تُقيم هذه الدراسة تعبير YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا باستخدام المعلوماتية الحيوية وتقنية qRT-PCR. وبينما تشير تحليلات قواعد البيانات إلى انخفاض في التعبير وعلاقة إنذارية، فإن التحقق السريري لم يظهر أي فرق معنوي. وتسلط النتائج الضوء على وجود تضاربات، مما يشير إلى دقة تشخيصية محدودة وضرورة إجراء مزيد من التحقق قبل التطبيق السريري.
مقالة بحثية
تعبير بروتين m6A القارئ YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا ضمن مجموعة سريرية صينية
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
لا يزال سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) سببًا رئيسيًا للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم، مع توفر عدد محدود من المؤشرات الحيوية للتشخيص المبكر والإنذار. وتلعب تعديلات الحمض النووي الريبي m6A (N6-methyladenosine) وبروتيناته القارئة، مثل YTHDC2، أدوارًا حاسمة في تنظيم الجينات وتكوين الأورام. تهدف هذه الدراسة إلى تقييم ملف تعبير YTHDC2 في أنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا باستخدام المعلوماتية الحيوية وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)، وتقييم العلاقة بين YTHDC2 والخصائص المرضية السريرية، واستكشاف أهميته السريرية والبيولوجية المحتملة للأبحاث المستقبلية. تم تحليل بيانات التعبير الجيني والبقاء على قيد الحياة من قواعد البيانات لتقييم دقة الإنذار. كما تم قياس تعبير YTHDC2 في أنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا ضمن مجموعة سريرية صينية، وتحليل الخصائص المرضية السريرية. وأظهرت تحليلات قواعد البيانات العامة أن YTHDC2 كان منخفض التعبير في أنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا (p < 0.05) وكان مرتبطًا ببقاء المرضى على قيد الحياة، على الرغم من أن أداءه الإنذاري كان ضعيفًا (AUC ≈ 0.5). وأظهر تحليل qRT-PCR لـ 19 زوجًا من الأنسجة الورمية والأنسجة الطبيعية المجاورة عدم وجود فرق ذو دلالة إحصائية (p = 0.537) في تعبير YTHDC2 بين الأنسجة السرطانية والأنسجة المجاورة. وبشكل جماعي، تشير تحليلات قواعد البيانات العامة إلى أن YTHDC2 قد يكون منخفض التعبير وله صلة إنذارية محتملة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا، ولكن التحقق السريري المستقل في مجموعتنا لم يؤكد وجود تعبير تفاضلي معتد به. تسلط هذه النتائج الضوء على التباين الكبير بين مجموعات البيانات واسعة النطاق والمجموعات السريرية الواقعية، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن يعمل YTHDC2 كمؤشر حيوي تشخيصي أو إنذاري موثوق بمفرده، وقد يتطلب دمجه مع مؤشرات جزيئية إضافية لتحقيق القابلية للتطبيق السريري.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يعد سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، والذي يشمل سرطان الخلايا الحرشفية والسرطان الغدي، أكثر أنواع سرطان الرئة تشخيصاً وسبباً رئيسياً لوفيات السرطان على مستوى العالم1. وتظهر إحصائيات السرطان العالمية أن سرطان الرئة هو أحد الأسباب الرئيسية لوفيات السرطان2. ولم تؤدِ التطورات الأخيرة في التشخيص والجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الموجه جزيئياً إلى تحسين مآل مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا بشكل ملحوظ، وذلك لأن التشخيص الأولي يحدث في مرحلة متأخرة، وغالباً ما يكون المرض بدون أعراض في المراحل المبكرة3. وهذا يؤكد الحاجة إلى مؤشرات حيوية جديدة لتحديد المرض والتنبؤ بمآله وتقييم فعالية العلاج لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا.
يُعد m6A أول تعديل تم تحديده وأكثر تعديلات RNA وفرة في حقيقيات النوى، وقد ارتبط باستقرار RNA وترجمته ونسخه4. وتتميز تعديلات m6A بأنها ديناميكية وقابلة للعكس، وتتم بتسهيل من إنزيمات ميثيل ترانسفيراز (الكُتّاب)، وإنزيمات إزالة الميثيل (الممحاة)، وبروتينات ربط محددة (القراء)5. ومن بين هذه البروتينات، يقوم YTHDC2، وهو بروتين قارئ رئيسي لـ m6A، بتنظيم استقرار RNA ومعدل الترجمة6. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن YTHDC2 يشارك في تنظيم أنواع متعددة من السرطانات، إما عن طريق تثبيط نمو الخلايا وغزوها أو عن طريق تحفيز موت الخلايا7. كما سلطت الدراسات الضوء على الأهمية السريرية لبروتينات قارئة أخرى لـ m6A، بما في ذلك YTHDF1 و YTHDF2 و YTHDC1، في تطور سرطان الرئة والتنظيم المناعي والإنذار المرضي، مما يؤكد أهمية التقييم المنهجي للقراء الفرديين لـ m6A في مجموعات مستقلة من المرضى8,9,10. وفي سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، توجد مستويات منخفضة بشكل ملحوظ من YTHDC2، وهو ما ارتبط بمراحل الورم المتقدمة، وانتشار العقد اللمفاوية، وسوء الإنذار المرضي للمرضى، مما يشير إلى أنه قد يكون عاملاً مضاداً للأورام11. كما كشفت التجارب المختبرية والحيوية أن التعبير العالي لـ YTHDC2 يثبط تكاثر الخلايا والانتشار في سرطان الرئة7.
في هذه الدراسة، تم استقصاء تنظيم YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) من خلال تحليلات حاسوبية متكاملة وتحقق تجريبي عبر تقنية qRT-PCR. كما تم بحث العلاقة بين تعبير YTHDC2 والخصائص المرضية السريرية وإنذار المرضى. وعلى الرغم من تزايد الأدلة المستمدة من قواعد البيانات العامة التي تشير إلى خلل في تنظيم YTHDC2 في NSCLC، فقد أفادت الدراسات المنشورة بنتائج غير متسقة فيما يتعلق بحجم وأهمية هذا الخلل السريرية، ولا يزال التحقق المستقل في مجموعات سريرية واقعية محددة الخصائص، خاصة في المجموعات السكانية الآسيوية، محدوداً. علاوة على ذلك، اعتمدت معظم الدراسات السابقة بشكل أساسي على مجموعات بيانات ترانسكريبتومية عامة أو نماذج تجريبية، مع وجود عدد قليل نسبياً من الدراسات التي تدمج نتائج المعلوماتية الحيوية مع تحقق سريري مستقل. ومن خلال الجمع بين تحليلات ترانسكريبتومية عامة واسعة النطاق وتحقق مستقل بواسطة qRT-PCR في مجموعة سريرية صينية، هدفت هذه الدراسة إلى تقييم مدى تكرار النتائج السابقة ومعالجة الفجوة الانتقالية بين تحليلات قواعد البيانات العامة والعينات السريرية الواقعية. وبناءً على ذلك، هدفت هذه الدراسة إلى تقييم تعبير YTHDC2 بشكل منهجي باستخدام مناهج متكاملة من المعلوماتية الحيوية والتحقق السريري، وتقدير أهميته البيولوجية والسريرية المحتملة في NSCLC. وقد افترضت الدراسة أن تعبير YTHDC2 مختل في NSCLC، وأن دمج تحليلات المعلوماتية الحيوية مع التحقق السريري المستقل سيوفر تقييماً أكثر موثوقية لأهميته التشخيصية والإنذارية مقارنة باستخدام أي من النهجين بمفرده.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية في جامعة هاينان الطبية (رقم الموافقة HMC1984.24)، وكانت متوافقة مع إعلان هلسنكي (بصيغته المنقحة في عام 2013).
أشخاص الدراسة
أُجريت دراسة شملت 50 مريضاً بسرطان الرئة تم تشخيصهم بين عامي 2017 و2024 في مستشفى سانيا المركزي بمقاطعة هاينان، وذلك وفقاً للإرشادات السريرية للجمعية الطبية الصينية لتشخيص وعلاج سرطان الرئة (طبعة 2024). وقد تم اعتماد تصنيف CSCO (2024) ليتوافق مع الإصدار الثامن من تصنيف AJCC لضمان القابلية للمقارنة بين الدراسات، كما تم التحقق من ذلك في المجموعات الصينية12، مع مراجعة مريضين من قبل طبيبين أورام مستقلين لضمان الاتساق. وتلخص الشكل 1 عملية اختيار المرضى، وتوفر الأنسجة، وتقييم جودة الـ RNA، والعينات النهائية المدرجة لتحليل qRT-PCR.
بيانات الدراسة
استخدمت هذه الدراسة المعلوماتية الحيوية لتحليل مستويات تعبير YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) وعلاقتها بالسمات السريرية المرضية، مما يوفر رؤى حول الآليات المحتملة. أُجريت تحليلات المعلوماتية الحيوية حصرياً باستخدام بيانات تسلسل RNA المتاحة علناً من أطلس جينوم السرطان (TCGA)، بما في ذلك سرطان الرئة الغدي (LUAD)، وسرطان الرئة الحرشف الخلايا (LUSC)، وعينات أنسجة الرئة الطبيعية المقابلة التي تم تنزيلها عبر بوابة بيانات GDC (https://portal.gdc.cancer.gov/). تضمنت مجموعة البيانات التي تم تنزيلها بيانات تعبير تسلسل RNA إلى جانب المتغيرات السريرية المتاحة (معرف المريض، ومعرف العينة، والعمر، والجنس، والمرحلة المرضية، وحالة البقاء على قيد الحياة، ووقت البقاء الإجمالي) للحالات المؤهلة من TCGA-LUAD وTCGA-LUSC. تم استبعاد العينات التي تفتقر إلى معلومات التعبير الجيني أو معلومات البقاء على قيد الحياة من تحليلات البقاء وتحليلات ROC اللاحقة. تتوفر مجموعة البيانات المستخدمة في هذه الدراسة في الملف التكميلي 1. لم تُستخدم أي عينات سريرية جُمعت من مستشفى سانيا المركزي في تحليلات المعلوماتية الحيوية. تتوفر الإجراءات التفصيلية لتحليلات GEPIA وKaplan–Meier Plotter وsurvivalROC في قسم تحليل المعلوماتية الحيوية أدناه. تم تلخيص سير عمل المعلوماتية الحيوية الكامل، بما في ذلك الحصول على البيانات، والمعالجة المسبقة، وتحليل التعبير الجيني، وتحليل البقاء، وتحليل ROC، في الشكل 2.
معايير الاشتمال والاستبعاد
تظهر معايير الإدراج والاستبعاد للمرضى في الجدول 1. وقد حدد تحليل القوة باستخدام برنامج تحليل القوة الإحصائية أن توفير 26 حالة على الأقل لكل مجموعة سيعطي قوة بنسبة 80% للكشف عن حجم تأثير متوسط (d = 0.8, α = 0.05، ثنائي الذيل). وبينما كان الهدف من التسجيل الأولي هو 50 زوجاً في مجموعة سرطان الرئة، شمل تحليل qRT-PCR النهائي 30 عينة ورمية و19 عينة من الأنسجة الطبيعية المجاورة بعد استبعاد العينات بسبب جودة الأنسجة أو الحمض النووي الريبي RNA. ويعكس هذا الانخفاض في حجم العينة القيود السريرية الواقعية ويسلط الضوء على أهمية سلامة RNA وتوفر الأنسجة في الدراسات الانتقالية. وعندما يكون n = 19 للمقارنات، فإن الحد الأدنى لحجم التأثير القابل للكشف هو d = 1.0 (قوة 80%، α = 0.05). وبالتالي، كانت التجربة ذات قوة كافية للكشف عن الاختلافات الكبيرة، ولكن ليس الاختلافات الصغيرة إلى المتوسطة، في تعبير YTHDC2.
عينات الأنسجة وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
تم تحديد التشخيصات الباثولوجية بطريقة مزدوجة التعمية بواسطة اثنين من أطباء الباثولوجيا المختلفين. وقام أطباء الباثولوجيا بتقدير نقاء الورم (>70% من الخلايا الخبيثة) وتم تأكيده عبر ESTIMATE (TCGA). كما تم إجراء تشريح عياني للأنسجة الطبيعية المجاورة لتقليل التلوث السدوي. شملت الأنواع النسيجية لسرطان الرئة سرطان الرئة الغدي وسرطان الخلايا الحرشفية، بواقع 26 حالة من سرطان الرئة الغدي و4 حالات من سرطان الخلايا الحرشفية. أُجري التصنيف السريري لـ 50 مريضاً مصاباً بسرطان الرئة وفقاً لمعايير التصنيف الموضحة في "الإرشادات السريرية لجمعية medical association الصينية لسرطان الرئة (طبعة 2024)". ومثلت عينات NSCLC المؤكدة باثولوجياً (n = 50) التوزيعات السريرية النموذجية (انظر الجدول 2). ومن بين 50 مريضاً تم إدراجهم في البداية، استوفت 30 عينة من أنسجة الورم و19 عينة مطابقة من الأنسجة الطبيعية المجاورة معايير جودة RNA. ونظراً لأن التحليل الإحصائي المزدوج يتطلب عينات مطابقة من المريض نفسه، فقد أُجريت مقارنة التعبير الجيني في الورم مقابل الأنسجة الطبيعية المجاورة باستخدام الأزواج الـ 19 المطابقة المتاحة. استُخدمت هذه العينات السريرية حصرياً للتحقق التجريبي بواسطة qRT-PCR وتم تحليلها بشكل مستقل عن مجموعات بيانات TCGA العامة المستخدمة في تحليل المعلوماتية الحيوية. تمت معالجة هذه العينات المختارة فور التأكيد الباثولوجي والتعامل معها في ظروف خالية من RNase قبل استخلاص RNA. تعكس هذه المجموعة الفرعية الحالات التي أمكن فيها الحصول على كمية كافية من الأنسجة وRNA كلي عالي الجودة (رقم سلامة RNA، RIN >7.0). وتم قياس تركيز ونقاء RNA الكلي قبل النسخ العكسي، وأُدرجت فقط العينات ذات جودة RNA الكافية (RIN >7.0) في التحليلات اللاحقة. تم تحويل كميات متساوية من RNA الكلي إلى DNA مكمل (cDNA) عن طريق النسخ العكسي وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة قبل إجراء PCR الكمي. وضمنت هذه العملية صحة بيانات التعبير الجيني التي تم تحليلها. أُجريت تجارب qRT-PCR على جهاز thermocycler لـ PCR في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة PCR كمية تعتمد على المسبار. نُفذت جميع التفاعلات في ثلاث نسخ مكررة، جنباً إلى جنب مع ضوابط خالية من القالب لضمان قابلية التكرار التحليلي. أُجري تضخيم PCR في ظل ظروف الدورات التالية: خطوة تنشيط الإنزيم/المسخ الأولية عند 95°C لمدة 10 min، تلتها 40 دورة من المسخ عند 95°C لمدة 15 s والارتباط/التمديد عند 60°C لمدة 60 s. وتم الحصول على إشارات الفلورة في نهاية كل دورة تضخيم. تم الحصول على جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية من موردين تجاريين (انظر جدول المواد). وتتوفر تسلسلات البادئات والمسبارات المستخدمة في qRT-PCR في الجدول 3.
التحليل المعلوماتي الحيوي
تحليل قاعدة بيانات GEPIA للتعبير الجيني لـ YTHDC2
تم استخدام قاعدة بيانات GEPIA لتحليل تعبير YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). تم الدخول إلى خادم GEPIA الإلكتروني (http://gepia.cancer-pku.cn/) عبر متصفح الويب، واختيار وحدة Expression DIY، ثم إدخال رمز الجين "YTHDC2"، واختيار مجموعات بيانات LUAD وLUSC، مع الإبقاء على معلمات التعيير الافتراضية، ومن ثم توليد مخططات الصندوق للتعبير التفاضلي مباشرة عبر واجهة GEPIA. وقد حُددت الدلالة الإحصائية بأن تكون p < 0.05.
قاعدة بيانات Kaplan-Meier plotter لتحليل البقاء على قيد الحياة لمرضى سرطان الرئة
حللت الدراسة العلاقة بين تعبير YTHDC2 والإنذار لدى مرضى سرطان الرئة باستخدام قاعدة بيانات Kaplan-Meier Plotter. تم اختيار مجموعة بيانات سرطان الرئة، وإدخال رمز الجين "YTHDC2"، وتطبيق خيار نقطة القطع المثلى المختارة تلقائياً، ثم تم إنشاء منحنيات Kaplan–Meier للبقاء على قيد الحياة الإجمالي والبقاء على قيد الحياة بعد تطور المرض باستخدام إعدادات التحليل الافتراضية. تم تقسيم المرضى تلقائياً إلى مجموعات ذات تعبير عالٍ ومنخفض بناءً على نقطة القطع المثلى التي حددتها منصة Kaplan–Meier Plotter، كما تم استخراج نسب المخاطر مع فواصل الثقة 95% المقابلة باستخدام الإعدادات الافتراضية للمنصة.
تشغيل حزم R في برنامج R لرسم منحنى ROC
تم تنزيل بيانات تعبير تسلسل الـ RNA والبيانات السريرية الوصفية المقابلة لها للحالات المؤهلة من TCGA-LUAD وTCGA-LUSC من بوابة بيانات GDC. تم دمج مجموعات البيانات التي تم تنزيلها بواسطة معرف المريض واستيرادها إلى برنامج R لإجراء التحليلات اللاحقة. استُخدمت حزمة survivalROC لإنشاء منحنيات ROC المعتمدة على الوقت عند نقاط زمنية تنبؤية تبلغ 1 و3 و5 سنوات، وحُسبت قيم المساحة تحت المنحنى (AUC) المقابلة لتقييم الأداء الإنذاري لتعبير YTHDC2. شمل تحليل survival ROC فقط مرضى TCGA-LUAD وTCGA-LUSC الذين تتوفر لديهم معلومات تعبير RNA-seq ومعلومات البقاء على قيد الحياة. ولم تُستخدم المجموعة السريرية المحلية للتنبؤ بالبقاء على قيد الحياة نظراً لعدم توفر بيانات المتابعة طويلة الأمد.
تعبير YTHDC2 في الأنسجة بواسطة qRT-PCR
لتحليل مستويات التعبير الجيني، تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). أضيفت أحجام متساوية من cDNA إلى كل تفاعل وفقاً لظروف التفاعل الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. تم إجراء التضخيم باستخدام مقايسة PCR كمية تعتمد على المسبار، وجُمعت بيانات الفلورة تلقائياً في نهاية كل دورة تضخيم. باختصار، تضمنت عملية استخلاص RNA عدة خطوات، شملت تحضير العينة، وإزالة البارافين، وإزالة السوائل المتبقية، والهضم باستخدام البروتيناز K، والحضن، والطرد المركزي، والمعالجة بإنزيم DNase، وإضافة DNase I، والترسيب بالإيثانول. ثم رُبطت العينة بعمود تنقية RNA يعتمد على السيليكا وجرى طردها مركزياً عند 8,000 × g لمدة 30 s. غُسل العمود بعد ذلك بمحلول الغسيل 1، ومحلول الغسيل 2، ومحلول الغسيل 2 المخفف بالإيثانول، ثم جُفف عند 13,000 × g لمدة 2 min. استُخلص RNA بعد ذلك بإضافة 70 µL من الماء الخالي من RNase إلى مركز غشاء العمود، متبوعاً بالطرد المركزي عند 13,000 × g لمدة 1 min. أظهر كل زوج من البادئات منتج تضخيم واحداً، وهو ما تم تأكيده بواسطة تحليل منحنى الانصهار قبل حساب التعبير الجيني النسبي. تم التحقق من كفاءة البادئات (90–110%) باستخدام منحنيات قياسية قبل تحليل العينات. وأكدت تحليلات منحنى الانصهار وجود مضخمات فردية وغياب ثنائيات البادئات. حُسب التعبير النسبي لـ YTHDC2 باستخدام طريقة 2-ΔCt، حيث تم تطبيع قيم Ct بالنسبة للجين المرجعي الداخلي GAPDH. وبما أن قيم التعبير قُدمت كمستويات تعبير مطبعة بدلاً من تغيرات طيّة بالنسبة لعينة معايرة، فقد تم الإبلاغ عن النتائج كقيم 2−ΔCt. تم اختيار GAPDH كجين تدبير منزلي لأن تعبيره أظهر تبايناً أدنى (CV < 5%) مقارنة بالبدائل المختبرة (ACTB، CV = 12%؛ 18S rRNA، CV = 18%)، وهو ما يتفق مع معايير اختيار الجينات المرجعية في دراسات m6A.
التحليل الإحصائي
أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برامج إحصائية، بما في ذلك إنشاء الرسوم البيانية والمخططات. ولتحليل البيانات الكمية والفئوية الخاصة بالتعبير الجيني لـ YTHDC2 في مرضى NSCLC، استُخدم برنامج R لإجراء تحليلات المعلوماتية الحيوية وإنشاء منحنيات ROC. كما استُخدمت منحنيات ROC والمساحة تحت المنحنى (AUC) لتقييم الأداء التشخيصي للتعبير عن YTHDC2 في التنبؤ بالبقاء على قيد الحياة. وبالنسبة للتحليلات القائمة على الانحدار، تم تسجيل تقديرات التأثير (نسب الأرجحية) مع فواصل الثقة المقابلة بنسبة 95% حيثما كان ذلك مناسباً. استُخدم اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة (Wilcoxon signed-rank test) لمقارنة التعبير عن YTHDC2 بين عينات الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة المقترنة، بينما استُخدم تحليل ارتباط بيرسون لتقييم العلاقة بين التعبير عن YTHDC2 والسمات المرضية السريرية. وتم تسجيل معاملات الارتباط (r) وقيم p المقابلة لها. ونظراً لأن بيانات qRT-PCR تضمنت عينات مقترنة من الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة من نفس المرضى، ولأن بيانات التعبير الجيني لم تكن موزعة توزيعاً طبيعياً، فقد استُخدم اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة لمقارنة مستويات التعبير عن YTHDC2 بين الأنسجة المقترنة؛ حيث لا يفترض هذا الاختبار طبيعية توزيع البيانات ويُستخدم عادةً للبيانات البيولوجية ذات التوزيع الملتوي. كانت جميع الاختبارات الإحصائية ثنائية الذيل، واعتُبرت قيمة p <0.05 دالة إحصائياً. كما تم تقييم المتغيرات المستمرة للتأكد من طبيعية توزيعها قبل التحليل، وعُرضت المتغيرات المستمرة كمتوسط ± انحراف معياري أو وسيط (المدى الربيعي)، حسبما هو مناسب.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تعبير جين YTHDC2 في الأورام استناداً إلى قاعدة بيانات TCGA
يوضح الشكل 3 الارتباط بين سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) وبروتين YTHDC2 من خلال فحص مستويات تعبير YTHDC2 في أنواع مختلفة من السرطانات باستخدام أداة GDC في قاعدة بيانات TCGA.
تعبير جين YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) في قاعدة بيانات GEPIA
تم الحصول على 483 عينة نسيج من سرطان الرئة الغدي، و347 عينة نسيج رئوي طبيعي، و486 عينة نسيج من سرطان الرئة الخلايا الحرشفية، و338 عينة نسيج رئوي طبيعي من خلال فحص إضافي لمستويات تعبير YTHDC2 في سرطان الرئة الغدي (LUAD) وسرطان الرئة الخلايا الحرشفية (LUSC) ضمن قاعدة بيانات GEPIA. ومن خلال التحليلات الإحصائية، وُجد أن أنسجة كل من سرطان الرئة الغدي وسرطان الرئة الخلايا الحرشفية تظهر مستويات تعبير YTHDC2 أقل بكثير من أنسجة الرئة الطبيعية (p < 0.05)، كما هو موضح في الشكل 4.
تحليل GEPIA لتعبير YTHDC2 عبر المراحل المرضية
استُخدمت قاعدة بيانات GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) لإنشاء مخطط مرحلي لتقييم التعبير التفاضلي لـ YTHDC2 عبر مراحل سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). وكما هو موضح في الشكل 5، لم تُلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في تعبير YTHDC2 عبر المراحل المرضية لـ NSCLC (p = 0.644).
تحليل كابلان-ماير لـ YTHDC2 ومعدلات البقاء على قيد الحياة في سرطان الرئة
تَم استخدام قاعدة بيانات Kaplan-Meier Plotter لإجراء تحليل كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة لجين YTHDC2. ووفقاً للنتائج، أظهر المرضى الذين يعانون من تعبير مرتفع لـ YTHDC2 معدل بقاء إجمالي (OS) أعلى بكثير مقارنة بأولئك الذين لديهم تعبير منخفض (p < 0.05). وكما هو موضح في الشكل 6A (OS)، كان تشخيص مرضى سرطان الرئة الذين أظهروا مستويات أعلى من YTHDC2 أفضل، وكان هذا الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05). ووفقاً لـ الشكل 6B (PPS)، أظهرت المجموعة ذات التعبير المرتفع لـ YTHDC2 تشخيصاً أفضل من المجموعة ذات التعبير المنخفض في مجموعة بيانات البقاء على قيد الحياة بعد تطور المرض (PPS)؛ وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05).
نموذج التنبؤ بمعدل البقاء على قيد الحياة لـ YTHDC2
كشف تحليل منحنى خصائص التشغيل (ROC) المعتمد على الوقت، استناداً إلى بيانات التعبير الجيني لـ RNA-seq وبيانات البقاء على قيد الحياة من TCGA، عن قدرة تنبؤية محدودة للتعبير عن YTHDC2 بمفرده في التنبؤ بالبقاء على قيد الحياة لمرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، حيث بلغت قيم المساحة تحت المنحنى (AUC) 0.50 (95% CI: 0.38-0.62)، و0.51 (95% CI: 0.39-0.63)، و0.52 (95% CI: 0.40-0.64)، و0.52 (95% CI: 0.39–0.65) عند مرور سنة واحدة و3 و5 و8 سنوات على التوالي (الشكل 7). وقد شملت جميع فترات الثقة لقيم AUC القيمة 0.5، مما يشير إلى أداء يعادل الصدفة العشوائية. وتشير هذه النتائج إلى أن التعبير عن YTHDC2 بمفرده يفتقر إلى القدرة التمييزية للتنبؤ بالبقاء على قيد الحياة، ولا ينبغي اعتباره مؤشراً حيوياً إنذارياً مستقلاً. وقد يؤدي دمج هذا المؤشر مع المتغيرات المرضية السريرية أو البصمات الجينية المتعددة إلى تحسين الأداء التنبؤي.
تعبير YTHDC2 في الأنسجة السرطانية مقابل الأنسجة الطبيعية بواسطة qRT-PCR
تم استقصاء تعبير جين YTHDC2 في كل من الأنسجة الخبيثة والأنسجة الطبيعية المجاورة لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) باستخدام تقنية qRT-PCR. وكان تعبير YTHDC2 المعياري (2−ΔCt) هو 3.24 ± 2.34 في الأنسجة الخبيثة و3.60 ± 1.70 في الأنسجة الطبيعية المجاورة. ولم يكن هناك فرق معنوي في تعبير YTHDC2 بين 19 زوجاً من أنسجة أورام NSCLC والأنسجة الطبيعية المجاورة المقابلة لها (p = 0.537)، كما هو موضح في الشكل 8. وبينما أشار تحليل المعلوماتية الحيوية لمجموعات البيانات الضخمة إلى انخفاض معنوي في تعبير YTHDC2 في حالات NSCLC، إلا أن تقنية qRT-PCR في مجموعتنا لم تظهر فرقاً معنوياً، مما يسلط الضوء على التناقضات المحتملة الناتجة عن حجم المجموعة، وعدم تجانس العينات، والتباين التقني. بالإضافة إلى ذلك، تشير قيمة AUC المنخفضة (0.5) إلى أن YTHDC2 بمفرده يفتقر إلى الدقة التشخيصية أو التنبؤية.
تعبير YTHDC2 والميزات الباثولوجية السريرية في سرطان الرئة غير صغري الخلايا (NSCLC)
شملت هذه الدراسة 50 فرداً مصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). كان هناك 32 مريضاً من الذكور (64.00%) و18 مريضة من الإناث (36.00%)، بمتوسط عمر قدره 63.10 ± 9.85 سنة، وتراوحت أعمارهم بين 37 و86 سنة. ومن بين المرضى، كان هناك 25 شخصاً قد سبق لهم التدخين، و25 شخصاً لم يدخنوا مطلقاً. وتضمنت الأنواع المرضية تسع حالات من سرطان الخلايا الحرشفية (18.00%) وواحد وأربعين حالة من سرطان الرئة الغدي (82.0%). وكان 22 مريضاً في المرحلتين III–IV (44.00%) و28 مريضاً في المرحلتين I–II (56.00%) وفقاً للتصنيف السريري لـ CSCO. لم يظهر لدى أربعة وعشرين مريضاً نقائل في العقد اللمفاوية، بينما ظهرت لدى ستة وعشرين فرداً (54.00%). وكان لدى تسعة مرضى سرطانات ضعيفة التمايز (18.00%)، بينما كان لدى 41 مريضاً أورام جيدة إلى متوسطة التمايز (82.00%).
تم فحص الارتباط بين الخصائص الباثولوجية السريرية ومستويات تعبير YTHDC2 في أنسجة NSCLC. لوحظت اختلافات في تعبير YTHDC2 بين الأنواع الفرعية الباثولوجية ووفقاً لحالة نقيلة العقد اللمفاوية (p < 0.05). ومع ذلك، ونظراً لتوفر أربع عينات فقط من سرطان الخلايا الحرشفية، يجب تفسير مقارنة النوع الباثولوجي الفرعي بحذر واعتبارها استكشافية. كما هو موضح في الشكلين 9A و B، كان تعبير YTHDC2 أعلى بكثير في سرطان الخلايا الحرشفية مقارنة بسرطان الرئة الغدي، وكان أعلى بكثير في أنسجة NSCLC التي تعاني من نقيلة العقد اللمفاوية مقارنة بتلك التي لا تعاني منها (5.70 ± 2.53 مقابل 3.83 ± 0.91، p = 0.027). ومع ذلك، ونظراً لإدراج أربع عينات فقط من سرطان الخلايا الحرشفية، يجب تفسير المقارنة بين الأنواع الباثولوجية الفرعية بحذر واعتبارها استكشافية لحين التحقق منها في مجموعات أكبر. قد يشير ارتفاع تعبير YTHDC2 في المرضى الذين يعانون من نقيلة العقد اللمفاوية إلى ارتباط محتمل بين YTHDC2 وحالة نقيلة العقد اللمفاوية؛ ومع ذلك، يجب تفسير هذه النتيجة بحذر بسبب صغر حجم العينة وتتطلب التحقق في مجموعات مستقلة أكبر. في المقابل، لم يؤثر العمر، وتاريخ التدخين، والمرحلة السريرية لـ CSCO، والتمايز النسيجي بشكل كبير على تعبير YTHDC2 (p > 0.05). تتوفر معلومات إضافية في الجدول 4، والجدول 5، والشكل 9.
الانحدار اللوجستي الثنائي لانتقال الخلايا السرطانية إلى العقد اللمفاوية في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)
واتساقاً مع تحليل الارتباط، ارتبط تعبير YTHDC2 بشكل ملحوظ بنقائل العقد اللمفاوية (p < 0.05). وبالاعتماد على نقائل العقد اللمفاوية كمتغير تابع، والعمر، والجنس، وتاريخ التدخين، ومرحلة الورم، والنوع الباثولوجي، ومستوى تعبير YTHDC2، ودرجة التمايز كمتغيرات مستقلة، أُجري تحليل انحدار لوجستي ثنائي على مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). وأظهرت النتائج أن تعبير YTHDC2 لدى مرضى NSCLC ارتبط بشكل ملحوظ بنقائل العقد اللمفاوية (p = 0.027, OR = 2.286, 95% CI: 1.101–4.748).
في البيانات السريرية العامة، ارتبطت مرحلة الورم لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) ارتباطاً وثيقاً من الناحية الإحصائية بنقيلة العقد الليمفاوية (p = 0.007, OR = 27, 95% CI: 2.504-291.186). ومع ذلك، لم تكن هناك علاقة ارتباط ذات دلالة إحصائية بين العمر، والجنس، وتاريخ التدخين، والنوع الباثولوجي، ودرجة التمايز وبين نقيلة العقد الليمفاوية في حالات NSCLC (p > 0.05)، كما هو موضح في الجدول 6.
توفر البيانات: مجموعات البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة في مستودع Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). يتضمن المستودع البيانات الوصفية السريرية لـ TCGA، وتوضيحات العينات، ومواصفات استرداد البيانات، وبيان التحليل المستخدم في التحليلات المعلوماتية الحيوية. تتوفر بيانات إضافية من المؤلف المسؤول بناءً على طلب معقول.
الشكل 1: مخطط تدفقي لاختيار المرضى وإدراج الأنسجة لتحليل qRT-PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. سير عمل تحليلات المعلوماتية الحيوية التي أجريت لتقييم تعبير YTHDC2 والأهمية الإنذارية في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تعبير جين YTHDC2 في قاعدة بيانات TCGA. تمت مقارنة مستويات تعبير YTHDC2 في سرطان الرئة الغدي (LUAD) وسرطان الرئة الخلايا الحرشفية (LUSC) مع مستوياتها في أنسجة الرئة الطبيعية باستخدام بيانات تسلسل RNA التي تم الحصول عليها من أطلس جينوم السرطان (TCGA) من خلال بوابة بيانات Genomic Data Commons (GDC)، وجرى تحليلها باستخدام منصة GEPIA الإلكترونية. حُللت البيانات عبر منصة GEPIA. تم تحديد الدلالة الإحصائية عندما كانت قيمة p-value < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: التعبير التفاضلي لـ YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) بناءً على تحليل قاعدة بيانات GEPIA. تمت مقارنة مستويات تعبير YTHDC2 في سرطان الرئة الغدي (LUAD) وسرطان الرئة حرشفي الخلايا (LUSC) مع تلك الموجودة في أنسجة الرئة الطبيعية باستخدام بيانات من أطلس جينوم السرطان (TCGA) ومشاريع التعبير الجيني النسيجي (GTEx) عبر منصة GEPIA. تمثل المخططات الصندوقية مستويات التعبير الجيني الموحدة. وتم تحديد الدلالة الإحصائية بقيمة p-value < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تحليل التعبير الجيني لبروتين YTHDC2 حسب مراحل المرض في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) باستخدام قاعدة بيانات GEPIA. تم تحليل مستويات تعبير YTHDC2 عبر المراحل الباثولوجية المختلفة (I–IV) لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) باستخدام منصة GEPIA. يوضح مخطط المراحل التباين في التعبير الجيني عبر مراحل الورم. لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في تعبير YTHDC2 بين المراحل (p = 0.644). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: تحليل كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة بناءً على تعبير YTHDC2 في مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا NSCLC (أداة Kaplan–Meier Plotter). (أ) البقاء الإجمالي (OS): منحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة تقارن البقاء الإجمالي في مرضى NSCLC المصنفين إلى مجموعات ذات تعبير مرتفع (n = 140) ومنخفض (n = 364) لـ YTHDC2، باستخدام إعداد نقطة القطع المثلى ("الاختيار التلقائي لأفضل نقطة قطع") المتوفرة في أداة Kaplan–Meier Plotter. استُخدم اختبار log-rank لتقييم الدلالة الإحصائية (p = 0.0093)؛ نسبة الخطر (HR) = 0.61؛ فاصل ثقة (CI) 95%: 0.42–0.89. يرتبط ارتفاع تعبير YTHDC2 ببقاء إجمالي أفضل بشكل ملحوظ. (ب) البقاء بعد تطور المرض (PPS): منحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة تقارن البقاء بعد تطور المرض في مرضى NSCLC المصنفين إلى مجموعات ذات تعبير مرتفع (n = 181) ومنخفض (n = 296) لـ YTHDC2، باستخدام إعداد نقطة القطع المثلى ("الاختيار التلقائي لأفضل نقطة قطع") المتوفرة في أداة Kaplan–Meier Plotter. استُخدم اختبار log-rank للمقارنة الإحصائية (p = 4.2 × 10⁻5)؛ نسبة الخطر (HR) = 0.63 (فاصل ثقة 95%: 0.51–0.79). يرتبط التعبير المرتفع لـ YTHDC2 ببقاء أطول بشكل ملحوظ بعد تطور المرض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: نموذج التنبؤ بمعدل البقاء على قيد الحياة لـ YTHDC2. منحنيات خصائص التشغيل للمستقبل (ROC) التي تقيم دقة التنبؤ لـ YTHDC2 فيما يتعلق بالبقاء الإجمالي لدى مرضى TCGA-LUAD وTCGA-LUSC الذين تتوفر لهم بيانات التعبير عن RNA-seq وبيانات البقاء على قيد الحياة عند النقاط الزمنية: سنة واحدة، و3 سنوات، و5 سنوات، و8 سنوات. قيم AUC: سنة واحدة = 0.50، 3 سنوات = 0.51، 5 سنوات = 0.52، و8 سنوات = 0.52. يشير الخط القطري المتقطع إلى فرصة عشوائية (AUC = 0.5). أُجري التحليل باستخدام حزمة survival ROC في لغة R. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: تعبير YTHDC2 في أزواج من أورام سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) والأنسجة الطبيعية المجاورة مقاساً بواسطة qRT-PCR. تم حساب التعبير النسبي لـ YTHDC2 باستخدام طريقة 2–ΔCt وتم توحيده بالنسبة لـ GAPDH. تمثل قيم التعبير مستويات التعبير الموحدة بدلاً من التغيرات المضاعفة بالنسبة لعينة معايرة. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام 19 زوجاً متطابقاً من أنسجة الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة المتاحة للمقارنة المزدوجة. تظهر البيانات كملاحظات مزدوجة فردية مع المتوسط ± الانحراف المعياري. تم تحليل الاختلافات بين العينات المزدوجة باستخدام اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة (p = 0.537). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
شكل 9: الارتباط بين تعبير YTHDC2 والخصائص السريرية المرضية لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). (A) تعبير YTHDC2 في الأنواع المرضية المختلفة، حيث يظهر تعبير أعلى في سرطان الخلايا الحرشفية مقارنة بسرطان الغدّي (p < 0.05). (B) تعبير YTHDC2 وفقاً لحالة نقائل العقد اللمفاوية، مما يظهر تعبيراً أعلى لدى المرضى الذين يعانون من نقائل العقد اللمفاوية مقارنة بأولئك الذين ليس لديهم نقائل (p < 0.05). (C) تعبير YTHDC2 عبر درجات التمايز النسيجي المختلفة، مع عدم وجود فرق ذو دلالة إحصائية (p = 0.181). (D) تعبير YTHDC2 عبر المراحل السريرية لـ CSCO، مع عدم وجود فرق ذو دلالة إحصائية (p = 0.08). تم قياس مستويات تعبير YTHDC2 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) وحُسبت باستخدام طريقة 2–ΔCt، مع المعايرة بالنسبة لـ GAPDH. البيانات معروضة كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم إجراء المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب. اعتبرت القيمة *p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الرقم التسلسلي | معايير الاشتمال | معايير الاستبعاد |
| 1 | العمر ≥18 سنة، بغض النظر عن الجنس. | تشخيص أورام خبيثة أخرى. |
| 2 | تشخيص مؤكد بـ NSCLC وفقاً للمبادئ التوجيهية السريرية لسرطان الرئة الصادرة عن الجمعية الطبية الصينية (إصدار 2024). | وجود أمراض تنفسية أو قلبية وعائية مزمنة (على سبيل المثال: COPD، أمراض القلب الرئوية، فشل القلب). |
| 3 | توفر بيانات سريرية كاملة، بما في ذلك التفاصيل الديموغرافية، وعلامات الأورام في المصل، وتصوير الصدر المقطعي المحوسب المعزز، مع توقيع الموافقة المستنيرة. | خلل وظيفي حاد في الأعضاء، بما في ذلك القصور الكلوي (eGFR <30 ml/min/1.73m²) أو تليف الكبد. |
| 4 | المرضى الذين لم يتلقوا علاجاً سابقاً (Treatment-naive) ولم يخضعوا لعلاجات موجهة ضد الورم. | الفئات الخاصة، بما في ذلك النساء الحوامل أو المرضعات (يتم التأكد من ذلك عن طريق اختبار β-hCG حيثما كان ذلك مناسباً). |
| 5 | توفر عينات كافية من الورم و/أو الأنسجة المجاورة المناسبة للتحليل الجزيئي. | رداءة جودة العينة، بما في ذلك عدم كفاية الأنسجة أو تحلل RNA (يتم التأكد من ذلك من خلال مراجعة أخصائي علم الأمراض). |
الجدول 1: معايير الاشتمال والاستبعاد لمرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) في الدراسة
| نوع النسيج | العينات المزدوجة التي تم تحليلها (n) | التعبير النسبي (Mean ± SD) |
| نسيج ورمي | 19 | 3.24 ± 2.34 |
| نسيج طبيعي مجاور مطابق | 19 | 3.60 ± 1.70 |
الجدول 2: تعبير YTHDC2 في أورام NSCLC والأنسجة الطبيعية المجاورة المقترنة. تم قياس التعبير النسبي لـ YTHDC2 باستخدام طريقة 2–ΔCt ومعايرته بالنسبة لـ GAPDH. البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء المقارنة الإحصائية لـ 19 زوجاً مطابقاً من أنسجة الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة باستخدام اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة (p = 0.537).
| الجين المستهدف | البادئ/المسبار | التسلسل (5′→3′) |
| YTHDC2 | أمامي (F) | CCTGTCACCAATAAAGAGCG |
| عكسي (R) | CACTGGAATCTGAGGTATGCC | |
| مسبار (P) | AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA | |
| GAPDH | أمامي (F) | AATCCCATCACCATCTTCCAG |
| عكسي (R) | ATGACCCTTTTGGCTCCC | |
| مسبار (P) | CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT |
الجدول 3: تسلسلات البادئات والمجسات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). تم قياس تعبير YTHDC2 باستخدام تقنية TaqMan، مع استخدام GAPDH كعنصر تحكم داخلي.
| الخاصية | الفئة | n | % |
| النوع الباثولوجي | سرطان غدي | 41 | 82 |
| سرطان الخلايا الحرشفية | 9 | 18 | |
| مرحلة CSCO | I–II | 28 | 56 |
| III–IV | 22 | 44 | |
| نقائل العقد اللمفاوية | لا | 24 | 48 |
| نعم | 26 | 52 | |
| درجة التمايز | تمايز منخفض | 9 | 18 |
| تمايز متوسط-عالي | 41 | 82 | |
| العمر | ≥60 سنة | 36 | 72 |
| <60 سنة | 14 | 28 | |
| الجنس | ذكر | 32 | 64 |
| أنثى | 18 | 36 | |
| تاريخ التدخين | نعم | 25 | 50 |
| لا | 25 | 50 |
الجدول 4: الخصائص السريرية والباثولوجية لمرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). يتم عرض البيانات كأعداد (n) ونسب مئوية (%) بناءً على إجمالي عدد سكان الدراسة (n = 50).
| السمات المرضية السريرية | مجموعة | نـ | تعبير YTHDC2 (المتوسط ± الانحراف المعياري | pالقيمة الاحتمالية (p-value) |
| نوع النسيج | ورم | 30 | 3.24 ± 2.34 | 0.537 |
| طبيعي مجاور | 19 | 3.60 ± 1.70 | ||
| النمط الباثولوجي | سرطان غدي | 26 | 4.13 ± 1.29 | 0.022* |
| سرطان الخلايا الحرشفية | 4 | 7.50 ± 3.41 | ||
| تحديد مرحلة المرض وفقاً لتصنيف CSCO | ١-٢ | 22 | 4.29 ± 1.94 | 0.08 |
| ٣-٤ | 8 | 5.05 ± 1.51 | ||
| النقائل في العقد اللمفاوية | لا | 19 | 3.83 ± 0.91 | 0.027* |
| نعم | 11 | 5.70 ± 2.53 | ||
| التمايز النسيجي | متمايز بدرجة متوسطة إلى جيدة | 25 | 4.33 ± 1.90 | 0.181 |
| ضعيف التمايز | 5 | 5.18 ± 1.60 | ||
| العمر | ≥60 سنة | 20 | 4.62 ± 2.10 | 0.835 |
| <60 عامًا | 10 | 4.16 ± 1.12 | ||
| التاريخ التدخيني | نعم | 12 | 4.62 ± 2.40 | 0.845 |
| لا | 18 | 4.38 ± 1.40 |
الجدول 5: الارتباط بين تعبير YTHDC2 والسمات المرضية السريرية لدى مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). تم قياس تعبير YTHDC2 بواسطة qRT-PCR وحسابه باستخدام طريقة 2–ΔCt، مع المعايرة بالنسبة لـ GAPDH. البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). تمثل أحجام المجموعات (n) عدد العينات الصالحة التي تم تحليلها. أُجريت المقارنات الإحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب (Wilcoxon rank-sum test). اعتبرت القيمة *p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
| متغير | β | فالد | القيمة الاحتمالية (p-value) | أو | فاصل ثقة 95% |
| العمر (≥60 مقابل <60) | 0.07 | 0.01 | 0.93 | 1.08 | 0.20–5.68 |
| الجنس (أنثى مقابل ذكر) | 0.53 | 0.4 | 0.525 | 1.7 | 0.33–8.67 |
| تاريخ التدخين (نعم مقابل لا) | 0.54 | 0.46 | 0.496 | 1.71 | 0.36–8.09 |
| مرحلة الورم (III-IV مقابل I-II) | 3.3 | 7.38 | 0.007* | 27 | 2.50–291.18 |
| التمايز (ضعيف مقابل متوسط إلى جيد) | –1.29 | 1.62 | 0.204 | 0.28 | 0.04–2.02 |
| تعبير YTHDC2 | 0.83 | 4.91 | 0.027* | 2.29 | 1.10–4.75 |
الجدول 6: تحليل الانحدار اللوجستي متعدد المتغيرات للعوامل المرتبطة بنقائل العقد اللمفاوية في مرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). تم إجراء الانحدار اللوجستي الثنائي باستخدام نقائل العقد اللمفاوية كمتغير تابع. تم تسجيل نسب الأرجحية (ORs) مع فترات ثقة (CI) بنسبة 95%. الفئات المرجعية: العمر (<60 عاماً)، الجنس (ذكر)، تاريخ التدخين (لا)، مرحلة الورم (I–II)، والتمايز (متوسط-جيد). *p < 0.05 تشير إلى دلالة إحصائية.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يعد YTHDC2، وهو أكبر بروتين رابط لـ N6-methyladenosine (m6A) في عائلة YTH، فريداً بنشاطه كإنزيم RNA helicase المعتمد على ATP، مما يجعله منظماً رئيسياً لاستقلاب RNA13. وبخلاف الأعضاء الآخرين في عائلة YTH، يتواجد YTHDC2 في كل من النواة والسيتوبلازم، حيث يعمل على تنظيم ترجمة mRNA واستقرار RNA14. وقد أظهرت الدراسات التجريبية السابقة أن YTHDC2 يثبط تطور سرطان الرئة الغدي (LUAD) من خلال تثبيط تعبير mRNA لكل من ADIRF و MRPL12، وتعزيز الموت الخلوي المبرمج، وتقليل تكاثر الخلايا والانتشار الورمي15,16. كما أشارت الدراسات التجريبية السابقة أيضاً إلى أن YTHDC2 يعمل على تثبيت lncRNAs مثل ZNRD1-AS1 لتثبيط تكاثر LUAD، وينظم mRNAs المعدلة بـ m6A مثل CYLD و SLC7A11، مما يؤدي إلى تثبيط مسار إشارات NF-κB، وامتصاص السيستين، والعمليات المضادة للأكسدة، بينما يحفز الموت الخلوي الحديدي (ferroptosis) والنشاط المضاد للسرطان17,18.
في هذه الدراسة، تم تقصي تعبير والأهمية السريرية لبروتين قارئ m6A وهو YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) باستخدام نهج تكاملي يجمع بين التحليلات المعلوماتية الحيوية والتحقق التجريبي. وكشف هذا التحليل المعلوماتي الحيوي لقواعد بيانات TCGA وGEPIA عن انخفاض ملحوظ في تعبير YTHDC2 في أنسجة أورام NSCLC مقارنة بأنسجة الرئة الطبيعية، كما ارتبط ارتفاع تعبير YTHDC2 بتحسن معدلات البقاء الإجمالية والبقاء بعد تطور المرض، مما يشير إلى دور إنذاري محتمل. ومن المثير للاهتمام أن تجارب qRT-PCR التي أجريناها باستخدام 19 عينة مزدوجة متاحة من الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة في المجموعة الحالية لم تظهر فرقاً ذا دلالة إحصائية في تعبير YTHDC2 بين الأنسجة الورمية والأنسجة الطبيعية المجاورة. ويسلط هذا التضارب الضوء على تحديات نقل النتائج من مجموعات البيانات العامة واسعة النطاق إلى مجموعات سريرية مستقلة، ويؤكد الحاجة إلى تفسير حذر للتحليلات التي تتم عبر الحاسوب (in silico). إن فهم الأسباب الكامنة وراء هذه الاختلافات أمر بالغ الأهمية لتقييم فائدة YTHDC2 كعلامة بيولوجية وهدف علاجي في NSCLC بدقة. ويتماشى تركيز الدراسة الحالية على YTHDC2 مع نشاط الهليكاز الفريد الذي يتميز به من بين قارئات YTH19، إلا أن التحليلات الحديثة الشاملة للسرطانات كشفت عن أدوار تعتمد على السياق لأفراد آخرين من هذه العائلة. فعلى سبيل المثال، أثبت Li وزملاؤه أن YTHDF1/2 يرتفع تعبيرهما في معظم أنواع السرطانات (مثل LIHC وLUAD) ويرتبطان بإنذار سيء، بينما يظهر YTHDC1/2 تأثيرات مثبطة للأورام في KIRC وBRCA20. ومن الجدير بالذكر أن الدور المسبب للأورام لـ YTHDF1 عبر تنشيط Wnt/β-catenin يتناقض مع الوظيفة المضادة للانتشار الورمي لـ YTHDC2 في NSCLC، مما يبرز الحاجة إلى استراتيجيات للعلامات البيولوجية خاصة بكل نوع فرعي. ومقارنة بالعلامات الإنذارية الراسخة (مثل PD-L1 للاستجابة للعلاج المناعي)، قد يتم تعزيز القدرة التنبؤية لـ YTHDC2 من خلال دمجه مع منظمات m6A أخرى (مثل METTL3 وYTHDF1) أو جينات نقاط التفتيش المناعية، كما اقترحت تحليلات الارتشاح المناعي الشاملة للسرطانات. وعلى الرغم من أن الدراسات السابقة تشير إلى أن YTHDC2 ينظم مسار NF-κB/CYLD12، فقد اقتصرت الدراسة الحالية على غياب التحقق على مستوى البروتين باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية أو لطخة ويسترن، وكذلك غياب التحقق الوظيفي. ويجب أن تجمع الأعمال المستقبلية بين فحوصات إسكات الجينات وتسلسل m6A لتحديد الأهداف المباشرة.
كشفت التحليلات السابقة أن تعبير YTHDC2 ينخفض في أنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) ويرتبط بسوء الإنذار21. وأشار تحليل كابلان-ماير إلى بقاء المرضى الذين لديهم تعبير أعلى لـ YTHDC2 على قيد الحياة لفترة أطول، إلا أن تحليل منحنى ROC أشار إلى قدرة تنبؤية محدودة للبقاء على قيد الحياة20. وقد أُجري تحليل ROC للبقاء في الدراسة الحالية باستخدام بيانات تعبير RNA-seq وبيانات البقاء من أطلس جينوم السرطان (TCGA)، نظراً لعدم توفر معلومات المتابعة طويلة المدى لمجموعتنا السريرية المحلية. ومن المهم الإشارة إلى أن قيم AUC المنخفضة (~0.5) الملحوظة في هذه الدراسة تشير إلى أن تعبير YTHDC2 يفتقر إلى الحساسية والنوعية الكافيتين للاستخدام السريري كعلامة بيولوجية مستقلة22. ويتماشى هذا القصور مع الأدلة الناشئة التي تشير إلى أن العلامات البيولوجية المعتمدة على جين واحد غالباً ما تكون غير كافية للأمراض المعقدة مثل NSCLC، حيث تزداد الحاجة إلى نهج الأوميكس المتعددة ولوحات العلامات البيولوجية المتكاملة لتحقيق أداء تنبؤي ذو مغزى سريري. وقد لوحظ تعبير أعلى لـ YTHDC2 في أنسجة NSCLC التي تعاني من نقائل في العقد الليمفاوية، مما يشير إلى وجود ارتباط محتمل بين تعبير YTHDC2 وحالة النقائل في العقد الليمفاوية في المجموعة الحالية. وعلى الرغم من ملاحظة اختلافات في تعبير YTHDC2 بين السرطانات الغدية وسرطان الخلايا الحرشفية، إلا أنه يجب تفسير هذه المقارنة بحذر، حيث توفرت 4 عينات فقط من سرطان الخلايا الحرشفية للتحليل، مما حد بشكل كبير من القوة الإحصائية لهذه المقارنة بين المجموعات الفرعية. ولم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في المرحلة السريرية، أو التمايز، أو العمر، أو تاريخ التدخين، ويرجع ذلك على الأرجح إلى قيود الدراسة، بما في ذلك حجم العينة وتصميم الدراسة في مركز واحد. وبالرغم من أن الارتباط الملحوظ بين انخفاض تعبير YTHDC2 ونقائل العقد الليمفاوية يشير إلى دور بيولوجي محتمل في NSCLC، فإن قدرته التمييزية الضعيفة (AUC ~0.5) والكشف غير المتسق بواسطة qRT-PCR يمنعان استخدامه كعلامة سريرية مستقلة. وينبغي أن تستكشف الدراسات المستقبلية ما إذا كان دمج YTHDC2 مع بروتينات أخرى مرتبطة بـ m6A يحسن من القيمة التنبؤية.
أشارت تحليلات المعلوماتية الحيوية إلى أن تعبير YTHDC2 ينخفض في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) وقد يكون مرتبطاً بتحسن نتائج المرضى. وعلى الرغم من ملاحظة انخفاض التعبير أيضاً لدى المرضى الذين يعانون من نقائل في العقد اللمفاوية ورصد اختلافات بين الأنواع الفرعية المرضية، إلا أنه يجب تفسير نتائج هذه المجموعات الفرعية بحذر بسبب صغر حجم العينة، لا سيما بالنسبة لسرطان الخلايا الحرشفية. ومع ذلك، لم يتم تأكيد هذه النتائج من خلال تحليل qRT-PCR في مجموعتنا السريرية، وهو ما قد يعكس اختلافات في خصائص المجموعة، أو حجم العينة، أو التباين التقني، أو التنظيم ما بعد النسخي، أو غياب التحقق على مستوى البروتين. وينبغي أن تستكشف الأبحاث المستقبلية آليات YTHDC2 في الأنواع الفرعية الأخرى من سرطان الرئة من خلال تجارب مخبرية (in vitro) وحيوية (in vivo). وقد تساهم هذه الدراسات في توضيح الدور البيولوجي لـ YTHDC2 وتحديد ما إذا كان له أي فائدة سريرية كجزء من نهج متعدد العلامات بدلاً من اعتماده كعلامة بيولوجية مستقلة.
القيود
هناك عدة قيود لهذه الدراسة؛ فقد كانت دراسة استرجاعية أجريت في مركز واحد وبحجم عينة صغير نسبيًا، مما قد يحد من إمكانية تعميم النتائج. كما أن استخدام الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE) قد يكون قد أثر على جودة RNA وحساسية تقنية qRT-PCR. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم تعبير mRNA لـ YTHDC2 فقط، ولم يتم إجراء التحقق من مستوى البروتين باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أو لطخة ويسترن (Western blotting). وبما أن تعبير mRNA لا يرتبط بالضرورة بوفرة البروتين بسبب التنظيم ما بعد النسخي، فقد يفسر هذا جزئيًا التناقض بين نتائجنا السريرية وتحليلات قواعد البيانات العامة. كما افتقرت الدراسة إلى بيانات المتابعة طويلة المدى، وكانت تحليلات المجموعات الفرعية (مثل سرطان الخلايا الحرشفية) غير كافية إحصائيًا.
التوجهات المستقبلية
يجب أن تستكشف الأبحاث المستقبلية آليات YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) من خلال تجارب في المختبر (in vitro) وفي الكائن الحي (in vivo) لفهم دوره الوظيفي بشكل أفضل. كما ثمة حاجة إلى دراسات متعددة المراكز بأحجام عينات أكبر للتحقق من النتائج وتحسين إمكانية تعميمها. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي دمج YTHDC2 مع المنظمات الأخرى المرتبطة بـ m6A والمتغيرات المرضية والسريرية إلى تعزيز فائدته التنبؤية والإنذارية. ومن الضروري إجراء المزيد من الدراسات التي تدمج مناهج الأوميكس المتعددة (multi-omics)، بما في ذلك الترانسكريبتوميكس والبروتيوميكس والإبيجينوميكس، لتوضيح الآليات البيولوجية الكامنة وراء خلل تنظيم YTHDC2. كما يجب إجراء التحقق من مستوى البروتين عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أو لطخة ويسترن (Western blotting) لتقييم التوافق بين تعبير mRNA وتعبير البروتين. وسيكون توحيد معايير معالجة العينات وتقنيات التحقق أمراً بالغ الأهمية لضمان القابلية للتكرار والتطبيق السريري.
الخلاصة
تقدم هذه الدراسة تقييماً استكشافياً للتعبير عن YTHDC2 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) من خلال دمج تحليلات المعلوماتية الحيوية مع التحقق السريري باستخدام qRT-PCR. ومع ذلك، فإن عدم اتساق اكتشافه عبر المنصات التحليلية ودقته التشخيصية المحدودة (AUC ≈0.5) يمنعان حالياً استخدامه كعلامة بيولوجية سريرية مستقلة. وبينما تشير تحليلات المعلوماتية الحيوية إلى أهمية إنذارية محتملة، فإن التحقق السريري المستقل لا يدعم موثوقيته للتطبيقات التشخيصية أو الإنذارية. يجب تفسير هذه النتائج بحذر، وهي تتطلب التحقق في مجموعات أكبر متعددة المراكز مع إجراء دراسات على مستوى البروتين ودراسات وظيفية قبل النظر في أي تطبيق سريري.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
لا يوجد لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة هاينان الإقليمية للعلوم الطبيعية (رقم 821RC735).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بادئات ومجسات مخصصة | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | تخليق مخصص | تسلسلات البادئات والمجسات مدرجة في الجدول 6 |
| DNase I | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | DNase I (HiPure FFPE RNA Kit) | إزالة تلوث DNA الجينومي |
| خوارزمية ESTIMATE | Yoshihara et al. | حزمة R (الإصدار 1.0.13) | تقدير نقاء الورم |
| طقم استخلاص RNA من أنسجة FFPE | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02) | استخلاص RNA من أنسجة FFPE |
| بوابة بيانات GDC | National Cancer Institute (NCI), NIH, USA | https://portal.gdc.cancer.gov | تنزيل مجموعات بيانات TCGA |
| خادم GEPIA الويب | Peking University, China | http://gepia.cancer-pku.cn | تحليل التعبير الجيني |
| مخطط Kaplan–Meier Plotter | Semmelweis University, Hungary | https://kmplot.com | تحليل البقاء على قيد الحياة |
| جهاز طرد مركزي دقيق | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5424 R | إجراءات تنقية RNA |
| جهاز قياس الطيف الضوئي NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | NanoDrop 2000/2000c | تقدير كمية RNA |
| مزيج qPCR الرئيسي القائم على المجسات | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040) | تضخيم PCR الكمي |
| برنامج R الإحصائي | R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria | الإصدار 4.4.1 | التحليلات الإحصائية وتحليل ROC |
| نظام PCR في الوقت الحقيقي | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA | CFX Opus 96 | PCR الكمي في الوقت الحقيقي |
| طقم النسخ العكسي | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) | تخليق cDNA |
| عمود تنقية RNA | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure Mini Column I | عمود تنقية RNA بغشاء السيليكا |
| ماء خالٍ من RNase | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | RNase-Free Water | شطف RNA |
| إحصائيات SPSS | IBM Corp., Armonk, NY, USA | IBM SPSS Statistics Version 27.0 | التحليلات الإحصائية |
| حزمة survivalROC | CRAN (R Foundation for Statistical Computing) | الإصدار 1.0.3.1 | تحليل ROC المعتمد على الوقت |
| قاعدة بيانات TCGA | National Cancer Institute (NCI), NIH, USA | https://portal.gdc.cancer.gov | قاعدة بيانات عامة لعلم الجينوم السرطاني |
| محلول غسيل RW1 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Buffer RW1 | محلول غسيل لتنقية RNA |
| محلول غسيل RW2 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Buffer RW2 | محلول غسيل لتنقية RNA |
المراجع
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Shen, Y., Chen, J. Q., Li, X. P. Differences between lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma: Driver genes, therapeutic targets, and clinical efficacy. Genes Dis. 12 (1), 101374 (2025).
- Cao, W., Qin, K., Li, F., Chen, W. Comparative study of cancer profiles between 2020 and 2022 using global cancer statistics (GLOBOCAN). J. Natl. Cancer Cent. 4 (2), 128-134 (2024).
- Alduais, Y., Zhang, H., Fan, F., Chen, J., Chen, B. Non-small cell lung cancer (NSCLC): A review of risk factors, diagnosis, and treatment. Medicine (Baltimore). 102 (13), e32899 (2023).
- Sun, H., Li, K., Liu, C., Yi, C. Regulation and functions of non-m6A mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 24 (11), 714-731 (2023).
- Zhang, W., Qian, Y., Jia, G. The detection and functions of RNA modification m6A based on m6A writers and erasers. J. Biol. Chem. 297 (2), 100973 (2021).
- Li, Y. et al. Autophagy activation is required for N6-methyladenosine modification to regulate ferroptosis in hepatocellular carcinoma. Redox Biol. 69, 102971 (2024).
- Wang, J. et al. Downregulation of m6A reader YTHDC2 promotes the proliferation and migration of malignant lung cells via the CYLD/NF-κB pathway. Int. J. Biol. Sci. 17 (10), 2633-2651 (2021).
- Koh, Y. W., Han, J. H., Haam, S., Lee, H. W. Prognostic and predictive value of YTHDF1 and YTHDF2 and their correlation with tumor-infiltrating immune cells in non-small cell carcinoma. Front. Oncol. 12, 996634 (2022).
- Tsuchiya, K. et al. YTHDF1 and YTHDF2 are associated with better patient survival and an inflamed tumor-immune microenvironment in non-small-cell lung cancer. Oncoimmunology. 10 (1), 1962656 (2021).
- Diao, H. et al. The m6A reader YTHDF1 promotes lung carcinoma progression via regulating ferritin-mediated ferroptosis in an m6A-dependent manner. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 185 (2023).
- Sun, S. et al. Downregulation of m6A reader YTHDC2 promotes tumor progression and predicts poor prognosis in non-small cell lung cancer. Thorac. Cancer. 11 (11), 3269-3279 (2020).
- Chen, S., Wang, Z., Sun, B. Chinese Society of Clinical Oncology Non-small Cell Lung Cancer (CSCO NSCLC) guidelines in 2024: Key update on the management of early and locally advanced NSCLC. Cancer Biol. Med. In Press (2025). doi:10.20892/j.issn.2095-3941.2024.0592. (2025).
- Fan, S., Xu, X., Chen, J., Yin, Y., Zhao, Y. Genome-wide identification, characterization, and expression analysis of m6A readers-YTH domain-containing genes in alfalfa. BMC Genomics. 25, 18 (2024).
- Shi, R. et al. Linking the YTH domain to cancer: The importance of YTH family proteins in epigenetics. Cell Death Dis. 12 (4), 346 (2021).
- Wu, X. et al. The biological function of the N6-methyladenosine reader YTHDC2 and its role in diseases. J. Transl. Med. 22, 490 (2024).
- Teng, Y., Zhao, X., Xi, Y., Fu, N. N6-methyladenosine-regulated ADIRF impairs lung adenocarcinoma metastasis and serves as a potential prognostic biomarker. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2249173 (2023).
- Ma, L. et al. The m6A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function. Redox Biol. 38, 101801 (2021).
- Ma, L. et al. Targeting SLC3A2 subunit of system XC− is essential for m6A reader YTHDC2 to be an endogenous ferroptosis inducer in lung adenocarcinoma. Free Radic. Biol. Med. 168, 25-43 (2021).
- Lin, Y. et al. Pan-cancer analysis reveals m6A variation and cell-specific regulatory network in different cancer types. Genomics Proteomics Bioinformatics. 22 (4), qzae052 (2024).
- Li, L. et al. Bioinformatic analysis of m6A "reader" YTH family in pan-cancer as a clinical prognosis biomarker. Sci. Rep. 13, 17350 (2023).
- Sun, Y., Liu, Y., Wang, P., Chang, L., Huang, J. The m6A reader YTHDC2 suppresses lung adenocarcinoma tumorigenesis by destabilizing MRPL12. Mol. Biotechnol. 66 (8), 1051-1061 (2024).
- Hajian-Tilaki, K. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis for medical diagnostic test evaluation. Caspian J. Intern. Med. 4 (2), 627-635 (2013).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن