مقالة منهجية

تأثير توينا على تعبير أوركسين-أ تحت المهاد وسلوك النوم في نموذج الفئران للأرق الأولي

DOI:

10.3791/72000

⸱

يوليو 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Xinjiang Uygur Autonomous Region Academy of Traditional Chinese Medicine, 2School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Yueyang Clinical Medical College, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 4Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تبحث هذه الدراسة فيما إذا كانت توينا تخفف الأرق في نموذج الفئران من خلال تنظيم تعبير الأوركسين-A في تحت المهاد، باستخدام الفحوصات السلوكية، والكيمياء المناعية، وPCR الكمي في الوقت الحقيقي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأرق هو اضطراب نوم شائع يؤدي إلى ضعف الوظائف النهارية وزيادة خطر الإصابة بالأمراض المصاحبة، مما يؤثر بشكل كبير على جودة حياة المرضى. العلاجات الحالية، وخاصة العلاج السلوكي المعرفي والعلاج الدوائي، محدودة بقضايا مثل الإدمان على المخدرات، والتحمل، وارتداد الانسحاب. لقد ثبت أن علاج توينا ينظم الجهاز العصبي والغدد الصماء والمناعة، بينما يعد نظام الأوركسين منظما رئيسيا لدورة النوم واليقظة. وقد دفع ذلك إلى استكشاف ما إذا كانت توينا تخفف الأرق من خلال تعديل نظام الأوركسين تحت المهاد. يصف هذا البروتوكول طرق التدخل في توينا في نموذج الفئران للأرق الأولي الناتج عن طريقة البيئة المائية المعدلة متعددة المنصات. قمنا بتقسيم 64 فأر ويستار عشوائيا إلى أربع مجموعات: ضابطة، نموذج، توينا، ومضاد أوريكسين. أجريت تقييمات سلوكية (اختبار المجال المفتوح، اختبار النوم المستحث بالبنتوباربيتال)، وتم اكتشاف تعبير أوركسين-أ في تحت المهاد من خلال PCR الكمي في الوقت الحقيقي والكيمياء المناعية. يهدف البروتوكول إلى تقييم فعالية توينا ودراسة آلياتها المحتملة المتعلقة بنظام الأوركسين، موفرا مرجعا لتطبيق ودراسة توينا الميكانيكية في اضطرابات النوم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأرق، الذي يتميز بعدم الرضا عن مدة أو جودة النوم مما يؤدي إلى ضعف النهار، هو مشكلة صحية عالمية شائعة تشكل عبئا كبيرا على الأفراد وأنظمة الرعاية الصحية1،2. في الصين، انتشار الأرق مرتفع بشكل ملحوظ، مما يزيد من تأثيره على الصحة العامة3. يرتبط هذا الاضطراب بضعف الوظائف الإدراكية، وزيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية، وارتفاع المرض المصاحب مع الحالات النفسية مثل الاكتئاب والقلق. يعتمد الإدارة السريرية الحالية بشكل أساسي على العلاج السلوكي المعرفي والعلاج الدوائي، لا سيما البنزوديازيبينات والمنومات المهدئة غير البنزوديازيبينية. ومع ذلك، فإن تطبيقها طويل الأمد مقيد بالاعتماد على الأدوية، والتحمل، والتأثيرات المتبقية خلال النهار، وأعراض الانسحاب، مما يبرز الحاجة إلى بدائل فعالة غير دوائية6. في الممارسة السريرية، تعد توينا مناسبة بشكل خاص للمرضى الذين يعانون من الأرق الأولي المزمن الذين يبحثون عن تدخلات غير دوائية، خاصة لكبار السن المعرضين لخطر الاعتماد العالي على الأدوية، وكذلك النساء الحوامل أو المرضعات7.

كحجر الأساس في العلاج الخارجي للطب الصيني التقليدي، أظهر توينا مزايا فريدة في علاج الأرق. تظهر الأدلة التحليلية التلوية أن توينا يتفوق بشكل ملحوظ على الأدوية أو العلاج بالإبر الصينية وحدها في معدل الفعالية الكلي (OR = 4.12)، وجودة النوم، وحالات القلق والاكتئاب، مع أمان عالي9. تقدم بروتوكولات توينا المحددة مزايا واضحة: يحقق التوينا التقليدي فعالية بنسبة 89.5٪ لأرق البلغم الحراري، بينما يقلل فرك البطن من معدلات الانتكاس إلى 14.7٪ (مقابل 38.2٪ مع التوينا التقليدي)10. تعزز طريقة توينا المكونة من ثلاثة أجزاء فعالية العلاج بالأعشاب من 80.49٪ إلى 92.68٪ مع تحسين بنية النوم وملفات الناقلات العصبية11. أكدت الدراسات السريرية والمراجعات المنهجية أن توينا يمكن أن يحسن جودة النوم بشكل كبير، ويقلل من درجات القلق والاكتئاب، ويعدل مستويات المصل للناقلات العصبية مثل 5-هيدروكسي تريبتامين (5-HT)12. يعتقد أن تأثيراته العلاجية تتمحور عن خلال التنظيم الشامل لشبكة الجهاز المناعي العصبي والغدد الصماء. ركزت الأبحاث الحديثة بشكل متزايد على نظام الأوركسين، وهو نظام رئيسي للنويوروببتيدات ينبع من تحت المهاد الجانبي ويعد ضروريا لتعزيز والحفاظ على اليقظة13. النشاط الزائد غير الطبيعي لخلايا الأوركسين مرتبطة بالفيزيولوجيا المرضية للأرق، بينما أظهر تثبيط هذا المسار إمكانات علاجية14. تشير الأدلة الأولية إلى أن التلاعبات مثل فرك البطن يمكن أن تؤثر على مستويات الأوركسين-أ في الدماغ لدى فئران محرومة من النوم12، ومع ذلك لا يوجد تحقيق منهجي لمعرفة ما إذا كانت توينا تمارس تأثيراتها المضادة للأرق تحديدا من خلال تعديل نظام الأوركسين مفقودة.

لذلك، وبناء على نموذج الفئران للأرق الأولي، تهدف هذه الدراسة إلى: (1) تقييم تحسن سلوك النوم بعد التدخل الموحد في توينا باستخدام اختبارات السلوك؛ و(2) التحقيق في الآلية الأساسية من خلال فحص ما إذا كان تأثير توينا مرتبطا بانخفاض تنظيم تعبير أوركسين-أ في تحت المهاد، ومقارنة فعاليته مع مضاد مستقبلات الأوركسين. يسعى هذا البحث إلى تقديم أدلة تجريبية حول الآلية المركزية لتوينا في علاج الأرق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية وتقييمات رفاهية الحيوان من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة شينجيانغ الطبية (رقم الموافقة الأخلاقية: IACUC-20020158). يتبع البروتوكول إرشادات مؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الحيوانات

  1. فئران ويستار الخالية من الممرضات المحددة (SPF) من المنزل 64 (وزن الجسم 250 جرام ± 50 جم، توزيع متساوي بين الجنسين) في نظام حاجز SPF عند 18–22 درجة مئوية مع دورة ضوء وظلام لمدة 12 ساعة. وفر الطعام والماء بإرادته.
  2. بعد أسبوع من التغذية التكيفية، قسم الفئران عشوائيا إلى 4 مجموعات (n = 16 لكل مجموعة): ضابط (المجموعة A)، نموذج (المجموعة B)، توينا (المجموعة C)، والخصم (المجموعة D).

2. تأسيس نموذج الأرق الأساسي

ملاحظة: باستثناء المجموعة أ، تخضع الفئران في المجموعات ب وج ود لإجراء النمذجة التالي.

  1. جهز وعاء بلاستيكي أسطواني (القطر الأعلى: 30 سم، الارتفاع: 40 سم) كصندوق للفئران.
  2. ثبت منصة أسطوانية (القطر: 6 سم، الارتفاع: 10 سم) في قاع الحاوية.
  3. أضف الماء إلى الحاوية حتى يصبح مستوى الماء 1 سم تحت سطح المنصة. حافظ على درجة حرارة الماء عند 20 درجة مئوية.
  4. ضع شبكة حديدية دائرية (قطر: 25 سم، حجم الشبكة: 1 سم) أفقيا داخل الحاوية، على ارتفاع 15 سم فوق المنصة. ثبت الشبكة على حافة الحاوية باستخدام أسلاك حديدية رفيعة.
  5. ضع ماء الشرب والطعام على شبكة الحديد. استبدل الماء يوميا، ونظف وتعقيم الحاوية.
  6. ضع فأر واحد لكل حاوية على المنصة لمدة 8 أيام متتالية.

3. تقييم النموذج باستخدام اختبار النوم التآزري للصوديوم بنتوباربيتال

  1. يتم تحضير محلول الصوديوم البنتوباربيتال عن طريق إدخال ماء فائق النقاء مباشرة. وزن 1.0 جرام من المسحوق، أضف ماء فائق نقي معقم إلى 100 مل، ذيب الهواء، وتصفية عند 0.22 ميكرومتر للحصول على محلول بنسبة 1٪ (10 ملغ/مل).
  2. في اليوم التاسع، حقن جميع الفئران داخل الصفاق بمحلول بنتوباربيتال الصوديوم عند الحد الأدنى من الجرعة التي تحفز النوم (تم تحديدها في التجارب الأولية).
  3. سجل زمن الاستجابة للنوم (الوقت من الحقن حتى فقدان رد فعل التصحيح) ومدة النوم (الفترة من فقدان إلى استعادة رد فعل التصحيح). عرف فقدان رد فعل الاستقامة لمدة دقيقة واحدة كبداية نوم، وتعافيه بنهاية النوم.

4. تدخل توينا

ملاحظة: تبدأ التدخلات في اليوم التالي لنجاح تقييم النموذج وتستمر مرة واحدة يوميا لمدة 14 يوما متتالية. تخضع المجموعة أ والمجموعة ب للتقييد في إطار تثبيت لمدة 10 دقائق يوميا. يتلقى المشغلون تدريبا صارما قبل التجربة لضمان الاتساق في القوة والتردد والإيقاع.

  1. بالنسبة للمجموعة C، ثبت الفأر في وضعية الاستلقاء على طاولة العمليات.
  2. ثبت أطراف الفأر الأربعة بلطف باستخدام أصابع اليد اليسرى الخمسة، مع تمديد البطن بالكامل.
  3. قم بعمل توينا البطني باليد اليمنى: استخدم لب الفالانكس البعيد للإصبع الأوسط لتطبيق القوة عند نقطة جوانيوان (CV4، الواقعة على بعد 25 مم أسفل السرة). حافظ على الأصابع الأربعة المتبقية ممدودة بشكل طبيعي.
  4. قم بدفع الإصبع الأوسط باستخدام حركات دائرية صغيرة أمامية جانبية من مفصل الكتف، مع تنفيذ احتكاك دائري عكس عقارب الساعة على البطن.
  5. اتبع مسارا دائريا مغلقا يتكون من جيوي (CV15، 5 مم أسفل النتوء الزيفويد)، قوانيون (CV4)، ونقاط دايماي ثنائية (GB26، نقطة المنتصف بين الطرف الحرللضلع الثاني عشر والحد العلوي للرأس الحرقفي).
  6. حافظ على حركة دائرية سلسة وثابتة ومستمرة بسرعة 5–7 دورات في الدقيقة.
  7. قم بالتلاعب عكس عقارب الساعة لمدة 5 دقائق، ثم التلاعب باتجاه عقارب الساعة لمدة 5 دقائق.
  8. تأكد من أن القوة ثابتة وثابتة، مع بقاء الفأر هادئا وعدم مقاومته. طبق التدخل مرة واحدة يوميا لمدة 14 يوما.

5. إدارة الخصم

  1. بالنسبة للمجموعة د، أعط دواء MK-4305 (10 ملغ/كغ) عن طريق التشويش داخل المعدة مرة واحدة يوميا لمدة 14 يوما. قم بإذابة MK-4305 في محلول ملحي عادي لتحضير محلول بسعة 5 مل.

6. اختبار الملعب المفتوح

  1. بعد فترة التدخل، أجر اختبار المجال المفتوح باستخدام صندوق مكعب أسود (القاعدة: 100 سم × 100 سم، الارتفاع: 40 سم). قسم الأرضية إلى 25 مربعا متساويا بواسطة خطوط رمادية (16 مربعا طرفيا، 9 في الوسط).
  2. ضع الفأر في المربع المركزي وابدأ التوقيت.
  3. سجل إجمالي المسافة المقطوعة، وعدد فترات التربية، والوقت الذي يقضيه في المنطقة المركزية خلال أكثر من 3 دقائق باستخدام نظام التقاط الصور.
  4. بعد كل اختبار، أزل البراز ونظف الأرضية والجدران الداخلية بنسبة 75٪ إيثانول.
  5. تشغيل نظام اكتساب الصور
    1. قم بإعداد نظام اكتساب الصور. قم بتركيب كاميرا CCD رقمية (الدقة: 1280 × 720 بكسل؛ معدل الإطارات: 25 إطارا في الثانية) عموديا على ارتفاع 1.5 متر فوق الحقل المفتوح. قم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر عبر واجهة USB.
    2. قم بتكوين برنامج التتبع وإعدادات التحليل. قم بإجراء تتبع آلي باستخدام برنامج تحليل الفيديو السلوكي. اضبط معلمات التتبع كما يلي:
      1. عرف تركيز التتبع كنقطة مركز (مركز الكتلة) للفأر.
      2. اضبط معدل الإطارات على 25 إطارا في الثانية لكل من التقاط الصور والتحليل.
      3. معايرة الدقة المكانية بحيث يتوافق كل بكسل مع 1.5 مم من المسافة الفعلية بناء على أبعاد المجال المفتوح ودقة الفيديو.
      4. اضبط عتبة طرح الخلفية إلى 15 مستوى رمادي (النطاق: 0–255) لتمييز الفأر عن الخلفية.
      5. اضبط الحد الأدنى لمدة الحدث إلى 0.2 ثانية (5 إطارات) لتقليل الاكتشافات الإيجابية الكاذبة الناتجة عن الضوضاء.
      6. قسم الحقل المفتوح تقريبا إلى 5 × 5 مربعات متساوية المساحة (المناطق 1–25). حدد المنطقة المركزية كمناطق 7، 8، 9، 12، 13، 14، 17، 18، و19 (المربع المركزي 3 × 3، يمثل 36٪ من المساحة الإجمالية). حدد المنطقة المحيطية بأنها المربعات المتبقية.
    3. سجل معايير الإخراج التالية: إجمالي المسافة المقطوعة (مم)، متوسط السرعة (مم/ث)، الوقت الذي يقضيه في حالة ثبات متحركة، الوقت الذي يقضيه في كل منطقة (م)، المسافة التي تم تحريكها في كل منطقة (مم)، عدد الإدخالات في كل منطقة، وعدد فترات الصعود. تحقق من نوبات التربية يدويا.

7. التروية في الكيمياء المناعية النسيجية

ملاحظة: استخدم 4 فئران من كل مجموعة لإجراء الكيمياء المناعية.

  1. حضر محلول ملحي بنسبة 0.9٪ (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) ومحلول بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ (مخزن عند 4 درجات مئوية).
  2. تخدير الفئران بعمق باستخدام اليوريثان داخل الصفاق (محلول 25٪، 0.6 مل/100 جرام وزن الجسم). أكد فقدان ردود الفعل في الدواسة والقرنية والتقويم.
  3. ثبت الجرذ على لوح رغوة. افتح تجويف الصدر بسرعة عن طريق قطع الجلد واللفافة وعظمة القص.
  4. اسحب القلب بلطف لكشف الشريان الأبهر. أدخل إبرة عبر قمة البطين الأيسر إلى الشريان الأبهر حتى يصبح طرف الإبرة مرئيا في تجويف الشريان الأبهري. تأكد من محاذاة الإبرة، البطين الأيسر، والشريان الأبهري أفقيا.
  5. ثبت الشريان الأبهر والإبرة معا باستخدام ملقط دموي. قم بقص الأذين الأيمن فورا للسماح بتدفق الدم.
  6. البرود يحتوي على 150–200 مل من محلول ملحي مدفأ مسبقا بنسبة 0.9٪ (37 درجة مئوية). يشير النجاح إلى التروية من خلال تقشر الكبد، والميسيناريه، والأطراف الأمامية، وإزالة السائل من الأذين الأيمن.
  7. انتقل إلى بارافورمالديهايد بارد بنسبة 4٪ (4 درجات مئوية) وبيرفيوز 400 مل. قم بإجراء التروية الأولية بسرعة حتى تحدث تشنجاتات عضلية الجسم بالكامل وتصلب الأطراف. ثم قلل معدل التدفق إلى قطرتين/ثانية حتى يتم تثبيط كل مادة التثبيت (ثبيت).
  8. أكد نجاح التثبيت عندما يبدو الدماغ شاحبا وثابتا.

8. تشريح الدماغ

  1. بعد التروية، اقطع رأس الجرذ وأزل الدماغ بالكامل من الجمجمة بحذر.
  2. اقطع الجمجمة على طول خياطة السهمية باستخدام المقص. قم بتقشير عظام الجدارية والقذالة باستخدام عظام الرونجر العظمية.
  3. ارفع الدماغ بلطف باستخدام الملعقة، واقطع الأعصاب القمجمة والبصرية بمقص دقيق.
  4. بالنسبة لكيمياء المناعة النسية: انقل الدماغ بالكامل فورا إلى 4٪ بارافورمالديهايد، ثم قم بتثبيته عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
  5. لعملية PCR كمية في الوقت الحقيقي: اشطف سطح الدماغ بمحلول ملحي مبرد مسبقا، جفف الدماغ بورق فلتر، جمد في النيتروجين السائل لمدة 5–10 دقائق، واحتفظ به عند –80 درجة مئوية. قم بجميع الخطوات على الجليد.

9. التلوين الكيميائي المناعي

  1. دمج نسيج تحت المهاد في البارافين وقطع مقاطع تاجية بسماكة 4–5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بتركيب الأقسام على منزلقات مقاومة للسقوط، واخبزه على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1.5–2 ساعة.
  2. إزالة الشمع من الزيلين I وII (10 دقائق لكل منهما). أعد ترطيبه عبر الإيثانول المصنف: الإيثانول اللامائي I وII (5 دقائق لكل منهما)، ثم 95٪، 90٪، 80٪، 70٪ إيثانول (5 دقائق لكل منهما)، ثم الماء المقطر (5 دقائق).
  3. قم بسحب المستضدات عن طريق وضع أقسام في مخزن سترات مغلي بحجم 0.01 مولار (pH 6.0) في قدر الضغط. سخن حتى يرتفع صمام الضغط، ثم أوقف الحرارة. انقعها لمدة 10 دقائق، ثم برد طبيعيا إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. يعطل بيروكسيداز داخلي عن طريق غمر أقسام في H₂O₂ طازج بنسبة 3٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3× باستخدام PBS (5 دقائق لكل منها).
  5. اجعل النسيج الدائري بقلم الكيمياء المناعية. طبق الأجسام المضادة متعددة النسيلات من نوع الأرنب المضاد ل HCRT/Orexin-A (التخفيف 1:50، ~50 ميكرولتر لكل شريحة). حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في صندوق رطب.
  6. في اليوم التالي، أعد تسخينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل 3× باستخدام PBS (5 دقائق لكل منها).
  7. استخدم الأجسام المضادة الثانوية الموسومة ببيروكسيداز الفجل الحار. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3× باستخدام PBS (3 دقائق لكل منها).
  8. استخدم محلول عمل الستربتافيدين الموسوم ببيروكسيداز الفجل الحارس. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3× باستخدام PBS (5 دقائق لكل منها).
  9. تحضير محلول كروموجين DAB (0.85 مل ماء مقطر + 50 ميكرولتر لكل من المواد A، B، C). طبقها على الأقسام وطور لمدة 3–10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع المراقبة تحت المجهر. أوقف التفاعل بالغمر في ماء الصنبور لمدة 3 دقائق.
  10. ضع صبغة مضادة بالهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق. يمايز في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 1–2 ثانية. الأزرق في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
  11. جفف بالماء المقطر (3 دقائق)، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪ إيثانول (3 دقائق لكل منهما)، والإيثانول اللامائي I وII (5 دقائق لكل منهما). شفافة في زيلين I و II (5 دقائق لكل منهما).
  12. ضع بلسم محايد وغطاء. يجف طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  13. راقب وصور الأقسام باستخدام مجهر ضوئي (40×، 100×، 200×، 400×). عد خلايا أوركسين-أ الإيجابية (الترسيب الحبيبي البني في السيتوبلازم) باستخدام ImageJ.
  14. احسب الدرجة الإجمالية (0–12) كدرجة شدة التلوين (0 = سالب، 1 = أصفر فاتح، 2 = بني فاتح، 3 = بني داكن) مضروبة في نسبة الخلية الإيجابية (0 = 0٪، 1 = 1–25٪، 2 = 26–50٪، 3 = 51–75٪، 4 = 76–100٪). عرف 1–5 كتعبير منخفض، و6–12 كتعبير عالي.

10. PCR الكمي في الوقت الحقيقي ل mRNA أوركسين-أ

  1. يجب إجراء معالجة الحمض النووي الريبي بعد إذابة الأنسجة في ظروف خالية من الريناز. المتطلبات المحددة للتخلص من RNase هي كما يلي:
    1. بيئة العمل: استخدم منطقة عمل مخصصة للحمض النووي الريبي تم مسحها بمطهر RNase وتعرضت لأشعة فوق بنفسجية.
    2. المواد الاستهلاكية: استخدم أنابيب الطرد المركزي المعتمدة الخالية من RNase ورؤوس الماصات، أو بدلا من ذلك، نقعها في ماء DEPC بنسبة 0.1٪ ثم التلقيم التلقائي.
    3. الكواشف: استخدم مخزن تحلل خال من RNase وماء معالج ب DEPC.
    4. العملية: ارتد قفازات خالية من المسحوق طوال الإجراء، وتغيير القفازات بشكل متكرر، وتجنب الاتصال المباشر بداخل المواد الاستهلاكية والعينات.
    5. الإجراء التجريبي
      ملاحظة: خلال خطوات استخراج الحمض النووي الريبي ونسخ العكس، يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية والأدوات التي تلامس مع الحمض النووي الريبي أو كواشف النسخ العكسي خالية من الحمض النووي الريني. في مرحلة تضخيم PCR، وبما أن cDNA هو بنية مزدوجة السلسلة ولا يمكن ل RNase تحليل الحمض النووي مزدوج السلسلة، فإن المواد الاستهلاكية والأدوات في هذه المرحلة تحتاج فقط إلى أن تكون خالية من DNase وغيره من الشوائب التي قد تثبط تفاعلات PCR؛ لا يلزم علاج إضافي خال من RNase. طحن الأنسجة المجمدة تحت المهاد تحت النيتروجين السائل. ازن 50–100 ملغ من مسحوق الأنسجة داخل أنبوب يحتوي على 1 مل تريزول. اخلط ووقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  2. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم، وامزج بالانقلاب، واقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. انقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد. أضف كمية متساوية من الإيزوبروبانول، اخلط، واثبت على درجة حرارة –20 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  4. اغسل الترسب بنسبة 75٪ إيثانول، واستخدم الطرد المركزي بحرارة 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وكرر الغسيل مرة واحدة.
  5. ترسب جافا في الهواء عند درجة حرارة الغرفة. اذوب في ماء خال من RNase.
  6. قس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء (نسبة A260/A280 1.8–2.1). قيم السلامة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام 1٪ (نطاقات 28S و18S الواضحة، نطاق 5S ضعيف أو غائب).
  7. تحضير تفاعل النسخ العكسي (20 ميكرولتر): 800 نانوغرام RNA كلي، 1 ميكرولتر برايمر عشوائي (0.1 ميكروغرام/ميكرولتر)، 10 ميكرولتر 2× خليط تفاعل TS، 1 ميكرولتر خلطة إنزيم TransScript RT/RI، 1 ميكرولتر مزيل gDNA، وماء خال من RNase إلى الحجم.
  8. حضن على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان لتخليق cDNA للخيط الأول. تخفيف cDNA بنسبة 1:1 باستخدام ماء خال من RNase.
  9. تحضير تفاعل qPCR (10 ميكرو لتر): 5 ميكرولتر إيفاجرين 2× qPCR ماستر ميكس، 0.3 ميكرولتر تمهيد أمامي (10 ميكرومتر)، 0.3 ميكرولتر تمهيد عكسي (10 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر قالب cDNA، ماء خال من RNase إلى الحجم. انشر ثلاث نسخ.
    ملاحظة: البادئات: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGACGTGTTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCAGAGTGAG-3' (طول المنتج 88 حص); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
    β-أكتين-آر: 5'-TTTAATGTCACCACGATTTC-3' (طول المنتج 150 بوت).
  10. شغل برنامج qPCR: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (قبل التعويذة)؛ 40 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان (إزالة الطبيعة) و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (التلدين/التمديد).
  11. تحقق من منحنيات التضخيم والصهر. شغل 5 ميكرولتر من المنتج على جل أغاروز بنسبة 2٪ للتأكد من النوعية.
  12. حساب تعبير mRNA النسبي في Orexin-A باستخدام طريقة 2⁻ΔΔCt باستخدام β-Actin كضابط تحكم داخلي.

11. التحليل الإحصائي

  1. استخدم SPSS 26.0 لتحليل البيانات. عبر عن جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. للمقارنات بين مجموعتين، استخدم عينات مستقلة اختبار t إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي؛ وإلا استخدم اختبار مان-ويتني U.
  2. للمقارنات بين مجموعات متعددة، استخدم اختبار ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار LSD بعد الظهور للتباينات المتجانسة أو اختبار تامهان للتباينات غير المتجانسة. إذا لم تكن البيانات موزعة بشكل طبيعي، استخدم اختبار كروسكال-واليس H. اعتبر P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الجدول 1 أنه مقارنة بالمجموعة أ، كان زمن الاستجابة للنوم في المجموعات ب وج و د طويلا بشكل ملحوظ، وتم تقصير مدة النوم بشكل ملحوظ بعد النمذجة، مما يشير إلى أن نموذج فئران الأرق الأساسي تم تأسيسه بنجاح. تقدم النتائج في الجدولين 2 والجدول 3 دعما أوليا للتأثير العلاجي لتوينا في علاج الأرق. اختبار الحقل المفتوح (OFT) هو أحد أكثر النماذج الكلاسيكية والأكثر استخداما في علم الأعصاب السلوكي لتقييم السلوك الشبيه بالقلق لدى القوارض15. أظهرت الدراسات أن تفضيل المنطقة ذات الأربع زوايا هو مؤشر حساس لقياس السلوك الشبيه بالقلق، وقد يكون أكثر تمييزا من مؤشر المنطقة المركزية في مستويات القلق المتوسطة إلى المنخفضة. أظهرت فئران نموذج الأرق سلوكيات وتغيرات كبيرة شبيهة بالقلقفي السلوك الاستكشافي، بينما خفف تدخل توينا بشكل فعال من السلوكيات الشبيهة بالقلق لدى هذه الفئران. تظهر نتائج علم الأحياء الجزيئي المعروضة في الجدولين 4 والجدول 5، والشكل 1 أن توينا تقلل بشكل فعال من فرط التعبير عن أوركسين-أ في تحت المهاد لدى فئران نموذج الأرق.

figure-results-1
الشكل 1: نتائج التلوين المناعي الكيميائي لجهاز Orexin-A في تحت المهاد لدى الفئران في كل مجموعة (40×، 100×، 200×، 400×). (أ) لوحظت خلايا عصبية إيجابية لأوريكسين-أ في نسيج تحت المهاد للفئران، تظهر كإشارات حبيبية بنية داكنة. كانت درجة شدة التلوين 3 نقاط، ونسبة الخلايا الإيجابية 40٪ (تقع ضمن نطاق 26٪–50٪، مع تسجيل نقطتين)، وكانت النتيجة الإجمالية 6 نقاط، وهي ضمن نطاق التعبير العالي. (ب) زاد عدد الخلايا العصبية الإيجابية للأوركسين-أ في نسيج تحت المهاد للفئران بشكل ملحوظ مقارنة بالمجموعة الطبيعية، مع توزيع أكثر كثافة للخلايا الإيجابية. كانت درجة شدة التلوين 3 نقاط (بني داكن)، ونسبة الخلايا الإيجابية 80٪ (ضمن نطاق 76٪–100٪، مع تسجيل 4 نقاط)، وكانت النتيجة الإجمالية 12 نقطة، وهي ضمن نطاق التعبير العالي. (ج) تم تقليل عدد الخلايا العصبية الموجبة أوريكسين-أ في نسيج تحت المهاد للفئران مقارنة بمجموعة النموذج. كانت درجة شدة التلوين 3 نقاط (بني داكن)، ونسبة الخلايا الإيجابية 75٪ (تقع ضمن نطاق 51٪–75٪، مع تسجيل 3 نقاط)، وكانت الدرجة الإجمالية 9 نقاط، وهي ضمن نطاق التعبير العالي. (د) كما تم تقليل عدد الخلايا العصبية الإيجابية لأوريكسين-أ في نسيج تحت المهاد للفئران مقارنة بمجموعة النموذج. كانت درجة شدة التلوين 3 نقاط (بني داكن)، ونسبة الخلايا الإيجابية 60٪ (تقع ضمن نطاق 51٪–75٪، مع تسجيل 3 نقاط)، وكانت النتيجة الإجمالية 9 نقاط، وهي ضمن نطاق التعبير العالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المجموعةزمن الاستجابة للنوم / الحد الأدنىمدة النوم / دقيقة
A4.13 ± 1.8049.75 ± 38.46
B6.31 ± 2.80*22.13 ± 11.41*
C6.33 ± 2.60*24.93 ± 14.43*
D6.53 ± 1.90*24.73 ± 17.59*

الجدول 1: مقارنة اختبارات النوم المستحثة بالبنتوباربيتال الصوديوم بين المجموعات بعد النمذجة. * تشير إلى P < 0.05 مقارنة بمجموعة الضابطة.

المجموعةتردد الرفعوقت الجمود (أو الزمن)زمن الحركة (زمن)مسافة الحركة (م)الوقت في منطقة الوسط (أو الوسط)المسافة في المنطقة الوسطى (م)الوقت في منطقة الزواياالمسافة في منطقة الزاوية (م)الوقت في منطقة الزواياالمسافة في المنطقة الجانبية (م)
A1.875 ± 0.83576,700 ± 34.324103.350 ± 34.30718.318 ± 16.3148,750 ± 7.7182.937 ± 5.112103,000 ± 28.5826.315 ± 3.89356,600 ± 27,7726.705 ± 3.666
B7.125 ± 5.66831.513 ± 10.964148.488 ± 10.96422.399 ± 9.15916.275 ± 10.7033.244 ± 2.99175.088 ± 21.5616.578 ± 1.97285.463 ± 23.37411.724 ± 4.959
قيمة T-2.5923.547-3.545-0.617-1.613-0.1462.205-0.171-2.249-2.302
قيمة P0.0350.007*0.007*0.5470.1290.8860.045*0.8670.041*0.037*

الجدول 2: تحليل تأثير كل مستوى مؤشر بين مجموعة الضابط (A) ومجموعة النموذج (B).* يشير إلى P < 0.05 مقارنة بمجموعة التحكم.

المجموعةتردد الرفعوقت الجمود (أو الزمن)زمن الحركة (زمن)مسافة الحركة (م)الوقت في منطقة الوسط (أو الوسط)المسافة في المنطقة الوسطى (م)الوقت في منطقة الزواياالمسافة في منطقة الزاوية (م)الوقت في منطقة الزواياالمسافة في المنطقة الجانبية (م)
B5.875 ± 2.29529.819 ± 12.871150.219 ± 12.86719.165 ± 8.05424.838 ± 13.0683.178 ± 2.43869.075 ± 13.9925.823 ± 1.42283.019 ± 15.4649.878 ± 4.393
C6.357 ± 0.62735.993 ± 32.237144.021 ± 32.24623.291 ± 4.87314.321 ± 3.7743.106 ± 2.21487.057 ± 12.658 △8.087 ± 1.496 △68.943 ± 9.24010.420 ± 1.225
D6.667 ± 1.63330.808 ± 15.389149.200 ± 15.38018.584 ± 4.96927.792 ± 12.4603.085 ± 1.11474,600 ± 22.2485.744 ± 1.291▲74.192 ± 17.0119.465 ± 3.380

الجدول 3: تحليل تأثير كل مستوى مؤشر بين مجموعة النموذج (B)، مجموعة توينا (C)، ومجموعة الخصم (D). △P < 0.05 مقارنة بمجموعة النموذج (B); ▲P < 0.05 مقارنة بمجموعة توينا (C).

المجموعةأوركسين-أ
A1.011 ± 0.173
B10.436 ± 2.512△
C2.392 ± 0.998▲
D3.227 ± 1.703▲

الجدول 4: مستويات تعبير mRNA في أوركسين-أ في نسيج تحت المهاد. △P < 0.05 مقارنة بمجموعة الضابط (A); ▲P < 0.05 مقارنة بمجموعة النماذج (B).

المجموعةأوركسين-أ
شدة التلويننسبة الخلايا الموجبةالنسبة المئويةالموسيقى التصويرية
A340%26
B380%412
C375%39
D360%39

الجدول 5: درجات التلوين المناعي الكيميائي لأوركسين-أ في تحت المهاد لدى الفئران في كل مجموعة. معايير تقييم شدة الصبغ: 0 = صبغة سلبية (عديم اللون)، 1 = أصفر فاتح، 2 = بني فاتح، 3 = بني داكن. نسبة تقييم الخلايا الإيجابية: 0 = 0٪، 1 = 1٪–25٪، 2 = 26٪–50٪، 3 = 51٪–75٪، 4 = 76٪–100٪. الدرجة الكلية = درجة شدة التلوين × نسبة مئوية. تم تعريف الدرجات الإجمالية من 1 إلى 5 على أنها منخفضة التعبير، ودرجات 6–12 على أنها عالية التعبير.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هدفت هذه الدراسة إلى تقييم فعالية توينا في نموذج فئران الأرق الأولي واستكشاف آليتها المحتملة المرتبطة بنظام الأوركسين تحت المهاد. تظهر النتائج الحالية أن بروتوكول توينا الموحد حسن بشكل ملحوظ زمن النوم ومدة النوم، وخفف من السلوكيات الشبيهة بالقلق، وخفض بشكل فعال من فرط التعبير عن أوركسين-أ عند مستويات mRNA والبروتينات في منطقة تحت المهاد. ومن الجدير بالذكر أن تأثير توينا كان مشابها لتأثير مضاد مستقبلات الأوركسين MK-4305، مما يشير إلى أن تعديل نظام الأوركسين قد يكون آلية محورية يخفف من خلالها الأرق.

مقارنة بالتدخلات الدوائية، يقدم توينا كعلاج خارجي غير جراحي مزايا في السلامة، وتقليل الآثار الجانبية، والامتثال للمرضى12،18. تدعم فوائده العلاجية للأرق أدلة سريرية تظهر تحسنا في جودة النوم والحالة النفسية18,19. الآلية متعددة الأوجه، تشمل تنظيم محور تحت المهاد-الغدة النخامية-الغدة الكظرية، وتوازن الجهاز العصبي الذاتي، والناقلات العصبية الرئيسية مثل 5-HT18,20. توسع النتائج هذا الفهم من خلال تحديد نظام الأوركسين كهدف محدد. عصبونات الأوركسين هي المحركات المركزية لليقظة، وفرط استثارتها مرتبط بعدم استقرار النوم 21,22,23. يبدو أن انخفاض تنظيم الأوركسين-A الذي لوحظ بعد توينا يتوافق مع تأثير دواء الأرق الجديد مضاد مستقبلات الأوركسين المزدوج، مما يبرز وجود مسار تقارب محتمل بين التدخلات الدوائية وغير الدوائية24,25.

بينما تبني هذه الدراسة على عملنا المنشور سابقا حول توينا البطني واللائحة25 للأوركسين-A، تمثل المخطوطة الحالية امتدادا كبيرا وتحسينا منهجية يتجاوز التقرير الأصلي. على وجه التحديد، توسع هذه الدراسة حجم العينة إلى 64 فأرا لتعزيز القوة الإحصائية وتقدم مجموعة شاملة من التقييمات السلوكية، بما في ذلك اختبار المجال المفتوح واختبارات النوم المستحثة بالبنتوباربيتال، لتقييم هيكل النوم والسلوكيات الشبيهة بالقلق بشكل منهجي والتي لم يتم تناولها في الدراسة السابقة. على عكس العمل السابق الذي ركز بشكل كبير على الإجهاد التأكسدي والناقلات العصبية الكلاسيكية، تعطي هذه المقالة الأولوية للتحقق الوظيفي لنظام الأوريكسين من خلال نتائج سلوكية متكاملة واختبارات جزيئية، وتعمل كتحقيق ميكانيكي مستقل يكمل النتائج السابقة بدلا من تكرارها.

التزم التصميم التجريبي بنظرية الطب الصيني التقليدي من خلال التركيز على البطن ونقاط الوخز المحددة مثل قوانيوان (CV 4)، الذي يعتقد أنه يقوي الطاقة البدائية وينظم الوظيفة الحشوية، ضمن مسار التلاعب المغلق26,27. تم توحيد المعايير (التكرار، المدة، المسار) بناء على العمل الأولي لضمان الاتساق وقابلية التكرار، وهو جانب حاسم في دراسات الحيوانات الميكانيكية12.

ومع ذلك، لهذا البروتوكول حدود. أولا، تم إجراء التدخل في نقطة زمنية واحدة بعد النمذجة. ينبغي أن تبحث الدراسات المستقبلية في فترات وتكرار التدخل المختلفة لإثبات علاقة مثالية بين "الجرعة-الاستجابة" لتوينا. ثانيا، هذه الدراسة هي تصميم بحثي رصدي. على الرغم من وجود علاقة بين توينا وانخفاض تعبير أوركسين-أ والتحسن السلوكي، إلا أنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان هذا الارتباط تأثيرا مباشرا أو غير مباشر لتوينا أو عوامل أخرى. يمكن للأبحاث المستقبلية استخدام استراتيجيات تجريبية مثل إزالة الجينات، أو التثبيط الكيميائي، أو الحصار المضاد للتحقق مما إذا كانت توينا تحسن سلوك الأرق من خلال تنظيم تعبير أوركسين-أ، وبالتالي توضيح آليته السببية. أخيرا، لم تثبت هذه الدراسة مجموعة ضابطة لعملية وهمية أو تدخل وهمي. ومع ذلك، أخذت هذه الدراسة هذا الأمر في الاعتبار أثناء التصميم، وتلقت جميع مجموعات الحيوانات نفس مستوى عمليات الإمساك والتثبيت، والتي إلى حد ما كانت تتحكم في تأثير عوامل الإجهاد غير المحددة. بالإضافة إلى ذلك، تم توحيد تكرار وشدة ومسار الفعل لبرنامج توينا في هذه الدراسة بناء على تجارب أولية لضمان اتساق وقابلية تكرار التدخل. يجب أن تركز الأبحاث المستقبلية على تطوير طرق تحكم أكثر صرامة، مثل استخدام محاكاة غير تلامسية أو التحفيز اللمسي الأدنى، لتوضيح التأثيرات المحددة لعمليات توينا.

تشمل الخطوات الرئيسية الحاسمة لنجاح هذا البروتوكول: أولا، التحكم الصارم في درجة حرارة المياه وأبعاد المنصة في طريقة البيئة المائية متعددة المنصات المعدلة؛ ثانيا، معايرة ما قبل التجريبية لجرعة الصوديوم الخماسي تحت العتبة؛ ثالثا، توحيد معايير معالجة توينا (تردد 5–7 دورات/دقيقة، ثم عكس عقارب الساعة ثم التلاعب باتجاه عقارب الساعة لمدة 5 دقائق لكل دورة) وتدريب المشغلين؛ ورابعا، التجميد السريع لأنسجة تحت المهاد في النيتروجين السائل يليه التعامل الخالي من RNase لضمان استقرار mRNA أوريكسين-A.

تشمل التعديلات المحتملة: أولا، تطوير جهاز توينا ميكانيكي آلي لتقليل التنوع بين المشغلين؛ ثانيا، استخدام قياس تخطيط الدماغ الكهربائي/تخطيط الكهرومغناطيسي لاستبدال اختبار النوم الصوديوم بنتوباربيتال، مما يمكن من مراقبة مراحل النوم المستمرة؛ وثالثا، الجمع بين الأساليب الكيميائية أو البصرية للتحقق من ضرورة وجود خلايا أوركسين في التوسط في تأثيرات توينا.

تستند قابلية تكرار هذا البروتوكول على: مسارات العمليات التفصيلية والمعلمات، واستخدام دواء ضابط إيجابي، والكشف ثنائي الأبعاد على مستويات البروتين والmRNA، والتقارير الإحصائية الدقيقة. تنعكس قابليتها العملية في الجوانب التالية: متطلبات المعدات المنخفضة للاختبارات السلوكية دون الحاجة إلى أنظمة قياس عن بعد باهظة الثمن؛ دورة تجريبية إجمالية لا تتجاوز 8 أيام للنمذجة و14 يوما للتدخل في توينا، تكتمل خلال 4 أسابيع، مما يتماشى جيدا مع دورات التمويل والجداول المخبرية لمعظم مشاريع البحث الروتينية، مما يسهل جمع البيانات بسرعة والتحقق المنهجي. علاوة على ذلك، يتم قياس بروتوكول التلاعب بتوينا بوضوح من حيث مسار التشغيل (CV15 → CV4 → GB26 الثنائي → العودة إلى CV15)، والتردد (5–7 دورات/دقيقة)، والتسلسل الاتجاهي (عكس عقارب الساعة يليه عقارب الساعة)، ومدة (10 دقائق في كل جلسة). تسمح هذه المواصفات للمشغلين المختلفين بإتقان التقنية بعد تدريب قصير، مما يقلل من خطر ضعف قابلية التكرار الناتجة عن الاختلافات الفردية التي ترى عادة في دراسات التلاعب اليدوي.

أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، قد تظهر عدة مشاكل شائعة، ويوصى باتخاذ تدابير مناسبة لاستكشاف المشكلة. أولا، قد تسقط الفئران من المنصة أثناء إجراء البيئة المائية المعدلة متعددة المنصات. عادة ما يكون ذلك بسبب سطح منصة زلق بشكل مفرط. الحل هو خشونة سطح المنصة بخفة باستخدام ورق صنفرة ناعم لزيادة الاحتكاك. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يحتوي كل حاوية على فأر واحد فقط لتجنب الإزعاج المتبادل. ثانيا، قد يفشل اختبار النوم الصوديوم البنتوباربيتال في إظهار فروق ذات دلالة كبيرة بين المجموعات. الحل هو إعادة تعديل الجرعة الأدنى تحت العتبة بزيادات 5 ملغ/كجم خلال التجارب التجريبية باستخدام مجموعة منفصلة من الحيوانات (3–4 لكل مجموعة). يجب إجراء الحقن في نفس الوقت يوميا (ويفضل بين الساعة 9:00 و11:00 صباحا) لتقليل التغيرات اليومية. ثالثا، قد تواجه الجرذان صعوبة أو تصدر أصواتا أثناء التلاعب بتويين، مما يشير عادة إلى القوة المفرطة أو ضبط غير مناسب. يجب على المشغل تقليل القوة المطبقة حتى يبقى الفأر هادئا دون مقاومة. يوصى بالتدريب المسبق باستخدام دمية استشعار الضغط لتوحيد تطبيق القوة. يجب أن يكون الفأر مستلقيا على ظهره مع تثبيت جميع الأطراف الأربعة بلطف ولكن بأمان، لضمان تعرض البطن بالكامل. رابعا، غالبا ما ينشأ التباين الكبير في نسبة الخلايا الإيجابية للأوركسين-أ ضمن نفس المجموعة التجريبية نتيجة غير متسقة في مستويات القطع عبر منطقة تحت المهاد، أو تحيز العد الذاتي، أو التغير في التلوين من دفعة إلى دفعة. الحل الموصى به هو توحيد المستوى التشريحي بالرجوع إلى أطلس دماغ الفئران (مثل باكسينوس & واتسون)، وجمع مقاطع تاجية من بريغما –1.8 مم إلى –3.3 مم لتحليل تحت المهاد. يجب على مراقبين مستقلين أعمى عن تخصيص المجموعة إجراء عد الخلايا، ويجب استخدام القيمة المتوسطة. يجب صبغ جميع العينات لمقياس النتائج في نفس الدفعة، ويشجع تحليل العتبة شبه الآلي باستخدام ImageJ لتقليل ذاتية المراقب.

في الختام، وضعت هذه الدراسة بروتوكول تدخل توينا موحد ونظام تقييم متعدد المستويات في نموذج الأرق الأولي. يقدم هذا الدليل القوي على أن توينا يحسن سلوكيات الأرق، ربما من خلال آلية تتعلق بقمع فرط التعبير عن أوركسين-أ تحت المهاد. هذا الإطار المنهجي لا يقدم فقط نموذجا قابلا للتكرار للتحقيق في الآليات المركزية لتوينا نفسه، بل يوفر أيضا مرجعا للدراسات الميكانيكية للتدخلات غير الدوائية الأخرى لاضطرابات النوم.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحظى هذه الدراسة بدعم من مؤسسة العلوم الطبيعية لمنطقة شينجيانغ ذاتية الحكم للأويغور (رقم 2025D01C219) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81860885، 82474666). لم يكن للممولين أي دور في تصميم أو تنفيذ أو كتابة الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5x All-In-One RT MasterMixabmG492تخليق cDNA
Acetylcholine (Ach)Nanjing JianchengA105-1متفاعل ELISA
Adhesion microscope slidesJiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.N/Aتركيب أقسام الأنسجة
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A811BA0014الرحلان الكهربائي للهلام
Anhydrous ethanolTianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.N/Aإزالة الرطوبة من الأنسجة
Antibody diluentBeijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.ZLI-9029تخفيف الأجسام المضادة الأولية
BasketFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.N/Aحامل الشرائح
Citrate powderFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.MVS-0066تحضير محلول استرجاع المستضد
CoverslipJiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.N/Aالتصوير المجهري
DAB chromogen kitFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.DAB-1031الكشف اللوني
DEPCSangon Biotech (Shanghai)B417BA0001معالجة خالية من RNase
Dopamine (DA)Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.CSB-E08660rمتفاعل ELISA
Electrophoresis cellBeijing Liuyi Instrument FactoryDYCZ-21الرحلان الكهربائي للهلام
Electrophoresis power supplyBeijing Liuyi Instrument FactoryDYY-6Cالرحلان الكهربائي للهلام
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low RoxabmG891 / MasterMix-ELمتفاعل qPCR
Gamma-aminobutyric acid (γ-GABA)AMOKEAE91068Raمتفاعل ELISA للناقل العصبي
Gel imaging systemShanghai Tanon2500توثيق الهلام
H2O2 (30%)Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.N/Aحجب البيروكسيداز الذاتي
Hematoxylin staining solutionFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.CTS-1097صبغة مضادة
High-speed refrigerated centrifugeShanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.Nefuqe 15Rطرد المركزي للعينات
Histamine (HIS)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteEH171-1متفاعل ELISA
Hot air drying ovenShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.DHG seriesتجفيف العينات
IHC staining humidity chamberFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.BOX-1001حجرة رطبة للحضانة
Immunohistochemistry staining kitBeijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.SP9000صبغة الكيمياء النسيجية المناعية
IncubatorShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.DNP-9272حضانة متحكم فيها في درجة الحرارة
Induction cookerGuangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.C21-RK2101مصدر تسخين
Microplate readerBio-Rad, ChinaxMarkقياس الامتصاص
MicroscopeNikonE200التصوير المجهري
MK-4305Meilun BioMB3773متفاعل تجريبي
Neutral balsamBeijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.ZLI-9555وسط التثبيت
Norepinephrine (NA)Nanjing JianchengH096متفاعل ELISA
Nucleic acid and protein quantifierBeijing KaiaoK5500تقدير الحمض النووي
Orexin AWuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.CSB-E08860rمتفاعل ELISA
PCR thermal cyclerBio-Rad, USAMyCycler Thermal Cyclerتكاثر PCR
Phosphate-buffered saline (PBS)Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.PBS-0060/0061محلول الغسل
PipetteEppendorf, GermanyDragon labالتعامل مع السوائل
Pressure cookerZhejiang Supor Co., Ltd.YW20F1استرجاع المستضد
Protein quantification kitTransGen BiotechDQ111-01مجموعة تقدير البروتين BCA
Rabbit anti-HCRT (Orexin-A) polyclonal antibodySangon Biotech (Shanghai)D163595الجسم المضاد الأولي
Real-time PCR instrumentABI (Thermo Fisher)QuantStudio 6 Flexتحليل qPCR
RefrigeratorHefei Meiling Co., Ltd.BCD-249LCKتخزين العينات
Serotonin (5-HT)Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.CSB-E08364rمتفاعل ELISA
Staining jarGenericN/Aحاوية صبغ الشرائح
Super immunohistochemistry penFuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.PEN-0002قلم الحاجز المائي
Trans2K DNA MarkerTransGen BiotechBM101سلم الحمض النووي
TRIzol ReagentAmbion15596026استخراج RNA
Vortex mixerHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.GL-88Bمختلط المختبر
XyleneTianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.N/Aإزالة البارافين

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MedicineEffectiveness

مقالات ذات صلة