyme B+ وTNF-α+Granzyme B+ قد ارتفعت تدريجياً بطريقة تعتمد على جرعة anti-CD3 (الشكل 5A، B). وبشكل متسق، أظهرت شدة التألق المتوسطة (MFI) لـ TNF-α وGranzyme B أيضاً زيادة تعتمد على التركيز ووصلت إلى حدها الأقصى تحت التحفيز عالي الكثافة (10 µg/mL) (الشكل 5C)، مما يعكس تمايزاً مبكراً للخلايا المؤثرة يعتمد على الجرعة ويكون مدفوعاً بقوة إشارة TCR المتدرجة. ومع ذلك، عند 48 ساعة، انعكس هذا النمط بشكل ملحوظ؛ حيث أدت تركيزات anti-CD3 الأعلى إلى خفض النسب المئوية للخلايا TNF-α+Granzyme B+ بشكل كبير، كما قللت من مستويات تعبير الجزيئات المؤثرة على أساس كل خلية.

تعتبر جميع البيانات المعروضة ممثلة لـ 3 تجارب مستقلة. أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه مع اختبار توكي (Tukey’s post-hoc test)؛ وتُمثل البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). تجاوزت حيوية الخلايا باستمرار 90%، وتم الحصول على حد أدنى قدره 1 × 104 من أحداث خلايا CD8+ T الحية لكل عينة.

بيانات قياس التدفق الخلوي: مخططات تحديد بوابات المجموعات الخلوية، ومدرجات تكرارية للتقدير الكمي للبروتين، ورسم بياني شريطي.
الشكل 1: تنشيط CD8 في المختبر وتحليله باستخدام قياس التدفق الخلوي+ الخلايا التائية. (A) خلايا CD8 منقاة+ تم تحفيز الخلايا التائية المستخلصة من الخلايا الطحالية للفئران في المختبر بتركيزات متفاوتة من مضاد CD3 (0.1-10 µg/mLمقترناً بتركيز ثابت من مضاد CD28 (1 µg/mL) لمدة تتراوح من 6 إلى 48 ساعة، يلي ذلك تحليل تنشيط الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم استبعاد الحطام الخلوي عن طريق تحديد بوابات التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC)، كما تم استبعاد الخلايا المزدوجة عبر تحديد بوابات الخلايا المفردة، وتم تحديد الخلايا سالبة صبغة الحيوية القابلة للتثبيت وCD8+ في النهاية، تم تحديد الخلايا التائية (T cells) عبر عملية الفرز (gating) لإجراء التحليلات اللاحقة.Bفسفرة البروتين الريبوسومي S6 (p-S6) في خلايا CD8+ خلايا T بعد 6 ساعات من التحفيز بتركيزات محددة من anti-CD3 (0.1-10 µg/mL) بالإضافة إلى مضاد CD28 الثابت (1 µg/mL). المدرج التكراري التمثيلي (يساراً) وملخص متوسط شدة الفلورة (يمينًا). الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي تمثيلية لـ 3 تجارب مستقلة. البيانات تظهر المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. الإحصاءات: تحليل التباين أحادي الاتجاه للقياسات المتكررة مع اختبار توكي للمقارنات البعدية. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.01؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مقايسة تكاثر الخلايا، مخطط بياني تكراري، يوضح CTV مقابل نسبة التكاثر بمرور الوقت.
الشكل 2تحليل التكاثر المعتمد على صبغة تتبع التكاثر البنفسجية (CTV) لخلايا CD8 الأولية في الفئران+ خلايا t تحت تحفيز متدرج لمستقبلات الخلايا التائية (TCR). CD8+ خلايا T الموصومة بـ CTV والمحفزة مخبرياً باستخدام anti-CD3 بتركيزات متدرجة تتراوح بين 0.1-10 µg/mL لمدة تتراوح بين 6 إلى 48 ساعة. تم تقييم تكاثر الخلايا بناءً على تخفيف وتوهين فلورة CTV في خلايا CD8+ الخلايا التائية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. تُظهر المخططات التكرارية توزيع فلورة CTV لكل مجموعة من التركيزات، مع توضيح النسبة المئوية للخلايا التي خضعت لانقسام واحد أو أكثر. تُعد مخططات قياس التدفق الخلوي ممثلة لـ 3 تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل قياس التدفق الخلوي، تعبير CD69 وCD25، المخطط التكراري والمخطط الخطي، تنشيط الخلايا المناعية.
الشكل 3: حركية تعبير علامات التنشيط المبكرة CD69 وCD25 على خلايا CD8+ خلايا T بعد التحفيز بـ anti-CD3. خلايا CD8 الساذجة+ تم تحفيز الخلايا التائية باستخدام مضاد CD3 المرتبط بالصفيحة عند التركيزات الموضحة (0.1-10 µg/mL) بالإضافة إلى مضاد CD28 ثابت (1 µg/mLتم قياس CD69 عند 6 و12 و24 و36 ساعة، وCD25 عند 10 و12 و24 و36 ساعة، وحُللت النتائج باستخدام قياس التدفق الخلوي. تُظهر اللوحات اليسرى مخططات تكرارية ممثلة عند النقاط الزمنية المحددة؛ بينما تعرض اللوحات اليمنى التغيرات الديناميكية في متوسط شدة الفلورة (MFI) بمرور الوقت.A(CD69).BCD25. تمثل مخططات قياس التدفق الخلوي 3 تجارب مستقلة. تظهر البيانات المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). الإحصاء: تحليل التباين ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة (repeated-measures two-way ANOVA) مع اختبار توكي البعدي (Tukey’s post-hoc test). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.01؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل قياس التدفق الخلوي، تعبير PD-1 وICOS، المدرجات التكرارية والرسوم البيانية، الاستجابة الخلوية بمرور الوقت.
الشكل 4: حركية تعبير المستقبل المثبط PD-1 والجزيء المحفز المشترك ICOS على خلايا CD8+ الخلايا التائية بعد التحفيز بمضاد CD3. خلايا CD8 الساذجة+ حُفزت الخلايا التائية باستخدام مضاد CD3 المرتبط بالطبق عند التركيزات المحددة (0.1-10 µg/mL) بالإضافة إلى مضاد CD28 الثابت (1 µg/mL). حُصدت الخلايا عند الساعات 10 و12 و24 و36، وحُللت بواسطة قياس التدفق الخلوي. تُظهر اللوحات اليسرى مخططات توزيع تكرارية ممثلة عند النقاط الزمنية المحددة؛ بينما تعرض اللوحات اليمنى التغيرات الديناميكية في متوسط شدة الفلورة (MFI) بمرور الوقت. (A(PD-1. (B) ICOS. تمثل مخططات قياس التدفق الخلوي 3 تجارب مستقلة. البيانات تظهر المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). الإحصاء: تحليل التباين ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة مع اختبار توكي للمقارنات البعدية. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نتائج تحليل قياس التدفق الخلوي، تعبير TNF-α وGranzyme B، مخططات شريطية ومخططات تشتت، دراسة مناعية.
الشكل ٥: إنتاج السيتوكينات داخل الخلايا بواسطة خلايا CD8+ تعتمد الخلايا التائية على قوة مستقبلات الخلايا التائية (TCR). خلايا CD8 الساذجة+ حُفزت الخلايا التائية بتركيزات متزايدة من مضاد CD3 (0.1-10 µg/mL) بالإضافة إلى مضاد CD28 الثابت (1 µg/mLوفي غضون 24 و48 ساعة بعد التحفيز، تم حصاد الخلايا بعد تحضينها لمدة 5 ساعات مع مثبطات نقل البروتين (مونينسين وبريفيلدين A) في وجود PMA وأيونوميسين لمنع إفراز السيتوكينات والسماح بتراكمها داخل الخلايا.Aتوضح المخططات الكنتورية ترددات الخلايا الموجبة لـ TNF-α وGranzyme B عند كل تركيز ونقطة زمنية محددة. وقد استُخدمت الخلايا غير المحفزة كعنصر تحكم سلبي.B) نسب TNF-α+، غرانزايم ب+، وTNF-α+ جرانزايم ب+ خلايا. (كربونمتوسط شدة الفلورة (MFI) لـ TNF-α وGranzyme B. تمثل مخططات قياس التدفق الخلوي 3 تجارب مستقلة. تظهر البيانات المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). الإحصائيات: تحليل التباين ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة (repeated-measures two-way ANOVA) مع اختبار Tukey للمقارنات البعدية. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول طريقة منهجية وقابلة للتكرار لدراسة استجابات الخلايا التائية المعتمدة على قوة إشارة مستقبل الخلايا التائية (TCR). تتيح استراتيجية الطلاء المتدرج بـ anti-CD3 تحكماً دقيقاً في شدة التحفيز، مما يمكن الباحثين من تحليل العلاقة الكمية بين مدخلات TCR والنتائج الوظيفية اللاحقة. وتتضمن النقاط الإجرائية الرئيسية تنقية الخلايا التائية الساذجة CD8⁺، والتحكم الدقيق في تدرج تركيز طلاء anti-CD3، والتقييس الصارم لعدد الخلايا في كل بئر. ولضمان إمكانية مقارنة البيانات عبر التجارب، نوصي أيضاً باستخدام إعدادات أجهزة ومصفوفات تعويض واستراتيجيات تحديد بوابات (gating) متسقة، وتطبيق نفس تشغيلات الأجسام المضادة ودفعات صبغات الحيوية القابلة للتثبيت حيثما كان ذلك ممكناً. إن موثوقية هذه الخطوات الحرجة تحدد بشكل مباشر ما إذا كانت النتائج التجريبية يمكن أن تعكس بدقة تأثيرات شدات تحفيز TCR المتفاوتة على الديناميكيات المظهرية للخلايا التائية.

في هذا البروتوكول، استخدمنا التحفيز باستخدام أجسام مضادة مرتبطة بالصفيحة، حيث يتم طلاء الأجسام المضادة anti-CD3 مباشرة على سطح صفيحة الزرع لربط معقد TCR-CD3 تشابكياً. يوفر هذا النهج فعالية من حيث التكلفة، وتوزيعاً موحداً للأجسام المضادة، وأدنى حد من التباين بين الآبار، وقابلية ممتازة للتكرار. ومن الجدير بالذكر أن معايرة تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة في الطلاء تتيح تعديلاً متدرجاً ودقيقاً لشدة التحفيز، وهي ميزة تميز هذا النظام عن التحفيز المقترن بالخرز، حيث تكون كثافة الربيطة عادةً ثابتة عند مستوى مشبع، مما يحد من التعديل الدقيق للإشارة14. ومع ذلك، فإن التحفيز المرتبط بالصفيحة يقدم ربطاً تشابكياً لـ TCR مستداماً وفوق الفسيولوجي، وهو ما يختلف جوهرياً عن الارتباط العابر المعتمد على الألفة الذي تحفزه معقدات peptide-MHC على الخلايا المقدمة للمستضد. وعلى الرغم من أن التحفيز القائم على pMHC أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية، إلا أنه يتطلب دقة تقنية عالية، وخبرة متخصصة لإنتاج المتعددات (multimer)، ويكلف تكاليف أعلى بكثير. ولعزل الخلايا، استخدمنا الاختيار المناعي المغناطيسي السلبي، والذي يتميز بالبساطة والسرعة والفعالية من حيث التكلفة. ورغم أنه يوفر نقاءً أقل مقارنةً بتقنية FACS، إلا أنه يتجنب الإجهاد الميكانيكي والوسم الفلوري اللذين قد يؤثران سلباً على الحالة الفسيولوجية للخلايا المفروزة20,21.

تشمل المشكلات الرئيسية التي قد تطرأ أثناء تنفيذ البروتوكول انخفاض نقاوة الفرز، وضعف التكاثر، والسمية الخلوية الناجمة عن CTV، وضعف الحيوية بعد الزرع، وعدم اتساق التلوين. ولعلاج انخفاض النقاوة، يجب ضمان خلط الخلايا بشكل كافٍ مع كوكتيل الأجسام المضادة المبيوتنة والخرزات المغلفة بالستريبتاديفين، وتمديد وقت الفصل المغناطيسي إذا لزم الأمر، وتحسين نسبة الخرزات إلى الأجسام المضادة لكل تشغيلة جديدة من الكواشف. وفي حال لوحظ حدوث تكاثر ضئيل حتى عند أعلى تركيز من anti-CD3، يجب التحقق من حيوية ونقاوة الخلايا الساذجة المعزولة (خاصة التلوث بـ CD44hi)، والتأكد من إجراء تغليف anti-CD3 (إغلاق الأطباق بفيلم إغلاق أثناء الحضانة الليلية عند 4 °C وضمان التغطية الموحدة بالأجسام المضادة)، والتحقق من تركيز IL-2، حيث أن هذا السيتوكين ضروري لدعم تمدد الخلايا التائية. أما بالنسبة للسمية الخلوية الناجمة عن CTV، فينبغي تقليل تركيز التلوين مع الحفاظ على دقة واضحة لقمم الانقسام، وضمان إجراء خطوة الإخماد بدقة على الثلج لمدة 5 min كاملة لإزالة الصبغة الحرة المتبقية22,23. ولعلاج ضعف الحيوية بعد الزرع، يجب التحكم في كثافة الخلايا، وضمان حجم كافٍ من الوسط الغذائي، والحفاظ على التقنية المعقمة. وإذا لوحظ تلوين غير متسق أو تباين عالٍ في قياس التدفق الخلوي، فيتم تحضير كوكتيلات الأجسام المضادة كمزيج رئيسي (master mixes)، وحماية جميع العينات الملونة من الضوء، واستخدام نفس تشغيلات الأجسام المضادة ودفعات صبغة الحيوية القابلة للتثبيت عبر جميع المكررات.

ومع ذلك، فإن لهذا البروتوكول قيودًا معينة. وباعتباره نظامًا في المختبر (in vitro)، فإنه لا يمكنه محاكاة البيئة الدقيقة المعقدة للأنسجة، أو التفاعلات الخلوية، أو الوسط السيتوكيني للأعضاء اللمفاوية الثانوية. كما أن نافذة الزراعة محدودة بـ 48 h، مما يقصر التحليل على أحداث التنشيط المبكرة ويمنع تقييم التمايز في المراحل المتأخرة، أو الإنهاك، أو تكوين الذاكرة. علاوة على ذلك، يعتمد البروتوكول بشكل كبير على قراءات قياس التدفق الخلوي، والتي تتطلب توحيدًا صارمًا لإعدادات الأجهزة، ومصفوفات التعويض، واستراتيجيات تحديد البوابات (gating strategies) عبر التجارب المستقلة. فضلاً عن ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النظام القائم على anti-CD3/CD28 مشتقة حصريًا من خلايا CD8+ T، وقد لا تكون قابلة للتعميم مباشرة على خلايا CD4+ T، والتي من المعروف أن عتبات تنشيطها، ومتطلبات التحفيز المشترك، ومسارات التمايز اللاحقة تختلف12,24,25. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف حالة التنشيط الأساسية لخلايا T بين مستعمرات الفئران الفردية بسبب الاختلافات في الميكروبيوتا المتعايشة، مما يشكل مصدرًا محتملاً للتباين بين المختبرات يجب مراعاته عند تفسير النتائج عبر الدراسات المختلفة.

يتيح نظام التحفيز المتدرج الموصوف هنا للباحثين ضبط قوة إشارة TCR لتناسب أهداف تجريبية محددة، وذلك بناءً على أنماط الاستجابة المتميزة التي لوحظت عبر قراءات مختلفة. وتكشف هذه البيانات أن اختيار تركيز anti-CD3 ووقت الحصاد يجب أن يسترشد بالسؤال البيولوجي المطروح. بالنسبة لعلامات التنشيط المبكرة جداً، يمكن اكتشاف زيادة تنظيم CD69 في وقت مبكر يتراوح بين 6–12 h عبر جميع التركيزات، ولكنها تظهر حركية متميزة: حيث تحفز التركيزات العالية (5–10 µg/mL) ذروة سريعة يتبعها انخفاض، بينما تؤدي التركيزات المنخفضة (0.5–1 µg/mL) إلى زيادة تدريجية ومستمرة. أما بالنسبة لمقاييس التكاثر، فإن التركيزات الأقل من 1 µg/mL تكون غير مثالية وقد تعمل كضوابط سلبية داخلية، بينما تحفز التركيزات 5–10 µg/mL بشكل موثوق توسعاً نسيلياً قوياً يمكن اكتشافه عن طريق تخفيف CTV عند 48 h. ويتطلب التعبير عن المستقبل المثبط المشترك PD-1 وجزيء التحفيز المشترك ICOS تحفيزاً عالي الكثافة (5–10 µg/mL) وتصل ذروته عند 36 h، مما يشير إلى أن الدراسات التي تبحث في هذه الجزيئات يجب أن تتجنب الظروف ذات الجرعات الأقل أو الأوقات الأبكر. وبالنسبة لقراءات الوظيفة المؤثرة (TNF-α و Granzyme B)، فإن العلاقة بين قوة التحفيز وإنتاج السيتوكين تعتمد على الوقت وتتبع نمطاً ثنائي الطور مميزاً. فعند 24 h، يتناسب إنتاج الجزيئات المؤثرة طردياً مع تركيز anti-CD3، حيث تؤدي الجرعات الأعلى إلى إنتاج أكبر من السيتوكينات. ومع ذلك، بحلول 48 h، وبينما تكون المستويات المطلقة للخلايا المنتجة للسيتوكينات مرتفعة بشكل كبير في جميع الظروف مقارنة بـ 24 h، تنعكس العلاقة بين الجرعة والاستجابة: حيث تعطي تركيزات التحفيز المنخفضة (0.5–1 µg/mL) ترددات أعلى نسبياً من خلايا TNF-α⁺ Granzyme B⁺ مقارنة بالجرعات العالية (5–10 µg/mL). ويشير هذا الانعكاس إلى أن إشارات TCR القوية والمستمرة، رغم تعزيزها للتمايز المؤثر الأولي، قد تفرض قيداً نسبياً على الحفاظ على قدرة إنتاج السيتوكين لكل خلية، وهو ما قد يعكس بداية الإجهاد الناجم عن التنشيط أو نقص الاستجابة.

تضع هذه الملاحظات التجريبية، مجتمعةً، بروتوكولنا كإطار مرجعي يتيح للمستخدمين الاختيار المسبق لشروط التحفيز بناءً على نقاط نهاية محددة في المراحل اللاحقة، مما يعزز من كفاءة التصميم التجريبي وقابلية تفسير البيانات. وعلاوةً على الدراسات الميكانيكية الأساسية، يمكن لهذا النظام أيضًا أن يوجه عملية تحسين بروتوكولات توسيع الخلايا التائية (T cell) للعلاج المناعي التبني، حيث قد يساعد التنظيم الدقيق لقوة إشارة TCR في توجيه التمايز نحو أنماط ظاهرية مفضلة من الخلايا المؤثرة أو الخلايا الذاكرة26,27,28.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم T2394504, LY) وصندوق بدء أبحاث كبير العلماء الخاص بـ Lilin Ye (رقم R2045, LY).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب مخروطي سعة 15 مللابجيك (Labgic)CD-002-15Aأنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل
بارافورمالدهيد 4%BeyotimeP0099مثبت مائي بتركيز 4% لحفظ الخلايا قبل التلوين
طبق بقطر 60 مملابجيك (Labgic)12211طبق زراعة خلايا مقاس 60 مم
70 µm مصفاة خلايالابجيك (Labgic)BS-70-CS70 µm مصفاة شبكية من النايلون لتحضير معلقات الخلايا المفردة
لوح ذو 96 بئراً بقاع مستديرBeyotimeFPT016لوحة ذات قاع مستدير بـ 96 بئراً لاستزراع الخلايا وتلوينها
محلول ACK لتحليل الخلاياBeyotimeC3702محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء القائم على كلوريد الأمونيوم
مضاد CD25 للفأرBiolegend101910جسم مضاد لـ CD25 الفأري مقترن بـ APC، مستنسخ 3C7، لقياس التدفق الخلوي
مضاد CD28 للفئرانBio X CellBE0015-1جسم مضاد منقى لـ CD28 الفأري، النسيلة 37.51، للتحفيز المشترك للخلايا التائية
مضاد CD3 للفئرانBio X CellBP0001-1جسم مضاد منقى مضاد لـ CD3 الفأريε جسم مضاد، مستنسخ 145-2C11، لتنشيط الخلايا التائية
مضاد CD69 للفأرBD Biosciences553237جسم مضاد لـ CD69 الفأري مقترن بـ PE لصبغ مؤشر التنشيط
مضاد CD8 للفئرانInvitrogen17-0081-82جسم مضاد لـ CD8a الفأري مقترن بـ APC، مستنسخ 53-6.7، لتقنية قياس التدفق الخلوي
مضاد GZMB للفئرانBiolegend372212جسم مضاد لـ granzyme B البشري/الفأري مقترن بـ PerCP/Cyanine5.5، مستنسخ QA16A02، لقياس التدفق الخلوي داخل الخلوي
مضاد ICOS للفئرانBD Biosciences565886جسم مضاد لـ ICOS (CD278) للفئران مقترن بـ BV421 لتقنية قياس التدفق الخلوي
مضاد PD-1 للفئرانBiolegend135220جسم مضاد لـ PD-1 (CD279) الفأري المقترن بـ BV605، مستنسخ 29F.1A12، مخصص لقياس التدفق الخلوي
مضاد عامل نخر الورم الفأري (anti-mouse TNF)αInvitrogen46-7321-82جسم مضاد لـ TNF الفأري مقترن بـ PerCP-eFluor 710α جسم مضاد، النسيلة MP6-XT22، لقياس التدفق الخلوي داخل الخلوي
مضاد CD44 للفأر/الإنسانBiolegend103030جسم مضاد لـ CD44 الفأري/البشري مقترن بـ PE/Cyanine7، المستنسخ IM7، مخصص لقياس التدفق الخلوي
بيوتين مضاد لـ CD11b الفأريBiolegend101204جسم مضاد anti-mouse CD11b مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse CD11cBiolegend117304جسم مضاد لـ CD11c الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
biotin anti-mouse CD16/32Biolegend156604جسم مضاد لـ CD16/32 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ CD19 الفأريBiolegend115504جسم مضاد لـ CD19 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse CD4Biolegend100508جسم مضاد لـ CD4 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
مضاد CD44 للفئران الموّسم بالبيوتينBiolegend103004جسم مضاد لـ CD44 الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ CD45R الفأريBiolegend103204جسم مضاد لـ CD45R/B220 الخاص بالفأر مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ CD49b الفأريInvitrogen13-5971-85جسم مضاد لـ CD49b الفأري مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
بيوتين مضاد للفأر F4/80Biolegend123106جسم مضاد F4/80 المضاد للفئران المقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse Ly6GBiolegend127604جسم مضاد لـ Ly6G الفأري مقترن بالبيوتين لاستنفاد السلالة الخلوية
بيوتين مضاد لـ NK1.1 الفأريBiolegend108704جسم مضاد NK1.1 مضاد للفئران مقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
biotin anti-mouse TER119Biolegend116204جسم مضاد TER-119 المضاد للفئران والمقترن بالبيوتين لاستنزاف السلالة الخلوية
فئران من سلالة C57BL/6شركة Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.نظرًا لعدم توفر نص مصدري للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.6–فئران ذكور تبلغ من العمر 8 أسابيع استخدمت في التجارب
ثاني أكسيد الكربون (CO₂2حضّانةThermo Fisher3120ثاني أكسيد الكربون المرطب (Humidified CO2)2 حضّانة لاستنبات الخلايا الثديية
صبغة CellTrace VioletInvitrogenC34557صبغة فلورية بنفسجية لمراقبة تكاثر الخلايا
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650ثنائي ميثيل سلفوكسيد؛ مذيب لتحضير المحاليل القياسية للكواشف
جسم مضاد ثانوي من الحمار مضاد لـ IgG (H+L) من الأرنب، ممتز شديد التقاطع، Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206جسم مضاد ثانوي من نوع IgG (H+L) من الحمار مضاد للأرنب مقترن بـ Alexa Fluor 488
محلول منظم من الفوسفات المتوازن المنزوع البروتين (D-PBS)VivaCell BiosciencesC3590-0500دالبوكو’محلول ملحي منظم بالفوسفات للغسيل وتحضير الكواشف
مصل جنين البقر (FBS)GibcoC11995500BTمكمل المصل لوسط استزراع الخلايا الثديية
صبغة حيوية قابلة للتثبيتInvitrogen65-0865-14صبغة حيوية قابلة للتثبيت لاستبعاد الخلايا الميتة أثناء قياس التدفق الخلوي
محلول التثبيت والنفاذيةBD Biosciences51-2090KZكاشف التثبيت والنفاذية للتلوين داخل الخلوي
صفيحة 96 بئراً ذات قاع مسطحلابجيك (Labgic)11510طبق مسطح القاع بـ 96 بئراً لاستزراع الخلايا ومقايسات التحفيز
جهاز قياس التدفق الخلويBD Biosciencesليزر LSRFortessa-3جهاز قياس التدفق الخلوي بثلاثة ليزرات للاستحواذ على الفلورة متعددة الألوان
سدادة جولجيBD Biosciences51-2301KZمثبط نقل البروتين القائم على بريفيلدين أ (Brefeldin A) لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا
إيقاف جهاز جولجيBD Biosciences51-2092KZمثبط نقل البروتين القائم على المونينسين لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا
ملح كالسيوم أيونوميسينسيجماI3909-1MLناقل أيونات الكالسيوم المستخدم مع PMA لتحفيز الخلايا
محلول نفاذية/غسيل منظمBD Biosciences51-20911KZمحلول النفاذية والغسل للتلوين داخل الخلوي
محلول Phosflow Lyse/Fix المنظمBD Biosciences5580495× محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء وتثبيت الكريات البيضاء في آن واحد
منظم الغسيل والنفاذية Phosflow IBD Biosciences557885منظم نفاذية قائم على الميثانول لصبغ البروتينات المفسفرة داخل الخلوية
جسم مضاد أحادي النسيلة من الأرنب لبروتين S6 الريبوزومي المفسفر (Ser235/236) (D57.2.2E)إشارات الخلايا4858Sجسم مضاد أحادي النسيلة من الأرانب لبروتين S6 الريبوسومي المفسفر (Ser235/236)، النسيلة D57.2.2E
PMAسيجماP1585-1MGفوربول 12-ميريستات 13-أسيتات؛ منشط يستخدم لتحفيز الخلايا خارج الجسم الحي
إنترلوكين-2 المؤتلف للفئرانGibco200-02-50UGإنترلوكين-2 المأشوب للفئران لاستزراع الخلايا التائية وتوسيعها
RPMI 1640لايف لاب (Life-Lab)AC01L064وسط Roswell Park Memorial Institute 1640 لزراعة الخلايا الثديية
حبيبات الستربتافيدين المغناطيسيةقندس22307خرزات مغناطيسية مغلفة بالستريبتاديفين لاستنفاد الخلايا القائم على الأجسام المضادة المرتبطة بالبيوتين
محلول صبغ التدفق الخلوييرجى تقديم النص المراد ترجمته.يرجى تزويدي بالنص المصدر الذي ترغب في ترجمته. بصفتي مترجمًا متخصصًا في محتوى JoVE العلمي والتعليمي، أنا جاهز لتحويل النصوص من الإنجليزية إلى العربية بدقة أكاديمية، مع الالتزام التام بالمصطلحات العلمية المعتمدة والسياق البحثي الموجه للأكاديميين والممارسين الصحيين والطلاب.محلول صبغ قياس التدفق الخلوي؛ لم يتم توفير المورد أو تركيبة التحضير
غشاء المختبر Parafilm Mأمكور (Amcor)PM996غشاء مختبري مرن ذاتي الإغلاق لسد الأطباق والأنابيب وأوعية المزارع الخلوية
محلول التحلل والتثبيتBD Biosciences5580495× محلول منظم لتحلل كريات الدم الحمراء وتثبيت كرات الدم البيضاء في آن واحد
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1برنامج، الإصدار 10.8.1، لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

المراجع

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

T CD8 anti CD3 anti CD28 T mTORC1 T
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.