علم الأدوية الشبكي والأبحاث التجريبية لعلاج β-سيتوستيرول في علاج أمراض الانسداد الرئوي المزمن عبر مستقبل الجلوكوكورتيكويد

ملخص

β-سيتوستيرول خفف من مرض الانسداد الرئوي المزمن وعزز فعالية الديكساميثازون، مع قيام مستقبل الجلوكوكورتيكويد بالوساطة في هذا التأثير. بالإضافة إلى ذلك، قلل β-سيتوستيرول من الالتهاب، والإجهاد التأكسدي، وشيخوختة الخلايا في كل من خلايا القصبات الدماغية التحفيزية ب CSE والفئران الناتجة عن دخان السجائر المزمنة المزمن المزمن (COPD).

الملخص

مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) هو اضطراب تنفسي شائع يتميز بالتهاب مستمر، وإجهاد تأكسدي، وتدهور تدريجي في وظائف الرئة. لا تزال الإمكانات العلاجية ل β-سيتوستيرول في مرض الانسداد الرئوي المزمن غير واضحة. هدفت هذه الدراسة إلى دراسة التأثيرات الوقائية ل β-سيتوستيرول ضد مرض الانسداد الرئوي المزمن وتوضيح آليته الأساسية. حددت الفحص في قواعد البيانات مستقبل الجلوكوكورتيكويد (GR) كهدف محتمل ل β-سيتوستيرول. تم إنشاء نموذج فأر لمرض الانسداد الرئوي المزمن الناتج عن دخان السجائر ونموذج خلية BEAS-2B المحفز بمستخلص دخان السجائر (CSE). تم تقييم وظيفة الرئة، والعلامات المرتبطة بإصابات الرئة، والالتهابات، والإجهاد التأكسدي، وشيخوختة الخلايا باستخدام اختبارات (RT-qPCR)، واختبارات DCFH-DA الفلورية، ومجموعات كشف الشيخوخة. كما تم تقييم تأثيرات β-سيتوستيرول وحده أو مع الديكساميثازون (DEX). حسن β-سيتوستيرول بشكل ملحوظ وظيفة الرئة، وعاد إلى علامات إصابة الرئة طبيعيا، وتخفيف الالتهاب، والإجهاد التأكسدي، وشيخوخة الخلايا في كل من خلايا BEAS-2B المحفزة ب CSE والفئران المعرضة للدخان من السجائر. وقد رافقت هذه التأثيرات الوقائية زيادة في التعبير عن النسبية النسبية النسائية. علاوة على ذلك، عزز β-سيتوستيرول الاستجابة ل DEX، وأدى العلاج المشترك مع β-سيتوستيرول وDEX إلى تحسينات أكبر في وظائف الرئة، ومؤشرات إصابة الرئة، والالتهابات، ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية، والشيخوخة الخلوية مقارنة بالعلاج ب DEX وحده. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن β-سيتوستيرول يخفف من التغيرات المرضية المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، على الأقل جزئيا، من خلال تنظيم تعبير النسبيات الضريبية وتعزيز الفعالية العلاجية للديكس، مما يبرز إمكاناته كاستراتيجية مساعدة لعلاج الانسداد الرئوي المزمن (COPD).

المقدمة

مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) هو مرض تنفسي تقدمي يتميز بالتهاب مستمر في مجرى الهواء، وتلف السنيخ، وانسداد تدفق الهواء بشكل لا رجعة فيه، مما يضر بوظيفة الجهاز التنفسي ويقلل من جودة الحياة¹. يزداد انتشاره بشكل كبير مع التقدم في العمر، وخطر الخطر على الأشخاص الذين تبلغ أعمارهم خمسة وستين عاما فأكثر هو حوالي خمسة أضعاف الخطر لدى الأشخاص دون^{سن الثانية} والأربعين. يرتبط هذا الاتجاه الديموغرافي بزيادة معدل الإصابة بالأمراض، والوفيات، والإعاقة³. تشير التوقعات الوبائية إلى أنه بحلول عام 2030، قد يصبح مرض الانسداد الرئوي المزمن رابع سبب الوفاة في العالم، حيث يمثل حوالي 5٪ من جميع الوفيات ^4,5,6. حاليا، تشمل عوامل الخطر المحددة القابلية الوراثية، خلل التنسج الرئوي، التعرض للجسيمات الدقيقة، التهاب الشعب الهوائية المزمن، والعدوى التنفسية⁷.

من بين عوامل الخطر، يعد دخان السجائر أهم عامل ممرض لمرض الانسداد الرئوي المزمن⁸. يحتوي على آلاف المواد الكيميائية التي يمكن أن تسبب تلف ظهارة الشعب الهوائية، وتعزز تسرب الخلايا الالتهابية، وتؤدي إلى إعادة تشكيل نسيج الرئة^. يمكن أن يؤدي التعرض طويل الأمد إلى إصابة ظهارية مستمرة وغير قابلة للعكس، ويعزز إطلاق عدد كبير من الكيموكينات الالتهابية، ويزيد بشكل كبير من إنتاج الروبوتات السرطانية (ROS)، ويحفز الاستماتة الخلوية¹⁰. أظهرت العديد من الدراسات أن ارتفاع مستويات الكيموكينات المضادة للالتهابات مثل الإنترلوكين-8 (IL-8) وعامل نخر الورم-α (TNF-α)، إلى جانب الإنتاج المفرط لفيروس ROS وشيخوخة الخلايا، ترتبط ارتباطا وثيقا بشدة مرض الانسداد الرئوي المزمن^11,12. يبرز هذا الحاجة إلى عوامل يمكنها تعديل هذه العوامل الممرضة الرئيسية بفعالية وأمان لممارسة تأثيرات وقائية وعلاجية في مرض الانسداد الرئوي المزمن.

الفيتوستيرولات هي مركبات طبيعية نشطة حيويا موجودة في أغشية خلايا النبات. من بينها، يعد β-سيتوستيرول الأكثر وفرة وينتشر على نطاق واسع في الأطعمة النباتية الغنية بالدهون مثل الخضروات والمكسرات والبذور وزيت الزيتون 13,14,15,16. أكدت الدراسات أن إعطاء β-سيتوستيرول بجرعات تصل إلى 1000 ملغ/كجم في الفئران والفئران لا يرتبط بالسمية الخلوية أو السمية الجينية¹⁷. علاوة على ذلك، أظهرت الأبحاث أن β-سيتوستيرول يظهر خصائص مضادة للأكسدة من خلال تأثيره على إنزيمات مضادات الأكسدة^{ومستقبلات} الإستروجين البشرية.

يظهر β-سيتوستيرول طيفا واسعا من الأنشطة الدوائية، بما في ذلك مضادات الالتهاب¹⁹، مضاد الحرارة²⁰، مسكنات²¹، ومضادات السكري¹³. كما أظهر قدرات علاجية في نماذج مرضية مختلفة، مثل التهاب القولون والتهاب الأمعاء²²، ويمتلك خصائص مضادة لتصلب الشرايين²³ وخصائص تعديل مناعة²⁴. بالإضافة إلى ذلك، يتمتع بملف أمان إيجابي. وبالنظر إلى هذه الخصائص، جذب β-سيتوستيرول اهتماما كبيرا كمرشح محتمل للدواء. ومع ذلك، لا تزال دورها الدقيق والآليات الأساسية في مرض الانسداد الرئوي المزمن غير واضحة إلى حد كبير.

لذلك، هدفت الدراسة الحالية إلى دراسة التأثيرات العلاجية المحتملة والآليات الكامنة وراء β-سيتوستيرول في مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). على وجه التحديد، تم استخدام نموذج إصابة خلايا BEAS-2B المستحث من مستخلص دخان السجائر (CSE) لتقييم ما إذا كان β-سيتوستيرول يمكن أن يخفف بشكل فعال من الضرر الخلوي الناتج عن CSE، وبالتالي تحديد جزيء مرشح جديد لاستراتيجيات علاجية للانسداد الرئوي المزمن (COPD).

البروتوكول

أجريت الدراسة وفقا لإرشادات علم الأدوية الأساسية والسريرية والسموم للدراسات التجريبية والسريرية²⁵. تمت الموافقة على جميع بروتوكولات التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المستشفى الثاني التابع لكلية الطب بجامعة تشجيانغ (الموافقة رقم 20230102)، وأجريت جميع التجارب وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات الحيوان. أجريت الدراسة وفقا لإرشادات ARRIVE.

فحص المكونات والأهداف الرئيسية عبر علم الأدوية الشبكي

المكونات الفعالة في Fritillaria cirrhosa D. Don، Lonicera japonica Thunb.، Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.، و Adenophora stricta Miq. تم استرجاعها من قاعدة بيانات أنظمة الأدوية التقليدية للطب الصيني (TCMSP؛ تم الوصول إليها في 12 مارس 2024). تم فحص المركبات المرشحة وفقا لمعايير ADME التالية: التوافر الحيوي الفموي (OB) ≥ 30٪، والشبه الدوائي (DL) ≥ 0.18، ونفاذية Caco-2 ≥ −0.4²⁵. تم الاحتفاظ بالمركبات التي تستوفي المعايير الثلاثة كلها كمكونات فعالة مرشحة للتحليلات اللاحقة.

تم الحصول على الهيكل القياسي لنظام إدخال خط إدخال الجزيئات المبسط (SMILES) ل β-سيتوستيرول من PubChem (تم الوصول إليه في 18 مارس 2024) وتم استيراده إلى SwissTargetPrediction (تم الوصول إليه في 21 مارس 2024) للتنبؤ بالأهداف. تم اختيار الإنسان العاقل كنوع مستهدف. تم التنبؤ بالأهداف المحتملة بناء على التشابه الهيكلي ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد بين β-سيتوستيرول والروابط المعروفة في قاعدة البيانات. تم الاحتفاظ بالأهداف المتوقعة باحتمالية أكبر من 0، وتمت إزالة الإدخالات المكررة.

تم استرجاع الجينات المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن من قاعدة بيانات الأهداف العلاجية (TTD؛ تم الوصول إليها في 25 مارس 2024) وقاعدة بيانات السموم المقارنة (CTD؛ تم الوصول إليها في 28 مارس 2024) باستخدام الكلمة المفتاحية "مرض الانسداد الرئوي المزمن". بعد إزالة الجينات المكررة، تم تقاطع الجينات المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن مع الأهداف المتوقعة ل β-سيتوستيرول لتحديد الأهداف المرشحة التي قد تكون متورطة في التأثيرات العلاجية ل β-سيتوستيرول ضد الانسداد الرئوي المزمن.

الالتحام الجزيئي بين β-سيتوستيرول وGR

تم استرجاع البنية ثلاثية الأبعاد ل β-سيتوستيرول بصيغة SDF من قاعدة بيانات PubChem (تم الوصول إليها في 2 يونيو 2026)، بينما تم الحصول على البنية البلورية لمستقبل الجلوكوكورتيكويد (GR) من بنك بيانات البروتينات التابع للمختبر التعاوني للبحوث المعلوماتية الحيوية الهيكلية (RCSB PDB؛ تم الوصول إليه في 3 يونيو 2026). بعد التحضير القياسي لهياكل الليغاند والمستقبلات، تم إجراء الالتحام الجزيئي باستخدام منصة CB-Dock2 الإلكترونية (تم الوصول إليها في 3 يونيو 2026). تم رفع ملفات الليغاند والمستقبلات المحضرة إلى المنصة، وأجريت حسابات الالتحام باستخدام المعلمات الافتراضية.

تحليل الإثراء الوظيفي لأنطولوجيا الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG)

تم تعريض جميع الجينات المستهدفة المتوقعة ل β-سيتوستيرول لتحليل إثراء وظيفي GO وتحليل إثراء مسار KEGG. تم فرز وتخزين نتائج الإثراء، بما في ذلك العمليات البيولوجية المثرية بشكل كبير، والمكونات الخلوية، والوظائف الجزيئية، ومسارات الإشارة، في الملف التكميلي 1 لتحليلها اللاحق في المعلوماتية الحيوية.

نمذجة الحيوانات وتجميعها

تم تحديد حجم العينة بستة حيوانات لكل مجموعة بناء على دراسة سابقة أجرت تحليلا مسبقا للطاقة باستخدام برنامج G*Power (α = 0.05، القدرة = 0.80) وأظهرت أن n = 6 كان كافيا لاكتشاف الفروق البيولوجية ذات الصلة تحت ظروف تجريبية مماثلة²⁶. تم توزيع الفئران الذكور C57BL/6 التي تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع (20 ± 2 ج) عشوائيا إلى خمس مجموعات: مجموعة الضابطة، مجموعة نموذج الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، مجموعة COPD + ديكساميثازون (DEX)، مجموعة COPD + β-سيتوستيرول، ومجموعة COPD + DEX + β-سيتوستيرول. تم وضع الفئران في ظروف مختبرية قياسية (25 درجة مئوية، دورة ضوء/ظلام 12 ساعة) مع وصول مجاني إلى الطعام والماء القياسيين، وسمح لها بالتأقلم لمدة أسبوع قبل التجربة.

لتأسيس نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن، وضعت الفئران في غرفة تعرض دخان سجائر كامل الجسم (63 سم × 55 سم × 45 سم) وتعرضت لدخان السجائر السائد لمدة 12 أسبوعا. كل سيجارة احتوت على 10 ملغ من القطران، و0.9 ملغ نيكوتين، و10 ملغ من أول أكسيد الكربون. تم إجراء التعرض للدخان مرتين يوميا (5 أيام في الأسبوع) في الساعة 9:30 صباحا و3:00 مساء، حيث تم تسليم الدخان الناتج عن 18 سيجارة إلى الحجرة لمدة 90 دقيقة في كل جلسة^و27.

لتقييم التأثيرات العلاجية للتدخلات، بدأ إعطاء الدواء بعد 8 أسابيع من التعرض لدخان السجائر واستمر لمدة 4 أسابيع المتبقية. ابتداء من الأسبوع التاسع، تلقت الفئران في مجموعات العلاج المعنية إعطاء يومي من DEX (1 ملغ/كغ)²⁸ أو β-سيتوستيرول (50 ملغ/كغ)^29.30 قبل ساعة من التعرض لدخان السجائر. أفادت دراسات سابقة عن توفر حيوي فموي بنسبة تقارب 4٪ ل β-سيتوستيرول في القوارض³¹. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت عدة دراسات للفئران جرعات تتراوح بين 20 إلى 50 ملغ/كجم³². لذلك، تم اختيار جرعة 50 ملغ/كجم لضمان التعرض الجهازي الكافي مع البقاء ضمن النطاق المستخدم عادة في الدراسات قبل السريرية.

تعرضت الفئران في مجموعة الضابطة لهواء غرفة مفلتر، بينما تلقت الفئران في مجموعة النموذج والمعالجة حجم مكافئ من المحلول الملحي الطبيعي كوسيلة للعلاج. في نهاية فترة التجارب، تم تخدير الفئران بعمق باستخدام الإيزوفلوران حتى فقدان رد فعل الدواسة، ثم تم التخلص منها عن طريق النزيف عبر جمع دم الشريان الأبهر البطني. تم فتح تجويف الصدر فورا، وتم استئصال أنسجة الرئة الثنائية السليمة بعناية، وشطفها بمحلول ملحي مخمل بالفوسفات البارد (PBS)، ووضعها على الثلج. لجمع سائل الغسيل الحويجي القصبي (BALF)، تم قنابة القصبة الهوائية وغسلها بمحلول PBS المعقم البارد، الذي تم غرسه بلطف وسحبه مرارا لجمع سائل الغسيل. تم الاحتفاظ بأنسجة الرئة وعينات BALF على الثلج ثم تمت معالجتها لاحقا للتحليلات اللاحقة.

زراعة خلايا BEAS-2B

تم الحفاظ على خلايا ظهارية الشعب الهوائية البشرية من BEAS-2B في دواء Dulbecco المعدل Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) الذي يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ بنسلين/ستربتوميسين تحت 5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية.

تحضير CSE والتعرض لخلايا BEAS-2B

تم غسل خلايا BEAS-2B باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات وزرعها في صفيحات بئر 24 بئر ثلاثية بكثافة 5 × 10^{إلى 4} خلايا في كل بئر. بعد 12 ساعة من الزراعة، وصلت الخلايا إلى حوالي 60٪ من التقاء الخلايا ثم تعرضت لمادة CSE. تم إعداد CSE حديثا كما هو موصوف سابقا، مع تعديلات طفيفة³³. لفترة وجيزة، كانت سيجارة تجارية غير مفلترة تحترق باستمرار، ويتم فقاعات الدخان السائد في 10 مل من وسط خال من المصل باستخدام مضخة تفريغ بمعدل تدفق ثابت 1.05 لتر/دقيقة (حوالي −11 كيلوباسكال ضغط سالب) لمدة تقارب 5 دقائق حتى تحترق السيجارة بالكامل. تم تعريض المحلول المحصل أولا للترشيح المسبق لإزالة الشوائب الجسيمات الكبيرة، ثم تم تعقيمه بواسطة مرشح دقيق مسامي معقم بحجم 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات المتبقية؛ تم تعريف الحل الناتج للمخزون بأنه 100٪ CSE. تم استخدام جميع CSE المحضرة حديثا لمعالجة الخلايا مباشرة بعد الترشيح دون تخزين. تم تحفيز الخلايا باستخدام وسط يحتوي على 2.5٪ من CSE. بعد 24 ساعة من معالجة CSE، تم جمع المواد الزائفة للثقافة وتخزينها عند -40 درجة مئوية للتحليل اللاحق³⁴.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا BEAS-2B باستخدام مجموعة استخراج RNA كليا وتم نسخه عكسيا إلى cDNA باستخدام مجموعة نسخ عكسي وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. تم إجراء RT-qPCR لاحقا باستخدام نظام كشف PCR في الوقت الحقيقي ومزيج رئيسي qPCR قائم على SYBR Green. أجريت جميع تجارب RT-qPCR باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية وثلاث نسخ تقنية لكل عينة لضمان موثوقية البيانات.

تم تنفيذ كل تفاعل qPCR بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر، يحتوي على 10 ميكرولتر من خليط SYBR Green qPCR الرئيسي، و0.4 ميكرولتر من البرايمر الأمامي، و0.4 ميكرولتر من البرايمر العكسي، و2 ميكرولتر من قالب cDNA مخفف، و7.2 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. كانت شروط التضخيم كما يلي: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، والتلدين/التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم حساب مستويات التعبير الجيني النسبية باستخدام طريقة 2^−ΔΔCt، حيث كان GAPDH هو الجين المرجعي الداخلي. تم ذكر تسلسلات البادئات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1.

تحليل أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا (ROS)

تم تقييم إنتاج ROS داخل الخلايا في خلايا BEAS-2B باستخدام المسبار الفلوري 2′,7′-ثنائي كلوروديهيدروفلوريسيين ديأسيتات (DCFH-DA) وتم تحليله بواسطة قياس تدفق الخلايا الخلوي. أثناء اكتساب التدفق الخلوي، تم تطبيق استراتيجية بوابات التشتت الأمامي القياسية (FSC) والتبعثر الجانبي (SSC) لاستبعاد الحطام الخلوي واختيار الخلايا المفردة السليمة. تم جمع ما مجموعه 10,000 حدث خلوي صالح لكل عينة. تم ضبط أطوال موجات الإثارة والانبعاث عند 488 نانومتر و525 نانومتر على التوالي. تم تحليل بيانات تدفق الخلايا لاحقا لقياس شدة فلورة ROS داخل الخلية.

تحديد مستوى مالونديالديهايد (MDA)

تم قياس محتوى MDA داخل الخلايا باستخدام مجموعة اختبار بيروكسيد الدهون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، تم جمع خلايا BEAS-2B المعالجة وتحللها، ثم تم طردها على درجة حرارة منخفضة لجمع الفائق. ثم تم إجراء تفاعل حمض الثيوباربيتوريك (TBA) اللوني، وتم قياس الامتصاص عند 532 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوبايت. تم حساب مستويات MDA النسبية وفقا للمنحنى القياسي.

تقييم شيخوخة الخلايا

تم تقييم شيخوخة الخلايا باستخدام اختبار كشف الشيخوخة بناء على نشاط إنزيم β-جالاكتوسيداز (SA-β-gal) المرتبط بالشيخوخة. تم قياس خلايا SA-β-gal-الموجبة بواسطة قياس تدفق الخلية. بالتوازي، تم تحديد مستويات تعبير mRNA لعلامات الشيخوخة p53 وp21 بواسطة RT-qPCR.

اختبار تكاثر الخلايا

تم تقييم تكاثر الخلايا باستخدام مجموعة اختبار حيوية الخلايا اللوني. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبلايت.

اختبار الضربة النسبية العامة

تم إجراء نقل الخلايا باستخدام كاشف نقل يعتمد على الدهون. تم نقل الأوليجونكليوتيدات التالية: RNA صغير متداخل (si-GR) المستهدف مستقبلات الجلوكوكورتيكويد، وRNA صغير متداخل سالب التحكم (si-NC). تم تصميم تسلسلات siRNA المرشحة التي تستهدف GR باستخدام منصة المعلوماتية الحيوية الإلكترونية siDirect 2.0. بعد النقل، تم زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة، واستخدمت جميع siRNA بتركيز نهائي يبلغ 50 نانوم. تم التحقق من كفاءة الإلغاء من خلال قياس تعبير mRNA في GR باستخدام RT-qPCR.

تم تضمين مجموعات التحكم في المركبات في كل من تجارب علاج β سيتوستيرول وتجارب النقل الداخلي. بالنسبة لتدخل β-سيتوستيرول، كانت الخلايا التي عولجت بمذيب المركبة وحدها بمثابة مجموعة التحكم في المركبة (المشار إليها ب CSE+0). أكد التحليل الإحصائي أنه لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعة التحكم في المركبات ومجموعة التحكم الفارغ.

التحليل الإحصائي

تم التعبير عن جميع النتائج الكمية كمتوسط ± انحراف معياري من ثلاث تجارب مختبرية مستقلة بيولوجيا. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي. استخدم اختبار شابيرو-ويلك لفحص توزيع البيانات الطبيعي قبل الاختبارات الإحصائية؛ تم اعتماد تصحيح بونفيروني بعد التصحيح لضبط قيم P للمقارنات المتعددة بعد تحليل التباين (ANOVA). تم تقييم المقارنات بين مجموعتين من خلال اختبار t للطالب غير المرتبط، بينما تم استخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه للمقارنات متعددة المجموعات. تم اعتبار قيمة p ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

كان β-سيتوستيرول منتجا طبيعيا محتملا لعلاج مرض الانسداد الرئوي المزمن

بسبب التأثيرات العلاجية المبلغ عنها لزهرة Fritillaria cirrhosa D. Don، الزهرة المجففة من Lonicera japonica Thunb.، والجذر الجاف من Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.، وAdenophora stricta Miq. في علاج أمراض الرئة 35,36,37,38، استخدمت هذه الدراسة قاعدة بيانات TCMSP لتحديد المكونات الفعالة لهذه الأعشاب التقليدية من الطب الصيني (TCM) بشكل منهجي تم تحديد β-سيتوستيرول كمكون نشط مهم مشترك بين هذه الأعشاب الصينية الصينية (الشكل 1A). لاستكشاف الآلية الجزيئية الأساسية ل β-سيتوستيرول بشكل منهجي، تم استرجاع معلومات SMILES الهيكلية من قاعدة بيانات PubChem واستيرادها إلى قاعدة بيانات SwissTargetPrediction للتنبؤ بالأهداف؛ تم الاحتفاظ بجميع الأهداف المتوقعة التي كانت احتمالية تنبؤية أعلى من 0 للتحليل لاحقا. تم تصور شبكة التفاعل الناتجة بين المكون والهدف بين β-سيتوستيرول وأهدافه المرشحة وعرضها في الشكل 1B. تم التنبؤ بإجمالي 43 جينا مستهدفا محتملا ل β-سيتوستيرول باستخدام قاعدة بيانات SwissTargetPrediction. لاحقا، أجريت تحليلات إثراء وظيفي GO وتحليل إثراء مسار KEGG على الجينات المستهدفة ل β-سيتوستيرول، وتم أرشفة جميع مجموعات بيانات الإثراء الكاملة في الملف التكميلي 1. ومن الجدير بالذكر أن العمليات الأيضية للستيرويدات تم تحديدها كواحدة من أكثر المسارات تأثرا بشكل ملحوظ. أظهرت الأدبيات المتراكمة العلاقة الوثيقة بين استقلاب الستيرويدات الشاذ ومقاومة الجلوكوكورتيكويد في مرض الانسداد الرئوي المزمن³⁹. علاوة على ذلك، كان النسبوب النسبي غنيا بشكل واضح ضمن المجموعات الوظيفية المرتبطة باستقلابيات الستيرويدات. يوفر هذا الاكتشاف دعما حيويا حيويا لتجارب خلوية لاحقة التي تحقق من آلية تحسين β-سيتوستيرول لحساسية DEX وتغيير مستويات تعبير ال GR.

تم استرجاع الجينات المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن من قاعدة بيانات TTD وCTD. كشف تحليل تقاطع فين اللاحق (الشكل 1C) عن جينين متداخلين بين أهداف β-سيتوستيرول وجينات مرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن المشتقة من TTD، وجينين متداخلين آخرين بين أهداف β-سيتوستيرول وجينات مرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن المشتقة من CTD، وخمسة جينات مشتركة بين مجموعات بيانات TTD وCTD. في النهاية، كان GR هو الجين الوحيد المشترك في مجموعات البيانات الثلاث، وتم تعريفه كهدف أساسي لجرعة β-سيتوستيرول ضد مرض الانسداد الرئوي المزمن. البيانات الرقمية التفصيلية لتحليل فين مدرجة في الملف التكميلي 2. للتحقق الإضافي من الألفة الارتباطية، تم إجراء الربط الجزيئي بين β-سيتوستيرول وGR (الشكل 1D). اعتبرت جيوب الربط التي تحتوي على درجات فينا أقل من −7.0 كيلو كالوري/مول على أنها تظهر ألفة ارتباط إيجابية. كانت درجات فينا للجيوب C1 و C5 −8.8 و−7.2 كيلو كالوري/مول على التوالي، مما يشير إلى تفاعل متوقع قوي بين β-سيتوستيرول وGR.

حمى β-سيتوستيرول خلايا BEAS-2B من تلف CSE، والذي قد يرتبط بارتفاع تعبير GR

أظهر β-سيتوستيرول تأثيرا وقائيا كبيرا في نموذج إصابة خلايا BEAS-2B الناتجة عن CSE. تم تصميم مجموعة CSE + 0 كمجموعة تحكم في المركبات تستقبل CSE بالإضافة إلى حجم مماثل من مذيب الأدوية بدون β-سيتوستيرول. كما هو متوقع، لم يتم العثور على فرق ذي دلالة إحصائية بين مجموعتي CSE و CSE + 0. كان المركب يثبط إنتاج TNF-α وIL-6 الناتج عن CSE بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 2A). كما قلل من مستويات ROS داخل الخلايا (الشكل 2B). كما خفض β-سيتوستيرول بشكل ملحوظ محتوى MDA (الشكل 2C)، وقمع الشيخوختة الخلوية الناتجة عن CSE (الشكل 2D)، وخفض مؤشرات الشيخوخة p53 و p21 (الشكل 2E). وقد رافقت هذه التأثيرات زيادة في التعبير عن mRNA في GR (الشكل 2F)، مما يشير إلى أن وظيفته الوقائية قد تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا بزيادة التمثيل النسبي النسوي في النسخ (GR). ضمن نطاق التركيز المختبر، لم يمارس β-سيتوستيرول سمية خلوية واضحة على بقاء خلايا BEAS-2B (الشكل 2G)، مما يشير إلى تحمل خلوي إيجابي لهذا المركب. نظرا لأن 20 ميكروغرام/مل (حوالي 48.2 ميكرومول) أظهرت أقوى تأثيرات مثبطة للجرعة، تم اختيار هذه الجرعة للتجارب اللاحقة. على الرغم من عدم ملاحظة فرق ذو دلالة إحصائية بين مجموعتي 10 ميكروغرام/مل و20 ميكروغرام/مل فيما يتعلق بقمع السيتوكينات الالتهابية، أظهر 20 ميكروغرام/مل β-سيتوستيرول اتجاها تناقصا طفيفا في مستويات عوامل الالتهاب. علاوة على ذلك، مقارنة ب 10 ميكروغرام/مل، حققت 20 ميكروغرام/مل فعالية فائقة في تثبيط تراكم ROS وMDA الناتج عن CSE، وتقليل شيخوخة الخلية، وتنظيم تعبير mRNA في GR. وقد دعم ذلك اختيار تركيز العمل الأمثل ل 20 ميكروغرام/مل لاختبارات الإنقاذ اللاحقة.

أكدت نتائج RT-qPCR (الشكل 2H) نجاح إسقاط النسبة العمومية. انخفضت مستويات mRNA في مجموعة si-GR بحوالي 78٪ مقارنة بالتحكم في si-NC، مما يتحقق من كفاءة كتم الحمض النووي الإجمالي في اختبارات الإنقاذ اللاحقة. بعد انخفاض مقاومة الحمض النسبي، انعكست التأثيرات المثبطة ل β-سيتوستيرول على العوامل الالتهابية وROS بشكل ملحوظ (الشكل 2I، J). وبالمثل، تم إلغاء توهين شيخوخة الخلية بواسطة β-سيتوستيرول (الشكل 2K). عند جمع هذه النتائج معا، أظهرت أن β-سيتوستيرول لعب دورا وقائيا ضد الإصابة الناتجة عن CSE في خلايا ظهارة الشعب الهوائية من خلال آليات مضادة للالتهابات، ومضادات الأكسدة، ومضادة للشيخوخة بوسائط GR.

عزز β-سيتوستيرول التأثيرات العلاجية ل DEX على وظائف الرئة والالتهاب في نموذج فأر لمرض الانسداد الرئوي المزمن

في نموذج فأر لمرض الانسداد الرئوي المزمن الذي تم اكتشافه من خلال التعرض لدخان السجائر، كان العلاج ب β-سيتوستيرول أو DEX أو مجموعتهما يمارس تأثيرات وقائية واضحة. تم تحليل المقارنات الإحصائية بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التوالي المبكر أحادي الاتجاه تلاها اختبار توكي بعد الاختبار. تم تطبيق خمسة أنماط رموز مميزة لتمييز مجموعات التجريب: دوائر لمجموعة الضابطة، مثلثات لمجموعة النموذج، النجوم لمجموعة النموذج + DEX، المربعات لمجموعة النموذج + β-سيتوستيرول، والماس لمجموعة النموذج + DEX + β-سيتوستيرول. يمثل كل قوس أفقي مقارنة إحصائية بين مجموعتين تجريبتين مرتبطتين.

مقارنة بمجموعة الضابطة، أظهرت فئران مجموعة نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن انخفاضات ملحوظة في حجم الزفير القسري بمقدار 0.1 ثانية (FEV₀.₁)، والسعة الحيوية القسرية (FVC)، وتدفق النفس الذروي (PEF)، ونسبة FEV₀.₁/FVC. كما هو موضح في الشكل 3A–D، فإن نسبة FEV₀.₁/FVC أقل من 70٪ أكدت نجاح تأسيس نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). أدى إعطاء DEX أو β-سيتوستيرول وحده إلى عكس هذه الاضطرابات في وظائف الرئة بشكل كبير مقارنة بالفئران النموذجية، وأدى العلاج المشترك إلى تحسينات إضافية مقارنة بالعلاج الفردي. بالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة MMP-9/TIMP-1 المتغيرة هي علامة جزيئية مميزة لإعادة تشكيل مجرى الهواء، وارتفاع تعبير MUC5AC يمثل فرط إفراز المخاط ^40,41. كما اكتشفنا مستويات mRNA في MMP-9 وTIMP-1 وعلامة المخاط MUC5AC، وحسبنا نسبة MMP-9 إلى TIMP-1 (الشكل 3E، F). أظهرت مجموعة النماذج زيادة ملحوظة في نسبة MMP-9/TIMP-1 وارتفاع في تعبير MUC5AC. DEX أو β-سيتوستيرول وحده قلل بشكل فعال من كلا المعلمين، وحقق العلاج المركب فعالية مثبطة متفوقة مقارنة بالعلاج الأحادي.

أظهرت فئران نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن ارتفاعات واضحة في مستويات BALF من TNF-α وIL-6، بالإضافة إلى زيادة في محتوى ROS الرئوي مقارنة بالفئران الضابطة. DEX أو β-سيتوستيرول وحده قلل بشكل ملحوظ من مستويات السيتوكين الالتهابية والإجهاد التأكسدي، وأدى العلاج المشترك إلى تأثيرات مثبطة أقوى (الشكل 3G، H). علاوة على ذلك، كان تعبير mRNA في الرئة أقل تنظيما بشكل ملحوظ في فئران نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن. DEX أو β-سيتوستيرول وحده رفع بشكل كبير من تعبير GR، ورفع العلاج المشترك مستويات GR أكثر (الشكل 3I).

أشارت هذه النتائج مجتمعة إلى أن β-سيتوستيرول حمى من التغيرات المرضية المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن في الفئران من خلال الحفاظ على وظيفة الرئة، وتثبيط الالتهاب، وتخفيف الإجهاد التأكسدي، ورفع تعبير المقاومة المزمنة. علاوة على ذلك، عزز الإعطاء المشترك ل β-سيتوستيرول فعالية الحماية ل DEX في هذا النموذج.

عزز β-سيتوستيرول فعالية DEX العلاجية، ربما من خلال تنظيم مسار GR في نموذج خلايا BEAS-2B المستحث بواسطة CSE

في نموذج خلايا BEAS-2B المستحث بواسطة CSE، خفضت معالجة DEX الأحادية بشكل كبير تعبير mRNA للسيتوكينات الالتهابية، وخفض مستويات ROS وMDA داخل الخلية، وقلل نسبة الخلايا المتقدمة للشيخوخة بالإضافة إلى تعبير علامات الشيخوخة p53 و p21. تؤكد هذه النتائج الأنشطة المضادة للالتهابات، المضادة للأكسدة، ومضادة للشيخوخة في DEX. ومن الجدير بالذكر أن الإعطاء المشترك ل β-سيتوستيرول عزز التأثيرات الوقائية ل DEX، مما أدى إلى تثبيط أقوى للالتهابات، والإجهاد التأكسدي، وشيخوخة الخلايا مقارنة بالعلاج الأحادي باستخدام DEX. عند انخفاض نسبة النساء النسبية (si-GR) في مجموعة العلاج المشترك DEX + β-سيتوستيرول، انخفضت الاستجابة الخلوية للعلاج المشترك بشكل ملحوظ. كما هو موضح في الشكل 4A–E، تم عكس تثبيط الالتهاب والإجهاد التأكسدي والشيخوخة المشترك بين DEX و β-سيتوستيرول بشكل كبير، مما يشير إلى أن نقص GR أضعف التأثيرات المفيدة ل β-سيتوستيرول على فعالية DEX.

بشكل مجتمع، أظهرت هذه النتائج أن β-سيتوستيرول عزز فعالية DEX، ربما من خلال تنظيم العمليات المرتبطة ب GR، مما يعزز التأثيرات الوقائية ل DEX ضد إصابات الخلايا الطهارية الناتجة عن CSE.

توفر البيانات:

جميع البيانات الخام التي تدعم نتائج هذه الدراسة موفرة في المواد التكميلية (الملف التكميلي 1، الملف التكميلي 2).

الشكل 1: الدور الرئيسي ل β-سيتوستيرول في علاج مرض الانسداد الرئوي المزمن. (أ) المكونات الفعالة في زهرة Fritillaria cirrhosa D. Don، زهرة Lonicera japonica Thunb.، والجذر المجفف من Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. وAdenophora stricta Miq. تم فحصها عبر قاعدة بيانات TCMSP. (ب) الأهداف المحتملة ل β-سيتوستيرول. (ج) تحليل تقاطع الأهداف اللاحقة لمادة β-سيتوستيرول والجينات المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). (د) تحليل الالتحام الجزيئي بين β-سيتوستيرول وبروتين GR. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تورط المقاومة النسبية في الحماية المرتبطة ب β السيتوستيرول ضد إصابات الخلايا الناتجة عن CSE. (أ) التعديل المعتمد على التركيز للوسطاء الالتهابيين المحفزين ب CSE (TNF-α، IL-6) بواسطة β-سيتوستيرول. (ب)تأثيرات جرعة β-سيتوستيرول على مستوى ROS في الخلايا المعرضة ل CSE. (C) تأثيرات β-سيتوستيرول على محتوى MDA المعزز ب CSE. (د) تأثير β-سيتوستيرول على شيخوخة الخلايا المدفوعة ب CSE. (ه) تعديل p53 و p21 المرتبطين بالشيخوخة بواسطة β-سيتوستيرول تحت تحفيز CSE. (و) تنظيم تعبير GR المعتمد على تركيز β سيتوستيرول تحت تحفيز CSE. (G) بقاء الخلايا ل β-سيتوستيرول عبر تركيزات مختبرة في خلايا BEAS-2B. (ح)كشف RT-qPCR لتعبير mRNA GR للتحقق من كفاءة الإيقاف بعد نقل siRNA المستهدف من GR. (1) الارتباط التنظيمي بين GR و β-سيتوستيرول ضد العوامل الالتهابية الناتجة عن CSE. (J) الارتباط التنظيمي بين GR و β-سيتوستيرول مع تراكم ROS الناتج عن CSE. (ك) الارتباط التنظيمي بين النسبية النسبية النسبية و β-سيتوستيرول مع الشيخوخة الخلوية الناتجة عن CSE. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001; NS، غير مهم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تأثيرات β-سيتوستيرول مع DEX على وظيفة الرئة، والالتهاب، والإجهاد التأكسدي، وتعبير GR في فئران نموذج COPD. (أ) التغيرات في حجم الزفير القسري بمقدار 0.1 ثانية (FEV₀.₁) في فئران مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). (ب) تغيرات في السعة الحيوية القسرية (FVC) في فئران مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). (C) تأثيرات التدفق الذروي للزفير (PEF) في فئران مرض الانسداد الرئوي المزمن. (د)نسبة FEV₀.₁/FVC في فئران نموذج COPD. (ه) نسبة mRNA النسبية ل MMP-9/TIMP-1 تعكس إعادة تشكيل مجرى الهواء. (و) يشير التعبير النسبي عن mRNA ل MUC5AC إلى فرط إفراز المخاط في أنسجة رئة الفئران. (G) مستويات TNF-α وIL-6 في سائل غسل الشعب الهوائية (BALF). (ح)إنتاج ROS في أنسجة الرئة لدى فئران مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). (الأولى) التعبير النسبي عن mRNA ل GR في نسيج رئة الفئران. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تأثير β-سيتوستيرول على مقاومة DEX التي يوسطها GR في خلايا BEAS-2B المستحثة من CSE. (أ) التعبير النسبي للرنا الريبي للعوامل الالتهابية (TNF-α، IL-6) في كل مجموعة. (ب)مستوى ROS في كل مجموعة. (C)محتوى MDA في كل مجموعة تجريبية. (د) نسبة خلايا BEAS-2B المتقدمة في السن في كل مجموعة. (ه) مستويات mRNA النسبية لمؤشرات الشيخوخة p53 و p21. **p < 0.01; p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: تسلسلات البادئات المستخدمة لتحليل RT-qPCR. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: مجموعات بيانات تحليل إثراء GO وKEGG الكاملة لجينات β-سيتوستيرول المستهدفة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: النتائج الرقمية التفصيلية لتحليل فين الذي حدد الأهداف المتداخلة بين β-سيتوستيرول ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يفرض مرض الانسداد الرئوي المزمن عبئا عالميا كبيرا على الأمراض ولا يزال يشكل تحديا كبيرا للصحة العالمية¹. تشمل الإدارة الحالية لمرض الانسداد الرئوي المزمن التدخلات الدوائية وغير الدوائية⁴². من بين العلاجات الدوائية، تستخدم الجلوكوكورتيكوستيرويدات (GCs) على نطاق واسع في اضطرابات الالتهاب المزمنة. تعمل عن طريق الارتباط ب GR واستدعاء ديأسيتيلاز الهيستون 2 إلى مركبات نسخ لعكس أسيتلة الهيستون⁴³. ومع ذلك، أظهرت العديد من الدراسات انخفاض حساسية العقدي الرسميي لدى مرضى الانسداد الرئوي المزمن^44,45، وقدمت التحقيقات أدلة على مقاومة العقدي في هذا المرض⁴⁶. تشير هذه النتائج إلى أن التغلب على مقاومة العقدي الرومي يمثل تحديا سريريا كبيرا، مما يبرز الحاجة إلى عوامل علاجية جديدة. لذلك، فإن تحديد خيارات علاجية أكثر فعالية لمرض الانسداد الرئوي المزمن أمر بالغ الأهمية.

أظهرت دراسات سابقة أن γ-سيتوستيرول له تأثير مضاد للتكاثر على خلايا ظهارة الشعب الهوائية في مرض الانسداد الرئوي المزمن⁴⁷. نظرا لأن γ-سيتوستيرول β-سيتوستيرول هما مكونان حيويان شائعان في الفيتوستيرولات، فإن الدراسة الحالية توسع الفهم الحالي لتأثيرات الفيتوستيرول في مرض الانسداد الرئوي المزمن وتبرز القيمة الوقائية المحتملة ل β-سيتوستيرول في مسببات الأمراض. كشفت نتائجنا أن β-سيتوستيرول يثبط بشكل كبير إفراز العوامل الالتهابية، ويقلل من الإجهاد التأكسدي، ويثبط شيخوخة الخلايا. وهذا يتوافق مع التقارير السابقة التي أظهرت أن β-سيتوستيرول يثبط بشكل فعال زيادة تنظيم الوسطاء الالتهابيين الناتجين عن الدهون مثل IL-6، وإزياز أكسيد النيتريك المحفز، وTNF-α⁴⁸. تؤكد هذه النتائج نشاطه المضاد للالتهابات وتدعم اتساقه عبر نماذج الالتهاب المختلفة.

الخلايا العقدية المستنشقة هي عوامل فعالة مضادة للالتهابات للتحكم في التهاب مجرى التنفس. تعمل بشكل أساسي من خلال الربط وتفعيل GR⁴⁹. ومع ذلك، فإن السمة المرضية الرئيسية لمرض الانسداد الرئوي المزمن هي انخفاض حساسية الخلايا للتأثيرات المضادة للالتهابات للGCs⁴⁴. يعتبر انخفاض أو ضعف الوظائف في المقاومة المزمنة آلية رئيسية وراء تطور مقاومة العقدي في مرضى الانسداد الرئوي^{المزمن 50}. أظهرت دراسات سابقة أن بعض الأدوية يمكن أن تعزز حساسية الجلوس كولومي. على سبيل المثال، ينتج مزيج الأزيثروميسين والبوديزونيد تأثيرا مثبطا أكبر بكثير على إنتاج IL-4 وCXCL8 مقارنة بأي من العوامل بمفردهما⁵¹.

ومن الجدير بالذكر أن الدراسة الحالية وجدت أنه في كل من نماذج فئران مرض الانسداد الرئوي المزمن المعرضة للدخان والنماذج لخلايا BEAS-2B المستحثة من CSE، أنتج دمج β-سيتوستيرول مع DEX تأثيرات مثبطة أقوى بكثير على العوامل الالتهابية، والإجهاد التأكسدي، وشيخوخة الخلايا مقارنة ب DEX وحده. كما عزز هذا المزيج بشكل كبير فعالية DEX الوقائية ضد التغيرات المرضية المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن وإصابة الخلايا الظهارية في القصبات الهوائية في الفئران. تشير هذه النتيجة إلى أن β-سيتوستيرول قد يحسن حساسية خلايا ظهارة الشعب الهوائية لديكس الدماغي، مما يوفر نهجا جديدا لمعالجة عدم الحساسية أو المقاومة للGC لدى بعض مرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن. تماشيا مع نتائج PCR الكمي في المختبر ، يرفع β-سيتوستيرول مستويات mRNA GR بطريقة تعتمد على التركيز بدلا من أن يكون منبهضا أو مضادا مباشرا لعلاج GR. تؤكد الكفاءة المثبتة لإزالة ال si-GR والاختبارات اللاحقة لإنقاذ الوظائف أن β-سيتوستيرول يحسن استجابة GC الخلوي عن طريق زيادة مستويات GR الكلية داخل الخلية بدلا من تنشيط GR مباشرة، مما يولد تأثيرات علاجية محسنة عند دمجه مع DEX، وهو منبه GR القانوني. وبالتالي، قد ترتبط التغيرات في تعبير GR بتأثير β-سيتوستيرول، وهو ما يتوافق مع الملاحظات السابقة لانخفاض ملحوظ في GR ونظير GRα النشط في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء^{من مرضى COPD 52}. ومن المهم أن تجارب إزالة المقاومة النسبية العظمى كشفت أكثر عن الدور المركزي لهذا المستقبل في الحماية الخلوية التي تعبر عنها β السيتوستيرول، مما يشير إلى أن بعض الوظائف البيولوجية ل β-سيتوستيرول تعتمد على سلامة مسار المقاومة النسبية النسائية.

وبالنظر إلى الدراسة الحالية، لا تكشف فقط أن الطب التجميلي قد يكون وسيطا رئيسيا لتدخل β-سيتوستيرول في الانسداد الرئوي المزمن، بل يوفر أيضا نهجا جديدا محتملا لتجاوز التحدي السريري لمقاومة DEX، مما يضع أساسا تجريبيا لتطوير علاجات طبيعية مساعدة تستهدف مسار المقاومة المزمنة.

ومع ذلك، كان للدراسة الحالية عدة قيود. أولا، تم تقييم وظيفة الرئة فقط لتأكيد نجاح نموذج الفأر لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، ولم تجر صبغات الهيماتوكسيلين-إيوزين (HE) وماسون للتحقق من السمات المرضية النموذجية، بما في ذلك الانتفاخ الرئوي، وإعادة تشكيل مجرى الهواء، وفرط إفراز المخاط. وبما أن جميع عينات الرئة الثابتة تم استهلاكها خلال التجارب السابقة، لم يكن من الممكن إعادة بناء نموذج فأر مرض الانسداد الرئوي المزمن الناتج عن دخان السجائر خلال 12 أسبوعا ضمن فترة الدراسة المتاحة. ولمعالجة هذا القيد جزئيا، تم قياس نسبة MMP-9/TIMP-1 ومستويات تعبير mRNA في MUC5AC باستخدام عينات RNA محفوظة من الرئة. ثانيا، تم تقييم جرعة واحدة فقط من β-سيتوستيرول وDEX في الجسم الحي، ولم يتم التحقيق بشكل منهجي في التأثيرات التفاعلية مع الجرعة أو التآزر. من الضروري إجراء دراسات إضافية تتضمن تركيبات جرعات متعددة لتوصيف التفاعلات التآزرية المحتملة. ثالثا، بسبب القيود التجريبية وتكاليف البحث، تم تضمين ستة فئران فقط في كل مجموعة. قد يكون حجم العينة الصغير نسبيا قد زاد من قابليتها للتباين بين الحيوانات وقل من المتانة الإحصائية للنتائج. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية بأحجام عينات أكبر لمزيد من التحقق من صحة النتائج الحالية. رابعا، لم يتم تحديد خطوط خلايا مقاومة ل DEX مستقرة؛ لذلك، لم يكن بالإمكان تقييم قدرة β-سيتوستيرول على عكس مقاومة الجلوكوكورتيكويد المثبتة بشكل مباشر. هناك حاجة إلى دراسات إضافية باستخدام نماذج مقاومة للجلوكوكورتيكويد المثبتة لمزيد من التحقيق في هذه الآلية المحتملة.

في الختام، تشير هذه النتائج إلى أن إشارات GR قد تكون متورطة في التأثيرات الوقائية ل β-سيتوستيرول ضد الإصابة الناتجة عن CSE في خلايا BEAS-2B، بما في ذلك تثبيط إطلاق العوامل الالتهابية، والإجهاد التأكسدي، وشيخوخة الخلية، بالإضافة إلى تحسينات في وظائف الرئة ومؤشرات إصابات الرئة. علاوة على ذلك، عزز β-سيتوستيرول الحساسية العلاجية لهذه الخلايا للDEX. تحدد هذه النتائج مجتمعة β-سيتوستيرول كجزيء طبيعي محتمل قد يساهم في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, الصين	SC-0218	Human bronchial epithelial cell line for in vitro study
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, الصين	213	Animal model for COPD in vivo experiment
CB-DOCK2	الصين	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	for molecular docking simulation between ligand and receptor protein
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, الصين	C0038	Detection of cell viability and proliferation
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, الولايات المتحدة الأمريكية	C10851	Detection of cellular senescence
Cigarettes	Hongta, الصين	Not provided	Cigarette used for smoke exposure and CSE preparation
CTD	الولايات المتحدة الأمريكية	https://ctdbase.org/	for retrieving COPD-related genes
DCFH-DA fluorescent probe	Sigma-Aldrich, الولايات المتحدة الأمريكية	D6883-50MG	Detection of intracellular ROS level
Dexamethasone (DEX)	Yeasen, الصين	40323ES03	Glucocorticoid for combined intervention
DMEM/F12 medium	Gibco, الولايات المتحدة الأمريكية	11330032	Basal medium for BEAS-2B cell culture
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, الولايات المتحدة الأمريكية	10270106	Supplement for cell culture medium
GraphPad Prism	GraphPad Software, الولايات المتحدة الأمريكية	9.3.1	Data statistical analysis and graph drawing
Isoflurane	RWD Life Science, الصين	R510-22-10	Inhaled anesthetic for animal euthanasia
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, الصين	S0131S	Detection of intracellular malondialdehyde (MDA) content
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, الولايات المتحدة الأمريكية	11668030	Transfection reagent for siRNA delivery
Multimode microplate reader	Thermo Fisher, الولايات المتحدة الأمريكية	VL0000D0	Detection of absorbance and fluorescence value
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, الولايات المتحدة الأمريكية	B80912	Analysis of ROS and senescent cells
Penicillin/streptomycin	HyClone, الولايات المتحدة الأمريكية	SV30010	Antibiotics to prevent bacterial contamination
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, الولايات المتحدة الأمريكية	4367659	Fluorescent quantitative PCR amplification
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, اليابان	RR037Q	Reverse transcription for cDNA synthesis
PubChem database	الولايات المتحدة الأمريكية	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	for acquiring canonical SMILES sequence and downloading 3D SDF structural information of beta-sitosterol
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, الولايات المتحدة الأمريكية	4479889	Real-time RT-qPCR detection
RCSB PDB	الولايات المتحدة الأمريكية	https://www.rcsb.org/	to obtain GR crystal 3D structure file
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, الصين	R0018S	Total RNA extraction from cell and lung tissue
si-GR	Designed in silico via siDirect 2.1	Custom synthesis	Guide: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passenger: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown for GR
si-NC	Thermo Fisher, الولايات المتحدة الأمريكية	4390843	used as negative transfection control for cellular and in vivo assays
SwissTargetPrediction database	Switzerland	http://swisstargetprediction.ch/	for in silico prediction of potential drug-related protein targets
TCMSP database	الصين	https://www.tcmsp-e.com/	for herbal ingredient screening and target prediction
TTD	سنغافورة	https://db.idrblab.net/ttd/	for collection of validated COPD-associated disease genes
Whole-body smoke exposure chamber	Teague Enterprise, الولايات المتحدة الأمريكية	TE-2	Establishment of cigarette smoke-induced COPD model
β-sitosterol	ChemicalBook, الصين	83-46-5	Active phytosterol for drug treatment