مقالة منهجية

نموذج فأر لبطانة الرحم باستخدام وسم جسيمات السيليكا النانوية المصبوغة بصبغة Ex Vivo Cy5.5 لرؤية الآفة

121 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72070

⸱

أغسطس 4, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تظهر هذه الدراسة تحفيز الانتباذ البطاني الرحمي باستخدام وسم خارج الجسم بواسطة جسيمات سيليكا النانوية الممطروبة بصبغة Cy5.5، مما يتيح التصور الفلوري للآفات في بطانة الرحم دون التلاعب الجيني.

الملخص

الانتباذ البطاني الرحمي هو اضطراب نسائي شائع يتميز بنمو نسيج شبيه ببطانة الرحم خارج تجويف الرحم، مما يؤدي إلى التهاب مزمن، وألم الحوض، وعقم. تعد نماذج الفئران الموثوقة ضرورية لدراسة الآليات الجزيئية والهرمونية والمناعية والبيئية التي تقوم عليها تطور المرض وتطوره. تعتمد الطرق التقليدية لتحديد الآفات بطانة الرحم غالبا على فئران الإبلاغ الفلورية المعدلة وراثيا، والتي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة في التنويد. هنا، نقدم نهجا بسيطا غير وراثي لتحفيز وتصور الانتباذ البطاني الرحمي في الفئران من خلال وضع علامات خارج الجسم على شظايا أنسجة رحم المتبرع بها بجزيئات سيليكا نانوية مطعمة ب Cy5.5 قبل الزراعة. تظهر الجسيمات النانوية خصائص فيزيائية كيميائية مفضلة، واستقرارا عاليا في الفلورة، وسمية خلوية قليلة، مما يتيح وضع وسم فعال لأنسجة الرحم دون المساس بالإجراءات التجريبية. بعد الزرع داخل الصفاق في الفئران المتلقية، يمكن بسهولة تمييز الآفات البطانية المهاجرة الموسومة ب Cy5.5 عن الأنسجة المضيفة المحيطة باستخدام التصوير الفلوري. يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار ومتعددة الاستخدامات لتصوير وتتبع الآفات، مما يسهل دراسات مسببات الانتباذ البطاني الرحمي والتقييم قبل السريري للاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية دون الحاجة إلى التلاعب الجيني.

المقدمة

الانتباذ البطاني الرحمي هو مرض نسائي شائع حيث تنمو الخلايا المبطنة للبطانة الرحمية خارج الرحم. تؤدي الآفات الناتجة عن بطانة الرحم إلى حالة التهابية مزمنة1، وغالبا ما تعاني النساء المصابات من آلام الحوض والعقم2. خلل في خلايا بطانة الرحم والخلايا الظهارية يعزز بقاء وتطور الآفات بطانية الرحم 3,4,5,6. يصيب هذا الاضطراب الشائع حوالي 11٪ من النساء في الولايات المتحدة وحدها. يعد سببا رئيسيا للعقم وألم الحوض7، ويزداد انتشاره إلى 50٪–60٪ لدى النساء المصابات بألم الحوض المزمن والعقم 8,9,10,11,12,13. التكلفة السنوية المقدرة لتشخيص وعلاج الانتباذ البطاني الرحمي تتجاوز 22 مليار دولار في الولايات المتحدة14.15. تشمل العلاجات الحالية إزالة الآفات جراحيا أو تحفيز حالة نقص الإستروجين. ومع ذلك، فإن تكرار المرض بعد الجراحة أمر شائع، وغالبا ما تكون العلاجات الحالية غير فعالة 9,16. عادة ما يتم تحديد التشخيص فقط من خلال التصوير الجراحي والتحقق النسيجي17,18. علاوة على ذلك، غالبا ما يكون الانتباذ البطاني الرحمي غير مشخصه أو يخطئ، مع تأخير تشخيصي يتراوح بين 9–11 سنةو19.20. هذا التأخير يفرض عبئا عاطفيا وماليا كبيرا على كل من المرضى ونظام الرعاية الصحية20,21. لذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير طرق غير جراحية لكل من تشخيص وعلاج الانتباذ البطاني الرحمي.

النماذج المختبرية لديها أبحاث متقدمة في علاج الانتباذ البطاني الرحمي. ومع ذلك، لا تزال محدودة في قدرتها على تكرار تعقيد المرض بالكامل. يكمن التحدي الرئيسي في الطبيعة متعددة العوامل لبطانة الرحم البطانية المهاجرة، والتي تتضمن تفاعلات معقدة بين الهرمونات والالتهابات والخلايا المناعية والأعصاب وأنواع الخلايا المتنوعة ضمن بيئة ثلاثية الأبعاد ديناميكية. بالإضافة إلى ذلك، لا تلتقط أنظمة المختبر التقلبات الطبيعية لهرمونات الستيرويد المبيضية، مما يحد من القدرة على دراسة تأثيرات الأمراض على الجهاز التناسلي 21,22,23. لذا، يوفر نموذج للبطانة المهاجرة المستحثة باستخدام فئران سليمة منصة متعددة الاستخدامات للتحقيق في الأدوار الفردية والتفاعلية لجهاز المناعة24، والهرمونات2526، والعوامل البيئية2728 في تطور الانتباذ البطاني الرحمي وتأثيراته على الجهاز التناسلي29. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا، حيث يتم حذف أو الإفراط في التعبير الانتقائي عن جينات معينة في بطانة الرحم، الباحثين من توضيح أدوار المسارات الجزيئية المختلفة في تطور وتقدم الانتباذ البطاني الرحمي. ومع ذلك، لا يزال التمييز الدقيق بين الآفات البطانية المهاجرة والأنسجة المحيطة للعوائل تحديا تقنيا كبيرا.

الجسيمات النانوية المصنوعة بالصبغة هي مجسات متعددة الاستخدامات وقوية لتتبع الخلايا والتصوير الحيوي. هي بسيطة في التصنيع، شديدة التشتت، مستقرة ضوئيا، متوافقة حيويا، وفعالة في وضع العلامات الخلوية30,31. يقوم عمود السيليكا بتثبيت الفلوروفورات الكارهة للماء داخل المصفوفة، مما يجعلها كمراسلين جزيئية فلورية عالية العائد الكمومي (QY) كفؤة. على مر السنين، تم اعتماد هذه الجسيمات النانوية من السيليكا الفلورية على نطاق واسع كملصقات زاهية ومتينة خارج الجسم الخلوي وهياكل الأنسجة قبل الزراعة والتصوير اللاحق في الجسم 32,33,34,35. هنا، نصف إجراء مفصلا لتحفيز الانتباذ البطاني الرحمي في الفئران ذات العلامات خارج الجسم باستخدام جسيمات سيليكا النانوية المشوهة بالصبغة Cy5.5، كما استخدمت في منشور سابق35، مما يتيح تطبيقها كعلامات تصوير مستقرة لتتبع الآفات.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة ميزوري (البروتوكول رقم 65323) وتم تنفيذها وفقا للإرشادات المؤسسية واللوائح الوطنية المعمول بها لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. تحضير مرافق Cy5.5-APTES

  1. قم بإذابة 1 ملغ من إستر السيانين 5.5-NHS في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل كبريتوكسيد (DMSO) في قارورة زجاجية شفافة بحجم 11.1 مل. غط القارورة فورا بورق الألمنيوم لحماية المحلول من الضوء.
    ملاحظة: يمكن تخزين Cy 5.5-APTES المرافق عند 4 درجات مئوية في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد.
  2. أضف 1 ميكرولتر من (3-أمينوبروبيل) تري إيثوكسيسيلان (APTES) إلى محلول الصبغة.
  3. أضف 0.5 ميكرولتر من ثلاثي الإيثيل أمين (TEA) وامزج فورا لتسهيل التفاعل.
  4. حرك خليط التفاعل بسرعة 300 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 24 ساعة للسماح بالاقتران التساهمي بين Cy5.5 وAPTES.
  5. أغلق القارورة بغطاءها واستمر في حمايتها من الضوء عن طريق لفها بورق الألمنيوم.

2. تخليق جسيمات السيليكا النانوية الممطروعة بصبغة Cy5.5

  1. أضف 1 ميكرولتر من محلول الأمونيا المركز (28٪) إلى قارورة زجاجية شفافة جديدة ذات لولب.
  2. أضف 8.5 مل من الإيثانول المطلق (درجة علم الأحياء الجزيئي).
  3. أضف 350 ميكرولتر من رباعي الإيثيل أورثوسيليكات (TEOS).
  4. أضف 15 ميكرولتر من محلول Cy5.5-APTES المحضر إلى خليط تفاعل تخليق السيليكا.
  5. حرك خليط التفاعل بسرعة 500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 24 ساعة لتمكين دمج الصبغة التساهمية في مصفوفة السيليكا.

3. التنقية والتشتت

  1. انقل خليط التفاعل بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
  2. جهز أنبوب توازن يحتوي على كمية متساوية من الماء المقطر للطرد المركزي.
  3. قم بالطرد المركزي في كلا الأنبوبين بدرجة حرارة 12,074 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تأكد من أن الحبيبة الظاهرة قد تكونت في أسفل الأنبوب بعد الطرد المركزي.
  4. اغسل الحبيبة ب 10 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ عن طريق الطرد المركزي بحرارة 12,074 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات، مع إعادة تعليق الحبيبة عن طريق السونيك لمدة تتراوح بين 3–5 دقائق تقريبا بين الغسلات، أو حتى تتشتت تماما.
  5. اغسل الحبيبة ب 5 مل من الماء المقطر والطرد المركزي عند 12,074 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذا الغسيل مرتين، مع إعادة تعليق الحبيبة عن طريق الصوتية لمدة تتراوح بين 3–5 دقائق تقريبا بين الغسلات، أو حتى يتم تشتتها بالكامل.
  6. أعد تعليق الحبيبة في 5 مل من الماء المقطر عن طريق الصوتية حتى تتشتت تماما (لم تلاحظ أي شظايا صلبة تؤكد التشتت). تأكد من أن تعليق الجسيمات يبدو أزرق بشكل واضح بعد التشتت الكامل.
  7. انقل التعليق إلى قارورة زجاجية، ولف القارورة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء، وخزنها في درجة حرارة الغرفة.
  8. تقييم تشتت الجسيمات والفلورة باستخدام نظام التصوير داخل الجسم ( IVIS). استخدم طول موجة إثارة 680 نانومتر وطول موجة انبعاث 710 نانومتر ل Cy5.5.

4. تحفيز الانتباذ البطاني الرحمي باستخدام وسم خارج الجسم بواسطة جسيمات سيليكا النانوية الممطرة بصبغة Cy5.5

  1. حقن فأر متبرعة أنثى عمرها 8 أسابيع (السلالة: C57Bl6J X129Sv) تحت الجلد بجرعة E2 (100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام/مل في زيت السمسم) مرة يوميا في الصباح لمدة ثلاثة أيام متتالية لتزامنة الهرمونات.
  2. قم بقتل الفأر المتبرع عن طريق خلع عنق الرحم بعد 6 ساعات من الحقن النهائي E2، وإزالة الرحم.
  3. قم بتقطيع نسيج الرحم إلى حوالي 1 ممو3 أجزاء في طبق بتري باستخدام مشرط30،36.
  4. حضن شظايا أنسجة الرحم (45 ملغ) بجزيئات سيليكا نانوية مطعمة بالصبغة 20٪ (v/v) Cy5.5 في صفيحة مكونة من 24 بئر تحتوي على وسط RPMI-1640 كامل (10٪ FBS) لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  5. قم بتخدير الفأر المستقبل (السلالة: C57Bl6J X129Sv) باستخدام 3٪ من الإيزوفلوران في الأكسجين وقم بعمل شق بطني بطول 0.5 سم في منتصف الخط.
    ملاحظة: ضع الفأر في غرفة تحفيز تحتوي على 3٪ من الإيزوفلوران حتى يتم التخدير. احلق البطن وانقل الفأر إلى منصة الجراحة. ضع مخروط الأنف المخدر قبل بدء الجراحة.
  6. اغسل شظايا نسيج الرحم الموسومة خارج الجسم بوسط زراعة بدرجة حرارة الغرفة بواسطة الطرد المركزي بحرارة 380 × جرام لمدة دقيقتين. كرر الغسيل ثلاث مرات.
  7. تحت التخدير، قم بعمل شق بطني بقطر 1 سم في منتصف الجرذان المتلقية. علق 45 ملغ من شظايا الأنسجة الموسومة ب Cy5.5 في 500 ميكرولتر من PBS وحقن التعليق في تجويف الصفاق باستخدام إبرة قياس 20.
  8. أغلق الصفاق بخياطة قابلة للامتصاص وأغلق الجلد بمشابك الجرح. ضع الفأر في بيئة دافئة وراقبه حتى التعافي من التخدير.
  9. قم بقتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم عند نقطة التجربة المختارة وجمع الآفات البطانية الرحمية.

النتائج

يمكن استخدام جسيمات السيليكا النانوية الممطروعة بالصبغة كمجسات تصوير لتطبيقات وسم الخلايا. تم تصنيع جسيمات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغ (Cy5.5-SiNPs) على خطوتين باستخدام عملية سيليكا سول-جل وتم تحويلها إلى صبغة السيليكا الفلورية Cy5.5 باستخدام كيمياء السيلان (الشكل 1). كشف المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) عن جسيمات نانوية كروية منتظمة بأقطار 156.67 ± 15.23 نانومتر (الشكل 1A). أظهر التشتت الديناميكي للضوء (DLS) أن الجسيمات النانوية المصنعة (SiNPs وCy5.5-SiNPs) كانت مستقرة غروية، بأقطار هيدروديناميكية (Hd) تبلغ 130.67 ± 3.20 نانومتر (PDI = 0.152 ± 0.009) و185.9 ± 5.44 نانومتر (PDI = 0.14 ± 0.009)، على التوالي (الشكل 1B). كانت جهود زيتا لوحدات SiNPs العارية وCy5.5-SiNPs −32.39 ± 3.55 مللي فولت و−50.53 ± 2.47 مللي فولت على التوالي (الشكل 1C). أكد مطيافية الإضاءة الضوئية (طول موجة الإثارة = 680 نانومتر؛ طول موجة الانبعاث = 710 نانومتر) الدمج الناجح ل Cy5.5 في جسيمات السيليكا النانوية، وأظهرت جسيمات Cy5.5-SiNPs تألقا مميزا (الشكل 1D). تم تأكيد نجاح التصلب الصبغي بشكل أكبر من خلال طيف الإضاءة الضوئية. بالإضافة إلى ذلك، كان العائد الكمومي (QY) لصبغة Cy5.5-SiNPs (φ = 0.31) مماثلا لصبغة Cy5.5 الحرة (φ = 0.23)36.

لتقييم التوافق الحيوي للجسيمات النانوية، تم حضنة خلايا ظهارة بطانة الرحم 12Z طوال الليل مع Cy5.5-SiNPs في DMEM عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂. تم تقييم بقاء الخلايا باستخدام اختبار MTT بعد العلاج بتركيزات جسيمات نانوية بلغت 0، 0.5، 1، 2.5، 5، و10 ميكروغرام/مل (الشكل 1E). لم يلاحظ أي سمية خلوية عند تركيزات تصل إلى 10 ميكروغرام/مل. أظهرت الخلايا التي تم حضنها ب 5 ميكروغرام/مل Cy5.5-SiNPs امتصاصا فعالا للجسيمات النانوية، مع المجهر الفلوري الذي أظهر توطين الجسيمات في المنطقة حول النواة (الشكل 1F). على النقيض من ذلك، لم يتم اكتشاف فلورة Cy5.5 في الخلايا الضابطة غير المعالجة. كما أظهرت Cy5.5-SiNPs المحضرة استقرارا مائيا، بأقطار هيدروديناميكية تتراوح بين 170–190 نانومتر في المياه منزوعة الأيونات والحفاظ على شدة فلورية مستقرة لمدة سبعة أيام، كما تم تحديدها بواسطة DLS وتصوير الفلورة على التوالي (الشكل 1G، H).

لإثبات ملاءمة جسيمات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغ ب Cy5.5 لوضع علامات الأنسجة خارج الجسم الحي ، تم التحقق من خصائصها التألقية قبل تحفيز الانتباذ البطاني الرحمي. أظهر تصوير IVIS انبعاث فلوري قوي من معلقات الجسيمات النانوية، في حين لم تلاحظ إشارة فلورية قابلة للكشف في جهاز التحكم السلبي الذي يحتوي على الماء فقط، مما يؤكد خصوصية وحساسية كشف فلورة Cy5.5 (الشكل 2).

تم تحسين تركيز ووقت الحضانة لوضع العلامات خارج الجسم لشظايا أنسجة الرحم لاحقا. تم اكتشاف التألق في شظايا أنسجة الرحم حضنة بجسيمات سيليكا مطعمة بالصبغ بنسبة 20٪ (v/v) Cy5.5 لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية تحت 5٪CO235. أكد تصوير IVIS إشارات فلورية قوية ومتسقة من شظايا الأنسجة الموسومة. تظهر هذه النتائج أن جسيمات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغ من Cy5.5 تضع علامات فعالة على شظايا نسيج الرحم دون تعديل وراثي (الشكل 3).

تم تقييم قدرة شظايا نسيج الرحم النانوية الموسومة بجسيمات السيليكا المشوهة بصبغة Cy5.5 على تحفيز الانتباذ البطاني الرحمي وتسهيل تحديد الآفات. تم حقن شظايا الأنسجة الموسومة في تجويف الصفاق للفئران المتلقية، وتمت مراقبة تقدم المرض لمدة شهر. في نهاية التجربة، تم تحديد آفات بطانة الرحم بسهولة داخل التجويف البريتوني. تم تمييز الآفات الموجبة ل cy5.5 بوضوح عن الأنسجة المضيفة المحيطة من خلال تصوير IVIS والمجهر الفلوري، مما أتاح التعرف السريع والواضح على الآفات. تم تأكيد فلورة Cy5.5 داخل الآفات بشكل إضافي بواسطة المجهر التألقي.

تظهر هذه النتائج أن وضع العلامات خارج الجسم بواسطة جسيمات السيليكا النانوية المطبعة بصبغة Cy5.5 يدعم نجاح تحفيز الانتباذ البطاني الرحمي وتمكين الرؤية الموثوقة للآفات البطانية المهاجرة في الجسم الحي (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: التوصيف الفيزيائي لجزيئات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغة Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs). (أ) صورة المجهر الإلكتروني الناقل التمثيلي (TEM) لجرسيمات Cy5.5-SiNPs. قطر الجسيمات = 156.67 ± 15.23 نانومتر. شريط المقياس = 100 نانومتر. (ب) قياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لأقطار SiNPs الهيدروديناميكية (130.67 ± 3.20 نانومتر، PDI = 0.152 ± 0.009) وCy5.5-SiNPs (185.9 ± 5.44 نانومتر، PDI = 0.14 ± 0.009). (ج) قياسات جهد زيتا لعناصر SiNPs (−32.39 ± 3.55 mV) وCy5.5-SiNPs (−50.53 ± 2.47 mV)، مما يظهر انخفاض جهد زيتا بعد اقتران Cy5.5. (د) ملف الفلورة لوحدات Cy5.5-SiNPs (طول موجة الإثارة = 680 نانومتر؛ طول موجة الانبعاث = 710 نانومتر). إدخال المواد: صور الحقل الساطع والفلورة لCy5.5-SiNPs متناثرة في الماء. (ه) اختبار بقاء خلايا MTT لخلايا 12Z عولجت ب Cy5.5-SiNPs بتركيزات 0، 0.5، 1، 2.5، 5، و10 ميكروغرام/مل. (و) امتصاص الخلايا ل Cy5.5-SiNPs بواسطة خلية 12Z. تمت معالجة الخلايا بمتلازمة PBS (ضابطة) أو Cy5.5-SiNPs. أزرق = DAPI; الأحمر = Cy5.5-SiNPs. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (G) استقرار حجم Cy5.5-SiNPs المخزنة في الماء لمدة 7 أيام، دون أن يظهر أي تغيير كبير في القطر الهيدروديناميكي. (ح) استقرار فلورية لمواد Cy5.5-SiNPs المخزنة في الماء لمدة 7 أيام، دون إظهار أي تغيير ملحوظ في شدة التألق. إدخال داخلي: صور فلورية تمثيلية تم التقاطها في الأيام 1 و3 و6. NS = غير معنوية. تعرض القيم كمتوسط ± SD. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تأكيد جسيمات السيليكا النانوية المطبعة بالصبغة ب Cy5.5. (أ) صورة تمثيلية لجسيمات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغة ب Cy5.5. (ب) الكشف عن فلورة Cy5.5 من جسيمات السيليكا النانوية المطبعة بصبغة Cy5.5 باستخدام تصوير IVIS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: وسم خارج الجسم الحي لشظايا أنسجة الرحم باستخدام جسيمات سيليكا النانوية الممطببة بصبغة Cy5.5. تظهر اللوحة اليسرى شظايا نسيج رحمي تحكم غير معالجة، وتظهر اللوحة اليمنى شظايا أنسجة رحمية موسومة بجسيمات سيليكا نانوية مطعمة بصبغة Cy5.5. تم اكتشاف فلورة Cy5.5 باستخدام تصوير IVIS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: اكتشاف آفات بطانة الرحم الموسومة بجسيمات سيليكا النانوية المشوهة بالصبغة Cy5.5. (أ) صورة IVIS لتجويف الصفاق. (ب) المجهر الفلوري للآفات البطانية الفضائية الموسومة ب Cy5.5 يتيح التعرف بوضوح داخل التجويف الصفاقي. (ج) صور مجهرية فلورية تمثيلية لآفات بطانة الرحم. يشير الفلورة الصفراء إلى إشارة Cy5.5، وتم صبغ النوى ب DAPI. (د) صورة تمثيلية لآفة بطانة الرحم. يشير السهم إلى جسيمات سيليكا النانوية المشوهة بالصبغة Cy5.5. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تقدم هذه الدراسة نهجا يعتمد على جسيمات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغة Cy5.5 كطريقة عملية وفعالة لرؤية آفات بطانة الرحم في نماذج الفئران35. تقدم هذه الاستراتيجية عدة مزايا، منها بساطتها ومرونتها وطبيعتها غير الجينية، مما يلغي الحاجة إلى إنتاج حيوانات مترجمة للوراثة. مقارنة بأساليب التصوير التقليدية، مثل نماذج الفئران الفلورية المراسلة، تقلل هذه الطريقة من التعقيد التقني مع الحفاظ على كفاءة وسم قوية، مما يوسع من سهولة الوصول إليها لأبحاث الانتباذ البطاني الرحمي. بالإضافة إلى ذلك، توفر جسيمات السيليكا النانوية منصة مستقرة لدمج الأصباغ الفلورية واحتفاظها بكفاءة داخل الأنسجة، مما يدعم تحديد الآفة القابلة لتكرار التأثير.

التمييز بين الآفات البطانية القطبية عن نسيج المضيف المحيط أمر ضروري لدراسة بدء المرض وتطوره في نماذج الفئران. تعبر فئران Rosa26mTmG بشكل واسع عن بروتين فلوري الطماطم (mT) الموجه للغشاء، والذي يتحول إلى بروتين فلوري أخضر موجه للغشاء بعد الاستئصال بواسطة Cre في أنسجة مستهدفةمحددة 37. على الرغم من توفر العديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا لدراسة وظيفة الجينات في الانتباذ البطاني الرحمي، فإن إنتاج حيوانات الإبلاغ الفلورية يتطلب جهدا كبيرا ويستغرق وقتا طويلا. على النقيض من ذلك، يوفر الوسم خارج الجسم الحي باستخدام جسيمات السيليكا النانوية المشوهة بالصبغة Cy5.5 بديلا سريعا ومرنا وغير جيني لرؤية الآفات، مع البقاء متوافقا مع مجموعة واسعة من نماذج الفئران الموجودة.

يعتمد التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول على التحكم الدقيق في عدة معايير تجريبية حيوية. أثناء تخليق الجسيمات النانوية، يؤثر تركيز المحفز، وتركيب المذيب، ومعدل إضافة TEOS، وظروف الخلط، وكفاءة الغسيل بشكل مباشر على حجم الجسيمات وشدة الفلورة وقابلية تكرار الوسم. توفر طريقة شتوبر نهجا بسيطا وقابلا للتوسع وقابلا للتكرار لتخليق جسيمات السيليكا الفلورية النانوية مع تحكم دقيق في حجم الجسيمات ودمج الصبغة المستقرة 38,39,40,41. مقارنة بطرق المستحلبات الدقيقة العكسية، يقلل نهج ستوبر من تحديات التنقية المرتبطة بالمواد السطحية مع الحفاظ على فلورة Cy5.5 تحت ظروف التفاعل المعتدلة 39,40,41,42. زيادة تركيز المحفز تزيد عادة من حجم الجسيمات40، بينما معدل زيادة TEOS أسرع يعزز تكوين النواة، مما يؤدي إلى جسيماتأصغر 41. الغسل الشامل ضروري لإزالة الكواشف غير المتفاعلة وتحسين استقرار الجسيمات النانوية أثناء التخزين.

هناك عدة عوامل إضافية مهمة لتحقيق وسم الأنسجة خارج الجسم القابل للتكرار وتكوين الآفات. يحسن حجم شظايا أنسجة الرحم الموحد، وتشتت الجسيمات النانوية المتجانسة، وظروف الحضانة المتسقة كفاءة الوسم وتقلل من التباين التجريبي. معالجة الأنسجة الضابطة غير المعنونة بالتوازي ضرورية أيضا للتمييز بين التألق الحقيقي ل Cy5.5 وبين التألق الذاتي للأنسجة والإشارات الخلفية غير المحددة. أثناء تحفيز الآفات، يؤدي التهيئة الهرمونية المستمرة للفئران المتبرعة، والزرع اللطيف لشظايا الأنسجة الموسومة، والرعاية المناسبة بعد الجراحة إلى تقليل إصابات الأنسجة والالتهابات غير النوعية، مما يحسن من قابلية تكرار تكوين الآفات.

على الرغم من هذه المزايا، يجب النظر في عدة قيود. قد تختلف استمرارية واستقرار إشارة الفلورة في الجسم الحي بعد الزرع بسبب إعادة تشكيل الأنسجة، وتكاثر الخلايا، والتنظيف المناعي. وباعتبارها علامة فلورية خارجية، من المتوقع أن تنخفض إشارة Cy5.5 تدريجيا مع انقسام الخلايا الموسومة، مما قد يحد من جدوى الدراسات الطولية طويلة الأمد. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر التفاوت في تحضير الأنسجة وامتصاص الجسيمات النانوية على كفاءة الوسم بين التجارب، مما يبرز أهمية الإجراءات التجريبية الموحدة.

على الرغم من أن الدراسة الحالية تركز على الكشف عن الآفات خارج الجسم الحي، إلا أن Cy5.5 هو صبغة فلورية حمراء بعيدة/قريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR) تقلل من التألق الذاتي للأنسجة وتتيح اختراقا أعمق للفوتونات. تجعل هذه الخصائص البصرية Cy5.5 مناسبا جدا لتطبيقات التصوير الحي. وبناء عليه، توفر استراتيجية وسم جسيمات السيليكا النانوية عالية العائد الكمي Cy5.5 المشوهة بالصبغة منصة قوية لتتبع الآفات الطولية غير الجراحية باستخدام الفلورة NIR والتصوير الصوتي الضوئي43,44.

يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على تحسين متانة الفلورة وتحسين اتساق العلامات عبر ظروف التجارب بشكل أكبر. سيساعد التقييم المنهجي لاحتفاظ الإشارة في تحديد نافذة التصوير المثلى للدراسات الطولية، بينما قد يعزز التحسين المستمر لتصميم الجسيمات النانوية وظروف الوسم الحساسية ويوسع تطبيق هذا النهج على نماذج الأمراض الأخرى. بشكل عام، توفر هذه الاستراتيجية القائمة على الجسيمات النانوية بديلا سريعا وقابلا للتكرار ومتعدد الاستخدامات لأساليب الوسم الجيني لرؤية آفات بطانة الرحم المهاجرة، ويجب أن تسهل الدراسات الميكانيكية والتقييم قبل السريري للاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) التابع ليونس كينيدي شرايفر (R01HD108895 إلى تي. كيه. وج. و. ج. ج.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)Sigma-Aldrich440140Purity ≥99%
17β-EstradiolMilliporeSigmaE8875Purity ≥98%
Ammonium hydroxideFisher ScientificA669S-50028% ammonium hydroxide solution
BD Autoclip Wound Closing SystemBD427631Surgical wound clips
Clear glass threaded vialFisherbrandFS60910A-311.1 mL clear glass vial
Cyanine 5.5 NHS esterSigma-AldrichGEPA15502Near-infrared fluorescent dye
Ethanol, absoluteFisher ScientificBP2818Molecular biology grade
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044Cell culture supplement
High-speed centrifugeBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-EHigh-speed centrifuge
In vivo imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumFluorescence imaging system
IsofluraneBaxterNDC1001-9-360-60Inhalation anesthetic
Magnetic stir barFisherbrand14-513-648 mm
Magnetic stir plateChelmsfordSP88854200Variable-speed magnetic stirrer
Refrigerated centrifugeEppendorf5427 REquipped with FA-45-48-11 rotor
RPMI-1640 mediumGibco11835-030Cell culture medium
Sesame oilMilliporeSigmaS3547Vehicle for estradiol preparation
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)Sigma-Aldrich86578Purity ≥99%
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886Purity ≥99%
Ultrasonic bathFisherbrandCPX1800HFor nanoparticle dispersion by sonication

المراجع

  1. Marquardt RM, Kim TH, Shin JH, Jeong JW. Progesterone and estrogen signaling in the endometrium: What goes wrong in endometriosis? Int J Mol Sci. 2019;20(15).
  2. Yilmaz BD, Bulun SE. Endometriosis and nuclear receptors. Hum Reprod Update. 2019;25(4):473–485.
  3. Kanzaki H, Wang HS, Kariya M, Mori T. Suppression of natural killer cell activity by sera from patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1992;167(1):257–261.
  4. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril. 1992;58(2):290–295.
  5. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S, Hiroi M. Decreased natural killer cell activity in women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 1992;34(1):27–30.
  6. Vigano P, Vercellini P, Di Blasio AM, Colombo A, et al. Deficient antiendometrium lymphocyte-mediated cytotoxicity in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1991;56(5):894–899.
  7. Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med. 2009;360(3):268–279.
  8. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):235–258.
  9. Johnson NP, Hummelshoj L, World Endometriosis Society Montpellier Consortium. Consensus on current management of endometriosis. Hum Reprod. 2013;28(6):1552–1568.
  10. Kim JJ, Kurita T, Bulun SE. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocr Rev. 2013;34(1):130–162.
  11. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril. 2012;98(3):511–519.
  12. Fadhlaoui A, Bouquet de la Joliniere J, Feki A. Endometriosis and infertility: How and when to treat? Front Surg. 2014;1:24.
  13. D'Hooghe TM, Debrock S, Hill JA, Meuleman C. Endometriosis and subfertility: Is the relationship resolved? Semin Reprod Med. 2003;21(2):243–254.
  14. Simoens S, Hummelshoj L, D'Hooghe T. Endometriosis: Cost estimates and methodological perspective. Hum Reprod Update. 2007;13(4):395–404.
  15. Gao X, Outley J, Botteman M, Spalding J, et al. Economic burden of endometriosis. Fertil Steril. 2006;86(6):1561–1572.
  16. Brown J, Farquhar C. An overview of treatments for endometriosis. JAMA. 2015;313(3):296–297.
  17. Martin DC, Hubert GD, Vander Zwaag R, el-Zeky FA. Laparoscopic appearances of peritoneal endometriosis. Fertil Steril. 1989;51(1):63–67.
  18. Quesada J, Harma K, Reid S, Rao T, et al. Endometriosis: A multimodal imaging review. Eur J Radiol. 2023;158:110610.
  19. Culley L, Law C, Hudson N, Denny E, et al. The social and psychological impact of endometriosis on women's lives: A critical narrative review. Hum Reprod Update. 2013;19(6):625–639.
  20. Nnoaham KE, Hummelshoj L, Webster P, et al. Reprint of: Impact of endometriosis on quality of life and work productivity: A multicenter study across ten countries. Fertil Steril. 2019;112(4 Suppl 1):e137–e152.
  21. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol. 2011;7(5):611–626.
  22. Malvezzi H, Marengo EB, Podgaec S, Piccinato CA. Endometriosis: Current challenges in modeling a multifactorial disease of unknown etiology. J Transl Med. 2020;18(1):311.
  23. Esfandiari F, Mansouri N, Shahhoseini M, Heidari Khoei H, et al. Endometriosis organoids: Prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 2022;45(1):5–9.
  24. Lin YJ, Lai MD, Lei HY, Wing LY. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 2006;147(3):1278–1286.
  25. Fang Z, Yang S, Lydon JP, DeMayo F, et al. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil Steril. 2004;82(3):673–678.
  26. Fang Z, Yang S, Gurates B, Tamura M, et al. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(7):3460–3466.
  27. Foster WG, Ruka MP, Gareau P, Foster RA, et al. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: Application to toxicology. Can J Physiol Pharmacol. 1997;75(10–11):1188–1196.
  28. Cummings AM, Metcalf JL, Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: Time-dose dependence and species comparison. Toxicol Appl Pharmacol. 1996;138(1):131–139.
  29. Yoo JY, Kim TH, Shin JH, Marquardt RM, et al. Loss of MIG-6 results in endometrial progesterone resistance via ERBB2. Nat Commun. 2022;13(1):1101.
  30. Ow H, Larson DR, Srivastava M, Baird BA, et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 2005;5(1):113–117.
  31. Chung SJ, Hadrick K, Nafiujjaman M, Apu EH, et al. Targeted biodegradable near-infrared fluorescent nanoparticles for colorectal cancer imaging. ACS Appl Bio Mater. 2024;7(12):7861–7870.
  32. Pittet MJ, Swirski FK, Reynolds F, Josephson L, et al. Labeling of immune cells for in vivo imaging using magnetofluorescent nanoparticles. Nat Protoc. 2006;1(1):73–79.
  33. Nguyen TT, Nguyen HN, Nghiem THL, Do XH, et al. High biocompatible FITC-conjugated silica nanoparticles for cell labeling in both in vitro and in vivo models. Sci Rep. 2024;14(1):6969.
  34. Marquardt RM, Nafiujjaman M, Kim TH, Chung SJ, et al. A mouse model of endometriosis with nanoparticle labeling for in vivo photoacoustic imaging. Reprod Sci. 2022;29(10):2947–2959.
  35. Kim TH, Bae N, Kim T, Hsu AL, et al. Leptin stimulates endometriosis development in mouse models. Biomedicines. 2022;10(9).
  36. Bouteiller C, Clave G, Bernardin A, Chipon B, et al. Novel water-soluble near-infrared cyanine dyes: Synthesis, spectral properties, and use in the preparation of internally quenched fluorescent probes. Bioconjug Chem. 2007;18(4):1303–1317.
  37. Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593–605.
  38. Stӧber W, Fink A, Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. J Colloid Interface Sci. 1968;26(1):62–69.
  39. Thorat AV, Ghoshal T, Chen L, Holmes JD, et al. Synthesis and stability of IR-820 and FITC-doped silica nanoparticles. J Colloid Interface Sci. 2017;490:294–302.
  40. Silva AS, Santos JHZ. Silica particle size and polydispersity control from fundamental practical aspects of the Stöber method. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 2024;702:135190.
  41. Saha A, et al. Greening the pathways: A comprehensive review of sustainable synthesis strategies for silica nanoparticles and their diverse applications. RSC Adv. 2024;14(16):11197-11216.
  42. Lian Y, Ding LJ, Zhang W, Zhang XA, et al. Synthesis of highly stable cyanine-dye-doped silica nanoparticles for biological applications. Methods Appl Fluoresc. 2018;6(3):034002.
  43. Kumar PPP, Chung SJ, Hadrick K, Hill ML, et al. Noninvasive detection and thermal ablation therapy of endometriosis using silica-coated gold nanorods. Adv Nanobiomed Res. 2025;5(12):2500101.
  44. Rahman MS, et al. Nanoceria as a non-steroidal anti-inflammatory drug for endometriosis theranostics. J Control Release. 2025;378:1015-1029.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

234 234 FITC

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.