فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) الموجه بالموجات فوق الصوتية في شريحة مائعيات دقيقة لنموذج الحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي لدراسات إيصال الأدوية

Yihong Li; Liyang Wu; Huadong Fan

doi:10.3791/72041

مقالة منهجية

فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) الموجه بالموجات فوق الصوتية في شريحة مائعيات دقيقة لنموذج الحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي لدراسات إيصال الأدوية

112 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

أغسطس 18, 2026

Yihong Li^*¹^,²^,³ , Liyang Wu^*¹^,²^,³ , Huadong Fan¹^,²^,⁴

¹Ningbo No.2 Hospital, ²Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, ³Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, ⁴Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول بناء نموذج شريحة ميكروفلويديك للحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي (BBB‑GBM). تم التحقق من صحة النموذج من حيث سلامة الحاجز الدموي الدماغي (BBB)، وهو يتيح دراسة فتح الحاجز الدموي الدماغي العابر والقابل للعكس إلى حد كبير والمحفز بالموجات فوق الصوتية منخفضة الكثافة، مما يسمح بالتقييم الكمي لنقل المذيلات النانوية عبر الحاجز الدموي الدماغي وكفاءة استهداف الورم بوساطة الموجات فوق الصوتية.

الملخص

يُعد الحاجز الدموي الدماغي (BBB) عائقاً رئيسياً أمام علاج الورم الأرومي الدبقي (GBM) نظراً لتقييده دخول معظم الجزيئات العلاجية إلى الدماغ. وتؤدي الاختلافات بين الأنواع في بنية ووظيفة الحاجز الدموي الدماغي إلى تعقيد الترجمة السريرية للنماذج الحيوانية، مما يبرز الحاجة إلى منصات بشرية ذات صلة في المختبر لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي لتقييم نفاذية الأدوية في علاج الورم الأرومي الدبقي. يتم هنا وصف بروتوكول لإنشاء نموذج شريحة مائعية دقيقة للحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي (BBB-GBM). يؤسس هذا النموذج نظام زراعة ثلاثياً يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الدماغية البشرية (HCMECs)، والخلايا النجمية الأولية (ACs)، وخلايا U87-MG ضمن منصة مائعية دقيقة مدمجة في مادة Matrigel. ويتم التحقق من سلامة الحاجز الدموي الدماغي من خلال التصبيغ المناعي المستمر لبروتين zonula occludens-1 (ZO-1) واختبار نفاذية FITC-dextran. بعد ذلك، يتم استخدام الموجات فوق الصوتية (US) منخفضة الكثافة (1 MHz، 1 W/cm²، 30 s) لتحفيز فتح عابر وعكسي إلى حد كبير للحاجز الدموي الدماغي، مما يسمح للمذيلات النانوية المستهدفة للأورام (SFN@RB@SPMs) بعبور الحاجز بكفاءة والتراكم في خلايا الورم الأرومي الدبقي. وتتمثل السمة الرئيسية لهذا البروتوكول في دمج قياسات نفاذية الحاجز الدموي الدماغي وإيصال الدواء في الوقت الفعلي ضمن شريحة واحدة مستجيبة للموجات فوق الصوتية، مما يوفر منصة قوية لتحليل آليات إيصال الدواء المعزز بالموجات فوق الصوتية في حالات الورم الأرومي الدبقي.

المقدمة

يواجه علاج الورم الأرومي الدبقي (GBM) قيوداً شديدة بسبب الحاجز الدموي الدماغي (BBB)، الذي يحد بشكل كبير من دخول جميع العوامل العلاجية تقريباً إلى الدماغ¹^,². يتكون الحاجز الدموي الدماغي من خلايا بطانية غير نافذة مرتبطة ببروتينات الموصلات المحكمة (مثل occludin و ZO-1)، مع دعم إضافي من الخلايا الحولية والنهايات القدمية للخلايا النجمية³. ورغم أن النماذج الحيوانية قدمت رؤى قيمة حول وظيفة الحاجز الدموي الدماغي، إلا أن الاختلافات النوعية في الفسيولوجيا والتمثيل الغذائي تحد من قدرتها على التنبؤ بدقة باستجابات الأدوية لدى البشر⁴^,⁵. وبناءً على ذلك، تبرز الحاجة الماسة إلى نماذج بشرية ذات صلة فسيولوجياً بالحاجز الدموي الدماغي لتقييم نفاذية الأدوية في علاج الورم الأرومي الدبقي.

تخفق نماذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB) التقليدية في المختبر (in vitro)، مثل نظام زراعة Transwell، في محاكاة تعقيد الحاجز الدموي الدماغي، بما في ذلك التفاعلات بين الخلايا، والتغيرات السائلة الديناميكية، وإجهاد القص الناجم عن التدفق⁶. وفي المقابل، ظهرت نماذج الحاجز الدموي الدماغي الموائع الدقيقة (microfluidic) كمنصات متفوقة تحاكي هذه الخصائص الشبيهة بالحالة الحية (in vivo) بدقة⁷. وقد استُخدمت أنظمة "الحاجز الدموي الدماغي على شريحة" (BBB-on-a-chip) على نطاق واسع لدراسة نقائل أورام الدماغ⁸، وبحث خلل وظائف الحاجز الدموي الدماغي في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر⁹، وتقييم نقل الأدوية عبر الحاجز الدموي الدماغي¹⁰^,¹¹. ومع ذلك، فإن معظم نماذج شرائح الحاجز الدموي الدماغي الحالية تُستخدم أساساً لاختبار نفاذية الأدوية وتفتقر إلى القدرة على دمج المحفزات الفيزيائية الخارجية التي تعدل نفاذية الحاجز. حالياً، برزت الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) كاستراتيجية واعدة لفتح الحاجز الدموي الدماغي بشكل مؤقت مع تعافٍ ملموس، مما يتيح تعزيز إيصال العوامل العلاجية إلى الدماغ¹²^,¹³. وقد أثبتت الدراسات الميكانيكية السابقة أن التحفيز الميكانيكي الناجم عن الموجات فوق الصوتية يمكن أن يعدل وظيفة الحاجز بشكل مؤقت عن طريق إعادة تشكيل الوصلات بين الخلايا وتعزيز نفاذية الخلايا البطانية. على سبيل المثال، أظهر Silvani وزملاؤه أن القوى الميكانيكية الناجمة عن الموجات فوق الصوتية أدت إلى تكوين فجوات بينية بطانية عكسية في نموذج "وعاء على شريحة" في المختبر (in vitro)¹⁴. واتساقاً مع هذه النتائج، أثبت Beekers وزملاؤه أن التأثيرات الحيوية الميكانيكية التي تتوسطها الموجات فوق الصوتية أدت إلى فتح مؤقت للتلامسات بين الخلايا البطانية، مما أدى بالتالي إلى زيادة نفاذية البطانة¹⁵. ومؤخراً، أفاد Qiao وزملاؤه أن نفاذية الحاجز البطاني يتم تنظيمها بشكل حاسم من خلال معايير التعرض للموجات فوق الصوتية، وخاصة طول النبضة، مما يؤكد أهمية تحسين المعايير الصوتية لتحقيق تعديل آمن وقابل للتحكم في الحاجز الدموي الدماغي¹⁶. وعلى الرغم من هذا التقدم، لا تزال المنصات المختبرية (in vitro) التي تسمح في آن واحد بالتحليل الكمي لفتح الحاجز الدموي الدماغي بوساطة الموجات فوق الصوتية وتأثير ذلك على إيصال الطب النانوي محدودة.

لسد الفجوة المذكورة أعلاه، يتم تقديم بروتوكول لإنشاء شريحة ميكروفلويديك لمحاكاة الحاجز الدموي الدماغي وورم الأرومة الدبقية المتعددة الأشكال (BBB-GBM). يدعم جهاز الميكروفلويديك زراعة ثلاثية لكل من خلايا HCMECs، والخلايا الفلكية الأولية (ACs)، وخلايا U87-MG GBM المدمجة في Matrigel. وقد أظهر الحاجز الدموي الدماغي المعاد بناؤه خصائص هيكلية ووظيفية لحاجز سليم، وهو ما ثبت من خلال التموضع المستمر لبروتين ZO-1 على طول الوصلات بين الخلايا والانتشار المحدود لـ 40 kDa FITC-dextran عبر الواجهة الوعائية. والأهم من ذلك، يمكن ربط هذه الشريحة بتحفيز بالموجات فوق الصوتية الخاضعة للتحكم لإحداث فتح مؤقت في الحاجز الدموي الدماغي، مما يعزز النقل اللاحق وكفاءة استهداف الورم للمذيلات النانوية. وباستخدام هذا النظام، يمكن تقييم كفاءة النقل واستهداف الورم للمذيلات النانوية SFN@RB@SPM كمياً. وبشكل عام، توفر هذه المنصة أداة مفيدة لدراسة العلاقة بين معاملات الموجات فوق الصوتية، وتعديل الحاجز الدموي الدماغي ذي الخصائص العكوسة، وتحسين إيصال المذيلات النانوية في علاج ورم الأرومة الدبقية المتعددة الأشكال (GBM).

البروتوكول

التزمت جميع الإجراءات الحيوانية بالمبادئ التوجيهية (GB/T35892-2018) للمراجعة الأخلاقية لرعاية الحيوانات التجريبية، وتم اعتمادها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في معهد نينغبو لصناعة الحياة والصحة، UCAS (رقم الاعتماد GK-2023-XM-0073). الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تصنيع وتحضير جهاز العضو على شريحة للحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي (BBB-GBM)

تصميم الرقيقة ومخطط القناع الضوئي
1. صمم الرقيقة باستخدام برنامج Auto CAD.
  ملاحظة: تتكون الرقيقة من ثلاث قنوات مائعية دقيقة متوازية، تشمل قناة دم، وقناة دماغ، وقناة ورم. يبلغ عرض قناة الدم وقناة الورم 1000 µm لكل منهما، بينما يبلغ عرض قناة الدماغ 1300 µm. ويبلغ ارتفاع القنوات الثلاث 150 µm، وتفصل بين القنوات المتجاورة مصفوفات من الركائز الدقيقة شبه المنحرفة بعرض 200 µm، والتي تسمح بالانتشار الجزيئي والتواصل الخلوي بين الحجرات. يتوفر المخطط التفصيلي لتصميم القناع الضوئي في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. والمقاوم الضوئي SU-8 المستخدم في هذه الدراسة هو 3050.
تصنيع قالب رئيسي من السيليكون باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية القياسية مع المقاوم الضوئي SU-8.
1. ضع رقاقة سيليكون فارغة على قاعدة التثبيت بالتفريغ في جهاز الطلاء الدوراني وقم بتنشيط التفريغ لتثبيت الرقاقة بإحكام.
2. وزع ببطء 10 mL من المقاوم الضوئي SU-8 على مركز الرقاقة.
3. قم بإجراء عملية طلاء دوراني على خطوتين للحصول على طبقة موحدة من المقاوم الضوئي: أولاً بسرعة 500 rpm لمدة 10 s، ثم بسرعة 2500 rpm لمدة 90 s.
4. انقل الرقاقة المطلية إلى لوح تسخين وأجرِ خبزاً أولياً (soft bake) عند 95 °C لمدة 30 min لتبخير المذيب.
5. اترك الرقاقة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة وقم بقياس سمك طبقة SU-8 باستخدام مقياس السمك.
  ملاحظة: لتكوين حاجز دم دماغي (BBB) مثالي، يوصى بارتفاع قناة يتراوح بين 110–150 µm. وعادة ما ينتج عن عملية طلاء دوراني واحدة (الخطوة 1.2.3) سمك غشاء يتراوح بين 40–50 µm؛ لذا يلزم إجراء عمليتي إلى ثلاث عمليات طلاء دوراني للوصول إلى السمك الإجمالي المطلوب.
تنميط الطباعة الحجرية الضوئية
1. اضبط شدة الأشعة فوق البنفسجية (UV) لجهاز محاذاة القناع على 14–15 mW/cm².
2. قم بمحاذاة القناع الضوئي المصنوع من الكروم مع رقاقة السيليكون المطلية بـ SU-8 وأجرِ التعريض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 s.
3. انقل رقاقة السيليكون فوراً إلى لوح تسخين لإجراء الخبز بعد التعريض (post-exposure baking) وفق الشروط التالية: 65 °C لمدة 10 s، يليه 95 °C لمدة 300 s.
4. بعد أن تبرد رقاقة السيليكون إلى درجة حرارة الغرفة، اغمرها في محلول المظهر (propylene glycol monomethyl ether acetate, PGMEA) واتركها تتطور لمدة 4–6 min.
5. اشطف الرقاقة بـ isopropanol لإيقاف عملية التظهير، ثم اغسلها بالماء منزوع الأيونات.
6. جفف الرقاقة باستخدام غاز النيتروجين وافحص هياكل القنوات الدقيقة المنمطة تحت مجهر ضوئي.
  ملاحظة: إذا بقيت بقايا من المقاوم الضوئي غير المظهر، كرر خطوة التظهير حتى تتحدد الهياكل الدقيقة بوضوح.
7. اخبز القالب الرئيسي من السيليكون المكتمل في فرن عند 200 °C لمدة 1 h لتحسين الالتصاق بين المقاوم الضوئي SU-8 وسطح رقاقة السيليكون.
تصنيع رقيقة PDMS
1. جهز البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) عن طريق خلط البوليمر الأساسي وعامل المعالجة جيداً بنسبة وزنية 10:1 (w/w) لمدة 30 min للحصول على بوليمر PDMS متجانس.
2. صب خليط PDMS فوق القالب الرئيسي من السيليكون المصنع، مع التأكد من تغطية الهياكل الدقيقة بالكامل.
3. ضع القالب الرئيسي في مجفف تفريغ لإزالة الفقاعات الهوائية.
4. انقل القالب الرئيسي إلى فرن وقم بمعالجته عند 65 °C لمدة 1.5–2 h.
5. بعد المعالجة، اقطع طبقة PDMS بعناية على طول حدود الرقيقة باستخدام سكين حرفي وافصلها برفق عن القالب الرئيسي من السيليكون.
6. اغمر رقيقة PDMS في إيثانول بتركيز 70%–75% لمدة 30 min للتعقيم الأولي، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات واتركها تجف في الهواء.
7. قم بثقب منافذ الدخول والخروج باستخدام خرامة خزعة مقاس 2 mm.
الربط بالبلازما وتجميع الجهاز
1. ضع رقيقة PDMS وشريحة زجاجية نظيفة في غرفة جهاز تنظيف البلازما، مع التأكد من أن جانب القنوات الدقيقة في PDMS متجه للأعلى.
2. قم بتفريغ الغرفة حتى ينخفض الضغط إلى أقل من 30 Pa، ثم أدخل غاز الأكسجين.
3. حافظ على تدفق الأكسجين لمدة 90 s مع إبقاء ضغط الغرفة أقل من 40 Pa.
4. اضبط قدرة التردد الراديوي (RF) على 55% وأجرِ معالجة بالبلازما لمدة 90 s لتنشيط أسطح PDMS والزجاج.
5. أحضر رقيقة PDMS المنشطة فوراً لتلامس الشريحة الزجاجية واضغط برفق لتحقيق ربط غير عكسي.
6. ضع الجهاز المجمع في فرن عند 65 °C لمدة 24 h لتثبيت الربط واستعادة خاصية كره الماء.
7. قبل استزراع الخلايا، عقم الجهاز المربوط عن طريق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 min.
  ملاحظة: حافظ على الظروف المعقمة عن طريق تخزين الرقائق المعقمة في أطباق بتري محكمة الإغلاق داخل كابينة السلامة البيولوجية حتى وقت الاستخدام.

2. استنبات الخلايا وتأسيس نموذج الحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي (BBB-GBM)

قم بتحضير الكواشف التالية:
1. وسط استنبات ACs (لقناة الدماغ): وسط DMEM/F12 الأساسي المحتوي على 20% من مصل البقر الجنيني (FBS) و1% من البنسلين/ستريبتومايسين (P/S).
2. وسط استنبات HCMECs (لقناة الأوعية الدموية): وسط الخلايا البطانية (ECM) المكمل بـ 1% P/S.
3. وسط استنبات خلايا GBM (لقناة الورم الدبقي): وسط MEM الأساسي المحتوي على 10% FBS و1% P/S.
4. كاشف تفكيك الخلايا: استخدم محلول trypsin-EDTA بتركيز 0.25% لفصل الخلايا الملتصقة.
  ملاحظة: قد يؤدي التعرض الطويل لـ trypsin إلى تقليل حيوية الخلايا. راقب انفصال الخلايا تحت المجهر وقم بتحييد trypsin فوراً باستخدام الوسط الكامل.
5. احتفظ بجميع الخلايا (ACs وHCMECs وU87-MG) في أطباق استنبات بقطر 100 مم قبل استزراعها في الجهاز الموائع الدقيقة.
عزل ACs الأولية
1. اعزل ACs الأولية من القشرة المخية للفئران حديثة الولادة (اليوم 1-3 بعد الولادة). بعد إزالة السحايا والأوعية الدموية بعناية على الثلج، قم بفرم النسيج القشري باستخدام مقصات جراحية معقمة وأخضعه للهضم الإنزيمي.
2. اغسل معلق الخلايا المفككة بمحلول PBS بارد جداً، وعالجه بـ trypsin لتحقيق تفكيك الخلايا الفردية، واجمع الرواسب عن طريق الطرد المركزي (400 x g، لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة).
3. أعد تعليق الخلايا واستزرعها في دوارق استنبات T25 تحتوي على وسط استنبات ACs.
4. تعرف على ACs عن طريق GFAP من خلال تلوين التألق المناعي. الصورة موفرة في الشكل 3 التكميلي.
استزراع الخلايا
ملاحظة: اليوم 1 - استزراع ACs في قناة الدماغ.
1. أضف 1 mL من trypsin-EDTA بتركيز 0.25% إلى طبق الاستنبات الذي يحتوي على ACs. حرك الطبق بلطف لضمان التغطية المتساوية.
2. حضن الطبق عند 37 °C لمدة 1-2 دقيقة حتى تنفصل الخلايا عن طبق الاستنبات.
3. أضف 3 mL من وسط استنبات ACs (من الخطوة 2.1.1) لتحييد trypsin. استخدم الماصة بلطف للحصول على معلق من الخلايا الفردية.
4. اجمع معلق الخلايا في أنبوب طرد مركزي وقم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 3 دقائق عند 4 °C.
5. أزل السائل الطافي وأعد تعليق رواسب الخلايا في 200 µL من وسط AC.
6. حدد تركيز الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي واضبط الكثافة لتصبح 2.5 × 10⁶ خلية/mL.
7. امزج معلق خلايا ACs مع Matrigel بنسبة 3:5 (v/v) (خلايا AC: Matrigel).
8. باستخدام ماصة دقيقة، وزع 10 µL من مزيج Matrigel-ACs في قناة الدماغ.
  ملاحظة: قم بإجراء عملية التحميل مع الحفاظ على الشريحة على الثلج لمنع بلمرة Matrigel المبكرة.
9. حضن الشريحة عند 37 °C في حضانة تحتوي على 5% CO₂ لمدة 30 دقيقة للسماح ببلمرة Matrigel واستقرار الخلايا.
  ملاحظة: اليوم 1 - استزراع HCMECs في قناة الأوعية الدموية.
10. ضع 1 mL من trypsin-EDTA بتركيز 0.25% وحضنها عند 37 °C لمدة 30 ثانية تقريباً حتى تنفصل الخلايا.
11. أضف 3 mL من وسط HCMECs (الخطوة 2.1.2) لإيقاف الهضم الإنزيمي.
12. استخدم الماصة بلطف لتوليد معلق موحد من الخلايا الفردية.
13. اجمع المعلق وقم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 3 دقائق عند 4 °C.
14. أزل السائل الطافي وأعد تعليق رواسب الخلايا في 200 µL من وسط HCMECs.
15. عد الخلايا واضبط التركيز ليصبح 2 × 10⁶ خلية/mL.
16. أدخل بعناية 10 µL من معلق HCMECs في قناة الأوعية الدموية للشريحة.
17. ضع الشريحة جانبيًا لمدة 30 دقيقة في حضانة الخلايا لتعزيز التصاق الخلايا البطانية على طول جدار القناة.
18. استزرع 10 µL إضافية من معلق HCMECs في قناة الأوعية الدموية لزيادة الكثافة البطانية في القناة الوعائية.
19. حضن الشريحة لمدة 30-60 دقيقة إضافية للسماح بالتصاق HCMECs.
20. أضف 100 µL من وسط استنبات مختلط إلى مدخل الشريحة.
  ملاحظة: يتكون الوسط المختلط من وسط AC ووسط HCMECs بنسبة 1:1 (v/v).
  اليوم 3 - استزراع خلايا U87-MG في قناة الورم الدبقي.
21. أضف 1 mL من trypsin-EDTA بتركيز 0.25% إلى طبق الاستنبات وحضنه عند 37 °C لمدة 1-2 دقيقة.
22. أضف 3 mL من وسط U87-MG (من الخطوة 2.1.3) لإنهاء الهضم.
23. استخدم الماصة بلطف للحصول على معلق متجانس من الخلايا الفردية.
24. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي وقم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 3 دقائق.
25. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق رواسب الخلايا في 200 µL من وسط U87-MG.
26. عد تركيز الخلايا واضبط الكثافة لتصبح 2 × 10⁶ خلية/mL.
27. أدخل 10 µL من معلق خلايا U87-MG في قناة الورم الدبقي للشريحة.
28. حضن الشريحة في درجة حرارة 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 30-60 دقيقة للسماح بالتصاق الخلايا.
29. أضف 100 µL من وسط استنبات U87-MG إلى مدخل الشريحة.
30. احتفظ بجهاز الموائع الدقيقة في بيئة عند 37 °C مع 5% CO₂لمدة 48 ساعة إضافية للسماح بتكوين الوصلات المحكمة البطانية.

3. تقييم سلامة الحاجز الدموي الدماغي (BBB)

مقايسة النفاذية
1. تحضير الدكستران المفلور بالإيزوثيوسيانات (FITC-dextran) بوزن جزيئي 40 kDa في وسط زراعة مختلط (وسط ACs : وسط HCMEC = 1:1، v/v) بتركيز نهائي 10 µg/mL.
2. إدخال 10 µL من محلول FITC-Dextran في القناة الوعائية.
3. وضع شريحة الموائع الدقيقة على منصة مجهر فلوري مقلوب لالتقاط صور فلورية لكل من القناة الوعائية والقناة الدماغية المجاورة بفواصل زمنية قدرها 20 min لمراقبة انتشار الدكستران عبر الحاجز البطاني.
4. قياس معامل النفاذية (P_app, cm/s) باستخدام الصيغة التالية:
  P_app (cm/s)=
  حيث P_app هو معامل النفاذية الظاهري (cm/s)، وF_S هو شدة الفلورة في الوقت الابتدائي في القناة الدموية، وF_C هو شدة الفلورة في القناة الدماغية في نهاية فترة الانتشار، وΔt هو زمن الانتشار (s)، وVT هو حجم انتشار FITC-dextran في القناة الدماغية (cm³)، وA هي مساحة السطح البطاني (cm²).
  ملاحظة: يشير معامل النفاذية المنخفض إلى سلامة أعلى للحاجز الدموي الدماغي (BBB) وتكوين حاجز بطاني أكثر إحكاماً.
5. إجراء تحليل البيانات وتحديد المعاملات.
  ملاحظة: تم طرح قيم الخلفية من قيم شدة الفلورة في كل من القناتين الدموية والدماغية باستخدام قياسات مأخوذة من المناطق الخالية من الخلايا في الشريحة. تم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) على كلا جانبي الواجهة الدموية الدماغية بناءً على طول انتشار الفلورة. تم حساب مساحة السطح البطاني (A) من مساحة الواجهة بين القناتين الوعائية والدماغية (باستخدام الفجوة بين عمودين دقيقين كمرجع): 200 µm × 150 µm = 30,000 µm² = 3 × 10^-6 cm². تم اشتقاق حجم انتشار FITC-dextran (VT) من مسافة اختراق الانتشار في القناة الدماغية مضروبة في A. تم التقاط الصور الفلورية كل 20 min (1200 s) على مدار فترة 60 min؛ وحُسب معامل النفاذية باستخدام بيانات الفاصل الزمني 20 min. حُسبت قيم النفاذية من ثلاث شرائح مستقلة لكل مجموعة تجريبية. أُجريت جميع تحويلات الوحدات قبل التعبير عن النفاذية بصيغة cm/s.
تحليل الفلورة المناعية لبروتين ZO-1
1. غسل قنوات الموائع الدقيقة ثلاث مرات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) لإزالة ما تبقى من وسط الزراعة.
2. تثبيت الخلايا عن طريق إدخال 4% بارافورمالدهيد (PFA) في القنوات والتحضين لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة.
3. زيادة نفاذية الخلايا باستخدام 0.1% Triton X-100 في PBS لمدة 15 min في درجة حرارة الغرفة.
4. منع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة عن طريق تحضين القنوات مع 2% ألبومين مصل بقري (BSA) في PBS لمدة 45 min في درجة حرارة الغرفة.
5. إدخال الجسم المضاد الأولي anti-ZO-1 (تخفيف 1:200) في القنوات والتحضين عند 4 °C طوال الليل.
6. غسل القناة جيداً بـ PBS لإزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط.
7. تحضين الشرائح مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب مقترن بـ Alexa Fluor 555 (تخفيف 1:1000) لمدة 45 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.
8. صبغ الأنوية تباينياً باستخدام 1 µg/mL من 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.
  ملاحظة: مادة DAPI حساسة للضوء ويجب حمايتها من الضوء أثناء الصبغ.
9. غسل القنوات ثلاث مرات بـ PBS.
10. تصوير جهاز الموائع الدقيقة باستخدام مجهر فلوري مقلوب ومجهر مسح ليزري بؤري لتصور تموضع ZO-1 على طول الوصلة بين الخلايا البطانية.

4. توصيل الميسيلات النانوية المعززة بالموجات فوق الصوتية عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB) إلى خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM)

التحفيز بالموجات فوق الصوتية
1. أخرج الشريحة بعناية من طبق الزرع وضعها داخل كابينة السلامة البيولوجية.
2. طبّق التحفيز بالموجات فوق الصوتية باستخدام نظام موجات فوق صوتية علاجي مجهز بمحول طاقة بتردد 1 ميجاهرتز (مساحة الإشعاع الفعالة: 5 سم٢)²).
3. ضع وسادة اقتران صوتي طبية بسمك 3 مم بين مسبار الموجات فوق الصوتية وسطح شريحة الموائع الدقيقة لضمان كفاءة الانتقال الصوتي.
4. ضع مسبار الموجات فوق الصوتية مباشرة فوق منطقة القناة الوعائية في الجهاز مائع الميكروات.
  ملاحظة: تؤدي الفقاعات الهوائية الموجودة بين المحول والرقاقة إلى تقليل انتقال الطاقة الصوتية بشكل كبير، لذا يجب تجنب تكونها.
5. اضبط معلمات الموجات فوق الصوتية كما يلي: دورة التشغيل: 60%؛ التردد: 1 ميجاهرتز؛ الشدة: 1 واط/سم²²؛ مدة التعرض: 30 ثانية؛ تردد تكرار النبضات (PRF): 100 هرتز. تتوفر معايير الموجات فوق الصوتية التفصيلية في الجدول التكميلي 1.
6. بالنسبة لمجموعة الضبط غير المعالجة، ضع محول الطاقة فوق الصوتي في الموضع نفسه، ولكن تأكد من إبقائه غير نشط ليكون بمثابة ضابط وهمي، مع ضمان تطابق إجراءات المناولة دون التعرض للموجات الصوتية.
7. بعد التعرض للموجات فوق الصوتية، قم بإزالة وسادة التوصيل وأعد الشريحة على الفور إلى طبق زراعة معقم.
8. أضف وسط استنبات جديداً إلى منافذ الإدخال في الشريحة.
9. حضّن الجهاز عند 37 °C مع 5% من أول أكسيد الكربون (CO)₂ حتى إجراء المزيد من التحليل.
تقييم تعديل الحاجز الدموي الدماغي المستحث بالموجات فوق الصوتية
1. أجرِ صبغ التألق المناعي لبروتين ZO-1 فوراً بعد العلاج بالموجات فوق الصوتية (0 ساعة) وبعد 24 ساعة من العلاج لتقييم التغيرات في سلامة الموصلات المحكمة.
2. اتبع إجراء صبغ التألق المناعي الموصوف في الخطوة 3.2.
3. قارن توزيع صبغة ZO-1 على طول المحور z لتقييم تأثير التحفيز بالموجات فوق الصوتية على سلامة الموصلات المحكمة في الحاجز الدموي الدماغي.
تحضير وتوصيف النانوميسيلات SFN@RB@SPM
1. قم بتحضير النانوميسيلات SFN@RB@SPM وفقاً للبروتوكول المعتمد مسبقاً¹⁷وباختصار، خُلطت المحاليل الأم لكل من الببتيد الأمفيفيلي (المسمى SPM، بتركيز 6 ملغ/مل)، وRB (بتركيز 0.6 ملغ/مل)، وSFN (بتركيز 6 ملي مولار) بنسبة حجمية بلغت 1:1:1.
2. ضع الخليط في جهاز سونيكيتور (sonicator) وقم بمعالجته بالموجات فوق الصوتية عند تردد 28 كيلو هرتز، 25 °C لمدة 30 دقيقة.
3. أجرِ عملية الديلزة (الديلزة الغشائية) للخليط (حد القطع للوزن الجزيئي: 1000 دالتون) لمدة 48 ساعة لإزالة الـ RB والـ SFN الحرين.
4. قِس حجم وجهد زيتا للميكيلات النانوية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). بيانات التوصيف موضحة في الشكل التكميلي 4.
تقييم توصيل المذيلات النانوية المحفزة بالموجات فوق الصوتية وتراكمها في خلايا الورم الدبقي
1. مباشرة بعد التعرض للموجات فوق الصوتية، أدخل وسط الزرع الذي يحتوي على المذيلات النانوية في القناة الوعائية لجهاز الموائع الدقيقة.
2. لتقييم انتقال المذيلات النانوية عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB)، ضع الشريحة الموائع مجهرية التدفق على منصة مجهر فلورسنتي مقلوب، والتقط صوراً فلورسنتية لكل من القناة الوعائية وقناة الدماغ المجاورة بفواصل زمنية مدتها 20 دقيقة على مدار 60 دقيقة.
3. قم بقياس صور الفلورة في قناة الدماغ لتقييم نفاذية المذيلات النانوية المعززة بالموجات فوق الصوتية.
4. لتقييم تراكم المذيلات النانوية (nanomicelles) في خلايا الورم الدبقي، يتم تحضين الجهاز تحت ظروف استزراع قياسية (37 °C، 5% CO2₂لمدة 3 ساعات بعد التعرض للموجات فوق الصوتية، ثم يتم تصوير قناة الورم الدبقي باستخدام مجهر فلوري لتقييم امتصاص النانوميسيلات داخل الخلايا.
التحليل الإحصائي
1. يُعبر عن جميع البيانات الكمية في صورة المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
2. يتم إجراء كل تجربة باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3 شرائح لكل حالة تجريبية). وبالنسبة لكل مكرر بيولوجي، تم قياس ثلاث مكررات تقنية على الأقل (منطقة اهتمام ROI لكل قناة) لضمان موثوقية البيانات.
3. احسب معامل النفاذية (P_تطبيق، سم/ثانية) من كل شريحة مستقلة، والتي استُخدمت كووحدة تحليل أساسية لجميع المقارنات الإحصائية.
  ملاحظة: أُجريت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار Student للعينات غير المرتبطة وذي الذيلين. اختبار tتم تحليل المقارنات بين ثلاث مجموعات أو أكثر باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، يليه اختبار توكي البعدي (Tukey’s post hoc test) للمقارنات المتعددة. أما بالنسبة للتجارب التي تضمنت متغيرين مستقلين، فقد أُجري تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA) يليه اختبار توكي للمقارنات المتعددة. وقد أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برامج إحصائية وبرامج للتمثيل البياني. pقيمة الـ p <اعتُبرت القيمة 0.05 دالة إحصائياً.

النتائج

لإعادة تكوين بنية الحاجز الدموي الدماغي (BBB) in vivo، تم تطوير شريحة مائعية دقيقة ذات زراعة ثلاثية من خلال دمج خلايا HCMECs، وخلايا ACs الأولية، وخلايا U87-MG (والتي سميت بـ "نموذج الشريحة"). كما هو موضح في الشكل 1A،B، تم ترتيب ثلاث قنوات متوازية داخل الجهاز: القناة الوعائية (اليسرى، زرقاء)، وقناة الدماغ المملوءة بـ Matrigel (المركزية، وردية)، وقناة الورم (اليمنى، خضراء)، والتي تم استزراعها بخلايا HCMECs وACs وU87-MG على التوالي. تفصل بين القنوات مصفوفات من الركائز المجهرية التي تحافظ على حصر الـ matrigel في القسم المركزي مع السماح بالتبادل الجزيئي والخلوي بين القنوات. بعد تعقيم الجهاز، تم إدخال خلايا ACs (بتركيز 2.5 × 10⁶ cells/mL) معلقة في Matrigel بنسبة 3:5 (v/v) إلى قناة الدماغ. وعند بلمرة Matrigel، تم استزراع خلايا HCMECs (بتركيز 2 × 10⁶ cells/mL) في القناة الوعائية اليسرى. وبعد زراعة مشتركة لخلايا ACs وHCMECs لمدة يومين، تم إدخال خلايا U87-MG (بتركيز 2 × 10⁶ cells/mL) في قناة الورم اليمنى لإنشاء قسم GBM. تم تأسيس نموذج الشريحة بالكامل بحلول اليوم الخامس. ثم تم تقييم سلامة الحاجز عن طريق صبغ المناعة لبروتين ZO-1 وقياسات نفاذية 40 kDa FITC-dextran. وكما هو موضح في الشكل 1C، أظهر ZO-1 توزيعاً خطياً مستمراً على طول الواجهة بين HCMEC وACs، مما يؤكد تشكل وصلات محكمة عند واجهة الحاجز الدموي الدماغي. وأظهر إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بالمجهر البؤري إشارات ZO-1 بارزة عند واجهة القناة الوعائية والدماغية (المستوى z-y، الشكل 1D)، مما يؤكد تكوين حاجز بطاني سليم داخل الشريحة. ولتحديد وظيفة الحاجز بشكل أكبر، تم تقييم النفاذية لـ 40 kDa FITC-dextran. تم قياس النفاذية على فترات زمنية مدتها 20 دقيقة على مدار ساعة واحدة. وكما هو موضح في الشكل 1E،F، كان معامل النفاذية (3.46 ± 0.50) × 10^-6cm/s عند 60 دقيقة، وهو ما يضاهي الدورة الدموية الدقيقة في الجرذان in vivo¹⁸ والنماذج المتقدمة القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)¹⁹، ويمثل تحسناً ملحوظاً عن النماذج التقليدية التي تقتصر على الخلايا البطانية فقط¹³. مجتمعة، أثبتت هذه البيانات الهيكلية والوظيفية النجاح في تأسيس منصة BBB-GBM ذات صلة فسيولوجية.

بما أنه قد أُبلغ عن قدرة الموجات فوق الصوتية على إحداث فتح عابر وقابل للانعكاس إلى حد كبير في الحاجز الدموي الدماغي (BBB)، مع استعادة وظيفة الحاجز عادةً في غضون 24 h²⁰، فقد تم بعد ذلك استقصاء التأثير المباشر لتحفيز الموجات فوق الصوتية (US) على وظيفة الحاجز الدموي الدماغي في نموذج الشريحة عند الساعة 0 h أو بعد 24 h من التعرض للموجات فوق الصوتية. عُرِض نموذج الشريحة للموجات فوق الصوتية (1 W/cm², 1MHz, 30 s). وأظهر تحليل التألق المناعي لبروتين ZO-1 شدة مماثلة عند الساعة 0 h و 24 h بعد العلاج بالموجات فوق الصوتية (الشكل 2A)، مما يشير إلى الحفاظ على سلامة الموصلات المحكمة. وأكد التحليل الكمي لتألق ZO-1 تماثل شدة الإشارة عند الواجهة الوعائية الدماغية بين المجموعة الضابطة والمجموعة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (الشكل 2B). ولتقييم ما إذا كان التعرض للموجات فوق الصوتية قد عزز نفاذية الحاجز الدموي الدماغي، استُخدم FITC-dextran بوزن 40 kDa ككاشف للنفاذية. وكما هو موضح في الشكل 2C,D، أدى التعرض للموجات فوق الصوتية إلى تسريع انتشار الكاشف عبر الحاجز الدموي الدماغي على الفور، حيث ارتفع معامل النفاذية من 4.20 x 10^-6cm/s في المجموعة غير المعالجة إلى 1.33 x 10^-5cm/s. وعند الساعة 24 h بعد التعرض للموجات فوق الصوتية، انخفض معامل النفاذية إلى 8.04 x 10^-6cm/s، مما يمثل تعافيًا كبيرًا مقارنة بمجموعة ما بعد التعرض الفوري للموجات فوق الصوتية، على الرغم من بقائه أعلى قليلاً من مستوى المجموعة الضابطة غير المعالجة. وتثبت هذه النتائج أن الموجات فوق الصوتية منخفضة الكثافة تؤدي إلى فتح عابر للحاجز الدموي الدماغي يليه تعافٍ كبير في وظيفة الحاجز مع الحفاظ على السلامة الهيكلية في نموذج الشريحة.

تم بعد ذلك تقييم نفاذية المذيلات النانوية SFN@RB@SPM عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB) تحت تحفيز الموجات فوق الصوتية (US). في دراستنا السابقة، تبين أن هذه المذيلات النانوية ذاتية التجميع تعبر الحاجز الدموي الدماغي بفعالية وتتراكم في موقع الورم في نموذج فأر مصاب بورم دبقي مزروع¹⁷. ولفحص ما إذا كان تعديل الموجات فوق الصوتية يعزز نقل SFN@RB@SPM في نموذج الرقاقة هذا، طبقنا نفس معاملات الموجات فوق الصوتية الموضحة في الشكل 2C. وقد أدى التعرض للموجات فوق الصوتية إلى تسريع انتقال SFN@RB@SPM بشكل ملحوظ عبر الحاجز الدموي الدماغي، مما رفع معامل النفاذية من (2.42 ± 0.15) × 10^-5cm/s إلى (4.58 ± 0.07) × 10^-5cm/s بعد 60 دقيقة من العلاج، وهو ما يمثل زيادة بمقدار 1.9 ضعف مقارنة بمجموعة الضبط (الشكل 3A،B). وللتحقق من استهداف الورم النشط، تم قياس إشارة الفلورة الحمراء لـ RB في قناة الورم الدبقي بعد حقن المذيلات النانوية في القناة الوعائية. وكما هو موضح في الشكل 3C، لوحظت زيادة ملحوظة في الفلورة الحمراء في قناة الورم الدبقي بعد 3 ساعات من التعرض للموجات فوق الصوتية، مما يشير إلى تعزيز نقل المذيلات النانوية عبر الحاجز الدموي الدماغي. وفي حالة عدم وجود الموجات فوق الصوتية، تم رصد فلورة ضئيلة فقط، مما يؤكد أن اختراق الحاجز الدموي الدماغي ضروري لوصول SFN@RB@SPM وتركيزها داخل موقع الورم.

مخطط لشريحة مائيات مجهرية للحاجز الدموي الدماغي وتجربة توضح تحليل بيانات النفاذية.
الشكل 1: تصنيع وتوصيف نموذج BBB-GBM على شريحة. (A) مخطط للجهاز المائعي المجهري ثلاثي القنوات: القناة الوعائية (باللون الأزرق)، وقناة الدماغ (باللون الوردي)، وقناة الورم (باللون الأخضر). (B) صورة للشريحة المجمعة من PDMS والزجاج. (C) صبغ مناعي لبروتين ZO-1 (باللون الأحمر) عند الوصلات البطانية، مع صبغ نووي مضاد بـ DAPI (باللون الأزرق). شريط القياس: 50 µm. (D) مناظر بؤرية متعامدة (x-z و y-z) توضح تركيز ZO-1 (باللون الأحمر) عند الواجهة الوعائية الدماغية. (E) صور ممثلة بفاصل زمني لانتشار 40 kDa FITC-dextran من القناة الوعائية إلى قناة الدماغ على مدار 60 min (بفواصل زمنية قدرها 20 min). شريط القياس: 200 µm. (F) معاملات النفاذية المحددة كمياً، والتي تؤكد وظيفة الحاجز الانتقائي حسب الحجم. تمثل البيانات المتوسط ± SEM من ثلاث شرائح مستقلة (n = 3). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات المتعددة. تظهر قيمة p الدقيقة في الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المجهر الفلوري، رسم بياني للنفاذية، مقارنة بالموجات فوق الصوتية، تصوير زمني، تحليل النفاذية.
الشكل 2: فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) والتعافي اللاحق لوظيفة الحاجز الناجم عن الموجات فوق الصوتية. (A) صبغ مناعي لبروتين ZO-1 عند الواجهة الوعائية الدماغية فوراً (0 h) وبعد 24 h من المعالجة بالموجات فوق الصوتية. تظهر الصور عمليات إعادة بناء بؤرية ثلاثية الأبعاد (3-D confocal reconstructions). (B) كثافة الفلورة المعيارية لـ ZO-1 على طول المحور z (العمق) عند الواجهة الوعائية الدماغية في المجموعة الضابطة والمجموعة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (US). (C) حركية انتشار 40 kDa FITC-dextran من المقصورات الوعائية إلى الدماغ عند 0 h و 24 h، مع أو بدون التعرض للموجات فوق الصوتية (تم التقاط الصور بفواصل زمنية قدرها 20-min على مدى 60 min). شريط المقياس: 200 µm. (D) معامل النفاذية المكمم للمقتفي 40 kDa عند 0 h أو 24 h بعد الموجات فوق الصوتية، مع أو بدون المعالجة بالموجات فوق الصوتية. تمثل البيانات المتوسط ± SEM من ثلاث شرائح مستقلة (n = 3). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA)، متبوعاً باختبار Tukey post hoc للمقارنات المتعددة. الدلالة الإحصائية: p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

دراسة نفاذية الخلايا مع تطبيق الموجات فوق الصوتية؛ وتتضمن صور الفاصل الزمني، ورسماً بيانياً شريطياً للنفاذية، ومجهراً فلورياً مع مقارنة تلوين DAPI.
الشكل 3: نفاذية SFN@RB@SPM واستهدافه لخلايا U87-MG المعزز بالموجات فوق الصوتية (US). (A) قياس نفاذية SFN@RB@SPM عبر الواجهة الوعائية الدماغية، مع أو بدون التعرض للموجات فوق الصوتية. شريط المقياس: 200 µm. (B) معاملات النفاذية الكمية لـ SFN@RB@SPM في ظروف المجموعة الضابطة والظروف المعالجة بالموجات فوق الصوتية. (C) تراكم SFN@RB@SPM في القناة الورمية بعد فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) بوساطة الموجات فوق الصوتية، حيث تم تسجيل الفلورة الحمراء بعد 3 h من الحقن. شريط المقياس: 50 µm. تمثل البيانات المتوسط ± SEM من ثلاث شرائح مستقلة (n = 3). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار Student’s t-test غير المقترن وذي الذيلين. الدلالة الإحصائية: p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: مخطط تصميم CAD لشريحة الموائع الدقيقة لنموذج الحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي (BBB-GBM).يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التصميم التفصيلي لشريحة BBB-GBM. يتكون التصميم من ثلاث قنوات مائعية دقيقة متوازية؛ يبلغ عرض كل من القناتين الجانبيتين 1000 µm، بينما يبلغ عرض القناة المركزية 1300 µm.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: توصيف الخلايا النجمية الأولية بواسطة GFAP (باللون الأخضر)، وصبغ النوى باستخدام DAPI (باللون الأزرق). شريط المقياس: 50 µm.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: توصيف المذيلات النانوية ذاتية التجميع SFN@RB@SPM. (A) تحليل تشتت الضوء الديناميكي (DLS) يوضح توزيع حجم SFN@RB@SPM، بمتوسط قطر جسيمات يبلغ حوالي 64 nm. (B) يشير قياس جهد زيتا إلى شحنة سطحية تبلغ حوالي 150.67 ± 2.85 mV. أجريت جميع القياسات باستخدام أجهزة DLS.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: جدول ملخص لمعلمات الموجات فوق الصوتية.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول إنشاء شريحة ميكروفلويديك لمحاكاة الحاجز الدموي الدماغي وورم الأرومة الدبقية (BBB-GBM) لتقييم تعديل الحاجز الدموي الدماغي بوساطة الموجات فوق الصوتية وإيصال المذيلات النانوية. وبالمقارنة مع نماذج الحاجز الدموي الدماغي التقليدية المختبرية in vitro (مثل Transwell)، تتيح هذه المنصة الميكروفلويديكية زراعة مشتركة محددة مكانيًا للخلايا البطانية، والخلايا النجمية (ACs)، وخلايا الورم الدبقي، مما يسمح بدراسة انتقال الدواء عبر حاجز دموي دماغي ذي صلة فسيولوجيًا. تتطلب عدة خطوات حرجة في البروتوكول تحسينًا دقيقًا لضمان تشكيل حاجز موثوق. أحد المعايير الأساسية هو نسبة الحجم بين Matrigel والوسط الخاص بمعلق الخلايا النجمية المستخدم لتحضير المزيج الذي يتم تحميله في القناة الدماغية المركزية. تعد هذه النسبة حاسمة للحفاظ على لزوجة الجل المناسبة بحيث يظل مزيج AC-Matrigel داخل القناة الوسطى أثناء التحميل. إذا كان المزيج يحتوي على جزء مفرط من وسط معلق الخلايا النجمية، فقد تؤدي اللزوجة المنخفضة إلى تسرب Matrigel إلى القنوات الميكروية المجاورة، مما يسمح للخلايا النجمية بالهجرة إلى القنوات المجاورة. وعلى العكس من ذلك، فإن Matrigel عالي التركيز قد يضعف حيوية الخلايا ويعيق انتشار العناصر الغذائية. توفر النسبة المحسنة 3:5 (v/v) من معلق الخلايا النجمية و Matrigel (الخطوة 2.2.7) استقرارًا ميكانيكيًا كافيًا للاحتفاظ بالجل داخل القناة المركزية مع دعم نمو الخلايا النجمية داخل Matrigel. وقد تم تسليط الضوء على اعتبارات مماثلة في نماذج ميكروفلويديك أخرى للحاجز الدموي الدماغي، حيث تكون لزوجة الهيدروجيل المناسبة (مثل الفبرين أو Matrigel) ضرورية لمنع التسرب عبر القنوات، والحفاظ على الفصل المكاني لأقسام الخلايا، ومحاكاة خصائص المصفوفة خارج الخلوية⁷^,²¹^,²².

ثانياً، فور استزراع خلايا HCMECs في القناة الوعائية، يجب وضع الجهاز الموائع الدقيق بشكل جانبي لمدة 30 min تقريباً. تعزز هذه الخطوة التصاق خلايا HCMECs على طول الجدار الجانبي بين القناتين الوعائية والدماغية، وهو أمر ضروري لتكوين حاجز بطاني مستمر عند الواجهة البينية بين الخلايا. وبدون هذه الخطوة، تستقر خلايا HCMECs بشكل أساسي على السطح السفلي للقناة، مما يؤدي إلى تغطية بطانية غير مكتملة على طول الجدار الجانبي وانخفاض سلامة الحاجز. كما تضمن خطوة استزراع خلايا HCMECs الإضافية اللاحقة تحقيق كثافة خلوية كافية داخل القناة الوعائية. ويعد الحفاظ على كثافة خلوية مناسبة أمراً هاماً لأن انخفاض كثافة HCMECs يمكن أن يؤدي إلى تكوين طبقة أحادية غير مكتملة وزيادة الموت الخلوي المبرمج. وقد أكدت دراسات سابقة حول نموذج الحاجز الدموي الدماغي على شريحة (BBB-on-a-chip) وبالمثل أن تحقيق طبقة بطانية أحادية متصلة أمر بالغ الأهمية لسلامة الحاجز والتعبير عن بروتينات الوصلات المحكمة في أنظمة الموائع الدقيقة²³^,²⁴.

يمكن أن يؤدي استكشاف المشكلات الشائعة وإصلاحها إلى تحسين قابلية التكرار بشكل كبير. في حال حدوث تسرب لـ Matrigel إلى القنوات المجاورة أثناء تحميل قناة الدماغ (الخطوة 2.2.8): (1) تأكد من حفظ خليط Matrigel والخلايا على الثلج لمنع بلمرة Matrigel؛ (2) احقن خليط الخلايا و Matrigel ببطء وبثبات لتجنب التدفق إلى القنوات المجاورة؛ (3) اضبط نسبة Matrigel إلى الخلايا لتصبح 5:4 (v/v)، مما يساعد في الحفاظ على اللزوجة المناسبة والحصر داخل القناة المركزية. بالإضافة إلى ذلك، يعتمد التكوين الناجح للحاجز البطاني بقوة على التصاق وكثافة الخلايا البطانية الكافية. إذا فشلت الخلايا البطانية في تكوين طبقة أحادية مستمرة على طول واجهة القناة الوعائية، فكر في زيادة كثافة استزراع الخلايا البطانية أو تمديد وقت الالتصاق لتحسين التغطية البطانية وتكوين الموصلات المحكمة. وفي حال ظهور فقاعات هوائية في القناة بعد إضافة الوسط، قم بالنقر برفق على الشريحة أو إزالتها باستخدام طرف ماصة أصفر مع شفط لطيف، حيث أن الفقاعات المحتبسة بالقرب من الحاجز البطاني قد تؤدي إلى تعطيل سلامة الموصلات المحكمة موضعياً.

على الرغم من أن نموذج BBB-GBM على شريحة (BBB-GBM on-a-chip) الموصوف هنا يوفر نموذجاً أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية، إلا أنه يمكن تحسين عدة جوانب في الدراسات المستقبلية لتعزيز الدقة الفسيولوجية والفهم الميكانيكي. يتمثل الجانب الأول في استخدام النموذج الحالي لخلايا ACs أولية مشتقة من الجرذان مستزرعةร่วม مع HCMECs، مما أدى إلى عدم تطابق في الأنواع. ورغم أن هذا النهج قد استخدم على نطاق واسع لبناء منصة BBB-on-a-chip¹³^,²³، إلا أن الاختلافات بين الأنواع قد تؤثر على خصائص الحاجز واستجابات نفاذية الأدوية. ستتضمن الدراسات المستقبلية خلايا ACs مشتقة من iPSC البشرية أو خلايا ACs بشرية أولية لإنشاء نموذج بشري بالكامل، مما سيقضي على هذا القصور ويعزز بشكل أكبر الصلة الترجمية للمنصة. ثانياً، يفتقر النموذج الحالي إلى مكونات الوحدة الوعائية العصبية، وخاصة الخلايا الحولية (pericytes) والخلايا المناعية، والتي تعد منظمات مهمة لوظيفة BBB وتطور الورم²⁵^,²⁶. ومن شأن دمج هذه المكونات أن يحاكي بشكل أفضل تعقيد البيئة الدقيقة للورم. ثالثاً، يعمل الجهاز في ظروف استاتيكية دون تروية مستمرة للوسط. وقد ثبت أن إجهاد القص الفسيولوجي الناتج عن تدفق الدم يعزز خصائص BBB عن طريق زيادة تعبير بروتينات الوصلات المحكمة مثل claudin-5 وoccludin . لذا، فإن غياب التدفق قد يتسبب في معامل نفاذية أعلى في الشرائح الاستاتيكية مقارنة بالأنظمة الديناميكية²⁷. رابعاً، تم تقييم سلامة BBB بشكل أساسي من خلال الجمع بين صبغ المناعة الفلورية لـ ZO-1 وتحليل نفاذية FITC-dextran. ومع ذلك، فإن هذه المقاييس البنيوية والوظيفية المتكاملة تستخدم على نطاق واسع للتحقق من BBB في كل من نماذج transwell التقليدية ونماذج BBB-on-a-chip الموائعية الدقيقة⁶^,²⁸^,²⁹. ومن شأن التوصيف الإضافي للمنظمات الرئيسية التي تتحكم في النقل عبر الخلايا وبجوار الخلايا، بما في ذلك claudin-530 وMFSD2A وcaveolin-1، أن يوفر تقييماً أكثر شمولاً لوظيفة BBB³⁰^,³¹^,³². وسيتم دمج هذه المؤشرات في الدراسات المستقبلية لتعزيز التوصيف الفسيولوجي للمنصة. وأخيراً، يستخدم البروتوكول الحالي الموجات فوق الصوتية العلاجية منخفضة الكثافة دون استخدام فقاعات دقيقة خارجية أو قياس مباشر للضغط الصوتي. وعلى عكس أنظمة الموجات فوق الصوتية المركزة التقليدية، التي توظف عادةً فتح BBB بمساعدة الفقاعات الدقيقة in vivo، صممت الدراسة الحالية لإنشاء منصة in vitro مبسطة وقابلة للتكرار لتقييم تعديل نفاذية BBB ونقل الطب النانوي الناجم عن الموجات فوق الصوتية. ويقلل هذا النهج من المتغيرات الإضافية المرتبطة بتركيز الفقاعات الدقيقة وتوزيعها وسلوك التكهف في بيئة موائعية دقيقة ميكروية. ومع ذلك، فإن الدراسات المستقبلية التي تدمج الموجات فوق الصوتية بمساعدة الفقاعات الدقيقة، ومراقبة درجة الحرارة، والتوصيف التفصيلي للمجال الصوتي ستعزز بشكل أكبر الصلة الفسيولوجية والفهم الكمي لتعديل BBB بوساطة الموجات فوق الصوتية.

بشكل عام، يوفر البروتوكول المعروض هنا منصة ميكروفلويديك مضبوطة لمحاكاة الحاجز الدموي الدماغي والورم الأرومي الدبقي (BBB-GBM)، وهي قادرة على دمج التحفيز بالموجات فوق الصوتية والتحليل الكمي لتوصيل المذيلات النانوية. يتيح هذا النظام الاستقصاء المباشر لفتح الحاجز الدموي الدماغي بوساطة الموجات فوق الصوتية، ومن ثم نقل الأدوية النانوية عبر الحاجز البطاني. وبالإضافة إلى تقييم توصيل المذيلات النانوية، يمكن استخدام هذه المنصة أيضاً لفحص قدرة الأدوية على اختراق الحاجز الدموي الدماغي، ودراسة آليات تعطيل هذا الحاجز، وتوفير منصة قوية للتقييم قبل السريري للعلاجات الموجهة للجهاز العصبي المركزي (CNS).

الإفصاحات

أثناء إعداد هذه المخطوطة، استخدم المؤلفون ChatGPT (OpenAI) لغرض تحرير اللغة وتحسينها فقط. وقد قام المؤلفون بمراجعة وتحرير جميع المحتويات التي تمت الاستعانة بالذكاء الاصطناعي في إنتاجها، ويتحملون المسؤولية الكاملة عن دقة المخطوطة وسلامتها. لم يتم استخدام أي أدوات ذكاء اصطناعي لتوليد البيانات أو تحليلها أو إعداد الأشكال.

شكر وتقدير

نقر بامتناننا للتمويل المقدم من مؤسسة تشجيانغ الطبيعية للعلوم (LQ24H160003)، ومؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة تشجيانغ (2024KY351)، ومؤسسة نينغبو للعلوم الطبيعية (2023J365)، وبرنامج يونغجيانغ لاستقطاب المواهب (مشروع المواهب الابتكارية الشابة، 2021A-012-G)، وبرنامج بي آن للمواهب في منطقة جيانغبي، نينغبو (2023RC004).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب مقترن بـ Alexa Fluor 555	Cell Signaling Technology, Inc.	4413
جسم مضاد لـ ZO-1	شركة Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.	40-2200
خزعة ثقبية	شركة Zhejiang YoungChip Technology المحدودة	10305130004
ألبومين المصل البقري	Absin Bioscience Inc.	9048-46-8
عداد الخلايا	شركة Thermo Fisher Scientific المحدودة	Countess TM3
طبق زراعة خلايا (100 ملم)	Corning Inc.	430167
جهاز طرد مركزي	Beckman Coulter, Inc.	Avanti J-15R
قناع كروم	شركة سوزو تشيب للأجهزة العلمية المحدودة (Suzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.)	ZX-GBYM
المجهر البؤري الماسح بالليزر	Carl Zeiss AG	Zeiss LSM900
DAPI	شركة Beyotime Biotech Inc.	C1002
المُطور	شركة سوزو شيب للأجهزة العلمية المحدودة (Suzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.)	RCD-400
DMEM/F12	مختبرات ScienCell Research Laboratories	C3130-0500
المصفوفة خارج الخلوية	مختبرات ScienCell للأبحاث	1001
إيثانول	مصنع نينغبو تشنهاي يونغفنغ للمواد الكيميائية	6923193900015
مصل جنين البقر	مختبرات ساين سيل للأبحاث (ScienCell Research Laboratories)	C04001-500
فيجي (Fiji Is Just ImageJ)	مشروع مفتوح المصدر	بما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي المراد ترجمته إلى اللغة العربية، وسأقوم بصياغته وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة لـ JoVE.
ديكستران مُعلم بـ FITC (40 كيلو دالتون)	شركة Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.	GC19938
شرائح زجاجية	شركة سيتوتست العلمية المحدودة (Citotest Scientific Co., Ltd.)	188105W
GraphPad Prism 9.5	GraphPad Software, Inc.	بما أنه لا يوجد نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة.
خلايا بطانية مجهرية وعائية دماغية بشرية (HCMECs)	مجموعة مزارع BeNa	BNCC337717
حضّانة	شركة Esco Lifesciences المحدودة	CLM-170B-8-CN
مجهر فلوري مقلوب	Nikon Instruments Inc.	TS2-FL
إيزوبروبانول	شركة سينوفارم للكواشف الكيميائية المحدودة (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.)	80109218
ماتريجيل (Matrigel)	Corning Inc.	354234
وسط إيجل الأساسي المعدل (MEM)	بريسيلا لعلوم الحياة (Pricella Life Science) &شركة amp; للتكنولوجيا المحدودة.	PM150410
النيتروجين	شركة نينغبو بايفانغ للغاز المحدودة (Ningbo Baifang Gas CO., Ltd.)	نظرًا لعدم وجود نص مصدر للترجمة، يرجى تقديم المحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية.
الأكسجين	شركة نينغبو بايفانغ للغاز المحدودة (Ningbo Baifang Gas CO., Ltd.)	نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تقديم النص الإنجليزي المطلوب ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والمهنية المحددة.
بارافورمالدهيد (PFA، 4%)	شركة ووهان سيرفيسبيو للتكنولوجيا المحدودة (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.)	G1101-500مل
محلول منظم من الفوسفات الملحي (PBS)	مختبرات ScienCell للأبحاث	C3580-0500
بولي داي ميثيل سيلوكسان (PDMS)	Corning Inc.	220777
بنسلين/ستربتومايسين	بريسيلا لعلوم الحياة (Pricella Life Science) &شركة amp; للتكنولوجيا المحدودة	PB180120
الطباعة الحجرية الضوئية	معهد البصريات والإلكترونيات، الأكاديمية الصينية للعلوم	URE-2000\AL
لوح تسخين للتصوير الضوئي	شركة سوزو وينهاو لتكنولوجيا الموائع الدقيقة المحدودة (Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.)	WH-HP-02
جهاز ترميد البلازما	شركة TIANKECHUANGDA المحدودة	PT-05-LF
الخلايا النجمية الأولية	نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تقديم المحتوى المراد ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بترجمته وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.	يرجى تقديم النص المراد ترجمته.	عُزلت من دماغ جرذ حديث الولادة (اليوم 1-3)
رقاقة السيليكون	شركة Zhejiang YoungChip Technology المحدودة	10204040001
جهاز الطلاء الدوراني	شركة سوزو وينهاو لتكنولوجيا الموائع الدقيقة المحدودة (Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.)	WH-SC-01
SU-8	شركة Kayaku Advanced Materials Inc.	1030403002
Triton X-100	بكين سولاربيو ساينس (Beijing Solarbio Science) &شركة amp; Technology المحدودة	9002-93-1
تريبسين	مختبرات سايينسيل للأبحاث (ScienCell Research Laboratories)	C3530-0100
خلايا U87-MG	بريسيلا لعلوم الحياة (Pricella Life Science) &شركة amp; للتكنولوجيا المحدودة	CL-0238
جهاز الموجات فوق الصوتية	شركة شينزين دونغديكسين للتكنولوجيا المحدودة (Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.)	Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(blue edition)	Carl Zeiss AG	يرجى تقديم النص الذي ترغب في ترجمته.

المراجع

Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1667-1681.
Shawahna R, Decleves X, Scherrmann JM. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 2013;14(1):120-136.
Oddo A, Peng B, Tong Z, Wei Y, Tong WY, Thissen H, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier (BBB) Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.
Hajal C, Offeddu GS, Shin Y, Zhang S, Morozova O, Hickman D, et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nat Protoc. 2022;17(1):95-128.
Xu H, Li Z, Yu Y, Sizdahkhani S, Ho WS, Yin F, et al. A dynamic in vivo-like organotypic blood-brain barrier model to probe metastatic brain tumors. Sci Rep. 2016;6:36670.
Park J, Wetzel I, Marriott I, Dreau D, D'Avanzo C, Kim DY, et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2018;21(7):941-951.
Park TE, Mustafaoglu N, Herland A, Hasselkus R, Mannix R, FitzGerald EA, et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nat Commun. 2019;10(1):2621.
Peng B, Tong Z, Tong WY, Pasic PJ, Oddo A, Dai Y, et al. In situ surface modification of microfluidic blood-brain-barriers for improved screening of small molecules and nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):56753-56766.
Mainprize T, Lipsman N, Huang Y, Meng Y, Bethune A, Ironside S, et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: a clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):321.
Adriani G, Ma D, Pavesi A, Kamm RD, Goh EL. A 3D neurovascular microfluidic model consisting of neurons, astrocytes and cerebral endothelial cells as a blood-brain barrier. Lab Chip. 2017;17(3):448-459.
Silvani G, Scognamiglio C, Caprini D, Marino L, Chinappi M, Sinibaldi G, et al. Reversible cavitation-induced junctional opening in an artificial endothelial layer. Small. 2019;15(51):e1905375.
Beekers I, Vegter M, Lattwein KR, Mastik F, Beurskens R, van der Steen AFW, et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 2020;322:426-438.
Qiao C, Luo S, Liu Z, Bu Y, Cai Y, Liu Z, et al. Tuning endothelial barrier permeability with ultrasound: a pulse-length-dependent interplay between bubble dynamics and cellular bioeffects. Ultrason Sonochem. 2026;129:107851.
Li Y, Yang X, Wei Z, Niu H, Wu L, Chen C, et al. Sulforaphane wrapped in self-assembled nanomicelle enhances the effect of sonodynamic therapy on glioma. Pharmaceutics. 2024;17(1):34.
Yuan W, Lv Y, Zeng M, Fu BM. Non-invasive measurement of solute permeability in cerebral microvessels of the rat. Microvasc Res. 2009;77(2):166-173.
Lee SWL, Campisi M, Osaki T, Possenti L, Mattu C, Adriani G, et al. Modeling nanocarrier transport across a 3D in vitro human blood-brain-barrier microvasculature. Adv Healthc Mater. 2020;9(7):e1901486.
Mehta RI, Carpenter JS, Mehta RI, Haut MW, Ranjan M, Najib U, et al. Blood-brain barrier opening with MRI-guided focused ultrasound elicits meningeal venous permeability in humans with early Alzheimer disease. Radiology. 2021;298(3):654-662.
Cho H, Seo JH, Wong KH, Terasaki Y, Park J, Bong K, et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 2015;5:15222.
Campisi M, Shin Y, Osaki T, Hajal C, Chiono V, Kamm RD. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
Wang YI, Abaci HE, Shuler ML. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. 2017;114(1):184-194.
Jiang L, Li S, Zheng J, Li Y, Huang H. Recent progress in microfluidic models of the blood-brain barrier. Micromachines (Basel). 2019;10(6):375.
Bonkowski D, Katyshev V, Balabanov RD, Borisov A, Dore-Duffy P. The CNS microvascular pericyte: pericyte-astrocyte crosstalk in the regulation of tissue survival. Fluids Barriers CNS. 2011;8(1):8.
Hurtado-Alvarado G, Cabanas-Morales AM, Gomez-Gonzalez B. Pericytes: brain-immune interface modulators. Front Integr Neurosci. 2014;7:80.
Santa-Maria AR, Walter FR, Figueiredo R, Kincses A, Vigh JP, Heymans M, et al. Flow induces barrier and glycocalyx-related genes and negative surface charge in a lab-on-a-chip human blood-brain barrier model. J Cereb Blood Flow Metab. 2021;41(9):2201-2215.
van der Helm MW, van der Meer AD, Eijkel JC, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 2016;4(1):e1142493.
Alluri H, Peddaboina CS, Tharakan B. Evaluation of tight junction integrity in brain endothelial cells using confocal microscopy. Methods Mol Biol. 2024;2711:257-262.
Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003;161(3):653-660.
Ben-Zvi A, Lacoste B, Kur E, Andreone BJ, Mayshar Y, Yan H, et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 2014;509(7501):507-511.
Andreone BJ, Chow BW, Tata A, Lacoste B, Ben-Zvi A, Bullock K, et al. Blood-brain barrier permeability is regulated by lipid transport-dependent suppression of caveolae-mediated transcytosis. Neuron. 2017;94(3):581-594 e5.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FITC

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

أبقِني على اطلاع: