يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكارديويدات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان كنموذج لتقييم توصيل الأوليجونكليوتيدات

219 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

أغسطس 11, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتيح هذا البروتوكول توليد أمراض القلب المعتمدة على خلايا عضلة القلب ذاتية التنظيم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يحثها الإنسان لتقييم مجهر لامتصاص الأوليجونكليوتيدات الموسومة بالفلورية.

الملخص

تمثل العلاجات القائمة على الأوليجونكليوتيدات فئة سريعة التطور من الأدوية ذات الإمكانيات الكبيرة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية؛ ومع ذلك، يبقى تحقيق توصيل فعال إلى نسيج القلب تحديا حاسما وغير محلول. العقبة الرئيسية هي محدودية توفر نماذج بشرية قوية وفسيولوجية ذات صلة في المختبر ، قادرة على دعم التقييم الكمي لامتصاص الخلايا الأوليجونكليوتيدية وتوزيعها داخل الخلية. يتم تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتوليد كارديويدات ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان (iPSCs) وتطبيقها كمنصة لتقييم امتصاص الأوليغونوكليوتيدات الموسومة بالفلورية. يوجه البروتوكول المستخدمين خلال التمايز القلبي الموجه في زراعة التعليق من خلال تعديل إشارات Wnt/β-catenin زمنيا، مما يتيح تحديد تسلسلي لأنابيب iPSC عبر مراحل الأديم المتوسط، ومتوسط الأديم القلبي، وسلف خلايا عضلة القلب. في هذه الظروف، تتجمع الخلايا تلقائيا إلى هياكل ثلاثية الأبعاد تحتوي على تجاويف تعبر عن علامات خلايا عضلة القلب القانونية. توفر الكارديويدات الناتجة منصة قابلة للتوسع وقابلة للتنفيذ تجريبيا لتقييم كفاءة امتصاص الأوليغونوكليوتيدات عبر التصوير الصناعي، مما يدعم تطوير وتحسين استراتيجيات التوصيل لتطبيقات القلب.

المقدمة

العلاجات القائمة على الأوليجونكليوتيدات، وخاصة الأوليغونيوكليوتيدات المضادة للحس (ASOs) والحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs)، تظهر بسرعة كنهج تحويلي ومحدد للغاية لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك الحالات الوراثية والمكتسبة 1,2,3. تمكن هذه الأساليب من التعديل المباشر لتعبير الجينات على مستوى mRNA من خلال الارتباط التسلسلي الخاص بالنسخ المستهدفة، مما يسمح بتصحيح الجينات المرتبطة بالأمراض أو تصحيح الجينات المرتبطة بالأمراض التي غالبا ما تكون غير متاحة للعلاجات التقليدية للجزيئات الصغيرة 4,5. وبالتالي، توفر العلاجات الجينية القائمة على الأوليجونوكليوتيدات منصة متعددة الاستخدامات لاستهداف آليات مرضية متنوعة عبر عدة مناطق مرضية، بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية. حتى الآن، تمت الموافقة على عدة علاجات قائمة على الأوليجوننيوكليوتيدات، بما في ذلك ASOs، siRNAs، وعوامل تبديل التوصيلات، للاستخدام السريري7. على الرغم من هذا التقدم، لا تزال فعاليتها العلاجية في كل من البيئات ما قبل السريرية والسريرية مقيدة بسبب عدم كفاءة التوصيل داخل الخلايا8. تشير التقديرات الحالية إلى أن أقل من 1٪ من الأوليجونوكليوتيدات الداخلية تهرب من الحجرات الداخلية لتصل إلى السيتوسول وتتفاعل مع الحمض النووي الريبي المستهدف، مما يحد من النشاط الوظيفي 9,10. هذا القيد واضح بشكل خاص في نسيج القلب، حيث لا يفهم الامتصاص وحركة الخلايا بشكل جيد.

تاريخيا، اعتمد التقييم قبل السريري للعلاجات القلبية الدموية بشكل كبير على النماذج الحيوانية، التي لا غنى عنها لتقييم الحراكية الدوائية، والتوزيع الحيوي، والفعالية، والسلامة في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن الفروق المهمة بين الأنواع في فسيولوجيا القلب، وتنظيم الجينات، والاستجابات الخلوية غالبا ما تحد من قدرتها على التنبؤ بدقة بفعالية العلاج والسمية لدى البشر. وقد دفعت هذه القيود تطوير نماذج مختبرية مبنية على الإنسان ذات صلة فسيولوجية أفضل. من بين هذه المواد، أحدثت تقنية الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان ثورة في نمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية من خلال توفير مصدر شبه غير محدود من الخلايا التي يمكن تمييزها إلى سلالات قلبية وعائية. تلخص خلايا عضلة القلب المشتقة من iPSC البشرية (iPSC-CMs) العديد من الخصائص الجزيئية والبنيوية والوظيفية لعضلة القلب البشرية، وأصبحت منصة معتمدة على نطاق واسع للتحقيق في آليات المرض، واستجابات الأدوية، والأساليب العلاجية الناشئة11. ومع ذلك، فإن الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد لجسم iPSC-CM البشري لها قيود مهمة. معظم بروتوكولات التمايز تولد خلايا عضلة القلب تشبه خلايا جنينية بدلا من خلايا بالغة، وتظهر خصائص بنيوية، كهربائية فيزيولوجية، أيضية، وانقباضية غير ناضجة12.

علاوة على ذلك، تفتقر الزراعة أحادية الطبقة إلى البنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D)، والتفاعلات متعددة الخلايا، وتركيب المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر على وظيفة خلايا عضلة القلب في الجسم الحي. لمواجهة هذه التحديات، تم تطوير نماذج قلبية ثلاثية الأبعاد متطورةبشكل متزايد 13. من بين هذه الأنسجة، أنسجة القلب الهندسية (EHTs)، التي تولد عن طريق تضمين iPSC-CMs داخل سقالات المواد الحيوية وتطبيق التحفيز الميكانيكي والكهربائي، تعزز النضج الهيكلي والوظيفي مع إعادة إنتاج البيئة الحيوية الميكانيكية لعضلة القلبالأصلية 13 بشكل أوثق. على الرغم من أن أجهزة EHT توفر منصات ذات صلة فسيولوجية عالية لنمذجة الأمراض واختبار الأدوية، إلا أن إنتاجها عادة ما يتطلب خبرة متخصصة في الهندسة الحيوية ومعدات مخصصة. في الطرف الآخر من الطيف، تحافظ شرائح الأنسجة القلبية خارج الجسم الحي ، على بنية الأنسجة الأصلية وتركيبها الخلوي، لكنها تعتمد على الوصول إلى الأنسجة القلبية الأولية، ولديها قدرة محدودة على البقاء في الزراعة، وليست قابلة للتوسع بسهولة.

مؤخرا، ظهرت العضويات القلبية كأنظمة نماذج ثلاثية الأبعاد متاحة تعيد تلخيص جوانب رئيسية من تنظيم ووظيفة نسيج القلب14. الكارديويدات هي عضويات قلبية ذاتية التجمع تتكون أساسا من خلايا عضلة القلب تخضع لتحديد داخلي، ونمط مكاني، وتشكل لتشكيلهياكل شبيهة بالحجرة، تحتوي على التجاويف. تعتمد طرق تكوين القلبيات عادة على تنشيط أولي لإشارات Wnt لتحفيز تحديد الأدم المتوسط، يليه تثبيط لاحق لتعزيز الالتزام بالسلالة القلبية. يمكن توليد القلبيات في مزارع تعليق ساكن أو متحرك، مما يدعم الإنتاج القابل للتوسع ويعزز تنظيم الأنسجة الذاتية 15,16,17,18,19. الأعضاء القلبية متعددة الأنساب الأكثر تعقيدا التي تدمج أنواعا من الخلايا البطانية أو فوق القلبية أو غيرها من الأهمية الفسيولوجية تزيد من الأهمية الفسيولوجية لكنها تتطلب بروتوكولات تمايز أكثر تعقيدا، وفترات زراعة أطول، وتحسين واسعالنطاق 13،14.

يقدم بروتوكول بسيط وقابل للتكرار وفعال لتوليد كارديويدات تعتمد على خلايا عضلة القلب ذاتية التنظيم من iPSCs البشرية وتطبيقها لتقييم امتصاص الأوليجونكليوتيدات الموسومة بالفلورية. من المتوقع أن يكون البروتوكول ذا قيمة للباحثين الذين يسعون لتحسين كيمياء الأوليغونوكليوتيدات واستراتيجيات التوصيل في تطبيقات القلب والأوعية الدموية. جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الزراعة وتحضير iPSCs للتمييز

تحذير: قم بجميع التعامل المفتوح مع الخلايا والوسائط في خزانة سلامة حيوية من الفئة الثانية المعتمدة. ارتد معطف مختبر وقفازات. قم بتطهير أسطح العمل والنفايات السائلة باستخدام مطهر مناسب.

  1. حافظ على أنظمة iPSCs.
    1. ألواح زراعة الطلاء بمصفوفة الغشية القاعدية المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. أطعم iPSCs بوسط خلايا جذعية متعددة القدرات محدد وخالي من التغذية واستبدل الوسط كل 24 ساعة.
    3. حافظ على الزراعة تحت الالتقاء الزائد والخلايا التي تمر عندما تصل إلى 70–80٪ من التقاطع.
      ملاحظة: تأكد من أن الخلايا الروحية النفسية البحوزية تحتفظ بشكل عالي الجودة وغير متمايز، وتأكد من خلوها من الميكوبلازما قبل بدء التمايز.
  2. ما قبل التمايز الزائد.
    1. قم بإذابة الخلايا العضلية العضلية وتوسيع الخلايا لمدة ممرتين على الأقل قبل بدء التمايز القلبي.
    2. تستخدم خلايا المرور طريقة تفكك خالية من الإنزيمات، PBS-EDTA، المتوافقة مع صيانة iPSC.
      نقطة التوقف: الحفاظ على iPSCs في الزراعة حتى تصل إلى التقاء 70–80٪ والحفاظ على الشكل النموذجي دون علامات التمايز التلقائي.

2. تحضير تجمعات iPSC في صفائح البئر الدقيق

  1. فصل iPSCs إلى تعليق خلية واحدة.
    1. استنشق وسط واغسل الخلايا مرة واحدة بسعة 1 مل من 1× PBS.
    2. أضف محلول فصل الخلية (أكيوتاز) عند 500 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة ذات 6 آبار، وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5–7 دقائق.
    3. أضف 1.5 مل من وسط الغسيل لكل بئر، ثم أعد تعليقه بلطف لتوليد تعليق خلية واحدة.
    4. انقل نظام التعليق إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط iPSC خال من المغذي مع إضافة مثبط ROCK (الكمية النهائية 10 ميكرومول).
      ملاحظة: عدل وقت حضانة الانفصال لكل خط iPSC عن طريق فحص الانفصال عند 5 دقائق وتمديد الفترات القصيرة إذا لزم الأمر.
  2. عد الخلايا وحضر كثافة الدرع.
    1. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة عد الخلايا القياسية.
    2. جهز نظام تعليق خلية واحدة بمعدل 0.9 × 106 خلايا/مل لكل بئر من صفيحة تجميع البئر الدقيق بحجم 800 ميكرومتر (بصيغة 24 بئر، ~300 ميكروبئر/بئر).
      ملاحظة: قم بتحسين عدد الخلايا لكل بئر، حيث يختلف حجم التجميع أو كفاءة التمايز عبر خطوط iPSC.
  3. قم بتهيئة لوحة الميكروويل وإزالة الفقاعات.
    1. أضف 500 ميكرولتر من وسط iPSC الخالي من المغذيات يحتوي على مثبط الصخور (ال 10 ميكرومولان النهائية) إلى كل بئر.
    2. قم بعمل جهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة فقاعات الهواء من الآبار الدقيقة.
      حرج: إزالة جميع الفقاعات تماما للسماح بترسيب خلوي متساو في قاع كل بئر دقيق ودعم تكوين التجميع الفعال.
  4. زرع iPSCs في ميكروآفير.
    1. أضف 1.0 مل من التعليق أحادي الخلية المحضر (0.9 × 106 خلايا/مل) إلى كل بئر، مما يعادل 0.9 × 106 خلايا لكل بئر.
    2. أعد تعليق الهواء بلطف داخل البئر 3–5 مرات باستخدام P1000 وتجنب إدخال فقاعات هواء.
    3. قم بالطرد المركزي في اللوح على حرارة 200 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإدخال الخلايا إلى الآبار الدقيقة.
    4. تحقق تحت المجهر من أن الخلايا قد استقرت في الآبار الصغيرة قبل وضع الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
      حرج: تعامل مع اللوح بعناية بعد الطرد المركزي. لا تحرك أو تهز الصفيحة، لأن ذلك قد يتسبب في رفع الخلايا من الآبار الدقيقة.

3. توسع تجمعات iPSC في الآبار الدقيقة

  1. قم بسحب الوسط بعناية واستعادته دون إزعاج أو إزاحة الركام.
    1. قم بإمالة الصفيحة واستنشق ببطء حوالي 1.0 مل من الوسط من كل بئر باستخدام ماصة P1000، لضمان بقاء الركام في الآبار الدقيقة.
    2. استنشق الوسط المتبقي ~500 ميكرولتر ببطء باستخدام ماصحة P1000.
    3. أضف 1.5 مل من وسط iPSC الخالي من المغذي إلى كل بئر عن طريق تفريغه ببطء على جانب البئر باستخدام ماصنة مصلية.
    4. حضانه عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون وكرر التغيير المتوسط يوميا.
      حرج: صب الوسط على جدار البئر وتجنب التدفق المباشر إلى الركام.

4. التمايز القلبي لمجموعات iPSC (من اليوم 0 إلى اليوم 12)

  1. تحفيز الأديم المتوسط (اليوم 0).
    1. إزالة الوسط باستخدام طريقة الشفط اللطيف الموضحة في الخطوات 3.1.1–3.1.2.
    2. أضف 1.5 مل لكل بئر من الوسط القاعدي مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين ومنشط مسار Wnt/β-كاتينين (CHIR99021، التركيز النهائي: 11 ميكرومول).
      ملاحظة: حضر محلول مخزوني بحجم 10 مللي مولار من CHIR99021، وهو مثبط جزيء صغير لإزياز جليكوجين سينثاز كيناز-3 (GSK-3). لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 11 ميكرومول، أضف 1.65 ميكرولتر من المحلول المخزن إلى 1.5 مل من الوسط.
  2. تغير متوسط بعد التحفيز (اليوم الأول).
    1. بعد 24 ساعة من إضافة CHIR99021، استنشق الوسط بلطف من كل بئر.
    2. أضف 1.5 مل لكل بئر من الوسط القاعدي الطازج مع 2٪ B27 ناقص الإنسولين، ثم حضن لمدة 48 ساعة.
      حرج: التزم بدقة بتوقيت خطوات تعديل Wnt، لأن الانحرافات قد تؤثر على كفاءة التفاضل.
      ملاحظة: من المتوقع حدوث بعض موت الخلايا بعد التعرض لمنشط مسار Wnt/β-Catenin. إذا لوحظ فقدان إجمالي واسع النطاق، فكر في تقليل تركيز المنشط في التجارب المستقبلية.
  3. الالتزام القلبي عبر تثبيط العضلات البيضاء (اليوم الثالث).
    1. تحضير وسط مكيف عن طريق نقل 760 ميكرولتر من الوسط المستهلك من كل بئر إلى أنبوب مخروطي معقم بسعة 50 مل.
    2. لكل بئر، أضف 760 ميكرولتر من الوسط القاعدي الطازج مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين إلى الأنبوب الذي يحتوي على الوسط المكيف المجمع، وامزج بلطف.
    3. أضف مثبط مسار Wnt، IWP4، إلى الوسط المختلط حتى يصل تركيز نهائي إلى 5 ميكرومول، ثم قلب الأنبوب بلطف عدة مرات للخلط.
    4. استنشق الوسط المتبقي من كل بئر بعناية، ثم أضف 1.5 مل لكل بئر من الوسط المكيف مع إضافة IWP4.
    5. الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: حضر محلول مخزون بسعة 1 مللي مول من مثبط مسار Wnt IWP4. لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر، أضف 7.6 ميكرولتر من محلول المخزون لكل 1.52 مل من الوسط الكلي (760 ميكرولتر وسط مكيف + 760 ميكرولتر وسط قاعدي طازج) لكل بئر.
  4. تغير متوسط في الميكروويلز (اليوم الخامس).
    1. استبدل الوسط باستخدام نهج الشفط اللطيف الموضح في الخطوات 3.1.1–3.1.2.
    2. أضف 1.5 مل من الوسط القاعدي مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين إلى كل بئر، ثم حضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 48 ساعة.
  5. نقل الركام من الآبار الصغيرة إلى صفائح ذات 6 آبار (اليوم 7).
    1. استنشق الوسط بعناية من كل بئر باستخدام طريقة الشفط اللطيف الموضحة في الخطوات 3.1.1–3.1.2.
    2. أضف 1.0 مل من الوسط القاعدي مع 2٪ B27 مع الأنسولين إلى كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة. باستخدام ماصة P1000، قم بعمل ماصة برفق للأعلى والأسفل على الوسط خمس مرات مع تحريك طرف الماصة بحركة دائرية عبر سطح البئر لإزالة الركام في الآبار الدقيقة ونقلها إلى حالة تعليق.
    3. انقل تعليق المجموع إلى بئر واحد من صفيحة زراعة غير معالجة ذات 6 آبار.
    4. اشطف كل بئر من صفيحة الميكروويل بمقدار 1.0 مل إضافي من الوسط الطازج مرتين إلى ثلاث مرات لاستعادة أي مواد متبقية، ثم نقل كل شطف إلى نفس البئر في صفيحة الستة آبار.
    5. الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
      ملاحظة: من المتوقع وجود خلايا ميتة وحطام خلوي بعد نقل التجمعات. سيتم إزالة معظم الحطام خلال التغيير الوسيط التالي.
  6. تغير متوسط أثناء ثقافة التعليق (اليوم العاشر).
    1. حرك اللوحة بلطف لإزالة أي تجمعات متصلة بشكل غير مرتخ.
    2. قم بإمالة الصفيحة للسماح للركام بالاستقرار في قاع البئر بالجاذبية.
    3. استنشق الوسط المستهلك بعناية دون إزعاج أو شفط التجميعات.
    4. أضف 2.0 مل من الوسط القاعدي الطازج مع 2٪ B27 مع الأنسولين إلى كل بئر، وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48–72 ساعة.
      ملاحظة: عادة ما يلاحظ الضرب العفوي من اليوم العاشر تقريبا فصاعدا.
      نقطة التوقف: يمكن الحفاظ على القلبيات المقاومة في ثقافة تعليق لفترات نضج ممتدة عن طريق استبدال الوسط كل يومين إلى ثلاثة.

5. التوصيف المجهري للقلبيات

ملاحظة: توفر هذه الطريقة سير عمل لتوصيف القلب النسيجي باستخدام عمليات التجميد بالتجميد. يمكن استخدام المقاطع الناتجة لمجموعة متنوعة من التحليلات النسيجة، بما في ذلك تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) لتقييم البنية العامة للأنسجة وتصنيف التألق المناعي لتقييم هوية خلايا عضلة القلب.

  1. تثبيت التثبيت والتقسيم بالتجميد.
    1. ثبت الكارديويدات في بارافورمالديهايد 4٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      تحذير: بارافورمالديهايد سام وربما يكون مسرطنا؛ تعامل معه بغطاء بخار كيميائي وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. اجمع جميع النفايات التي تحتوي على بارافورمالديهايدات (المثبتة والغسول) في حاوية موسومة بوضوح للنفايات الخطرة أو الألدهيد، والتخلص منها وفقا لإجراءات النفايات الخطرة المؤسسية.
      السلامة: قم بجميع عمليات تثبيت والتعامل مع البارافورمالديهايدات باستخدام غطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    2. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بحماية القلب الثابتة ب 30٪ (بدون زجاج) السكروز في PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بدمج الكاردويدات في الجيلاتين، ثم تجميدها، وقطع مقاطع التجميد بسماكة 10 ميكرومتر على شرائح المجهر. تخزين الأقسام عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. وضع ملصقات مناعة.
    1. قم بإذابة الأقسام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل الأقسام في PBS عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مرتين.
    3. قم بتدوير منطقة الاهتمام في كل شريحة بقلم كاره للماء لإنشاء بئر يحتفظ بمحاليل الحجب والأجسام المضادة.
    4. أعد ترطيب الأقسام لمدة 2–3 دقائق في مخزن نفاذية (PB؛ PBS يحتوي على 0.1٪ Tween-20) في جرة Coplin.
    5. أزل الشرائح من PB، وقم بتفريغ المحلول الزائد، وضع الشرائح في غرفة رطبة.
      حرج: من هذه النقطة فصاعدا، من الضروري ألا تجف المقاطع بشكل كبير.
    6. قم بإغلاق المقاطع التي تحتوي على 200–300 ميكرولتر من مصل الجنين (FBS) الذي يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني لمدة 90 دقيقة في غرفة رطبة.
    7. قم بإزالة محلول الانسداد وحضن الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (مضاد cMYBP-C؛ 1:50) مخفف في محلول الانسداد (PB يحتوي على 1٪ FBS).
    8. اغسل الشرائح ثلاث مرات بزيت البول بيد واحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر أخضر فلوري (1:200)، وفالويدين فلوري أحمر بعيد (1:400)، وDAPI (1 ميكروغرام/مل).
    9. اغسله ثلاث مرات بزيت PB وركب بوسط تثبيت مضاد للتلاشي.
      تحذير: اجمع جميع المحاليل التي تحتوي على صبغة فلورية (الأجسام المضادة الثانوية، والفالودين، ومحاليل التلوين DAPI والغسولات المطابقة) في وعاء وتخلص منها كنفايات كيميائية وفقا للإرشادات المؤسسية.
  3. الحصول على الصور.
    1. التقاط صور كونفوكال باستخدام مجهر كونفوكال بالليزر مزود بكاشف مصفوفة للتصوير فائق الدقة باستخدام هدف غمر زيتي بقياس 10× و63×/1.40.
    2. استثار الفلوروفور الأحمر البعيد، والفلوروفور الأخضر، والصبغة النووية باستخدام خطوط ليزر بطول 639 نانومتر، 488 نانومتر، و405 نانومتر عند انتقال 4.0٪، 4.0٪، و1.0٪ على التوالي.
    3. الحصول على مقاطع بصرية واحدة بحجم بكسل 0.0353 × 0.0353 ميكرومترمربع، مسح أحادي الاتجاه، سرعة مسح 6، تكبير 1.7، متوسط خط 1، ووقت توقف بكسل 0.935 ميكروثانية لكل بكسل.
    4. تطبيق معالجة الصور فائقة الدقة باستخدام ترشيح وينر التلقائي.

6. اختبار امتصاص الأوليجونكليوتيدات الفلورية

  1. تحضير محلول مخزوني من الأوليجونكليوتيد الموسوم بالفلورية المترافقة مع حمض البالميتيك لزيادة الحب الدهني.
    1. إعادة تشكيل الأوليجونكليوتيد الفلوري الموسوم بالفلورية في مياه خالية من النوكلياز إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ملليمول. الدوامة لفترة وجيزة وجهاز الطرد المركزي عند 3,000 × جرام لمدة 30 ثانية لجمع المحلول في أسفل الأنبوب.
    2. جهز أليكوات للاستخدام الواحد من محلول المخزون بحجم 1 مللي مولتر وتخزينه عند −20 درجة مئوية محميا من الضوء.
    3. في يوم التجربة، أضف 1 ميكرولتر من مخزون 1 ملليمولار إلى 1 مل من وسط زراعة القلب للحصول على تركيز نهائي للأوليجوننيوكليوتيدات بمقدار 1 ميكرومول. اخلط بتحريك خفيف على الصفائح.
  2. يحتضن القلبيات التي تحتوي على الأوليغونيوكليوتيد الموسوم بالفلورية (تركيز نهائي 1 ميكرومول) في وسط خال من المصل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.
  3. اغسل القلبيات ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الأوليغونيوكليوتيد خارج الخلية.
  4. ثبت الكارديويدات في بارافورمالديهايد 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS، واستمر في وضع العلامات الفلورية قبل التصوير.
  5. حضن القلبيات الثابتة السليمة طوال الليل عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، في PBS يحتوي على 5 ميكروغرام/مل من جرثومة القمح (WGA) مقترن بفلوروفور أخضر و1 ميكروغرام/مل DAPI. اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS وركبته بوسط تثبيت مضاد للتلاشي.
    تحذير: اجمع جميع الأوساط والغسولات التي تحتوي على الأوليجونكليوتيدات والصبغات الفلورية، بما في ذلك وسط حضانة الأوليجونكليوتيدات الموسوم من الخطوة 6.2 ومحلول التلوين WGA/DAPI، في حاوية منفصلة والتخلص منها كنفايات كيميائية/خطيرة بيولوجيا وفقا للإرشادات المؤسسية.
  6. احصل على صور كونفوكالية لامتصاص وتوزيع الأوليجونكليوتيدات.
    1. التقاط صور كونفوكال باستخدام مجهر كونفوكال ليزر مزود بكاشف مصفوفة للتصوير فائق الدقة وهدف غمر في الماء بزاوية 40×. احصل على صور كمكدسات z-مقسمة بحجم خطوة z 2 ميكرومتر، تغطي عمقا إجماليا 16 ميكرومتر.
    2. إثارة الصبغة النووية، وعلامة الغشاء، والأوليغونوكليوتيد الموسوم بفلورية بالأحمر البعيد باستخدام خطوط ليزر 405 نانومتر، 488 نانومتر، و639 نانومتر عند انتقال الليزر 0.9٪، 0.2٪، و3.0٪ على التوالي.
    3. التقاط صور بحجم فوكسل 0.0449 × 0.0449 × 2 ميكرومتر3، مسح ثنائي الاتجاه، سرعة مسح 5، متوسط خط 1، ووقت بسكون بكسل 1.51 ميكروثانية لكل بكسل. طبق معالجة الصور بجودة Airyscan/فائقة الدقة باستخدام فلترة Wiener التلقائية.
    4. حافظ على جميع إعدادات الاستحواذ (قوة الليزر، كسب الكاشف، خطوة z، وحجم الفوكسل) ثابتة عبر جميع مواقع z وعبر جميع العينات للسماح بمقارنة صحيحة لإشارة الأوليجونكليوتيدات بين الظروف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يلخص الشكل 1 سير عمل التمايز ويوضح التغيرات الشكلية المميزة المتوقعة في كل مرحلة من مراحل البروتوكول، من تجميع iPSC إلى تكوين القلبيات ذاتية التنظيم. يوفر تجميع البئر الدقيق المعتمد على التعليق نهجا بسيطا وموحدا لتوليد أعداد كبيرة من الكارديويدات المتحكم بها بالحجم بشكل متوازي. يتميز التمايز الناجح بتكوين تجمعات بحجم متساو، تليها تطور تجاويف داخلية وبدء ضربات تلقائية، عادة من حوالي اليوم العاشر فصاعدا. معا، توفر هذه الميزات الشكلية نقاط تحقق عملية لمراقبة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

برزت العلاجات القائمة على الأوليجونكليوتيدات كفئة قوية من أساليب استهداف الجينات، مدعومة بعقود من التقدم في كيمياء الأوليجونكليوتيدات الذي حسن خصوصية الهدف، واستقرار الأيض، والتحمل المناعي 7,8. على الرغم من تزايد عدد علاجات RNA المعتمدة سريريا، إلا أن تطبيقها الأوسع لا يزال محدودا بسبب عدم كفاءة التوصيل داخل الخلايا 7,8. نظرا لحجمها وشحنتها وحيويتها للماء، لا يمكن للأوليج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مركز تحدي مؤسسة نوفو نورديسك للهروب المحسن من الأوليغو، وخاصة كنود جنسن لتصميم وتصنيع الأوليجونكليوتيدات، ونيكوس إس. هاتزاكيس وتوماس كيرشهاوزن على الإرشادات القيمة في التصوير الكمي وتحليل الحركات داخل الخلايا. تم تمويل هذا العمل من قبل مركز تحدي مؤسسة نوفو نورديسك للعبة أوليغو إسكايب المحسنة (NNF23OC0081287). حصل م.ف. على زمالة من مؤسسة العلوم والتقنيات (FCT)، البرتغال (2020.04836.BD). نشكر GIMM للتصوير الحيوي ومنصات GIMM لعلم الأنسجة (لشبونه، البرتغال) على المساعدة الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

المراجع

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدراتنموذج الكارديويدالتمايز القلبيإشارات Wntالأديم المتوسط القلبيسلف الخلايا العضلية القلبيةقليلة النوكليوتيد الفلوريةالامتصاص الخلويالكارديويدات ثلاثية الأبعاد

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.