مقالة منهجية

الحفاظ على تعقيد الأنسجة In Vivo في نموذج للجهاز العصبي الشمي للفئران باستخدام تحليل العينة الكاملة لدراسة التجديد العصبي

DOI:

10.3791/72036

⸱

أغسطس 18, 2026

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول سير عمل كاملاً للحفاظ على التعقيد التشريحي للجهاز العصبي الشمي لدى الفئران. لقد فصلنا هنا سير العمل الكامل، بما في ذلك التشريح، وتحضير الأنسجة، والتصوير. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الجهاز الشمي في الظروف الطبيعية أو غير الطبيعية، بما في ذلك ظروف الإصلاح الطبيعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عصر التصوير ثلاثي الأبعاد (3D)، أصبح من المعروف أن الكيمياء النسيجية المناعية القياسية محدودة للغاية في دراسات علم الأمراض والتشريح البشري المعقد. فمن خلال تحليل شرائح ضيقة فقط، قد تفقد الهياكل الأكبر والجوانب الأساسية لبنية الأنسجة تفاصيل سياقية حاسمة، مما يؤدي إلى تفسيرات ناقصة أو مضللة. وبينما دعمت المقاطع ثنائية الأبعاد (2D) الفهم الأساسي للبنية النسيجية، إلا أنها غير كافية لالتقاط الواقع ثلاثي الأبعاد الحقيقي للأنسجة البيولوجية.

تعتمد أعداد متزايدة من الدراسات في مناطق تشريحية متعددة حالياً تقنيات تعزل وحدات تشريحية سليمة - مثل التحضيرات المسطحة (flat mount)، أو التحضيرات الكاملة (whole-mount)، أو تحضيرات الوجه (en face) - مقترنة بالمجهر الفلوري عالي الدقة. وتوفر هذه المنهجيات تصوراً وتفسيراً أكثر شمولاً للتنظيم البنيوي. ويكتسب هذا أهمية خاصة في الجهاز العصبي الشمي، حيث يتطلب تحديد الآليات الخلوية المعقدة الكامنة وراء قدرته المذهلة على التجدد سياقاً يشمل كامل السُمك. إذ تنطوي المقاطع الرقيقة على مخاطرة فقدان سمات مرضية فسيولوجية رئيسية لا تزال غير محددة بدقة.

نظرًا لهذه القيود والفجوة المعرفية المحيطة بالتفاعلات الخلوية التي تحفز تجديد الشم، كان من الضروري تطوير تقنية دقيقة للتحضير الكامل (whole-mount) قادرة على الحفاظ على تعقيد الأنسجة بكامل سمكها. تم عزل أغشية مخاطية شمية كاملة كعينات ذات سمك كامل، مصحوبة ببروتوكول مُحسَّن لنفاذية الأجسام المضادة. وقد أتاح التصوير عالي الدقة (EVIDENT SpinSR) وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد تصورًا دقيقًا للتفاعلات الخلوية in vivo.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل الجهاز العصبي الشمي (ONS) نموذجاً فريداً ورصيناً لدراسة آليات التجدد العصبي، حيث يحتفظ بالقدرة الفريدة على تجديد الخلايا العصبية طوال الحياة1. ومع ذلك، لا تزال إمكانية التطبيق السريري لهذه القدرة على الإصلاح العصبي محدودة بسبب وجود فجوات كبيرة في فهمنا لسلوكيات الخلايا في الجهاز الشمي2,3,4. وقد وُصفت الاستجابات الخلوية والتنظيم التشريحي للجهاز العصبي الشمي، بما في ذلك الخلايا العصبية الشمية الأولية، والخلايا الغمدية الشمية (OECs)، والأرومات الليفية حول العصبية، في العديد من الدراسات الحيوانية التي اعتمدت على تقطيع الأنسجة إلى شرائح رقيقة جداً (<2 µm) مقترنة بنماذج إصابة جسدية شديدة طُبقت على الجهاز العصبي الشمي للقوارض1,2. وعادة ما كانت الحيوانات في هذه الدراسات تُقاد إلى القتل الرحيم بعد 10 أيام من الإصابة، مما وفر نافذة زمنية ضيقة تقتصر على لحظة محددة واحدة من عملية إعادة التشكيل الواسعة والأكثر تعقيداً لهذه الأنسجة أثناء الإصابة العصبية2. وقد أفادت هذه الدراسات بأن الخلايا الغمدية الشمية والأرومات الليفية تظل موجودة كقنوات مستمرة بعد موت المحاور العصبية عقب الإصابة.

على الرغم من كونه مفيداً، إلا أن النهج المستخدم قد قدم نظرة عامة مفاهيمية منخفضة الدقة وعلى مستوى سطحي للعصب الشمي (ONS)، وذلك بسبب العديد من القيود الموضحة أعلاه، مما حال في النهاية دون إجراء تقييم شامل للتنظيم الخلوي الحقيقي داخل العصب الشمي السليم3. ونتيجة لذلك، قد تكون بعض العلاقات المكانية الحرجة قد أغفلت.

يعد الحفاظ على بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد أمراً ضرورياً لإجراء تحليل تشريحي وخلوي دقيق، وقد تم تطبيق ذلك بنجاح عبر العديد من الأعضاء والأمراض4,5,6,7,8,9,10,11,12. وقد استُخدمت منهجيات التحضير الكامل (Whole-mount) لرسم خريطة للتنظيم العصبي داخل المخاطية الشمية13,14، ومع ذلك، لم يتم بعد تصوير التفاعلات الخلوية مع بنية ONS كاملة السماكة، بما في ذلك الصفيحة المخصوصة المحفوظة.

نؤسس في هذه الدراسة سير عمل باستخدام نموذج فأر يتضمن معالجة الأنسجة كاملة التركيب، والصبغ المناعي، والتصوير عالي الدقة، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، مما يتيح تحليلاً مفصلاً لبنية ONS. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لسد الفجوة في الطرق المنشورة حالياً، حيث يعمل البروتوكول على حفظ وصون مخاطية شمية كاملة السمك، بما في ذلك الصفيحة المخصوصة، مما يسمح بدراسة التفاعلات بين الخلايا. والجدير بالذكر أن منهجية جمع ومعالجة الأنسجة المطورة هذه يمكن تطبيقها ودمجها مع نماذج مختلفة للجهاز الشمي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أُجريت جميع التجارب التي تضمنت حيوانات وخلايا معدلة وراثياً بموافقة لجنة السلامة الحيوية بجامعة Griffith (NLRD/003/2020_var3) ولجنة أخلاقيات التعامل مع الحيوان بجامعة Griffith (MHIQ/04/23/AEC)، وذلك وفقاً لإرشادات مكتب تنظيم تكنولوجيا الجينات في الكومنولث الأسترالي (OGTR).

ملاحظة: تم استخدام ما مجموعه 15 فأراً مختبرياً بالغاً (8-9 أسابيع) من كلا الجنسين في هذه الدراسة. وتحديداً، فئران S100β-DsRed المعدلة وراثياً والتي تعبر فيها جميع خلايا OECs عن البروتين الأحمر الساطع DsRed تحت تحكم محفز S100β. يُعد S100β جزءاً من عائلة أوسع من البروتينات الرابطة للكالسيوم، ويتم التعبير عنه عادةً في الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي، مثل خلايا OECs. كان هذا النموذج مثالياً لأغراض هذه التجارب، حيث سمح بتحديد مواقع مجموعات الخلايا المستهدفة بسهولة باستخدام إشارات الفلورة الداخلية. وقد تم إنتاج فئران S100β-DsRed المعدلة وراثياً سابقاً، وأظهرت النتائج أن استخدام هذه الفئران المعدلة وراثياً يوفر كشفاً محسناً لخلايا OECs مقارنة بالكيمياء النسيجية المناعية لتحليلات الأنسجة المثبتة15,16,17,18.

1. تجميع الرؤوس وتثبيت الأنسجة

  1. يتم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق استنشاق CO2 المتصاعد في النقاط الزمنية التجريبية.
  2. يجب التأكد من حدوث الوفاة من خلال غياب منعكسات سحب القرنية والقدم، يليه خلع الفقرات العنقية، أو وفقاً لإجراء التشغيل القياسي (SOP) المعتمد.
  3. تتم إزالة الرأس والفكين بالكامل باستخدام المقص.
  4. تتم إزالة الجلد من الجمجمة وإزالة الغضروف الموجود عند طرف الأنف للكشف عن التجويف الأنفي وضمان التغلغل الفعال لعامل التثبيت.
    ملاحظة: لوحظ أن هذه الخطوة المتمثلة في قطع الجزء الأمامي من غضروف أنف الحيوان كانت حاسمة للسماح بالتثبيت الصحيح للأنسجة داخل التجويف الأنفي.
  5. تُشطف الرؤوس سريعاً في PBS 1× لإزالة الدم الزائد.
  6. يتم تثبيت الأنسجة عن طريق الغمر طوال الليل (12–18 h) في 4% paraformaldehyde، لمدة 6 h على الأقل (وقت كافٍ لتثبيت الأنسجة المستهدفة) عند 4 °C على جهاز تدوير (roller).
    تنبيه: الـ paraformaldehyde مادة كيميائية خطرة تطلق أبخرة الفورمالدهيد. وهي مادة سامة عن طريق الاستنشاق، وملامسة الجلد، والبلع؛ وتسبب تهيجاً في العين والجلد والجهاز التنفسي؛ ويُشتبه في كونها مادة مسرطنة. يجب التعامل معها فقط داخل خزانة أبخرة (fume hood) مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، وواقي العينين. يجب التخلص الآمن من المواد الكيميائية الخطرة والنفايات البيولوجية الناتجة خلال البروتوكول وفقاً للوائح المؤسسية والمحلية.
    ​ملاحظة: أثناء عمليات التحسين، لاحظنا أن 6 h كانت كافية لتثبيت الأنسجة المستهدفة؛ ومع ذلك، فإن تجاوز 12 h من المرجح أن يؤدي إلى فرط التثبيت وتدهور البنى المخاطية.
  7. تُنزع الرؤوس من عامل التثبيت وتُغسل لمدة 3 h في PBS 1× في درجة حرارة الغرفة (20–25 °C) على جهاز تدوير.
  8. تُحفظ الرؤوس في PBS طازج عند 4 °C ويتم جمع أنسجة الغشاء المخاطي كاملة (whole-mount) في غضون 48 h.

2. جمع عينات الأنسجة كاملة

  1. قم بعزل الأنسجة تحت المجهر.
  2. اقطع الرؤوس إلى نصفين باستخدام المشرط، مع اتباع الخط الناصف السهمي.
  3. اكشف الجزء الداخلي من التجويف الأنفي (الشكل 1). حدد المناطق التشريحية واجمع النسيج المخاطي المبطن للقسم التشريحي بأكمله (الشكل 1B).
  4. باستخدام قاطعة عظام، قم بكسير وإزالة عظم الحاجز برفق، والذي يغطي جزءاً من التجويف المخاطي.
    ملاحظة: انظر الشكل 2A؛ هذه الخطوة حاسمة للكشف عن التجويف المقعر الموجود تحت العظم حيث تمر حزم المحاور العصبية عبر الجدار الظهري (الشكل 1B).
  5. بمجرد الكشف عن هذه المنطقة، استخدم ملاقط منحنية لفصل وغرف النسيج برفق من الجدار الظهري المقعر. ارفع النسيج عن العظم الموجود تحته وقشر الغشاء المخاطي الشمي المتبقي برفق لجمع تحضير كامل غير مقطع وسليم.
    ملاحظة: تطلب الأمر حذراً شديداً في هذه المرحلة لتجنب تمزق النسيج.
  6. اجمع النسيج المطلوب من كل من المنخرين الأيمن والأيسر: يغطي الغشاء المخاطي الحاجز، والجدران الظهرية اليسرى واليمنى، والصفيحة المصفوية للتجويف الأنفي (الشكل 1A، B). اجمع النسيج من كلا المنخرين، بما في ذلك الحاجز والجدران الظهرية والصفيحة المصفوية، لعزل المنطقة التشريحية التي تحتوي على الهياكل الشمية الأولية (الشكل 2C).
  7. اغسل الأنسجة المجمعة في PBS 1× وأزل أي أنسجة غير مرغوب فيها، بما في ذلك شظايا العظام. خزن الأنسجة في درجة حرارة 4 °C في PBS 1× من أجل تحليل كيمياء نسيجية مناعية لاحق.
    ملاحظة: إذا كانت الأنسجة ستخضع للتخزين طويل الأمد، يُنصح بتخزينها في محلول من PBS 1× و 0.001% (W/V) Sodium Azide، في درجة حرارة 4 °C.

3. بروتوكول الصبغ المُحسَّن

ملاحظة: عادةً ما يتم تحسين بروتوكولات الصبغ الشائعة للاستخدام في المقاطع ذات السماكة الرقيقة إلى المتوسطة (على سبيل المثال، حتى 50 µm). لذا، كان من الضروري تكييف البروتوكول ليتناسب مع الأنسجة الأكثر سماكة بكثير.
​لوحظ أن الخطوة الحاسمة تتمثل في إبقاء النسيج عائماً داخل أنابيب Eppendorf طوال عملية الصبغ، ووضع الأنابيب على جهاز تدوير (roller) أثناء تغلغل الكواشف. وبناءً على ذلك، لم يتم تنفيذ خطوات الصبغ والنسيج موضوع على شريحة تصوير، بل صُبغ النسيج أولاً أثناء تعويمه، ثم ثُبت لاحقاً على شرائح التصوير. وقد ضمنت هذه التفاصيل عدم انطواء النسيج، وقدرة الكواشف والأجسام المضادة على التغلغل في المنطقة بأكملها.

  1. أخرج الأنسجة من وحدة التخزين وضعها في أنبوب Eppendorf يحتوي على محلول الحجب (يعتمد نوع المحلول المستخدم على نوع الصبغ).
    ​ملاحظة: محلول الحجب: 3% BSA و0.3% Triton X-100 في PBS. وكان هناك تعديل هام آخر وهو الوقت الذي تعرضت فيه الأنسجة لكل كاشف ومزيج أجسام مضادة.
  2. احتفظ بالأنسجة في محلول الحجب لمدة 3 h في درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير (roller).
    ملاحظة: لوحظ أنه ليس من الضروري زيادة تركيز الأجسام المضادة المختارة وكواشف الصبغ (Table 1) إذا تمت زيادة مدة التعرض لها مقارنة بطريقة الصبغ المناعي النسيجي القياسية للمقاطع الرقيقة. وقد قلل ذلك أيضاً من استخدام كواشف الأجسام المضادة باهظة الثمن. تُجرى عمليات التحضين في أنبوب Eppendorf سعة 1.5 mL مع قص مثبت الغطاء حتى يتمكن من الدوران على جهاز التدوير. وكان حجم الكاشف 500 µL.
  3. قم بالتحضين لمدة 72 h عند درجة حرارة 4°C مع الأجسام المضادة الأولية على جهاز التدوير.
  4. اغسل الأنسجة مرتين (مدة كل غسلة 1.5 h) باستخدام PBS 1× في درجة حرارة الغرفة على جهاز التدوير.
  5. قم بتحضين الأنسجة مع الجسم المضاد الثانوي (مغلفة بورق ألومنيوم) وصبغ النواة لمدة 4 h على الأقل في درجة حرارة الغرفة على جهاز التدوير أولاً، ثم انقله ليبقى طوال الليل (12–18 h) عند درجة حرارة 4 °C على جهاز التدوير.
  6. اغسل الأنسجة مرتين (مدة كل غسلة 1.5 h) باستخدام PBS 1× في درجة حرارة الغرفة على جهاز التدوير.

4. تحضير الشريحة

  1. أخرج النسيج برفق من أنبوب Eppendorf
  2. ضع النسيج على شريحة تحت المجهر وتأكد من عدم وجود أي ثنيات في النسيج.
    ملاحظة: من الممكن تحديد اتجاه النسيج تحت المجهر دون الحاجة إلى الفلورية. يجب وضع جانب الصفيحة المخصوصة (lamina propria) للنسيج المخاطي على الشريحة بحيث تكون الظهارة (epithelium) مواجهة للزجاج والشريحة المخصوصة مواجهة لغطاء الشريحة. يمكن التعرف على الصفيحة المخصوصة من خلال وجود حزم عصبية سميكة تظهر بوضوح دون صبغ. إن وضع النسيج بحيث تكون الصفيحة المخصوصة مواجهة لغطاء الشريحة والظهارة مستقرة على زجاج الشريحة سيسهل عملية الصبغ والتصوير.
  3. غطِ الشرائح باستخدام وسط تثبيت فلوري ثم قم بإغلاق الشرائح بإحكام.
  4. يمكن تخزين الشرائح عند درجة حرارة 4 °C، بعد تجفيفها طوال الليل (12–18 h) في الظلام وبدرجة حرارة الغرفة

5. الحصول على الصور ومعالجتها اللاحقة

  1. التقاط صور التألق المناعي ذات التكبير المنخفض
    1. قم بإجراء عملية دمج الصور التلقائية (stitching) أثناء التقاط الصور باستخدام المزج الخطي لـ alpha-blending.
      ​ملاحظة: يجب ضبط عدد إطارات المكدس المحوري (z-stack) وفقاً لسماكة العينة لضمان التغطية الكاملة لحجم النسيج.
    2. التقط حقول رؤية متجاورة بتداخل نسبته 15%. التقط الصور المبلطة باستخدام نمط اكتساب متعرج (meander acquisition pattern).
    3. اضبط العدد الإجمالي للمقاطع البصرية وفقاً لسماكة النسيج.
    4. اضبط معايرة الصورة على 215.594 nm/pixel في كلا المحورين X و Y. التقط الصور كمكدسات محورية (z-stacks) باستخدام حجم خطوة z قدره 0.8 µm.
    5. ضع النسيج الكامل المثبت على منصة المجهر البؤري (confocal microscope). التقط صوراً عامة باستخدام عدسة شيئية بقوة 30x (بفتحة عددية NA 1.04).
  2. التقاط صور التألق المناعي ذات التكبير العالي.
    1. التقط صوراً تفصيلية باستخدام عدسة شيئية بقوة 60× (بفتحة عددية NA 1.5). اضبط معايرة الصورة على 107.923 nm/pixel في كلا المحورين X و Y. التقط صور المكدس المحوري (z-stack) باستخدام حجم خطوة z قدره 0.41 µm.
    2. اضبط العدد الإجمالي للمقاطع البصرية وفقاً لسماكة النسيج، والتقط الصور من حقل رؤية واحد.
      ​ملاحظة: لا يلزم دمج الصور في عمليات الالتقاط بقوة 60× لأن كل مجموعة بيانات تتكون من حقل رؤية واحد.
  3. التقاط الصور المرجعية النسيجية
    1. قم بتصوير مقاطع الرأس الوسطية السهمية للفأر المصبوغة بصبغة HE باستخدام مجهر مسح الشرائح تحت إضاءة الحقل المضيء (brightfield illumination).
    2. التقط الصور باستخدام عدسة شيئية بقوة 40× (بفتحة عددية NA 0.95) وتكبير للكاميرا قدره 0.63x، مما ينتج عنه تكبير فعلي قدره 25.2×.
    3. تحقق من معايرة البكسل بمقدار 136.905 nm/pixel في كلا المحورين X و Y، والتقط الصورة كمستوى بؤري واحد.
    4. ادمج الصور المبلطة تلقائياً باستخدام نمط اكتساب متعرج ومزج خطي لـ alpha-blending.
  4. التقاط صور مرجعية عامة للتألق المناعي
    1. التقط صور تألق مناعي عامة تكميلية باستخدام عدسة شيئية بقوة 10x.
    2. التقط العينة كشريحة z واحدة عن طريق استخدام تداخل بلطي بنسبة 0% أثناء التقاط الصور.
    3. اضبط معايرة الصورة على 647.249 nm/pixel في كلا المحورين X و Y، وقم بتوليد صورة عامة تشمل المنطقة التشريحية الكاملة محل الاهتمام.
  5. معالجة الصور وإنشاء الأشكال النهائية.
    1. قم بتصدير مجموعات الصور المكتسبة إلى برنامج تحليل الصور. قم بتوليد إسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) من مجموعات بيانات المكدس المحوري (z-stack).
    2. حدد المناطق محل الاهتمام (ROIs) للتحليل اللاحق وإعداد الأشكال.
    3. ادمج صور التألق المناعي العامة مع صور HE المقابلة لإنشاء أشكال مرجعية تشريحية. ثم، تحقق من المحاذاة والتطابق التشريحي بين مجموعات بيانات التألق والبيانات النسيجية قبل إعداد الأشكال.
      ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات دمج الصور تلقائياً أثناء التقاط الصور باستخدام إعدادات المجهر المحددة مسبقاً ولا ينبغي أن تتطلب معالجة إضافية بعد الالتقاط. في حالتنا، تم توليد التصيير ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج Imaris: حيث استُخدمت إضافة تصيير السطح، بناءً على كثافة العتبة لكل قناة مكتسبة، لإنتاج إعادة البناء ثلاثية الأبعاد. وفي النهاية، تم تجميع الصور النهائية باستخدام برنامج Adobe Illustrator.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد مكّننا نهج التثبيت الكامل المعروض هنا من عزل الغشاء المخاطي الشمي والحفاظ عليه بأكمله. وفي حالتنا هذه، انصب تركيزنا على فهم التغيرات الخلوية والتشريحية على كلا المقياسين: الكلي (منظور تشريحي كامل) والدقيق (المستوى الخلوي).

يتيح لنا نهج التحضير الكامل (whole-mount) جمع كل من الحجيرات الظهارية والصفيحة المخصوصة والحفاظ على العلاقات المكانية بين حزم المحاور، والخلايا الغمدية الشمية (OECs)، والأرومات الليفية - وهي الخلايا محل اهتمامنا. وقد سمح هذا النهج بالحصول على مجموعات بيانات كبيرة ومستمرة شملت السمك الكامل والمساحة السطحية الواسعة للنسيج المخاطي (الشكل 3)، ومكننا من رصد تفاصيل البنية الخلوية المعقدة والتفاعلات (الشكل 3)، وكيفية تغير هذه التفاصيل بين الحالات السليمة (n = 3) (الشكل 3A، B) والحالات المتضررة (n = 12) (الشكل 3C، D).

من خلال دمج إجراء معالجة الأنسجة والصبغ المُحسّن هذا مع المجهر البؤري عالي الدقة، تمكنا من الحصول على صور لمناطق مخاطية أوسع بتفاصيل دقيقة للغاية على المستوى الخلوي عبر كامل عمق النسيج. وقد أتاح الحصول على مسح طبقي (Z-stack) عبر مناطق متعددة متجاورة إعادة بناء نطاقات تشريحية ممتدة دون المساس بالدقة أو سلامة الإشارة (الشكل 4A–F). ونظراً للتفاصيل الخلوية عالية الدقة، تمكنا أيضاً من استخدام المسوحات الطبقية المكتسبة لكامل سمك النسيج (الشكل 4G) لإنتاج صور مُعالجَة (الشكل 4H) لمزيد من الفهم للبنية الدقيقة للأنسجة.

تم تحقيق تحديد موثوق لتوجيه الأنسجة قبل التثبيت والتصوير باستمرار دون الحاجة إلى الوسم الفلوري. وكان من السهل التعرف على جانب الصفيحة المخصوصة تحت مجهر المجال المضيء من خلال وجود حزم عصبية سميكة، والتي يمكن تمييزها بوضوح عن الطبقة الظهارية. وقد أدى توحيد توجيه العينات عن طريق وضع الصفيحة المخصوصة بجوار غطاء الشريحة والسطح الظهاري مقابل الشريحة الزجاجية إلى تحسين اتساق التصوير عبر العينات وتسهيل عملية إعادة البناء ثلاثية الأبعاد اللاحقة. ويمكن تحديد مدى تغلغل الأجسام المضادة من خلال تحليل الإشارة المرتبطة الملاحظة عبر كامل سمك النسيج؛ حيث يتضح ذلك عادةً إما بغياب الإشارة أو بتناقص الإشارة تدريجياً عند التعمق داخل النسيج.

أتاح التصوير ثلاثي الأبعاد الذي تم تنفيذه باستخدام برنامج Imaris رؤية واضحة للشبكات الخلوية المعقدة والتنظيم المحوري داخل الغشاء المخاطي السليم. كما أنتج التصوير القائم على السطح، والذي طُبق من خلال تحديد عتبة الكثافة لكل قناة، تمثيلات ثلاثية الأبعاد دقيقة لبنية النسيج مع الحفاظ على التفاصيل الهيكلية الدقيقة.

بالنسبة للتلوين والتصوير، تشمل النتائج المتوقعة رؤية واضحة لإشارة التلوين المستهدفة دون أي فقدان غير طبيعي للإشارة أو تدهور في جودتها عبر كامل سُمك الأنسجة. ويجب اعتبار عدم القدرة على رؤية هدف ملون معروف تحت المجهر نتيجة غير ناجحة.

figure-results-1
الشكل 1. تمثيل للمنطقة التشريحية مع تراكب لنسيج الغشاء المخاطي الكامل. (A–C). منظر سهمي للجزء الداخلي من المنخر الأيسر (صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين، HE) للفأر (A) مع تراكب لصبغة النسيج الكامل للمخاطية من المنطقة نفسها (للتوجيه التشريحي) (B) يظهر توجيه وموضع حزم المحاور العصبية باللون الأخضر مع نوى الخلايا باللون الأزرق. مكنت هذه التقنية من الحفاظ على البنية التشريحية الكاملة: حيث يمكن تمييز العصب الشمي الأولي (ON) وحزم المحاور العصبية الملحقة (الأعصاب الميكعية الأنفية، VNN) بوضوح، بالإضافة إلى تتبع مسارها من الحاجز الأنفي إلى البصلة الشمية (OB)، عبر الصفيحة الغربالية (B, C). صبغ النسيج المعروض هنا بـ Hoechst للنوى (أزرق) و β-III-Tubulin لحزم المحاور العصبية (أخضر). صور تمثيلية من n = 15 تحضيراً مستقلاً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. مناظر عيانية وتخطيطية للجهاز الشمي. (A) باستخدام قاطع عظام، واتباعاً للخط المنقط الأحمر، يتم إزالة عظم الحاجز الأنفي (المنطقة الصفراء). (B) بمجرد كشف تجويف المنخر المقعر الكامن (باللون البني)، يمكن جمع كامل النسيج المخاطي الممتد من هذه المنطقة إلى المخاطية التنفسية والشمية. (C) تمثيل رسومي لتوضيح استمرارية هذه البنى الممتدة من الظهارة الشمية وصولاً إلى البصلة الشمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. عرض موسع للمنطقة التشريحية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول تجميع وتصبيغ العينة الكاملةات. (A–D). تظهر صور ممثلة من الأغشية المخاطية السليمة والتالفة. من الأعلى إلى الأسفل، غشاء مخاطي سليم من نسيج صحي (n = 3) وغشاء مخاطي تالف (n = 12). في النسيج الصحي (A)، تلتف خلايا OECs ذات المورفولوجيا ثنائية القطب المستطيلة (A، يسار) حول حزم المحاوير (A، وسط)، وتُشكل الخلايا الليفية الطبقة الخارجية لهذه الهياكل الشبيهة بالأنفاق (A، يمين، السهم الأبيض). تعكس المناطق المختارة الثلاث (ROIs) هذه التفاصيل (B). في الغشاء المخاطي التالف، تُظهر خلايا OECs مورفولوجيا ثنائية القطب ودائرية على حد سواء (C, D، يسار، الأسهم البيضاء). وتبدو حزم المحاوير أقل انتظاماً وتماسكاً (C، D، وسط، الأسهم البيضاء). بينما تظهر الخلايا الليفية منتشرة في جميع أنحاء المنطقة بأكملها (C، D، يمين، الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد للعينات المخاطية الكاملة. (A–H). تم الحصول على صور منخفضة التكبير للخلايا (A–F) وصورة عالية التكبير (G) من مجموعات صور لمناطق متتالية متعددة باستخدام مجهر SpinSR. تظهر خلايا الغمد الشمية (OECs) باللون الأحمر، والأرومات الليفية باللون الأرجواني، والمحاور العصبية باللون الأخضر، والنوى باللون الأزرق. تشير الأسهم إلى أنماط مورفولوجية مختلفة لخلايا OEC (A) وطبقة خارجية من الأرومات الليفية حول حزم المحاور العصبية (B وC). تحتوي الصور D–F على أسهم تبرز التشابهات في البنيات السليمة للأرومات الليفية. سلطت هذه الصور الضوء على التنظيم المكاني للمكونات الخلوية، والتي تم تمثيلها بعد ذلك باستخدام برنامج Imaris (H). شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الكاشفالهدفالتخفيفشروط الحضنالأساس المنطقي
الأجسام المضادة الأولية
β-III-Tubulin (Rabbit)المحاور العصبية1:300لمدة 72 h عند 4 °C، على جهاز تدويرللسماح بالاختراق الكامل للسماكة
PDGFR-β (Rat)الخلايا الليفية1:100
الأجسام المضادة الثانوية
Alexa 488الأجسام المضادة الأولية للأرانب1:250مغلفة بورق ألومنيوم، لمدة 4 h كحد أدنى في درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير، ثم طوال الليل عند 4 °C على جهاز تدوير.يمنع ورق الألومنيوم التبييض الضوئي، بينما تتيح المدة ودرجة الحرارة والرج الناتج عن جهاز التدوير اختراقاً جيداً
Alexa 647الأجسام المضادة الأولية للجرذان1:500
النوى
Hoechstنوى الخلايا1:2500

الجدول 1: قائمة بالأجسام المضادة مع التخفيفات المحسنة لهذا البروتوكول. يسرد هذا الجدول كواشف الصبغ مع أهدافها، وتخفيفاتها، والأساس المنطقي لشروط الحضن.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شهدت العقود القليلة الماضية تدريجياً بداية عصر الأبعاد الثلاثية، مع تطور العديد من النهج المبتكرة في المجال العلمي. فعلى سبيل المثال، ساهمت طرق إعادة البناء ثلاثية الأبعاد، التي أصبحت ممكنة بفضل تطوير طرق تصوير العينات الكاملة المعقدة المقترنة بالمجاهر الفلورية عالية الدقة، في تسهيل فهم أفضل لعدة هياكل نسيجية كاملة السماكة. وقد استُخدمت طرق التصوير ثلاثي الأبعاد هذه لتحديد العديد من تراكيب جسم الإنسان، مثل الأوعية والغدد والأورام الشائعة4,5,6,7,8,9. وعلاوة على ذلك، تم جمع معلومات حول الاختلافات بين التراكيب المرضية والعادية، على سبيل المثال في أدمغة الفئران الكاملة10,11,12. وقد تم تحديد هذا النهج كخطوة حاسمة نحو فهم أفضل لمختلف الأنظمة البيولوجية، مما يسهل استيعاباً أعمق للدوائر الخلوية، وتنظيمها المكاني البنيوي والوظيفي، ومساهمتها المحتملة في الأمراض البشرية.

تتمثل إحدى سلبيات التركيبات المختلفة لإعادة بناء الأنسجة ثلاثية الأبعاد والتصوير في أن معظم النهج تتضمن خطوات تصفية الأنسجة. وبالرغم من أن هذه الطريقة مفيدة للعديد من الأنسجة، إلا أنها ليست مناسبة لجميع أنواع الأنسجة8,9,19. في الواقع، تتضمن إجراءات التصفية عدة خطوات غسيل، والتي قد تؤدي إلى إتلاف الحاتمات المستهدفة والتأثير على الإشارات الداخلية20.

لقد استُخدمت النهج الموضحة أعلاه لتحديد العديد من التراكيب الخلوية الهامة ضمن أنظمة مختلفة. ومع ذلك، فإن الجهاز الشمي والتراكيب ذات الصلة به تحتوي على حد أدنى من المكونات العظمية التي يمكن من خلالها عزلها بسهولة؛ وبناءً على ذلك، تم اختبار نهج التحضير الكامل (whole‑mount) التي لا تتضمن خطوات التصفية في السنوات الأخيرة13,14.

أقرت هذه الدراسات بأهمية تحديد تنظيم البنى العصبية في الجهاز الشمي بشكل أفضل. وبناءً على ذلك، كان تركيزها الأساسي منصباً على تقديم خريطة طبوغرافية واضحة لتوزيع العصبونات الحسية الشمية استناداً إلى تعبير علامات مختلفة14، فضلاً عن الكشف عن رؤى جديدة حول أهدابها المميزة13.

تتيح تقنية التثبيت الكامل (whole‑mount) التي تم تطويرها وعرضها هنا جمع الأنسجة المخاطية والحفاظ عليها بكامل هيئتها، مما يفتح المجال للحصول على رؤى حاسمة حول البنية التشريحية والفسيولوجية لهذه البيئة، مع تركيز خاص في حالتنا هذه على العلاقة بين خلايا الغمد الشمية (OECs) والأرومات الليفية وحزم المحاور العصبية. وقد مكن اقتران تقنية العزل والصبغ المنقحة هذه بالتصوير البؤري عالي الدقة من جمع صور كبيرة تعكس بنية المنطقة المستهدفة بأكملها والخلايا المقيمة فيها. وتحديداً، توفر تقنيتنا المنقحة ميزتين مميزتين، حيث يتم حصاد ومعالجة الغشاء المخاطي بأكمله، بما في ذلك بنية الصفيحة المخصوصة13، كما تساعد طريقة تحضير الأنسجة الأكثر رفقاً في الحفاظ على التشريح على النطاق الكلي وكذلك التفاعلات بين الخلايا (مثل خلايا الغمد الشمية والمحاور العصبية والأرومات الليفية) مقارنة ببروتوكولات التثبيت المسطح الأخرى14. وهذا هو السبب أيضاً في أن هذا البروتوكول لا يتضمن التحقق من الصحة مقابل صبغ المقاطع الرقيقة.

كما ذُكر سابقاً، تتضمن تقنيات التلوين الكامل عادةً فترات طويلة لمعالجة الأنسجة واستخدام كواشف محددة وباهظة الثمن. وقد تم تطوير هذه الطريقة مع التركيز على تقليل معالجة الأنسجة إلى الحد الأدنى لتقليص كل من الإطار الزمني وخطر إتلاف البنى الخلوية الهامة. وبناءً على ذلك، تمثل هذه الطريقة المُحسَّنة عملية سريعة يمكن تنفيذها باستخدام كواشف شائعة الاستخدام في الكيمياء النسيجية المناعية للمقاطع الرقيقة، مما يوفر بديلاً فعالاً للمناهج التي تتطلب أوقات معالجة أطول والتي لا تكون مناسبة للبنى الخالية من العظام مثل الأنسجة المخاطية.

يمكن إجراء عملية الحصول على الصور والمعالجة اللاحقة باستخدام أي منصة مجهرية بؤرية (confocal microscopy) قادرة على الحصول على مجموعات صور z-stacks عالية الدقة من عينات الأنسجة السميكة، مع اختراق ليزري كافٍ للتصوير عبر الأغشية المخاطية المستهدفة (يرجى الرجوع إلى قسم الطرق لمزيد من التفاصيل حول إعدادات الحصول على الصور ومعالجتها).

نعتقد أنه يمكن نقل هذا البروتوكول وتطبيقه على نماذج أخرى شائعة من القوارض مع إجراء التعديلات المناسبة. ومن خلال بعض التعديلات الخاصة بالأنسجة، يمكن تطبيق هذه الطريقة في سياقات مختلفة، بما في ذلك دراسة الأنسجة المخاطية وتحت المخاطية في الجهاز التنفسي والقناة الهضمية (GIT)؛ واستقصاء تنظيم الأنسجة والتفاعلات متعددة الأنظمة داخل الجهاز العصبي؛ وتحليل العمليات الالتهابية والأنسجة الليمفاوية المرتبطة بالمخاط (MALTs)؛ بالإضافة إلى استكشاف محاور مختلفة متعددة الأنظمة، مثل محور الأمعاء والدماغ.

تكمن القوة الرئيسية لهذا البروتوكول في التحسينات المنهجية التي تتيح تصويرًا ثلاثي الأبعاد عالي الجودة مع الحفاظ على سلامة الأنسجة، وضمان نهج سريع نسبيًا مقارنة بمنهجيات التحميل الكامل الأخرى التي تم تجربتها سابقًا في هذا المجال.

اعتمد التنفيذ الناجح لهذا النهج بشكل كبير على الفهم التشريحي العميق للنسيج المستهدف. في الواقع، وفي حالتنا هذه، كانت معرفة الموضع المتوقع لحزم المحاور العصبية أساسية لتقليل مدى توغل إجراء الجمع بمجرد الكشف عن الجزء الداخلي من الجمجمة. كانت هذه المعرفة التشريحية حاسمة في القدرة على تحديد المنطقة والنسيج المستهدفين بسرعة والحفاظ على البنية العامة للمخاطية، مما يسلط الضوء على أن نجاح معالجة الأنسجة يرتبط جوهرياً باستراتيجية جمع مدروسة وليس بخطوات ما بعد المعالجة وحدها.

كما ذُكر في قسم الطرق في عدة ملاحظات، كانت التعديلات التقنية المتعددة حاسمة في تطوير هذه الطريقة وتحسينها. وقد مثل الحفاظ على طفو النسيج بحرية داخل أنابيب Eppendorf طوال عملية الصبغ بأكملها، بالتزامن مع الدوران المستمر أثناء تحضين الكواشف والأجسام المضادة، خطوة رئيسية تميزت عن بروتوكولات التثبيت الكامل والقطاعات الرقيقة الأكثر سكوناً. وقد منع هذا التحسين طي النسيج مع ضمان تغلغل متجانس للكواشف عبر العينة بأكملها، مما أدى إلى تحسين اتساق الصبغ دون الحاجة إلى خطوات ترويق غير ضرورية. بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن التحسين الدقيق لمدة التحضين لكل كاشف ومزيج من الأجسام المضادة كان أمراً ضرورياً. وقد تحتاج هذه الخطوة الأخيرة إلى مزيد من الضبط بناءً على نوع الجسم المضاد المختار.

أدت هذه العوامل المحددة مجتمعة إلى تعزيز قابلية التكرار مع تقليل الوقت الإجمالي للمعالجة والحد من التعامل القاسي مع العينات.

تمثلت خطوة منهجية مهمة أخرى في القدرة على تحديد اتجاه النسيج بشكل موثوق قبل التثبيت والتصوير دون الحاجة إلى الوسم الفلوري. وكان من الممكن التعرف بسهولة على جانب الصفيحة المخصوصة (lamina propria) في النسيج المخاطي تحت مجهر الحقل المضيء من خلال وجود حزم عصبية سميكة، والتي يمكن تمييزها بوضوح عن النسيج الظهاري المحيط. وقد وُجد أن توحيد اتجاه العينة عن طريق وضع الصفيحة المخصوصة مواجهة لجهة غطاء الشريحة، مع استناد الطبقة الظهارية على الشريحة الزجاجية، يسهل جودة الحصول على الصور. وقد أدى هذا التحسين البسيط والفعال إلى تعزيز اتساق التصوير عبر العينات، وساهم في جودة عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها.

ومع ذلك، هناك بعض القيود التي يجب مراعاتها. لم يتم اختبار هذا البروتوكول على العديد من سلالات الفئران الشائعة أو أنواع القوارض الأخرى. وبالمثل، أُجريت عمليات التحسين في ظل الظروف التجريبية المحددة المذكورة أعلاه ومع مجموعات الأجسام المضادة المدرجة فقط. وبينما من المفترض أن يعمل البروتوكول مع معظم سلالات الفئران والجرذان، والعديد من الأجسام المضادة المختلفة، وأي نماذج تجريبية تسمح بجمع الأغشية المخاطية بسمكها الكامل، فقد يتطلب الأمر مزيداً من التحسين الدقيق. ومن القيود الملحوظة الأخرى أن المقطع الواحد من العينة الكاملة (whole-mount section) يمكن صبغه بمجموعة واحدة فقط من الأجسام المضادة، على عكس الأنسجة المقطعة إلى شرائح رقيقة، حيث يمكن صبغ كل شريحة بمجموعة أجسام مضادة منفردة، وبالتالي يمكن اختبار مجموعات متعددة ومختلفة من الأجسام المضادة على الأنسجة المقطعة إلى شرائح رقيقة.

وبشكل عام، تُظهر هذه الابتكارات المنهجية كيف يمكن للتعديلات البسيطة نسبيًا في التعامل مع الأنسجة وظروف الصبغ وتوجيه العينات أن تحسن نتائج التصوير الكامل (whole-mount) بشكل كبير. ومن خلال تجنب خطوات معالجة الأنسجة والتصفية المكثفة، يوفر هذا النهج بديلًا عمليًا وقابلًا للتكيف لدراسة الأنسجة الرقيقة الخالية من العظام، مع الاستمرار في تمكين الحصول على بيانات ثلاثية الأبعاد مفصلة وواسعة النطاق.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة Clem Jones، ومؤسسة Perry Cross Spinal Research، ولجنة تأمين حوادث السيارات لـ JSTJ و RR، وزمالة المخطط الوطني للتأمين ضد الإصابات في كوينزلاند لـ RR، وزمالة مؤسسة Perry Cross Spinal Research لـ FO. كما تم دعم جزء من هذا المشروع من خلال "منحة غريفيث للبحوث للدراسات العليا (GUPRS)" و"منحة جامعة غريفيث الدولية للبحوث للدراسات العليا (GUIPRS)" لـ FO.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألبومين المصل البقري (BSA)Sigma-AldrichA3294-50Gالكيمياء النسيجية المناعية
Adobe Illustratorversion 28.5
جسم مضاد لـ beta III Tubulin - وسم عصبيAbcamab18207
جسم مضاد لـ PDGFR beta [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochlorideSigma Aldrich14533
غطاء شريحة 24X50MM رقم 1.5، 100 قطعةBio-strategyEPBRCS245015GPالكيمياء النسيجية المناعية
جسم مضاد ثانوي من الحمار ضد IgG (H+L) من الأرنب، ممتز ممتص للغاية، Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
قاطع عظام Dumont #15A - مطلي بالإيبوكسيDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02تشريح الأنسجة
ملقط Dumont #7 - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10تشريح الأنسجة
جسم مضاد ثانوي من الماعز ضد IgG (H+L) من الجرذ، ممتز ممتص، Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
برنامج ImarisImarisversion 9.5.0التصوير
مقصات تشريح MayoProSciTech420SSتشريح الأنسجة
بارافورمالدهيدSigma-AldrichP6148-500Gمعالجة الأنسجة
محلول ملحي منظم بالفوسفات، أقراص PBS معقمة (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014معالجة الأنسجة
وسط تثبيت ProLong Glass المانع للتلاشيThermo Fisher ScientificP36980الكيمياء النسيجية المناعية
شفرة مشرط رقم 23Scalpel Blades Swann MortonCOS240Bتشريح الأنسجة
مقبض مشرط رقم 4ProSciTechT134تشريح الأنسجة
أزيد الصوديومSigma-AldrichS2002-25Gمعالجة الأنسجة
سكروزChem-Supply57-50-1معالجة الأنسجة
شرائح مجهرية TOMO AdhesionProSciTechGEMS63705-09الكيمياء النسيجية المناعية
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLالكيمياء النسيجية المناعية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li Y, Field P M, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997;277 (5334),2000–2002.
  2. Li Y, Field P M, Raisman G. Olfactory ensheathing cells and olfactory nerve fibroblasts maintain continuous open channels for regrowth of olfactory nerve fibres. Glia. 2005;52(3):245–251.
  3. Yamaguchi M, et al. The New Era of Three-Dimensional Histoarchitecture of the Human Endometrium. J Pers Med. 2021;11(8).
  4. Falk M, Ynnerman A, Treanor D, Lundström C. Interactive visualization of 3D histopathology in native resolution. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 2018;25(1):1008–1017.
  5. Kiemen A, et al. In situ characterization of the 3D microanatomy of the pancreas and pancreatic cancer at single-cell resolution. BioRxiv. 2020.2012. 2008.416909, (2020).
  6. Tian J, et al. Three-dimensional reconstruction of laryngeal cancer with whole organ serial immunohistochemical sections. Sci Rep. 2020;10(1):18962.
  7. Lotz JM, et al. Integration of 3D multimodal imaging data of a head and neck cancer and advanced feature recognition. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2017;1865(7):946–956.
  8. Nojima S, et al. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Sci Rep. 2017;7(1):9269.
  9. Tainaka K, et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell reports. 2018;24(8):2196–2210.e2199.
  10. Onozato ML, Klepeis VE, Yagi Y, Mino-Kenudson M. A role of three-dimensional (3D)-reconstruction in the classification of lung adenocarcinoma. Stud Health Technol Inform. 2012;35(2):79–84.
  11. Hama H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of the transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011;14(11):1481–1488.
  12. Tainaka K, et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014;159(4):911–924.
  13. Oberland S, Neuhaus EM. Whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice. J Vis Exp. 2014;10.3791/52299(94).
  14. Gavid M, et al. Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons. PLoS One. 2023;18(1):e0280497.
  15. Windus LC, et al. Stimulation of olfactory ensheathing cell motility enhances olfactory axon growth. Cell Mol Life Sci. 2011;68(19):3233–3247.
  16. Windus LC, Claxton C, Allen CL, Key B, St John JA. Motile membrane protrusions regulate cell-cell adhesion and migration of olfactory ensheathing glia. Glia. 2007;55(16):1708–1719.
  17. Windus LC, et al. Lamellipodia mediate the heterogeneity of central olfactory ensheathing cell interactions. Cell Mol Life Sci. 2010;67(10):1735–1750.
  18. Chehrehasa F, et al. Olfactory glia enhance neonatal axon regeneration. Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):277–288.
  19. Ueda HR, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020;21(2):61–79.
  20. Jing D, et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res. 2018;28(8):803–818.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة