مقالة منهجية

الكارديويدات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان كنموذج لتقييم توصيل الأوليجونكليوتيدات

DOI:

10.3791/72013

⸱

أغسطس 11, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح هذا البروتوكول توليد أمراض القلب المعتمدة على خلايا عضلة القلب ذاتية التنظيم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يحثها الإنسان لتقييم مجهر لامتصاص الأوليجونكليوتيدات الموسومة بالفلورية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل العلاجات القائمة على الأوليجونكليوتيدات فئة سريعة التطور من الأدوية ذات الإمكانيات الكبيرة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية؛ ومع ذلك، يبقى تحقيق توصيل فعال إلى نسيج القلب تحديا حاسما وغير محلول. العقبة الرئيسية هي محدودية توفر نماذج بشرية قوية وفسيولوجية ذات صلة في المختبر ، قادرة على دعم التقييم الكمي لامتصاص الخلايا الأوليجونكليوتيدية وتوزيعها داخل الخلية. يتم تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتوليد كارديويدات ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان (iPSCs) وتطبيقها كمنصة لتقييم امتصاص الأوليغونوكليوتيدات الموسومة بالفلورية. يوجه البروتوكول المستخدمين خلال التمايز القلبي الموجه في زراعة التعليق من خلال تعديل إشارات Wnt/β-catenin زمنيا، مما يتيح تحديد تسلسلي لأنابيب iPSC عبر مراحل الأديم المتوسط، ومتوسط الأديم القلبي، وسلف خلايا عضلة القلب. في هذه الظروف، تتجمع الخلايا تلقائيا إلى هياكل ثلاثية الأبعاد تحتوي على تجاويف تعبر عن علامات خلايا عضلة القلب القانونية. توفر الكارديويدات الناتجة منصة قابلة للتوسع وقابلة للتنفيذ تجريبيا لتقييم كفاءة امتصاص الأوليغونوكليوتيدات عبر التصوير الصناعي، مما يدعم تطوير وتحسين استراتيجيات التوصيل لتطبيقات القلب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاجات القائمة على الأوليجونكليوتيدات، وخاصة الأوليغونيوكليوتيدات المضادة للحس (ASOs) والحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs)، تظهر بسرعة كنهج تحويلي ومحدد للغاية لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك الحالات الوراثية والمكتسبة 1,2,3. تمكن هذه الأساليب من التعديل المباشر لتعبير الجينات على مستوى mRNA من خلال الارتباط التسلسلي الخاص بالنسخ المستهدفة، مما يسمح بتصحيح الجينات المرتبطة بالأمراض أو تصحيح الجينات المرتبطة بالأمراض التي غالبا ما تكون غير متاحة للعلاجات التقليدية للجزيئات الصغيرة 4,5. وبالتالي، توفر العلاجات الجينية القائمة على الأوليجونوكليوتيدات منصة متعددة الاستخدامات لاستهداف آليات مرضية متنوعة عبر عدة مناطق مرضية، بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية. حتى الآن، تمت الموافقة على عدة علاجات قائمة على الأوليجوننيوكليوتيدات، بما في ذلك ASOs، siRNAs، وعوامل تبديل التوصيلات، للاستخدام السريري7. على الرغم من هذا التقدم، لا تزال فعاليتها العلاجية في كل من البيئات ما قبل السريرية والسريرية مقيدة بسبب عدم كفاءة التوصيل داخل الخلايا8. تشير التقديرات الحالية إلى أن أقل من 1٪ من الأوليجونوكليوتيدات الداخلية تهرب من الحجرات الداخلية لتصل إلى السيتوسول وتتفاعل مع الحمض النووي الريبي المستهدف، مما يحد من النشاط الوظيفي 9,10. هذا القيد واضح بشكل خاص في نسيج القلب، حيث لا يفهم الامتصاص وحركة الخلايا بشكل جيد.

تاريخيا، اعتمد التقييم قبل السريري للعلاجات القلبية الدموية بشكل كبير على النماذج الحيوانية، التي لا غنى عنها لتقييم الحراكية الدوائية، والتوزيع الحيوي، والفعالية، والسلامة في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن الفروق المهمة بين الأنواع في فسيولوجيا القلب، وتنظيم الجينات، والاستجابات الخلوية غالبا ما تحد من قدرتها على التنبؤ بدقة بفعالية العلاج والسمية لدى البشر. وقد دفعت هذه القيود تطوير نماذج مختبرية مبنية على الإنسان ذات صلة فسيولوجية أفضل. من بين هذه المواد، أحدثت تقنية الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان ثورة في نمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية من خلال توفير مصدر شبه غير محدود من الخلايا التي يمكن تمييزها إلى سلالات قلبية وعائية. تلخص خلايا عضلة القلب المشتقة من iPSC البشرية (iPSC-CMs) العديد من الخصائص الجزيئية والبنيوية والوظيفية لعضلة القلب البشرية، وأصبحت منصة معتمدة على نطاق واسع للتحقيق في آليات المرض، واستجابات الأدوية، والأساليب العلاجية الناشئة11. ومع ذلك، فإن الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد لجسم iPSC-CM البشري لها قيود مهمة. معظم بروتوكولات التمايز تولد خلايا عضلة القلب تشبه خلايا جنينية بدلا من خلايا بالغة، وتظهر خصائص بنيوية، كهربائية فيزيولوجية، أيضية، وانقباضية غير ناضجة12.

علاوة على ذلك، تفتقر الزراعة أحادية الطبقة إلى البنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D)، والتفاعلات متعددة الخلايا، وتركيب المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر على وظيفة خلايا عضلة القلب في الجسم الحي. لمواجهة هذه التحديات، تم تطوير نماذج قلبية ثلاثية الأبعاد متطورةبشكل متزايد 13. من بين هذه الأنسجة، أنسجة القلب الهندسية (EHTs)، التي تولد عن طريق تضمين iPSC-CMs داخل سقالات المواد الحيوية وتطبيق التحفيز الميكانيكي والكهربائي، تعزز النضج الهيكلي والوظيفي مع إعادة إنتاج البيئة الحيوية الميكانيكية لعضلة القلبالأصلية 13 بشكل أوثق. على الرغم من أن أجهزة EHT توفر منصات ذات صلة فسيولوجية عالية لنمذجة الأمراض واختبار الأدوية، إلا أن إنتاجها عادة ما يتطلب خبرة متخصصة في الهندسة الحيوية ومعدات مخصصة. في الطرف الآخر من الطيف، تحافظ شرائح الأنسجة القلبية خارج الجسم الحي ، على بنية الأنسجة الأصلية وتركيبها الخلوي، لكنها تعتمد على الوصول إلى الأنسجة القلبية الأولية، ولديها قدرة محدودة على البقاء في الزراعة، وليست قابلة للتوسع بسهولة.

مؤخرا، ظهرت العضويات القلبية كأنظمة نماذج ثلاثية الأبعاد متاحة تعيد تلخيص جوانب رئيسية من تنظيم ووظيفة نسيج القلب14. الكارديويدات هي عضويات قلبية ذاتية التجمع تتكون أساسا من خلايا عضلة القلب تخضع لتحديد داخلي، ونمط مكاني، وتشكل لتشكيلهياكل شبيهة بالحجرة، تحتوي على التجاويف. تعتمد طرق تكوين القلبيات عادة على تنشيط أولي لإشارات Wnt لتحفيز تحديد الأدم المتوسط، يليه تثبيط لاحق لتعزيز الالتزام بالسلالة القلبية. يمكن توليد القلبيات في مزارع تعليق ساكن أو متحرك، مما يدعم الإنتاج القابل للتوسع ويعزز تنظيم الأنسجة الذاتية 15,16,17,18,19. الأعضاء القلبية متعددة الأنساب الأكثر تعقيدا التي تدمج أنواعا من الخلايا البطانية أو فوق القلبية أو غيرها من الأهمية الفسيولوجية تزيد من الأهمية الفسيولوجية لكنها تتطلب بروتوكولات تمايز أكثر تعقيدا، وفترات زراعة أطول، وتحسين واسعالنطاق 13،14.

يقدم بروتوكول بسيط وقابل للتكرار وفعال لتوليد كارديويدات تعتمد على خلايا عضلة القلب ذاتية التنظيم من iPSCs البشرية وتطبيقها لتقييم امتصاص الأوليجونكليوتيدات الموسومة بالفلورية. من المتوقع أن يكون البروتوكول ذا قيمة للباحثين الذين يسعون لتحسين كيمياء الأوليغونوكليوتيدات واستراتيجيات التوصيل في تطبيقات القلب والأوعية الدموية. جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الزراعة وتحضير iPSCs للتمييز

تحذير: قم بجميع التعامل المفتوح مع الخلايا والوسائط في خزانة سلامة حيوية من الفئة الثانية المعتمدة. ارتد معطف مختبر وقفازات. قم بتطهير أسطح العمل والنفايات السائلة باستخدام مطهر مناسب.

  1. حافظ على أنظمة iPSCs.
    1. ألواح زراعة الطلاء بمصفوفة الغشية القاعدية المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. أطعم iPSCs بوسط خلايا جذعية متعددة القدرات محدد وخالي من التغذية واستبدل الوسط كل 24 ساعة.
    3. حافظ على الزراعة تحت الالتقاء الزائد والخلايا التي تمر عندما تصل إلى 70–80٪ من التقاطع.
      ملاحظة: تأكد من أن الخلايا الروحية النفسية البحوزية تحتفظ بشكل عالي الجودة وغير متمايز، وتأكد من خلوها من الميكوبلازما قبل بدء التمايز.
  2. ما قبل التمايز الزائد.
    1. قم بإذابة الخلايا العضلية العضلية وتوسيع الخلايا لمدة ممرتين على الأقل قبل بدء التمايز القلبي.
    2. تستخدم خلايا المرور طريقة تفكك خالية من الإنزيمات، PBS-EDTA، المتوافقة مع صيانة iPSC.
      نقطة التوقف: الحفاظ على iPSCs في الزراعة حتى تصل إلى التقاء 70–80٪ والحفاظ على الشكل النموذجي دون علامات التمايز التلقائي.

2. تحضير تجمعات iPSC في صفائح البئر الدقيق

  1. فصل iPSCs إلى تعليق خلية واحدة.
    1. استنشق وسط واغسل الخلايا مرة واحدة بسعة 1 مل من 1× PBS.
    2. أضف محلول فصل الخلية (أكيوتاز) عند 500 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة ذات 6 آبار، وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5–7 دقائق.
    3. أضف 1.5 مل من وسط الغسيل لكل بئر، ثم أعد تعليقه بلطف لتوليد تعليق خلية واحدة.
    4. انقل نظام التعليق إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط iPSC خال من المغذي مع إضافة مثبط ROCK (الكمية النهائية 10 ميكرومول).
      ملاحظة: عدل وقت حضانة الانفصال لكل خط iPSC عن طريق فحص الانفصال عند 5 دقائق وتمديد الفترات القصيرة إذا لزم الأمر.
  2. عد الخلايا وحضر كثافة الدرع.
    1. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة عد الخلايا القياسية.
    2. جهز نظام تعليق خلية واحدة بمعدل 0.9 × 106 خلايا/مل لكل بئر من صفيحة تجميع البئر الدقيق بحجم 800 ميكرومتر (بصيغة 24 بئر، ~300 ميكروبئر/بئر).
      ملاحظة: قم بتحسين عدد الخلايا لكل بئر، حيث يختلف حجم التجميع أو كفاءة التمايز عبر خطوط iPSC.
  3. قم بتهيئة لوحة الميكروويل وإزالة الفقاعات.
    1. أضف 500 ميكرولتر من وسط iPSC الخالي من المغذيات يحتوي على مثبط الصخور (ال 10 ميكرومولان النهائية) إلى كل بئر.
    2. قم بعمل جهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة فقاعات الهواء من الآبار الدقيقة.
      حرج: إزالة جميع الفقاعات تماما للسماح بترسيب خلوي متساو في قاع كل بئر دقيق ودعم تكوين التجميع الفعال.
  4. زرع iPSCs في ميكروآفير.
    1. أضف 1.0 مل من التعليق أحادي الخلية المحضر (0.9 × 106 خلايا/مل) إلى كل بئر، مما يعادل 0.9 × 106 خلايا لكل بئر.
    2. أعد تعليق الهواء بلطف داخل البئر 3–5 مرات باستخدام P1000 وتجنب إدخال فقاعات هواء.
    3. قم بالطرد المركزي في اللوح على حرارة 200 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإدخال الخلايا إلى الآبار الدقيقة.
    4. تحقق تحت المجهر من أن الخلايا قد استقرت في الآبار الصغيرة قبل وضع الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
      حرج: تعامل مع اللوح بعناية بعد الطرد المركزي. لا تحرك أو تهز الصفيحة، لأن ذلك قد يتسبب في رفع الخلايا من الآبار الدقيقة.

3. توسع تجمعات iPSC في الآبار الدقيقة

  1. قم بسحب الوسط بعناية واستعادته دون إزعاج أو إزاحة الركام.
    1. قم بإمالة الصفيحة واستنشق ببطء حوالي 1.0 مل من الوسط من كل بئر باستخدام ماصة P1000، لضمان بقاء الركام في الآبار الدقيقة.
    2. استنشق الوسط المتبقي ~500 ميكرولتر ببطء باستخدام ماصحة P1000.
    3. أضف 1.5 مل من وسط iPSC الخالي من المغذي إلى كل بئر عن طريق تفريغه ببطء على جانب البئر باستخدام ماصنة مصلية.
    4. حضانه عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون وكرر التغيير المتوسط يوميا.
      حرج: صب الوسط على جدار البئر وتجنب التدفق المباشر إلى الركام.

4. التمايز القلبي لمجموعات iPSC (من اليوم 0 إلى اليوم 12)

  1. تحفيز الأديم المتوسط (اليوم 0).
    1. إزالة الوسط باستخدام طريقة الشفط اللطيف الموضحة في الخطوات 3.1.1–3.1.2.
    2. أضف 1.5 مل لكل بئر من الوسط القاعدي مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين ومنشط مسار Wnt/β-كاتينين (CHIR99021، التركيز النهائي: 11 ميكرومول).
      ملاحظة: حضر محلول مخزوني بحجم 10 مللي مولار من CHIR99021، وهو مثبط جزيء صغير لإزياز جليكوجين سينثاز كيناز-3 (GSK-3). لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 11 ميكرومول، أضف 1.65 ميكرولتر من المحلول المخزن إلى 1.5 مل من الوسط.
  2. تغير متوسط بعد التحفيز (اليوم الأول).
    1. بعد 24 ساعة من إضافة CHIR99021، استنشق الوسط بلطف من كل بئر.
    2. أضف 1.5 مل لكل بئر من الوسط القاعدي الطازج مع 2٪ B27 ناقص الإنسولين، ثم حضن لمدة 48 ساعة.
      حرج: التزم بدقة بتوقيت خطوات تعديل Wnt، لأن الانحرافات قد تؤثر على كفاءة التفاضل.
      ملاحظة: من المتوقع حدوث بعض موت الخلايا بعد التعرض لمنشط مسار Wnt/β-Catenin. إذا لوحظ فقدان إجمالي واسع النطاق، فكر في تقليل تركيز المنشط في التجارب المستقبلية.
  3. الالتزام القلبي عبر تثبيط العضلات البيضاء (اليوم الثالث).
    1. تحضير وسط مكيف عن طريق نقل 760 ميكرولتر من الوسط المستهلك من كل بئر إلى أنبوب مخروطي معقم بسعة 50 مل.
    2. لكل بئر، أضف 760 ميكرولتر من الوسط القاعدي الطازج مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين إلى الأنبوب الذي يحتوي على الوسط المكيف المجمع، وامزج بلطف.
    3. أضف مثبط مسار Wnt، IWP4، إلى الوسط المختلط حتى يصل تركيز نهائي إلى 5 ميكرومول، ثم قلب الأنبوب بلطف عدة مرات للخلط.
    4. استنشق الوسط المتبقي من كل بئر بعناية، ثم أضف 1.5 مل لكل بئر من الوسط المكيف مع إضافة IWP4.
    5. الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: حضر محلول مخزون بسعة 1 مللي مول من مثبط مسار Wnt IWP4. لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر، أضف 7.6 ميكرولتر من محلول المخزون لكل 1.52 مل من الوسط الكلي (760 ميكرولتر وسط مكيف + 760 ميكرولتر وسط قاعدي طازج) لكل بئر.
  4. تغير متوسط في الميكروويلز (اليوم الخامس).
    1. استبدل الوسط باستخدام نهج الشفط اللطيف الموضح في الخطوات 3.1.1–3.1.2.
    2. أضف 1.5 مل من الوسط القاعدي مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين إلى كل بئر، ثم حضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 48 ساعة.
  5. نقل الركام من الآبار الصغيرة إلى صفائح ذات 6 آبار (اليوم 7).
    1. استنشق الوسط بعناية من كل بئر باستخدام طريقة الشفط اللطيف الموضحة في الخطوات 3.1.1–3.1.2.
    2. أضف 1.0 مل من الوسط القاعدي مع 2٪ B27 مع الأنسولين إلى كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة. باستخدام ماصة P1000، قم بعمل ماصة برفق للأعلى والأسفل على الوسط خمس مرات مع تحريك طرف الماصة بحركة دائرية عبر سطح البئر لإزالة الركام في الآبار الدقيقة ونقلها إلى حالة تعليق.
    3. انقل تعليق المجموع إلى بئر واحد من صفيحة زراعة غير معالجة ذات 6 آبار.
    4. اشطف كل بئر من صفيحة الميكروويل بمقدار 1.0 مل إضافي من الوسط الطازج مرتين إلى ثلاث مرات لاستعادة أي مواد متبقية، ثم نقل كل شطف إلى نفس البئر في صفيحة الستة آبار.
    5. الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
      ملاحظة: من المتوقع وجود خلايا ميتة وحطام خلوي بعد نقل التجمعات. سيتم إزالة معظم الحطام خلال التغيير الوسيط التالي.
  6. تغير متوسط أثناء ثقافة التعليق (اليوم العاشر).
    1. حرك اللوحة بلطف لإزالة أي تجمعات متصلة بشكل غير مرتخ.
    2. قم بإمالة الصفيحة للسماح للركام بالاستقرار في قاع البئر بالجاذبية.
    3. استنشق الوسط المستهلك بعناية دون إزعاج أو شفط التجميعات.
    4. أضف 2.0 مل من الوسط القاعدي الطازج مع 2٪ B27 مع الأنسولين إلى كل بئر، وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48–72 ساعة.
      ملاحظة: عادة ما يلاحظ الضرب العفوي من اليوم العاشر تقريبا فصاعدا.
      نقطة التوقف: يمكن الحفاظ على القلبيات المقاومة في ثقافة تعليق لفترات نضج ممتدة عن طريق استبدال الوسط كل يومين إلى ثلاثة.

5. التوصيف المجهري للقلبيات

ملاحظة: توفر هذه الطريقة سير عمل لتوصيف القلب النسيجي باستخدام عمليات التجميد بالتجميد. يمكن استخدام المقاطع الناتجة لمجموعة متنوعة من التحليلات النسيجة، بما في ذلك تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) لتقييم البنية العامة للأنسجة وتصنيف التألق المناعي لتقييم هوية خلايا عضلة القلب.

  1. تثبيت التثبيت والتقسيم بالتجميد.
    1. ثبت الكارديويدات في بارافورمالديهايد 4٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      تحذير: بارافورمالديهايد سام وربما يكون مسرطنا؛ تعامل معه بغطاء بخار كيميائي وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. اجمع جميع النفايات التي تحتوي على بارافورمالديهايدات (المثبتة والغسول) في حاوية موسومة بوضوح للنفايات الخطرة أو الألدهيد، والتخلص منها وفقا لإجراءات النفايات الخطرة المؤسسية.
      السلامة: قم بجميع عمليات تثبيت والتعامل مع البارافورمالديهايدات باستخدام غطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    2. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بحماية القلب الثابتة ب 30٪ (بدون زجاج) السكروز في PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بدمج الكاردويدات في الجيلاتين، ثم تجميدها، وقطع مقاطع التجميد بسماكة 10 ميكرومتر على شرائح المجهر. تخزين الأقسام عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. وضع ملصقات مناعة.
    1. قم بإذابة الأقسام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل الأقسام في PBS عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مرتين.
    3. قم بتدوير منطقة الاهتمام في كل شريحة بقلم كاره للماء لإنشاء بئر يحتفظ بمحاليل الحجب والأجسام المضادة.
    4. أعد ترطيب الأقسام لمدة 2–3 دقائق في مخزن نفاذية (PB؛ PBS يحتوي على 0.1٪ Tween-20) في جرة Coplin.
    5. أزل الشرائح من PB، وقم بتفريغ المحلول الزائد، وضع الشرائح في غرفة رطبة.
      حرج: من هذه النقطة فصاعدا، من الضروري ألا تجف المقاطع بشكل كبير.
    6. قم بإغلاق المقاطع التي تحتوي على 200–300 ميكرولتر من مصل الجنين (FBS) الذي يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني لمدة 90 دقيقة في غرفة رطبة.
    7. قم بإزالة محلول الانسداد وحضن الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (مضاد cMYBP-C؛ 1:50) مخفف في محلول الانسداد (PB يحتوي على 1٪ FBS).
    8. اغسل الشرائح ثلاث مرات بزيت البول بيد واحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر أخضر فلوري (1:200)، وفالويدين فلوري أحمر بعيد (1:400)، وDAPI (1 ميكروغرام/مل).
    9. اغسله ثلاث مرات بزيت PB وركب بوسط تثبيت مضاد للتلاشي.
      تحذير: اجمع جميع المحاليل التي تحتوي على صبغة فلورية (الأجسام المضادة الثانوية، والفالودين، ومحاليل التلوين DAPI والغسولات المطابقة) في وعاء وتخلص منها كنفايات كيميائية وفقا للإرشادات المؤسسية.
  3. الحصول على الصور.
    1. التقاط صور كونفوكال باستخدام مجهر كونفوكال بالليزر مزود بكاشف مصفوفة للتصوير فائق الدقة باستخدام هدف غمر زيتي بقياس 10× و63×/1.40.
    2. استثار الفلوروفور الأحمر البعيد، والفلوروفور الأخضر، والصبغة النووية باستخدام خطوط ليزر بطول 639 نانومتر، 488 نانومتر، و405 نانومتر عند انتقال 4.0٪، 4.0٪، و1.0٪ على التوالي.
    3. الحصول على مقاطع بصرية واحدة بحجم بكسل 0.0353 × 0.0353 ميكرومترمربع، مسح أحادي الاتجاه، سرعة مسح 6، تكبير 1.7، متوسط خط 1، ووقت توقف بكسل 0.935 ميكروثانية لكل بكسل.
    4. تطبيق معالجة الصور فائقة الدقة باستخدام ترشيح وينر التلقائي.

6. اختبار امتصاص الأوليجونكليوتيدات الفلورية

  1. تحضير محلول مخزوني من الأوليجونكليوتيد الموسوم بالفلورية المترافقة مع حمض البالميتيك لزيادة الحب الدهني.
    1. إعادة تشكيل الأوليجونكليوتيد الفلوري الموسوم بالفلورية في مياه خالية من النوكلياز إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ملليمول. الدوامة لفترة وجيزة وجهاز الطرد المركزي عند 3,000 × جرام لمدة 30 ثانية لجمع المحلول في أسفل الأنبوب.
    2. جهز أليكوات للاستخدام الواحد من محلول المخزون بحجم 1 مللي مولتر وتخزينه عند −20 درجة مئوية محميا من الضوء.
    3. في يوم التجربة، أضف 1 ميكرولتر من مخزون 1 ملليمولار إلى 1 مل من وسط زراعة القلب للحصول على تركيز نهائي للأوليجوننيوكليوتيدات بمقدار 1 ميكرومول. اخلط بتحريك خفيف على الصفائح.
  2. يحتضن القلبيات التي تحتوي على الأوليغونيوكليوتيد الموسوم بالفلورية (تركيز نهائي 1 ميكرومول) في وسط خال من المصل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.
  3. اغسل القلبيات ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الأوليغونيوكليوتيد خارج الخلية.
  4. ثبت الكارديويدات في بارافورمالديهايد 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS، واستمر في وضع العلامات الفلورية قبل التصوير.
  5. حضن القلبيات الثابتة السليمة طوال الليل عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، في PBS يحتوي على 5 ميكروغرام/مل من جرثومة القمح (WGA) مقترن بفلوروفور أخضر و1 ميكروغرام/مل DAPI. اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS وركبته بوسط تثبيت مضاد للتلاشي.
    تحذير: اجمع جميع الأوساط والغسولات التي تحتوي على الأوليجونكليوتيدات والصبغات الفلورية، بما في ذلك وسط حضانة الأوليجونكليوتيدات الموسوم من الخطوة 6.2 ومحلول التلوين WGA/DAPI، في حاوية منفصلة والتخلص منها كنفايات كيميائية/خطيرة بيولوجيا وفقا للإرشادات المؤسسية.
  6. احصل على صور كونفوكالية لامتصاص وتوزيع الأوليجونكليوتيدات.
    1. التقاط صور كونفوكال باستخدام مجهر كونفوكال ليزر مزود بكاشف مصفوفة للتصوير فائق الدقة وهدف غمر في الماء بزاوية 40×. احصل على صور كمكدسات z-مقسمة بحجم خطوة z 2 ميكرومتر، تغطي عمقا إجماليا 16 ميكرومتر.
    2. إثارة الصبغة النووية، وعلامة الغشاء، والأوليغونوكليوتيد الموسوم بفلورية بالأحمر البعيد باستخدام خطوط ليزر 405 نانومتر، 488 نانومتر، و639 نانومتر عند انتقال الليزر 0.9٪، 0.2٪، و3.0٪ على التوالي.
    3. التقاط صور بحجم فوكسل 0.0449 × 0.0449 × 2 ميكرومتر3، مسح ثنائي الاتجاه، سرعة مسح 5، متوسط خط 1، ووقت بسكون بكسل 1.51 ميكروثانية لكل بكسل. طبق معالجة الصور بجودة Airyscan/فائقة الدقة باستخدام فلترة Wiener التلقائية.
    4. حافظ على جميع إعدادات الاستحواذ (قوة الليزر، كسب الكاشف، خطوة z، وحجم الفوكسل) ثابتة عبر جميع مواقع z وعبر جميع العينات للسماح بمقارنة صحيحة لإشارة الأوليجونكليوتيدات بين الظروف.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلخص الشكل 1 سير عمل التمايز ويوضح التغيرات الشكلية المميزة المتوقعة في كل مرحلة من مراحل البروتوكول، من تجميع iPSC إلى تكوين القلبيات ذاتية التنظيم. يوفر تجميع البئر الدقيق المعتمد على التعليق نهجا بسيطا وموحدا لتوليد أعداد كبيرة من الكارديويدات المتحكم بها بالحجم بشكل متوازي. يتميز التمايز الناجح بتكوين تجمعات بحجم متساو، تليها تطور تجاويف داخلية وبدء ضربات تلقائية، عادة من حوالي اليوم العاشر فصاعدا. معا، توفر هذه الميزات الشكلية نقاط تحقق عملية لمراقبة الجودة لتقييم كفاءة وقابلية تكرار توليد الكارديويد.

يمكن تقييم بنية القلب وتنظيم الأنسجة من خلال التحليل النسيجي للعمليات التبريدية. كما هو موضح في الشكل 2، يكشف تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) للقلبيات التي تم تمايزها بنجاح عن أنسجة ثلاثية الأبعاد منظمة جيدا تحتوي على تجاويف أو أكثر داخلية محاطة بطبقات خلوية مضغوطة، متوافقة مع تنظيم يشبه الحجرة. عادة ما تظهر الكارديويدات الناجحة عدم وجود مناطق نخرية وتفككا هيكليا بسيطا. على النقيض من ذلك، غالبا ما تنتج التمايزات غير المثالية هياكل غير منتظمة أو منهارة تفتقر إلى تجاويف واضحة، مما يدل على ضعف في تنظيم النسيج الذاتي.

يمكن تقييم تمايز خلايا عضلة القلب بشكل أكبر من خلال التلوين الفلوري المناعي للعمليات بالتجميد. كما هو موضح في الشكل 3A–B، تظهر الكارديويدات الناجحة تعبيرا واسعا للعلامة الساركومية cMYBP-C، منظمة في خطوط دورية عالية الترتيب تميز الساركومرات. تنتشر هذه الهياكل المخططة على نطاق واسع في جميع أنحاء الأنسجة وغالبا ما تكون مصطفة على طول المحور الطولي لخلايا عضلة القلب، مما يعكس تمايز القلب بكفاءة. على النقيض من ذلك، تظهر الكارديويدات غير المثالية تلوينا ساركوميكيا ضعيفا أو متقطعا أو مقيدا إقليميا، وغالبا ما تكون محصورة في المناطق الطرفية، مع مناطق واسعة تفتقر إلى إشارة قابلة للكشف، مما يشير إلى عدم كفاءة تمايز خلايا عضلة القلب.

يمكن تقييم امتصاص الأوليجونكليوتيدات الموسومة بالفلورية إما بتصوير الخلايا الحية أو المجهر الكونفوكالي للقلبيات الثابتة. كما هو موضح في الشكل 4، يتميز الامتصاص الناجح بفلورة مرتبطة بالأوليجونوكليوتيدات داخل الخلية يمكن اكتشافها بسهولة موزعة كنقاط متقطعة، بما يتوافق مع تحديد المواقع الداخلية. تحدد WGA أغشية الخلايا ونوى صبغات مضادة DAPI، مما يمكن تأكيد وجود مكان الأوليجونكليوتيدات داخل الخلية. بالإضافة إلى توفير تصور نوعي لامتصاص الأوليجونكليوتيدات، يمكن استخدام مجموعات الصور المكتسبة للتحليلات الكمية، بما في ذلك شدة الفلورة لكل نقطة نقطية، وعدد النقاط لكل خلية، ونسبة الخلايا الموجبة للأوليجونكليوتيدات. كما هو موضح في الشكل 5A–C، يتيح تصوير Z-stack تقييم توزيع الأوليجونكليوتيدات عبر الأنسجة ثلاثية الأبعاد، مع اكتشاف الفلورة عبر عدة مقاطع بصرية تمتد من السطح إلى داخل القلب، مما يشير إلى اختراق فعال للأنسجة.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل لتوليد الكارديويدات البشرية المشتقة من iPSC. يتم تجميع الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان (iPSCs) في صفائح ميكروبئر (Day−2) وتتعرض لتمايز القلب الموجه من خلال التعديل الزمني لإشارات Wnt. يبدأ تحريض الأديم المتوسط في اليوم 0 بالعلاج بمنشط مسار Wnt CHIR99021 في وسط قاعدي مضيف ب B27 ناقص الإنسولين، يليه إزالة المنشط في اليوم الأول. يتم تحفيز تحديد القلب في اليوم الثالث عن طريق العلاج بمثبط مسار Wnt IWP4، والذي يزال في اليوم الخامس. في اليوم السابع، تنقل المجموعات إلى ألواح ذات 6 آبار وتحافظ عليها في وسط قاعدي مدعوم بإنسولين يحتوي على B27. بحلول اليوم الرابع عشر، يتم تأسيس القلبيات ذاتية التنظيم وتكون مناسبة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك اختبارات امتصاص الأوليجونكليوتيدات. تم إنشاء هذه الصورة من قبل المؤلفين باستخدام Biorender، وتم إرفاق ترخيص حقوق النشر المطلوب. توضح صور الحقول الساطعة الممثلة التي تم التقاطها عند النقاط الزمنية المحددة التقدم المورفولوجي المتوقع من تجمعات iPSC ذات الحجم الموحد إلى الكارديويدات ذات التنظيم الذاتي المجوفة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التوصيف النسيجي للقلبيات المشتقة من iPSC البشرية. تظهر مقاطع ممثلة من الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) الملونة بالتجميد في اليوم الرابع عشر تجاويف داخلية محاطة بطبقات خلوية مضغوطة، مما يتوافق مع تنظيم الأنسجة الشبيهة بالغرفة. تم التقاط الصور باستخدام مجهر تصوير. أظهر قياس نتائج التمايز أن 94.0 ± 2.6٪ من أمراض القلب أظهرت ضربات تلقائية و60.3 ± 20.6٪ احتوت على تسوس داخلي أو أكثر ظاهرا. تعرض البيانات كمتوسط ± SD من ثلاث تماميزات مستقلة، مع تحليل حوالي 115 قلبيا في كل تمايز. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: توصيف التمايز العضلي المناعي لتمايز خلايا عضلة القلب. عمليات تجميد نموذجية ليوم 14 من أمراض القلب. (أ) تلوين DAPI يظهر توزيع نوى الخلايا. (ب) صورة فلورية مناعية تظهر نوى موسومة ب DAPI (أزرق) وساركومير موسومة بجسم مضاد ضد بروتين C المرتبط بالميوسين القلبي (cMYBP-C، أخضر)، تظهر هياكل ساركومية منظمة في خلايا عضلة القلب المتمايزة. تم التقاط الصور بواسطة مجهر فلوري كونفوكالي بالليزر باستخدام هدف جاف 10×/0.30 (يسار) وهدف غمر زيت 63×/1.40 (يمين). أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تصوير لامتصاص الأوليغونوكليوتيدات بواسطة القلبيات. صور كونفوكال تظهر التموقع داخل الخلية لأوليجونكليوتيدات مضادة الموسومة بالفلورية (ASOs، أصفر) في الكارديويدات في اليوم الرابع عشر. تصنف أغشية الخلايا بمادة الغروتينين الفلورية لجرثوم القمح (WGA، أرجواني)، وتصبغ النوى بمادة DAPI (زرقاء). يتم اكتشاف الفلورة المرتبطة ب ASO كنقاط منفصلة داخل الخلية (أسهم). تظهر الألواح السفلية قلبيات تحكم سلبية لم تحضن بواسطة ASOs الفلورية. الصور في اللوحات اليمنى تتوافق مع مشاهد ذات تكبير أعلى للمناطق المجمعة في اللوحات اليسرى. تم التقاط صور تمثيلية بواسطة المجهر الكونفوكالي بالليزر مع تصوير فائق الدقة باستخدام كاشف المصفوفة باستخدام هدف غمر في الماء بزاوية 40×. أشرطة السلم = 10 ميكرومتر (يسار) و5 ميكرومتر (يمين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تقييم اختراق الأوليجونكليوتيدات عبر القلب. (أ) مخطط يوضح اكتساب المقاطع البصرية عند أعماق متزايدة داخل القلب. تم إنشاء هذه الصورة من قبل المؤلفين باستخدام Biorender، وتم إرفاق ترخيص حقوق النشر المطلوب. (ب) صور كونفوكالية تمثيلية تظهر توزيع ASOs الموسومة بالفلورية عند مواقع z 0 ميكرومتر، 6 ميكرومتر، و10 ميكرومتر بالنسبة لسطح النسيج. تم الحفاظ على إعدادات التصوير ثابتة في جميع وضعيات z. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (C) أظهر قياس نسبة الخلايا التي تحتوي على إشارة ثقب واحدة على الأقل مرتبطة ب ASO في كل عمق تصوير امتصاص أوليجونكليوتيدات مماثل في جميع أنحاء الأنسجة، حيث 83.1 ± 2.5٪، 84.9 ± 4.5٪، و84.0 ± 4.5٪ خلايا إيجابية ل ASO عند 0 ميكرومتر، 6 ميكرومتر، و10 ميكرومتر على التوالي. تعرض البيانات كمتوسط ± الديدان العصبي من ثلاثة قلبيات، مع تحليل ثلاثة أقسام بصرية لكل كارديويد وتم قياس 1,305 خلايا بمجموع. تم التقاط صور تمثيلية بواسطة المجهر الكونفوكالي بالليزر مع تصوير فائق الدقة باستخدام كاشف المصفوفة باستخدام هدف غمر في الماء بزاوية 40×. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو 1: تسلسل التايم لابس. يظهر فيديو تم الحصول عليه بسرعة 40 إطارا في الثانية نشاطا انقباضيا تلقائيا في القلب. تم إجراء التصوير باستخدام مجهر واسع المجال مزود بكاميرا sCMOS. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برزت العلاجات القائمة على الأوليجونكليوتيدات كفئة قوية من أساليب استهداف الجينات، مدعومة بعقود من التقدم في كيمياء الأوليجونكليوتيدات الذي حسن خصوصية الهدف، واستقرار الأيض، والتحمل المناعي 7,8. على الرغم من تزايد عدد علاجات RNA المعتمدة سريريا، إلا أن تطبيقها الأوسع لا يزال محدودا بسبب عدم كفاءة التوصيل داخل الخلايا 7,8. نظرا لحجمها وشحنتها وحيويتها للماء، لا يمكن للأوليجوننيوكليوتيدات الانتشار السلبي عبر غشاء البلازما، بل يتم استيعابها عبر المسارات التداخلية 9,10. بعد الامتصاص، تبقى الغالبية العظمى (~99٪) من الأوليجونوكليوتيدات الداخلية محجوبة داخل أقسام الإندوسومي 9,10. تمر عملية التنقل الداخلي من خلال عملية نضج من الإندوسومات المبكرة إلى المتأخرة وفي النهاية الليسوسومات؛ ومع ذلك، لا تزال الأقسام الدقيقة التي تهرب منها الأوليجوننيوكليوتيدات إلى السيتوسول غير مفهومة بشكل كامل وقد تشمل عدة مجموعات داخليةداخلية. يمثل هذا الإفراز السيتوزولي المحدود حاجزا حاسما يحد من المعدل ويؤكد الحاجة إلى أنظمة تجريبية فسيولوجية ذات صلة تمكن من التقييم الكمي لامتصاص الأوليجونوكليوتيدات، وحركة الركاب داخل الخلية، والهروب الداخلي20.

تم تطوير البروتوكول الموضح هنا لتلبية هذه الحاجة من خلال دمج القلبيات المشتقة من iPSC البشرية مع قراءات التصوير لامتصاص الأوليجونوكليوتيدات. تعتمد متانة هذا النظام على عدة خطوات حاسمة تؤثر مباشرة على قابلية التكرار ونتائج التجريب. أولا، جودة زراعة iPSC المبتدئة هي عامل رئيسي في نجاح التمايز القلبي. يوصي المؤلفون بتحليل الكاريومايب الدوري لضمان الاستقرار الجيني طويل الأمد والتقييم الروتيني لشكل المستعمرة، وسلامتها، وديناميكيات النمو. تتميز المزارع عالية الجودة بمستعمرات مدمجة ومحددة جيدا ذات حدود ناعمة، وأقل تمايز تلقائي، وتكاثر مستمر. يجب التخلص من الثقافات التي تظهر حواف مستعمرة غير منتظمة، أو شكل خلايا غير متجانس، أو مناطق تمايز واستبدالها بمخزونات مجمدة منخفضة الممر قبل بدء التمايز.

الخطوة الحرجة الثانية هي التكوين المتحكم به لمجموعات iPSC باستخدام صفائح ميكروويل، مما يعزز توليد هياكل ثلاثية الأبعاد موحدة ومحددة بالحجم وهي ضرورية للتمايز القلبيالقابل للتكرار 21. ينتج التجميع القائم على البئر الدقيق أجساما جنينية بأقطار محددة (مثالي بين 200–230 ميكرومتر)، مما يوحيد التفاعلات بين الخلايا والخوف والتعرض لتدرجات المورفوجين أثناء التعديل الزمني لإشارات Wnt. من خلال تجربتنا، يتم تحقيق هذا الحجم باستمرار من خلال زرع حوالي 3,000 خلية لكل بئر ميكرو فردي (الخطوة 2.2)، وهي حالة تم تحسينها والتحقق منها تجريبيا عبر عدة خطوط iPSC بشرية، بما في ذلك الخطوط التجارية المتاحة والخطوط التي أعيد برمجتها داخليا. ومع ذلك، نظرا لأن معدلات انتشار iPSC قد تختلف، فقد يتطلب الكثافة المثلى للبذر تعديلا للحفاظ على حجم الaggregate المطلوب. الفشل في التحكم في هذه المعايير قد يؤدي إلى تراكيب متجانسة، وانخفاض في القابلية، وضعف كفاءة التمايز.

يوفر التحليل النسيجي، كما هو موضح في الشكل 2، تقييما مناسبا للرقابة على الجودة لتكوين القلب. على وجه الخصوص، قد يشير غياب التجاويفات الداخلية أو وجود هياكل منهارة أو مجزأة إلى تكوين تجميع غير مثالي أو تحكم زمني غير كاف لإشارات Wnt خلال خطوات التمايز (الخطوات 4.1–4.3). في بعض التمايز غير الناجح، تظهر مجموعات خلايا غير منقبضة داخل أو حول القلبيات. عادة ما تظهر هذه الخلايا ذات اللون الأصفر بواسطة المجهر الساطع وتميل إلى التصاق بألواح الزراعة منخفضة الالتماس، بينما تكون الخلايا القلبية الغنية بخلايا عضلة القلب رمادية عموما، وتبقى كهياكل ثلاثية الأبعاد مدمجة، ولا تلتصق بسهولة. إذا أظهرت نسبة كبيرة من المجمعات هذا النمط الظاهري غير الانكماشي الملتصق، يجب اعتبار التمايز دون الأمثل. في هذه الحالة، يجب أن يبدأ استكشاف الأخطاء بمراجعة شكل مستعمرات iPSC قبل التمايز، وتأكيد حجم المجموع بين اليوم −1 واليوم 0، وإذا لزم الأمر، إعادة تحسين كثافة البذور وتركيزات CHIR99021 وIWP4 لخط iPSC المحدد.

عادة ما يعكس انخفاض أو غياب الخفقان التلقائي بحلول اليوم 10–12 غير فعال في الحث الأديم المتوسط أو تحديد القلب، وغالبا ما يكون بسبب تركيز أو توقيت غير مناسب لمعدل Wnt، أو بسبب موت الخلايا المفرط بعد العلاج CHIR99021 (الخطوة 4.2). من خلال خبرتنا، يمكن أن يحسن تعديل CHIR99021 ضمن نطاق 9–13 ميكرومولار لكل خط iPSC والتحقق من تركيز ونشاط المحاليل المخزونية كفاءة التمايز. يوفر تحليل التألق المناعي لتنظيم البروتينات الساركومية، كما هو موضح في الشكل 3، تقييما مناسبا لمراقبة الجودة لتمييز خلايا عضلة القلب. يشير التلوين الضعيف أو المتقطع في البروتينات الساركومية، خاصة عندما يقتصر على المناطق الطرفية من العضلة القلبية، إلى عادة ما إلى تمايز خلايا عضلة القلب غير مكتمل أو غير متجانس. في هذه الحالات، يوصى بتمديد فترة نضج التعليق والزراعة (الخطوة 4.6 ونقطة التوقف) قبل التثبيت والتحقق من شروط التثبيت وصبغ الأجسام المضادة.

بينما يوفر هذا النموذج بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد لقلب الإنسان تحسن بشكل كبير مقارنة بزراعة خلايا عضلة القلب ثنائية الأبعاد التقليدية، إلا أنه لا يعكس تماما تعقيد قلب الإنسان البالغ. تمثل الخلايا القلبية مرحلة مبكرة من تطور القلب البشري، حيث تحتفظ خلايا عضلة القلب بنمط ظاهري غير ناضج يشبه الجنين14. علاوة على ذلك، تفتقر الأنسجة إلى التروية الوعائية، والتعصيب، والخلايا المناعية المقيمة، والبنية الكاملة الخاصة بالحجرة لعضلة القلب الناضجة. وبالتالي، رغم أن هذه المنصة مناسبة جدا لدراسة امتصاص الخلايا وتوزيعه داخل الخلايا للأوليجوننيوكليوتيدات في ظروف تجريبية مضبوطة، يجب توخي الحذر عند استنتاج حركيات الامتصاص وآليات التوصيل مباشرة إلى البيئة الحية المحيطة. من المتوقع أن يعزز دمج أنواع أخرى من خلايا القلب الإضافية، والشبكات الوعائية، واستراتيجيات نضج الأنسجة بشكل أكبر الصلة الفسيولوجية لهذه المنصة.

يتطلب التقييم الموثوق لامتصاص الأوليجونوكليوتيدات بواسطة القلبيات الموصوفة في هذا البروتوكول تحسين وتوحيد تركيز ASO، ووقت الحضانة، وإعدادات اكتساب التصوير، كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5. اختيار الفلوروفور مهم بشكل خاص، حيث تختلف الأصباغ في السطوع والاستقرار الضوئي والحساسية للتأثيرات البيئية. في هذه الدراسة، استخدمنا جانيليا فلور 646 (JF646)22، وهو فلوروفور سيليكون رودامين أحمر بعيد ذو سطوع عالي واستقرار ضوئي يوفر اكتشافا قويا للإشارة مع تقليل التألق الذاتي للأنسجة في العينات ثلاثية الأبعاد. تجعله هذه الخصائص مناسبا جدا لتصوير امتصاص الأوليجونكليوتيدات في القلبيات الحية أو الثابتة. ومن الجدير بالذكر أن تصريف الفلوروفور يمكن أن يؤثر على سلوك الأوليجونوكليوتيدات، بما في ذلك امتصاصه والتهريب، ولذلك يجب التحقق منه لكل نظام تجريبي.

في شكله الحالي، يوفر هذا البروتوكول تقييما نوعيا وكميا لامتصاص الأوليجونوكليوتيدات. يتيح التصوير الكونفوكلي للبونكتا المرتبطة ب ASO داخل الخلية تصور موقع أوليغونوكليوتيدات داخل القلب، بينما يتم قياس كفاءة الامتصاص عن طريق تحديد نسبة الخلايا الموجبة ل ASO يدويا باستخدام إضافة Cell Counter في Fiji/ImageJ. على الرغم من أن هذا النهج مناسب جدا للتحليلات ذات الإنتاجية المتوسطة المعروضة هنا، إلا أن تحليل الصور اليدوي يتطلب جهدا كبيرا وقد يكون عرضة لتحيز المراقب، خاصة عند تطبيقه على مجموعات بيانات كبيرة. تقدم التطورات الحديثة في التعلم العميق الذاتي الإشراف للمجهر ثلاثي الأبعاد فرصا واعدة لتجاوز هذه القيود. يمكن لتحليل الصور المعتمد على الذكاء الاصطناعي تقسيم وتحديد وتتبع البنى تحت الخلوية غير المتجانسة بدقة في بيئات ثلاثية الأبعاد معقدة، مما يمكن من القياس التلقائي لامتصاص الأوليغونوكليوتيدات وتحريك الخلايا داخل الخلايا، بما في ذلك ديناميكيات الإندوسومات23. يجب أن يؤدي دمج هذه الأساليب في تطبيقات البروتوكول المستقبلية إلى تحسين معدل الإنتاج، وقابلية التكرار، والدقة التحليلية.

بالنظر إلى المستقبل، يوفر دمج القلبيات المشتقة من iPSC البشرية مع التصوير الكمي، وتحليل الصور المعتمد على التعلم الآلي، ومنهجيات الجسيمات الفردية إطارا قويا للتحقيق في الآليات التي تحكم توصيل الأوليغونوكليوتيدات في أنسجة القلب البشرية. إن دمج نماذج القلب ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجيا مع أدوات تحليلية متقدمة قادرة على حل التنظيم والديناميكيات تحت الخلوية سيمكن من التوصيف الكمي الشامل لامتصاص الأوليجونوكليوتيدات، وحركة الخلايا داخل الخلايا، ومع الفحوصات التكميلية المناسبة، الهروب من الإندوسوم. من المتوقع أن تسهل هذه الأساليب المتكاملة التعرف المنهجي على العوامل التي تحدد كفاءة التوصيل، وتدعم التحسين العقلاني لكيميائيات الأوليجونكليوتيدات ووسائل التوصيل، وتوفر منصة قابلة للتوسع لتقييم العلاجات الناشئة للأوليجونكليوتيدات في سياق أمراض القلب والأوعية الدموية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مركز تحدي مؤسسة نوفو نورديسك للهروب المحسن من الأوليغو، وخاصة كنود جنسن لتصميم وتصنيع الأوليجونكليوتيدات، ونيكوس إس. هاتزاكيس وتوماس كيرشهاوزن على الإرشادات القيمة في التصوير الكمي وتحليل الحركات داخل الخلايا. تم تمويل هذا العمل من قبل مركز تحدي مؤسسة نوفو نورديسك للعبة أوليغو إسكايب المحسنة (NNF23OC0081287). حصل م.ف. على زمالة من مؤسسة العلوم والتقنيات (FCT)، البرتغال (2020.04836.BD). نشكر GIMM للتصوير الحيوي ومنصات GIMM لعلم الأنسجة (لشبونه، البرتغال) على المساعدة الفنية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Wnt
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة