بروتوكولات للتربية الفعالة والتحليل الوظيفي للدبور الطفيلي الداخلي Asobara japonica ومضيفه ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر

Summary

هدف هذا البروتوكول هو تسهيل التحليل الوظيفي لتفاعلات الطفيليات والمضيف في أسوبارا جابونيكا وذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. من خلال طرق تربية محسنة، واختبار عدوى بوضع بيضة واحدة، وإسقاط جيني بوساطة RNAi.

Abstract

الطفيليات هي تفاعل بيولوجي يستغل فيه كائن حي ما جسم أو موارد كائن آخر (المضيف)، مما يؤدي إلى أضرار كبيرة أو موت للمضيف. بين الحيوانات الطفيلية، تعتبر دبابير الطفيليات من أكثر السلالات غناء بالنوع، حيث تمثل ما يقرب من 20٪ من جميع أنواع الحشرات. على وجه الخصوص، تضع الدبابير الطفيلية الداخلية البيض مباشرة في أجسام المضيف وتنشر مجموعة متنوعة من عوامل السم للتلاعب بتطور المضيف والمناعة والفسيولوجيا. استجابة لهجوم الدبابير، يحاول المضيفون القضاء على بيض الطفيليات من خلال آليات مناعة فطرية. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية والخلوية التي من خلالها مكونات السم الفردية التي تعدل بيولوجيا المضيف وتعزز الطفيليات الناجحة غير مفهومة بشكل جيد. هنا، نصف بروتوكولا مخبريا موحدا لتربية دبور الطفيليات الداخلية Asobara japonica ومضيفه ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. تتوفر كل من السلالات العذرية الجينية والجنسية من A. japonica، وتظهر السلالة العذرية نسبة نجاح عالية في الطفيليات، مما يسمح بالحفاظ على مستقرة لمخزونات المختبر لتحليل الجينوم واختبارات الطفيليات. تم تحسين اختبار العدوى بوضع البيض الواحد وطريقة إزالة الجينات المعتمدة على RNA مزدوج السلسلة للتحليل الوظيفي لجينات السم. معا، توفر هذه البروتوكولات إطارا تجريبيا عمليا لتحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء تفاعلات الطفيليات والمضيف، وستسهل الأبحاث المستقبلية في علم الأحياء التطوري، والمناعة، وعلم وظائف الأعضاء.

Introduction

الطفيليات هي نمط حياة يستغل فيه كائن حي الموارد الغذائية لآخر ومنتشر بين الأنواع المختلفة. يقدر أن ما يصل إلى نصف الكائنات المعروفة تظهر طفيليات في دورة^{حياتها 1}. من بين الطفيليات، تعتبر الدبابير الطفيلية مجموعة متنوعة بشكل خاص، حيث تمثل حوالي 20٪ من جميع الحشرات². يستغلون مجموعة واسعة من مضيفي المفصليات، مثل الحشرات والعناكب والعث، ويظهرون تنوعا ملحوظا في تاريخ حياتهم واستراتيجياتهم الطفيلية³. تجعل هذه الخصائص الدبابير الطفيلية واحدة من أنجح مجموعات الحشرات تطوريا وبيئيا.

تمت دراسة التفاعلات بين الطفيليات ومضيفيها بشكل موسع كنماذج لأنظمة "سباقات التسلح" التطورية. على وجه الخصوص، تستخدم الدبابير الطفيلية مجموعة متنوعة من العوامل، بما في ذلك السموم، والفيروسات التعايشية، والخلايا التيراتوسيتية ^4,5. تؤثر هذه العوامل على فسيولوجيا وتطور المضيف، مما يضمن نجاح التطور داخل المضيف. على الرغم من هذه التقدمات، لا تزال الآليات الجزيئية التي تقوم عليها الطفيليات غير مفهومة جيدا في معظم أنواع الطفيليات. أحد القيود الرئيسية هو صغر حجم أجسامها، مما أعاق التعرف الكيميائي الحيوي على مكونات السم. بالإضافة إلى ذلك، من الناحية التقنية صعوبة في الحفاظ على الطفيليات ومضيفيها في مراحل تطورية متزامنة تحت ظروف المختبر.

التطورات الحديثة في التسلسل من الجيل القادم وتقنيات الأوميكس الأخرى تتيح الآن إجراء تحليلات شاملة للجينوم حتى في الأنواع الطفيلية الصغيرة جدا. فتحت هذه الأساليب آفاقا جديدة للتحقيق في آليات جزيئية لم تكن متاحة سابقا، مما سمح بدراسة تفاعلات الطفيليات والمضيف بدقة غير مسبوقة. في هذا السياق، يركز مختبرنا على نوع Asobara japonica Belokobylskij  (غشائيات الأجنحة: Braconidae)، وهو نوع تم تحديده أصلا في اليابان ^6,7,8. تشمل أ. جابونيكا سلالة ثيليتوكوس العذرية الوراثية، حيث تنجب الإناث ذرية دون تزاوج. تسمح لنا هذه الخاصية بجمع كميات كبيرة من الحمض النووي الجيني الموحد وراثيا لتسلسل الجينوم الكامل⁹. بالإضافة إلى ذلك، يتطفل هذا النوع على مجموعة واسعة من أنواع ذبابة الفاكهة، بما في ذلك الكائن النموذجي D. melanogaster،  الذي يقدم مزايا تجريبية كبيرة بسبب ظروف التربية الراسخة ومراحل النمو المحددة بدقة، مما يتيح إجراء اختبارات عدوى قابلة للتكرار والتحكم الدقيق في تطور الطفيليات¹⁰.

أثناء تطفل A. japonica، تقوم أنثى الدبور بحقن السم مع بيضة واحدة في يرقة ذبابة، حيث تنمو يرقة الدبور بجانب مضيفها. ومن الجدير بالذكر أن A. japonica يظهر معدل نجاح مرتفع في الطفيليات لدى D. melanogaster المضيف، مما يجعل هذا الزوج من الطفيليات والمضيف نموذجا تجريبيا قويا. هنا، نصف بروتوكولات التربية المستقرة، واختبار العدوى بوضع البيض الواحد، وطريقة إزالة الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) في A. japonica. توفر هذه البروتوكولات إطارا موثوقا لتحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء تفاعلات الطفيليات والمضيف.

Protocol

يتم عرض نظرة تخطيطية لطريقة التربية المتزامنة ل D. melanogaster و A. japonica في الشكل 1.

1. تربية ذبابة الفاكهة المضيفة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر في المختبر

1. حافظ على جميع الحيوانات التجريبية عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية بين 50-60٪ تحت دورة ضوء/ظلام 12:12 ساعة. استخدم السلالة البرية أوريغون-آر (أوريغون) كمضيف لألبوم أورغون-جابونيكا (الشكل 2A).
2. نقل الذباب البالغ إلى قارورة طعام جديدة تحتوي على وسط دقيق الذرة-الخميرة-الأجار القياسي (0.55٪ آجار، الجدول 1). ضع علامة على القارورة بتاريخ النقل واسم السلالة ب "OR".
3. تخلص من هذه الذباب البالغ بعد يوم واحد من النقل لمنع وجود عدد زائد من البيض في الطعام. تأكد من أن يرقات النسل تتغذى على سطح الطعام.
   ملاحظة: كإرشاد، حافظ على حوالي 200-250 بيضة لكل قارورة طعام (φ30×100 مم). قد تقلل كثافة البيض الأعلى من نجاح الطفيليات وتزيد من التنوع في تطور العائل والدبابير.
4. بعد أربعة أيام من الخطوة 1.2، انقل ملعقة من يرقات الذباب (بعد 4 أيام من وضع البيضة، dAEL) إلى قارورة طعام جديدة. حافظ على هذه اليرقات دون تعرض للطفيليات للجيل القادم. تساعد هذه العملية أيضا في التحكم في كثافة اليرقات المضيفة في القارورة.

2. تربية دبور الطفيليات الداخلية Asobara japonica في المختبر

1. استخدم سلالة التوالد العذري طوكيو (TK) وسلالة جنسية إيريموتي-جيما (IR) (الشكل 2B). الأولى تتكون من الإناث، بينما الثانية تتكون من الإناث والذكور. الذكور يقتربون من الإناث قبل يومين إلى أربعة أيام. لذا، تأكد من وجود الإناث بواسطة أجهزة وضع البيض قبل النقل.
2. انقل 10-20 دبارا بالغة مباشرة من القارورة الأصلية إلى القارورة التي تحتوي على يرقات الذباب عند 4 دلال (dAEL). ضع علامة على القارورة بتاريخ النقل واسم السلالة "TK" أو "IR". حافظ على الدبابير في نفس الظروف التي وضعها Step 1.1.
3. اسمح للدبابير البالغة بوضع البيض في يرقات الذباب. تخلص من هذه الدبابير بعد يوم إلى يومين لمنع الطفيليات الفائقة، التي قد تؤدي إلى موت المضيف. قم بإزالة الذباب البالغ المغلق الذي هرب من الطفيليات بعد 10 أيام أو أكثر من الخطوة 2.2.
4. بعد أسبوعين من الخطوة 2.2، تبدأ الدبابير البالغة في الاقتراب من غلاف عذراء ذبابة المضيف. انقل هذه الدبابير البالغة المغلقة حديثا إلى قارورة طعام جديدة تحتوي على ورق فلتر يحتوي على 25٪ جلوكوز ومحلول فيتامين C بسعة 50 ملم. يجب تعقيم قطع ورق الفلتر عند درجة حرارة 130 درجة مئوية لمدة ساعتين. توفير المحلول على ورق الترشيح يعزز سلوكيات وضع البيض ويطيل عمر الدبابير البالغة. استلهم نهجنا في استخدام فيتامين C لتعزيز وضع البيض من ملاحظات دراسات ذبابة الفاكهة ¹¹.

3. اختبار عدوى بوضع البيض الواحد

1. مزامنة مرحلة التطور ليرقات الذباب المستخدمة في تجربة العدوى.
   1. ضع الذباب البالغ في أنبوب بحجم 50 مل يحتوي على طبق عصير العنب (3٪ أجار) مفرد بمعجون الخميرة الطازج ودعه يضع البيض لمدة 24 ساعة.
   2. اجمع اليرقات من المرحلة الأولى حديثا على طبق عصير العنب وانقلها إلى قارورة صغيرة (12 مل) تحتوي على 2-3 جرام من معجون طعام الذباب (طعام ذبابة ممزوج بكمية مناسبة من الماء). يتم وضع 20-30 يرقة في القارورة. يسمح ليرقات الذباب بالنمو عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
2. في الوقت المناسب، جهز طبق بترى بقطر 4 سم يحتوي على طبقة رقيقة ومتساوية من معجون طعام الذباب تغطي مساحة قطرها حوالي 1.5-2.0 سم (ويشار إليها لاحقا بساحة اختبار العدوى). بالإضافة إلى ساحة اختبار العدوى، حضر قارورة صغيرة جديدة (12 مل) تحتوي على كمية مناسبة من معجون طعام الذباب. تستخدم هذه القارورة لتربية يرقات المضيف بعد اختبار العدوى.
3. اجمع اليرقات المرحلية ونقلها إلى طبق يحتوي على ماء منزوع الأيونات (المقاومة = 15 MΩ·cm، 25 °C). اشطف اليرقات في الطبق بحركة خفيفة لإزالة بقايا الطعام من أجسامها.
4. بعد الشطف، قم بإزالة الرطوبة الزائدة من اليرقات بلطف باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر، حيث أن الماء الزائد يتداخل مع سلوك وضع البيض للدبابير في منطقة فحص العدوى. ثم انقل اليرقات إلى الحلبة. تزيد هذه الخطوة من نشاط اليرقات أثناء تجربة العدوى.
5. تخدير الدبابير البالغة_{بغاز ثاني} أكسيد الكربون بمعدل تدفق 5 لتر·دقيقة ^وضغط 0.2 ميغاباسكال. ثم ضع بلطف حوالي ثلاث دبابير إناث في ساحة اختبار العدوى. أغلق غطاء الطبق ودعهم يتعافون على معجون طعام الذباب.
6. راقب سلوك وضع البيض لهذه الدبابير تحت المجهر المجسم (إعداد التكبير: 10× إلى 15×).
   ملاحظة: عندما تلمس الدبور جسم يرقة ذبابة متحركة، تدخل بسرعة جهاز وضع البيض في جسم الذبابة وحقن مكونات السم. على الرغم من أن يرقة الذبابة تتلوى وتتلوى بجسدها، إلا أنها تصاب بالشلل فورا. بعد ذلك، يهتز الدبور في بطنه ويودع بويضة في جسم يرقة المضيف، وبعدها يتم سحب المبيضة. يشار إلى هذا السلوك في وضع البيض بالعدوى.
7. بعد العدوى، افتح الغطاء وانقل يرقة الذبابة المصابة إلى القارورة الصغيرة الجديدة التي تحتوي على معجون طعام الذباب المحضر في الخطوة 3.2. لتوحيد توقيت العدوى، قم بإجراء تجربة العدوى خلال 15 دقيقة.
8. ضع علامة على القارورة الصغيرة بمعلومات تجريبية مثل التاريخ، اسم العينة، وقت العدوى، وعدد الأفراد. يتم سد هذه القوارير ثم وضعها في حاوية رطبة وتحفظ عند 25 درجة مئوية.

4. توليد دبابير تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) عن طريق حقن dsRNA

1. تخليق dsRNA بطول 400 قطعة قاعدة أو أكثر لإزالة الجين بوساطة dsRNA (تداخل RNA، RNAi) باستخدام نظام تخليق dsRNA قائم على النسخ الصناعي . يجب الحفاظ على عينات dsRNA عند -20 إلى -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. البروتوكولات التفصيلية كما ذكرت سابقا^{هي 9}.
2. حضر طبق بتري بحجم 5.5 سم يحتوي على 2٪ أجار لوضع أجسام الدبابير. املأ ثلثي كل طبق بالأجار لتكوين طبقة سميكة من صفيحة الأجار للحقن.
3. ضع مناديل ورقية خالية من الوبر مبللة بالماء على غطاء طبق بلاستيكي.
4. اجمع عذراء ذبابة المضيف بعد 7 أيام من العدوى (DPI) من القارورة وضعها على مناديل ورقية خالية من الوبر المحضرة في الخطوة 4.3. إضافة قطرة ماء إلى جدار القارورة يساعد في فصل عفويات عفارقة ذبابة المضيف عن القارورة.
5. تحت المجهر المجسم (إعداد التكبير: 20×)، أزل غطاء عذراء ذبابة المضيف وكشف جسم دبور باستخدام الملقط. عند 7 نقاط في البوصة، تكون معظم الدبابير في مرحلة العذراء، حيث يمكن تمييز أجزاء الرأس والصدر والبطن. جسم الدبور غير متحرك.
6. ضع أجسام الدبابير المستخرجة على لوحة الأجار المعدة في الخطوة 4.2، مع محاذاة محاور أجسامها في نفس الاتجاه. رتب 20-30 جسم دبور بحيث يكون جانبها الظهري مرفوعا في صف إلى صفين. أزل الرطوبة الزائدة من طبق الأجار باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر لمنع انزلاق الدبابير.
7. باتباع تعليمات الشركة المصنعة، قم بتركيب جهاز الحقن والميكروسكوب المجسمي (الشكل 3A). استخدم نظام حقن دقيق مزود بإبرة شعرية زجاجية تسمح بالتحكم الدقيق في حجم الحقن وسرعة الحقن. ضع صفيحة الأجار التي تكون رؤوس الدبابير موجهة فيها نحو طرف إبرة الحقن. حجم الحقن هو 50 نانولتر·^دبور-1 وسرعة الحقن 50 نانولتر·ثانية ^واحدة على الحقنة.
8. جهز إبر الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام أداة سحب الإبر. شكل الشعيرات الدموية الزجاجية قابل للتعديل حسب درجة حرارة السخان.
9. ضع الإبرة الشعرية الزجاجية على مطحنة الإبر بزاوية 30-35°. قم بطحن الإبرة حتى يصل طول الرأس إلى 0.04 مم (أربعة أقسام على مؤشر العدسة العينية، الشكل 3B).
10. قبل الحقن مباشرة، قم بإذابة dsRNA. تركيز dsRNA هو 0.25-1 ميكروغرام·^{ميكروليتر-1}. للتصور، يتم تلوين محلول dsRNA بصبغة زرقاء (ملح إريوغلاوسين ثنائي الصوديوم، 2٪ وزن·^حجم-1). باستخدام رأس ماصة التحميل الدقيق، املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول dsRNA بصبغة زرقاء. 4 ميكرولتر يكفي لحقن 30 جسم دبابير. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل المحلول.
    ملاحظة: بعد تحميل محلول dsRNA، اضغط بلطف على جانب الإبرة بظفر لإزالة أي فقاعات هواء محبوسة. يمكن أن تعيق فقاعات الهواء المتبقية تدفق المحلول وتعيق الحقن الناجح.
11. باستخدام حقنة بسعة 1 مل وإبرة، املأ الجزء غير المشغول من الشعيرات الدموية الزجاجية بزيت معدني، لضمان عدم بقاء فقاعات هواء داخل الشعيرات الدموية.
12. قم بتثبيت الإبرة الزجاجية الشعرية التي تحتوي على محلول dsRNA وزيت معدني على حامل الإبر ثم ثبتها على جهاز الحقن.
13. قم بضبط موضع لوحة الأجار وإبرة الشعيرات الدموية الزجاجية على الحقن، بحيث تكون الإبرة الزجاجية موضوعة بزاوية 30-45° بالنسبة لأجسام الدبابير (الشكل 3A).
14. أدخل الإبرة الزجاجية الشعرية في الجانب الظهري من جسم الدبور، مع الجانب الجانبي قليلا إلى الخط الأوسط الظهري. حقن محلول dsRNA داخل الجسم. محلول dsRNA المحقون مرئي بصبغة  زرقاء (الشكل 3C).
15. بعد الحقن، ضع صفائح الأجار في وعاء رطب (رطوبة نسبية 70-80٪) واحتفظ بها في حاضنة بدرجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة أسبوع حتى تقترب الدبابير البالغة. يجب إزالة أجسام الدبابير المصابة من صفيحة الأجار لمنع التلوث البكتيري.
    نقطة توقف: في الخطوة 4.6، يمكن إبقاء عذراء الدبور على صفيحة الأجار لعدة ساعات قبل الحقن. يمكن تحضير الإبر مسبقا (الخطوة 4.8 و4.9)؛ ومع ذلك، فهي عرضة للانسداد مع مرور الوقت. عادة ما توفر الإبر الطازجة أداء حقن أكثر موثوقية.

Results

السلالات اللاجنسية والجنسية في أسوبارا اليابانية
تنتشر أ. يابونيكا على نطاق واسع في جميع أنحاء اليابان. السلالات البارثينوجينية الثيليتوكوس سائدة في الجزر الرئيسية، بينما توجد سلالات جنسية مجهزة في الجزر شبه الاستوائية، بما في ذلك جزر أماني-أوشيما وإيريوموتي-جيما^8،12. في السلالات الجنسية، يخرج الذكور قبل الإناث ببضعة أيام، لذا يكون توقيت نقل البالغين مختلفا بين هذه السلالات. يتم تحفيز التوالد العذري الثليتوكوس في A. japonica نتيجة عدوى ببكتيريا وولباشيا، وهي بكتيريا تكافلية داخلية تنتقل عن طريق الأم¹³. يؤدي القضاء على وولباشيا بالعلاج بالمضادات الحيوية إلى إنتاج الذكور^9،14، وزرع الولباشيا في السلالات الجنسية يحفز التوالد العذري¹⁵. تظهر كل من السلالات اللاجنسية والجنسية من A. japonica نجاحا عاليا في الطفيليات عبر عدة أنواع من ذبابة الفاكهة . على سبيل المثال، يمكنها أن تتسبب في الطفيليات من D. suzukii، وهي آفة فاكهية مهمة اقتصاديا، وتعتبر عوامل محتملة للمكافحة البيولوجية في الزراعة¹⁶. من بين السلالات المتاحة، استخدمنا بشكل أساسي سلالة TK المصابة ب Wolbachia في تجاربنا. تظهر سلالة TK نشاطا طفيليا أعلى تجاه يرقات المضيف مقارنة بسلالة IR¹⁴، مما يجعلها مناسبة للتحليلات.

يعتمد نجاح الطفيليات على ظروف التربية
معدل نجاح الطفيليات لدى A. japonica عادة مرتفع، لكنه يتأثر بشدة بحالة تربية ذباب المضيف. في ظروف فقيرة بالعناصر الغذائية، تطول فترة نمو يرقات الذباب وتأخر توقيت التحول إلى البكاء¹⁷. في هذه الظروف، قد تفشل الدبابير في الاستفادة الصحيحة من موارد المضيف وعدم مزامنة تطورها مع مضيفاتها. لفحص هذا الاحتمال، قمنا بتربية الذباب والدبابير في ظروف الخميرة العادية (1×) وفقيرة بالخميرة (0.1×). ثم قمنا بتقييم نجاح الطفيليات وتوقيت النمو (الأشكال 2C، 2D). تم حساب نجاح الطفيليات كنسبة الدبابير البالغة الناتجة إلى يرقات المضيف.

في ظروف الخميرة الطبيعية، كان معدل نجاح الطفيليات 81.7٪ في اختبار العدوى بوضع البيض الواحد (الشكل 2C، على اليسار؛ الجدول 2). عندما انخفض محتوى الخميرة إلى 10٪ (في حالة فقيرة بالخميرة)، انخفض معدل نجاح الطفيليات إلى 35.0٪ (الشكل 2C، يمين؛ الجدول 2). قد يفسر هذا الانخفاض بحقيقة أن حوالي 50٪ من يرقات المضيف ماتت بعد العدوى. تشير هذه النتائج إلى أن تخصيص الموارد بين المضيف والطفيلي يتأثر في ظروف فقيرة بالعناصر الغذائية.

ومن الجدير بالذكر أن توقيت إخراج الدبابير لم يتأخر بنفس القدر في ظروف الخميرة الفقيرة كما هو الحال في ظروف الخميرة العادية. بينما تأخر توقيت إكثار الذباب حتى 9 أيام، تأخر توقيت إكثار الدبابير فقط حتى 4-5 أيام. تشير هذه النتيجة إلى أن توفر العناصر الغذائية يؤثر بشكل أساسي على تطور المضيف. توقيت الإخراج ثابت في كل من الذباب والدبابير تحت ظروف الخميرة الطبيعية، لكنه ليس في ظروف فقيرة بالخميرة، مما يشير إلى أن التطور المتزامن بين الطفيليات والمضيفين يعتمد على توفر العناصر الغذائية.

النهج القائم على RNAi للتحليل الوظيفي لجينات السم
على الرغم من أن التحليلات النمطية والبروتيومية لغدة السم تحدد العديد من الجزيئات المرشحة، إلا أنه لا يزال من غير الواضح أي منها ضروري لنجاح الطفيليات. لتحديد الأدوار الفسيولوجية لهذه الجزيئات المرشحة، هناك حاجة إلى تحليلات وظيفية في الجسم الحي باستخدام طرق إزالة الجينات.

أبلغنا مؤخرا أن طفيليات A. japonica تسبب الاستماتة المبرمجة، والتهام الذاتي، وتوقف الانقسام في الأقراص التخيلية لرقاة D. melanogaster، مما يؤدي إلى تدهور شديد للأنسجة، وهي ظاهرة تسمى تحلل القرص التخيلي (IDD)¹⁰. لتحديد الجزيئات المسؤولة عن IDD، أجرينا فحص RNAi للجينات المرشحة التي تم تحديدها من خلال التحليل الجينومي النصي، والبروتيمي، والمقارن. ونتيجة لذلك، تم تحديد جينين، عامل تحلل القرص التخيلي (IDDF-1) وعامل IDDF-2. كل من IDDF-1 و IDDF-2 يحتويان على دالة المجال المجهول 4803 (DUF4803). ومن الجدير بالذكر أنه بعد تقريرنا الأولي، حددت دراسة مستقلة عدة بروتينات سم من A. japonica (تسمى تحلل السم الناجم عن السم، VID) مرتبطة ب IDD، وجميعها تحمل أيضا المجال DUF4803¹⁸.

استنادا إلى هذه النتائج، قمنا بتحسين بروتوكول RNAi بشكل أكبر لتحسين قابلية التكرار والكفاءة. على وجه الخصوص، مكن استخدام Nanoject III من التحكم الدقيق في حجم الحقن وسرعته، مما أدى إلى نتائج إسقاط أكثر اتساقا.

لتقييم كفاءة بروتوكول RNAi المحسن، قمنا بإلغاء تقييم IDDF-1. في الدبابير البالغة المغلقة، انخفض مستوى تعبير IDDF-1 بشكل ملحوظ مقارنة بالضبط (الشكل 3D). للتحقق الوظيفي، أجرينا اختبارات عدوى بوضعية البيض الواحد باستخدام هذه الدبابير RNAi ويرقات الذباب المضيف التي تعبر عن تقرير الاستماتة GC3Ai في منطقة حقيبة الجناح¹⁹. تم اكتشاف إشارة GC3Ai في حقيبة الجناح بعد الإصابة بالدبابير الضابطة (GFP RNAi). على النقيض من ذلك، انخفضت إشارة GC3Ai بشكل كبير بعد الإصابة بدبابير IDDF-1 RNAi (الشكل 3E، 3F). تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة، مما يؤكد أن وظيفة IDDF-1 يتم قمعها فعليا بواسطة RNAi.

الشكل 1. نظرة عامة تخطيطية لإجراءات التربية لدى D. melanogaster و A. japonica. 
تظهر الإجراءات خطوة بخطوة وفقا لمراحل النمو لديكروموكسيا ميلانوغاستر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. الطفيليات بواسطة أسوبارا يابونيكا. (أ) مخطط للعلاقة التطورية بين دي. ميلانوغاستر وطفيليته أ. جابونيكا. تضع أنثى الدبور سموما وبيضة واحدة في يرقة ذبابة. بعد الفقس، تتطور يرقة الدبور بالتوازي مع يرقة المضيف، والتي تتحول لاحقا إلى عذراء. بعد التبث، يلتهم الدبور جسم الذبابة بالكامل وفي النهاية ينفصل عن غلاف عذراء الذبابة. (ب) الدبابير البالغة من السلالة اللاجنسية (اليسار) والسلالة الجنسية (اليمنى) من A. japonica. شريط الميزة، 1 مم. (C) معدل ظهور الذباب أو الدبابير في الظروف العادية (1×) وظروف فقيرة بالخميرة (0.1×). أجريت اختبارات عدوى بوضع البيض الواحد باستخدام يرقات ذبابة المضيف بعد 4 أيام من وضع البيض (dAEL). n = 267 (1×، ذباب)، 120 (0.1×، ذباب)، 85 (1×، دبابير)، و80 (0.1×، دبابير)، على التوالي. (د) توقيت إخراج الذباب والدبابير تحت الشرطين الغذائيين الموضحين في (ج). يتم تحديد نسبة البالغين إلى الشرنقي. n = 250، 107، 61، و41 على التوالي. يشير السهم الأسود إلى توقيت إصابة الدبور. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. إجراء RNAi المحسن باستخدام Nanoject III. (أ) إعداد جهاز الحقن الدقيق تحت المجهر المجسم. تم وضع إبرة الشعيرات الدموية الزجاجية بزاوية تتراوح بين 30-45° بالنسبة للوحة الأجار. (ب) تم شحذ طرف إبرة الزجاج الشعري باستخدام مطحنة الإبر. (ج) تم حقن محلول مصبوغ باللون الأزرق في جسم الدبور باستخدام إبرة شعرية زجاجية. الجانب الأمامي للدبور مشار إليه بحرف A في الصورة. P، خلفي. شريط مقياس، 1 مم. (D) تم قياس مستويات التعبير ل IDDF-1 في دبابير RNAi GFP و IDDF-1 RNAi باستخدام طريقة دلتا-دلتا C_t . تم تطبيع مستويات التعبير إلى RpL32-Aj. تمثل البيانات متوسط ± SD مع نقاط بيانات فردية (n = 5). P < 0.005 (اختبار t للطالب). (E و F) إشارات GC3Ai في أقراص الأجنحة لليرقات واليرقات المضيفة غير المصابة بعد 6 ساعات من العدوى (hpi) بعد الإصابة بالدبابير الضابطة (GFP RNAi)  أو IDDF-1 RNAi. تحدد أقراص الأجنحة بخطوط بيضاء منقطة بناء على تلوين DAPI للنوى (1:10000، 62247؛ ثيرمو فيشر ساينتيفيك). تم قياس نسبة المساحة الإيجابية ل GC3Ai إلى مساحة حقيبة الجناح. P < 0.005 (تحليل التنفس السريع أحادي الاتجاه يتبعه اختبار المقارنات المتعددة لتوكي). n = 11 نسخة بيولوجية لكل مجموعة. شريط القياس، 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المكونات	المبلغ
الماء	1 لتر
أغار	5.5 جرام
الخميرة	40 جرام
دقيق الذرة	90 جرام
الجلوكوز	100 جرام
حمض البروبيونيك	3 مل
10٪ بيوتيل بي-هيدروكسي بنزوات في 70٪ EtOH	3.5 مل

الجدول 1: مكونات وسط دقيق الذرة-الخميرة-الأجار القياسي (طعام الذباب).

نوع الطعام	الحالة	# من إجمالي الأفراد	# من الأفراد المغلقين أو الموتى				معدل ظهور الذباب أو الدبابير (٪)
			طر	دبور	العذراء القاتل	اليرقات قاتلة
1×	غير مصاب	267	248	0	2	17	92.88389513
	ملوثة ب A. japonica	120	0	98	9	13	81.66666667
0.1×	غير مصاب	85	38	0	23	24	44.70588235
	ملوثة ب A. japonica	80	0	28	13	39	35

الجدول 2: عدد الأفراد ومعدلات الظهور في الظروف الطبيعية (1x) وفقيرة بالخميرة (0.1x).

اسم البداية	التسلسل (5'>3')	الغرض
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	استنساخ CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	استنساخ CDS، قالب dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	غاغتاغ	قالب dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	قالب dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTACTATAGGGAG غاغاججكاجتاج	قالب dsRNA
※ تم الإبلاغ عن هذه البادئات وقوالب dsRNA في كامياما وآخرين. 2022.
※ gene007424 يرمز إلى IDDF-1.

الجدول 3: تسلسلات البادئات وقوالب dsRNA المستخدمة في هذه الدراسة.

Discussion

في هذه الدراسة، أنشأنا منصة تجريبية متعددة الاستخدامات للتحقيق في تفاعلات الطفيليات والمضيف على المستوى الجزيئي. من خلال تحسين ظروف التربية، واختبار العدوى بوضع البيض الواحد، وبروتوكول RNAi، نوفر نظاما قويا للدراسات الوظيفية للعوامل المشتقة من الطفيليات. ستسهل هذه المنصة دراسات مستقبلية تهدف إلى كشف الآليات التي تتلاعب بها الدبابير الطفيلية بتطور العائل، وقد تساهم أيضا في تطوير استراتيجيات مكافحة آفات بيولوجية.

توفر سلالة Tk المصابة ب Wolbachia من A. japonica نظاما تجريبيا قابلا للتكرار لتحليل الطفيليات. في العديد من دراسات المضيف الطفيلي، غالبا ما تكون النتائج التجريبية متغيرة، حيث يعتمد بقاء المضيف ونجاح الطفيليات بشكل حساس على الظروف البيئية والفسيولوجية. في المقابل، يظهر سلالة TK نجاحا عاليا باستمرار في الطفيليات، مما يخلق حالة "سيطرة الطفيليات" حيث تكون نتيجة العدوى متجانسة إلى حد كبير. علاوة على ذلك، كسلالة تماثيل عذرية، تقلل من التنوع التجريبي بين الأفراد بسبب خلفيتها الجينية الموحدة. تمكن هذه القابلية للتكرار من تتبع عملية الطفيليات بشكل موثوق وتسهل التحليلات الكمية لاستجابات المضيف والعوامل المشتقة من الطفيليات.

بالإضافة إلى ذلك، يسهل التكاثر الثيليتوكوس بشكل كبير التحليلات الجينومية من خلال تمكين توليد حمض نووي جينومي متجانس للغاية، وهو أمر حاسم لتجميع الجينوم عالي الجودة⁹. بينما لا تتوفر مثل هذه السلالات العذرية في جميع أنواع الطفيليات، تبرز نتائجنا إمكانات الثيليتوكي المستحث بواسطة وولباشيا كاستراتيجية لتحسين الموارد الجينومية. لذا فإن إنشاء خطوط مصابة بالولباشيا في أنواع طفيليات أخرى قد يكون نهجا قويا لتوسيع الموارد الجينومية وتسريع الدراسات الجزيئية المقارنة عبر الطفيليات.

تتأثر نتائج الطفيليات بشكل كبير بالظروف الغذائية للمضيف، مما يشير إلى أن ظروف التربية هي عامل حاسم لنجاح الطفيليات. نظرا لأن الطفيليات الناجحة تعتمد على التنسيق الزمني الدقيق مع نمو المضيف والدبابير، فمن المرجح أن تؤثر الظروف الغذائية غير المنضبطة على هذه العملية وتقلل من قابلية التكاثر. لذلك، فإن توحيد شروط تربية المضيف بعناية أمر ضروري لإنشاء نظام تجريبي موثوق لدراسة التفاعلات بين الطفيليات والمضيف. علاوة على ذلك، يجب الحفاظ على قوارير المخزن الذبابي بشكل منفصل عن قوارير مخزون الدبابير، حيث يقلل وجود الدبابير من سلوكيات وضع البيض لدى الذباب^.

لتمكين التقييم الكمي لتفاعلات الطفيليات مع المضيف، قمنا بابتكار اختبار عدوى بوضع البيض الواحد حيث يتم وضع بويضة واحدة في كل مضيف. يختلف هذا الاختبار عن اختبارات العدوى الجماعية التقليدية، التي غالبا ما تتضمن أحداث وضع البيض متعددة تؤدي إلى تلف مفرط للمضيف والوفاة. لتعزيز تفعيل البيض بكفاءة خلال نافذة زمنية محدودة (~15 دقيقة)، تم تكييف الدبور البالغين حديثا بمحلول جلوكوز وفيتامين C، مما حسن كفاءة وضع البيض وقابلية التكاثر بشكل عام.

علاوة على ذلك، قمنا بتحسين بروتوكول RNAi لتحليل وظائف الجينات في الدبابير الطفيلية. باستخدام نظام الحقن الدقيق، حققنا تحكما دقيقا في حجم الحقن وحسننا ثبات كفاءة الضرب. أكد التحقق الوظيفي باستخدام IDDF-1 أن هذه الطريقة تقمع التعبير الجيني بشكل فعال وتنتج نتائج ظاهرية قابلة للتكرار. نظرا لأن الدراسات النبتية والبروتيومية تواصل تحديد أعداد كبيرة من عوامل السم المرشحة، فإن توفر منصة فحص وظيفية سيكون ضروريا لتحديد أدوارها البيولوجية.

من قيود هذا البروتوكول RNAi أنه غير مناسب لتحليل الجينات التي تعمل خلال المراحل المبكرة من تطور الدبور، حيث يمثل تحديا تقنيا حقن dsRNA في بيض الدبابير الموجودة داخل أجسام المضيف. لتجاوز ذلك، قد يوفر إنشاء نظام تربية خارج الجسم الحي ، نهجا مفيدا²². بدلا من ذلك، قد توفر طرق إزالة الجينات باستخدام نظام الوالدين المباشر (DIPA)-CRISPR استراتيجية تكميلية، حيث يتم حقن الكواشف في الإناث البالغات لإنتاج نسل معدل جينوم²³. في الواقع، نجح هذا النهج في إنتاج أفراد جينيين في الطفيلي الخارجي للعذراء Nasonia vitripennis عن طريق حقن المواد الكيميائية في الإناث البالغات أو الأفراد في المرحلة المتأخرة من العذراء²⁴. وبالاشتراك مع طريقتنا المعتمدة على تحليل الجينات المعتمدة على RNAi، ستسهل هذه الأساليب تحليلات أكثر شمولا لوظائف الجينات المشاركة في عملية الطفيليات.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	اختبار العدوى
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	حقن dsRNA
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	تربية
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	اختبار العدوى
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	حقن dsRNA
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	حقن dsRNA
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	تربية
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	اختبار العدوى
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	تحليل الصورة
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	تربية
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	تلطيخ النواة، 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	اختبار العدوى
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	حقن dsRNA
Fiji	NA	https://fiji.sc	تحليل الصورة
Filter paper	Advantec	ITEM 526	تربية
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	تربية
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	تربية
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	تشريح
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	تخزين العينات
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	تخزين العينات
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	اختبار العدوى
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	تربية
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	تخليق dsRNA
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	تربية
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	تخليق dsRNA
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	حقن dsRNA
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	حقن dsRNA
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	حقن dsRNA
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	حقن dsRNA
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	تخليق dsRNA
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	تخليق dsRNA
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	تخليق dsRNA
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	تربية
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	اختبار العدوى، حقن dsRNA.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	اختبار العدوى
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	اختبار العدوى
Spatula	As One Corporation	6-522-02	تربية
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	حقن dsRNA
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	اختبار العدوى
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	حقن dsRNA
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	تخليق dsRNA
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	تخليق dsRNA، qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	تربية
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	اختبار العدوى
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	تربية