إثبات استهداف مثبط الببتيديل الفلوري لمادة ClpXP الميتوكوندرية باستخدام المجهر الفلوري في الخلايا الثديية

ملخص

يؤسس هذا البروتوكول سير عمل تصوير كمي يتضمن تطبيق المجهر الكونفوكلي لمراقبة التمركز الانتقائي لمثبط ClpP الببتيديلي الفلوري FAM-FAPAL-CMK (كربوكسي فلوريساين-FAPAL-كلوروميثيل كيتون) في الميتوكوندريا لاستهداف ClpP، والتغيرات الشكلية اللاحقة في الميتوكوندريا في الخلايا السليمة الناتجة عن تثبيط ClpP.

الملخص

تعد البروتيازات المعتمدة على ATP الميتوكوندرية ضرورية للحفاظ على توازن البروتين من خلال تحلل البروتينات التالفة أو غير المطوية بشكل خاطئ. من بين هذه المواد، يقع مركب بروتياز ClpXP في مصفوفة الميتوكوندريا ويساهم في مراقبة جودة الميتوكوندريا تحت الظروف الفسيولوجية والإجهاد. يظهر هذا العمل سير عمل مجهر فلوري كمي لتقييم استهداف الميتوكوندريا لمثبط الببتيديل الفلوري FAM-FAPAL-CMK وتقييم التغيرات الشكلية للميتوكوندريا المرتبطة بتثبيط ClpXP في الخلايا الثديية. تمت معالجة خلايا HeLa ب FAM-FAPAL-CMK وتم تحليلها باستخدام المجهر الكونفوكلي مع تلوين فلوري مناعي لمؤشرات الميتوكوندريا وتحليل الصور الكمي. أظهر تحليل التداخل باستخدام عتبة كوستس ومعاملات تداخل ماندرز وجود إثراء ميتوكوندري لإشارة المثبط. ونتيجة لذلك، غير تثبيط ClpP شكل الميتوكوندريا. أظهر تحليل القطع المناعية عدم وجود تغيير كبير في وفرة بروتين ClpP بعد العلاج بالمثبط. مجتمعة، يصف هذا العمل سير عمل قائم على التصوير القابل للتكرار يتيح استجواب وظائف ClpXP الميتوكوندرية في الخلايا السليمة استجابة لاضطرابات التوازن التأكسدي، مثل الإجهاد التأكسدي.

المقدمة

تعد البروتيازات المعتمدة على ATP الميتوكوندرية مركزية في توازن البروتين، حيث تدمر البروتينات التي تم طيها بشكل خاطئ أو تالفة 1,2,3,4,5,6. من بين هذه المواد، ClpXP هو مركب بروتياز AAA+ غير متجانس يقع في مصفوفة الميتوكوندريا. يتعرف جهاز ClpX ATPase على البروتينات ويفتحها، ثم ينقلها إلى غرفة ClpP البروتيولية ^7,8,9. إلى جانب بروتيازات الميتوكوندريا الأخرى، يحافظ ClpXP على مراقبة جودة البروتين في الظروف الطبيعية والإجهاد، بما في ذلك الإجهاد التأكسدي والاضطرابات الأيضية ^1,2,4. تم ربط اضطراب توازن البروتين الميتوكوندري بأمراض مثل التنكس العصبي والسرطان، مما يبرز أهمية فهم هذه الأنشطة البروتيازية في الأنظمة الخلوية السليمة ^3,6,10.

تحد كبير في هذا المجال هو نقص الطرق لمراقبة نشاط بروتياز الميتوكوندريا بشكل مباشر مع دقة مكانية في الخلايا السليمة. تعتمد الأساليب الحالية بشكل أساسي على الاختبارات الكيميائية الحيوية باستخدام البروتينات المنقاء أو محللات الخلايا، التي توفر معلومات حركية مفصلة لكنها لا تحفظ السياق تحت الخلوي ^11,12,13,14. لقد عالجت استراتيجيات علم الأحياء الكيميائي هذا القيد جزئيا من خلال تطوير ركائز ببتيدية فلوروجينية ومثبطات موجهة للمواقع النشطة. تمكن ركائز الببتيديل الفلورية من قياس النشاط الببتيداز المعتمد على ATP بشكل كموي، بينما تشكل مثبطات الببتيديل تفاعلات تساهمية عكسية مع موقع المحلل البروتيني لتحقيق التثبيط الانتقائي^{13، 15، 16، 17، 18، 19}. سابقا، أظهر مثبط ClpXP المصنع في المختبر FAPAL-CMK أنه يشكل رابطة تساهمية مع ClpP²⁰. في هذه الدراسة، تم تطوير FAM-FAPAL-CMK، وهو مشتق موسوم بالفلوريسين من FAPAL-CMK، كمثبط قائم على آلية ل ClpP، مما أتاح تصور موقعه داخل الخلية.

مقارنة بالاختبارات الكيميائية الحيوية، يمكن المجهر الفلوري الكونفوكي من تقييم توزيع المجس وشكل الميتوكوندريا في الخلايا السليمة بشكل مكاني، مما يوفر معلومات لا يمكن الحصول عليها من التحلل فقط. ومع ذلك، وعلى عكس الاختبارات الإنزيمية، لا يقيس تحديد موقع الفلورة النشاط التحفيزي أو أحداث الارتباط الجزيئي بشكل مباشر، وقد يتأثر بكفاءة امتصاص المجسات، وديناميكيات الميتوكوندريا، وظروف التصوير. بالإضافة إلى ذلك، يعتمد التنفيذ الناجح على تراكم كاف للمجسات وشبكات ميتوكوندرية محددة بشكل كاف، مما يجعل هذا السير العمل أكثر ملاءمة للخلايا المزروعة الملتصقة ذات الشكل الميتوكوندري المميز بوضوح.

هدف هذه الدراسة هو إنشاء سير عمل كمي يدمج مجسات فلورية قائمة على آليات مع المجهر الكونفوكالي لمراقبة موقع ووظيفة بروتياز الميتوكوندريا في الخلايا السليمة. من خلال دمج المجسات الكيميائية الانتقائية مع التصوير الكونفوكلي عالي الدقة، يمكن هذا السير من تقييم تحديد موقع الميتوكوندريا، وتوزيع المجسات، والاستجابات الشكلية لاضطرابات توازن الميتوكوندريا في الخلايا السليمة. يمكن أن يكمل الاختبارات الكيميائية الحيوية الموجودة التي تقيس نشاط البروتيازات مباشرة لكنها تفتقر إلى الدقة المكانية.

البروتوكول

أجريت التجارب باستخدام خلايا HeLa المتوفرة تجاريا. لم يتم استخدام أي مشاركين بشريين أو حيوانات فقارية أو مواد بيولوجية أولية مشتقة من الإنسان أو الفقاريات. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا والعلاج

1. زراعة خلايا HeLa في وسط النسر المعدل (DMEM) في دولبيكو مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
2. تضع خلايا الألواح على أغطية زجاجية معقمة وتحتضن لمدة 24 ساعة للسماح بتثبيت الخلايا.
3. إذابة المثبط FAM-FAPAL-CMK في DMSO لتحضير مخزون 50 ميكروموتر وتجمده عند -20 درجة مئوية للتخزين.
4. أضف 50 نانومتر من FAM-FAPAL-CMK إلى وسط نمو الخلايا في عينات الخلايا المعالجة.
5. أضف حجما مساويا من DMSO لعينات التحكم لتتوافق مع التركيز النهائي للمذيب في عينات المعالجة بالمثبطات، مما يضمن أن أي تأثيرات ليست ناتجة عن DMSO.
6. حضن الخلايا لمدة 18 ساعة إضافية تحت نفس ظروف الزراعة قبل المعالجة اللاحقة.
   ملاحظة: مثبط FAM-FAPAL-CMK مصمم ومركب في المختبر، وقد تم الإبلاغ عن طريقة التخليق قبل²⁰.

2. التثبيت والنفاذية

1. اغسل الخلايا بمحلول D-PBS المسخن مسبقا لمدة 5 دقائق وكرر العملية مرة واحدة.
2. ثبت الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول PHEM (أنابيب 68 ملليمول، 25 ملليمولار HEPES، 15 ملليمولار EGTA، 3 ملليمولار ملغ كلول₂، درجة حموضة 6.9) تحتوي على 2.4٪ (فولت/فول) فورمالديهايد، 0.05٪ (v/v) جلوتارالديهايد، و0.5٪ (مع الفولت) سابونين.
3. حضر محلول بوروهيدريد الصوديوم الطازج (5 ملغ/مل بنظام D-PBS).
4. حضن الخلايا في محلول بوروهيدريد الصوديوم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعادلية الجلوتارالديهايد المتبقي.
5. اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام D-PBS لمدة 5 دقائق لكل منها قبل الصبغ.
   ملاحظة: الفورمالديهيد والجلوتارالديهايد هما مثبطان سام. قم بخطوات تثبيت في غطاء المحرك وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، وحماية للعين). بوروهيدريد الصوديوم هو عامل تقليل تفاعلي ويجب التعامل معه بحذر. تم اختيار محلول التثبيت المعتمد على PHEM الذي يحتوي على الفورمالديهايد، الجلوتارالديهايد، والسابونين للحفاظ على شكل الميتوكوندريا مع الحفاظ على إمكانية الوصول إلى المستضد أثناء التلوين المناعي. يوفر فورمالديهايد وجلوتارالديهايد تشابك البروتين للحفاظ على الهيكل، بينما تساعد تركيبة التخزين ودرجة الحموضة في PHEM في استقرار البنية الفائقة للميتوكوندريا²¹. يسهل سابونين نفاذية الغشاء لتحسين معدل الاختراق المثبت. تقلل هذه الاستراتيجية من تشويه شبكات الميتوكوندريا وهي مناسبة بشكل خاص للتحليل الكمي لمورفولوجيا الميتوكوندريا.

3. التلوين بالفلورة المناعية

1. حجب الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في حاجز حجب يحتوي على 3٪ (مع ضج) ألبومين مصل البقري (BSA) في PBS (137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار Na₂HPO₄، 1.8 ملليمولار KH₂PO₄، pH 7.4) مع 0.1٪ (v/v) ترايتون X-100.
2. حضن الخلايا التي تحتوي على أجسام مضادة أولية مخففة في حاجز حاجز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدم فأرة ضد TOMM20 (1:500) وضد ClpP الأرنب (1:500).
3. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المربوطة.
4. حضن الخلايا ذات الأجسام المضادة الثانوية المخففة في حاجز العزل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدم الجسم المضاد الثانوي المكون من CF405S للفأر (1:500) والأجسام المضادة الثانوية لأرنب أليكسا فلور 647 (1:500).
5. حماية العينات من الضوء أثناء وبعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.
6. كرر الخطوة 3.3.
7. تركيب الغطاء على شرائح زجاجية باستخدام وسط التثبيت.
   ملاحظة: تم عرض ClpP وTOMM20 تحت 405 نانومتر و647 نانومتر لتجنب أي تداخل طيفي مع إشارات FAM.

4. اكتساب الصور

1. التقاط الصور باستخدام مجهر ليزر كونفوكال مزود بهدف غمر زيت عالي الفتحة عددية.
2. استثار الفلوروفورات باستخدام خطوط ليزر 405 نانومتر و633 نانومتر. استخدم مقسمات شعاع ثنائية اللون مناسبة لعكس ضوء الإثارة ونقل الفلورة المنبعثة إلى الكواشف.
3. اضبط حجم البكسل إلى 35.3 نانومتر (X, Y) وخطوة Z على 0.1 ميكرومتر لضمان أخذ عينات محورية كافية من هياكل الميتوكوندريا.
4. التقاط صور بحجم إطار 1900 × 1900 بكسل (X, Y) وجمع 5 مقاطع بصرية لكل مكدس Z تبدأ من الإشارة الميتوكوندرية العليا وتنتهي تحت إشارة الميتوكوندريا لضمان جمع الإشارة الميتوكوندرية السائدة.
   ملاحظة: تم توفير إعدادات اقتناء المجهر التمثيلية في الشكل التكميلي 1. بالنسبة لخلايا HeLa، تكون الميتوكوندريا عادة هياكل أنبوبية رقيقة، يبلغ قطرها حوالي 0.5-1 ميكرومتر²². لذا فإن حجم Z بحجم 0.5 ميكرومتر يكفي لالتقاط جزء كبير من مصفوفة الميتوكوندريا الفردية، وليس بالضرورة الخلية بأكملها. تم اختيار مكدس Z مكون من 5 أقسام لموازنة أخذ عينات كافية من هياكل الميتوكوندريا مع التقاط الصور السريع لتقليل التشويهات المرتبطة بالحركة أثناء تصوير الخلايا.

5. علاج الخلايا الحية والتصوير

1. زراعة خلايا HeLa على أطباق زجاجية بحجم 35 مم في DMEM مع 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.
2. أضف مثبطا (التركيز النهائي: 50 نانومتر) أو حجم مكافئ من DMSO إلى الخلايا بعد 24 ساعة من البذر. احتضن الخلايا لمدة 18 ساعة إضافية في ظروف الزراعة القياسية.
3. أزل وسط الزراعة الذي يحتوي على المثبط أو DMSO واشطف الخلايا مرة واحدة ب D-PBS المسخن مسبقا لمدة 5 دقائق.
4. أضف محلول تصوير الخلايا الحية الذي يحتوي على MitoTracker DeepRed بتردد 20 نانومتر.
5. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية في درجة حرارة الغرفة باستخدام نفس إعدادات المجهر الموضحة أعلاه. احصل على صور في وضع المسح لكل إطار مع حوالي 4.72 ثانية لكل قسم بصري (حوالي 24 ثانية إجمالا لكل 5 أقسام من مكدس Z).
   ملاحظة: تم ضبط خمسة أقسام بصرية لكل مكدس Z لتحقيق توازن في أخذ عينات كافية من هياكل الميتوكوندريا مع أوقات اكتساب قابلة للإدارة. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم محلول تصوير الخلايا الحية في درجة حرارة الغرفة لتقليل حركة الميتوكوندريا مقارنة بالتصوير عند 37 درجة مئوية. على الرغم من أن حركة الميتوكوندريا أثناء تصوير الخلايا الحية قد تساهم في التفاوت في قياسات التوازن، إلا أن إعدادات الاستحواذ المتسقة عبر جميع العينات تساعد في تقليل التحيز المنهجي. تظهر إعدادات البرمجيات التمثيلية في الشكل التكميلي 2.

6. تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا

1. افتح ملفات الصور في فيجي²³ وأنشئ إسقاطات بأقصى شدة من مكدس Z عن طريق اختيار مكدس الصورة → → Z واختيار الحد الأقصى للشدة.
2. طبق طريقة عتبة أوتسو عن طريق التنقل إلى الصورة → تعديل → العتبة واختيار أوتسو من خيارات العتبة. طبق العتبة على الميتوكوندريا المقطعية.
3. شغل إضافة Mitochondria Analyzer^{رقم 24} واختر وضع التحليل ثنائي الأبعاد على أساس كل ميتو.
4. قياس حجم (مساحت) ومحيط الميتوكوندريا باستخدام مخرج محلل الميتوكوندريا.
5. احصل على قيم عامل الشكل الميتوكوندري مباشرة من مخرج محلل الميتوكوندريا، حيث يحسب عامل الشكل ك P²/(4πA)، حيث يمثل P المحيط وA المساحة.
6. قم بقياس طول الفرع الكلي لكل ميتوكوندريا باستخدام دالة تحليل الشبكة داخل الإضافة لتقييم الاتصال الميتوكوندري.
7. قدم البيانات كتوزيعات لقياسات الميتوكوندريا الفردية مع القيم المتوسطة المستمدة من 30 خلية لكل حالة عبر ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.
8. قيم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t الخاص بويلش في برنامج تحليل إحصائي.

7. تحليل التداخل

1. افتح ملفات الصور في فيجي وأنشئ عروضا ثنائية الأبعاد بأقصى كثافة من مجموعات الصور ثلاثية الأبعاد. للاتساق، حلل جميع العينات باستخدام نفس استراتيجية الإسقاط والاكتساب.
2. تقسيم قنوات الفلورة عن طريق اختيار الصورة → اللون → القنوات المنقسمة.
3. شغل إضافة Coloc 2 باختيار Plugins → Colocalization → Coloc 2.
4. خصص القنوات المناسبة للتحليل وفعل انحدار عتبة كوستس في إعدادات الإضافات. قم بإجراء التحليل على أساس كل خلية.
5. سجل معاملات تداخل ماندرز (M1 و M2) لتقييم نسبة الإشارة في كل قناة التي تتطابق مكانيا مع الأخرى.
6. فعل عشوائية كوستس في إعدادات Coloc 2 وحدد عدد العشوائيات إلى 50 لتقييم الدلالة الإحصائية.

8. توليد محلل الخلايا

1. خلايا HeLa البذور في DMEM مع 10٪ FBS وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
2. أضف مثبط 50 نانومتر أو حجم مكافئ من DMSO إلى الخلايا بعد 24 ساعة من البذر، ثم حضن لمدة 18 ساعة إضافية في ظروف الزراعة القياسية.
3. أزل وسط الزراعة وشطف الخلايا باستخدام D-PBS المسخن مسبقا لمدة 5 دقائق، ثم قم بالتربسين لفصلها.
4. قم بتبريد التربسين باستخدام وسط نمو خلايا طازج وجهاز الطرد المركزي عند 300 x جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت.
5. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في D-PBS وجهاز الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 3 دقائق لغسل الخلايا. تخلص من السوبرناتانت.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول تحلل مسبق التبريد (50 ملليموتر تريس-هيكربونيتل، درجة الحموضة 7.6، 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم، 0.1٪ SDS، 0.5٪ ديكوسيكولات الصوديوم، 2٪ CHAPS، 10 ملليمولار TCEP، 1 ململ PMSF، وتركيبة مثبط بروتياز 1x).
7. حضن التحلل على الثلج لمدة 20 دقيقة وتحلل الصوت في حمام ماء مثلج لمدة دقيقتين لضمان التحلل الكامل.
8. يقوم الطرد المركزي بتحلل عند 13,000 × g، و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
9. انقل المادة الفائقة المصفحة إلى أنبوب مبرد مسبقا جديد للتحليل في المراحل التالية.
   ملاحظة: PMSF سام ويجب التعامل معه في غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. SDS مهيج، والصوت يولد الحرارة والهباء الجوي. قم بتنفيذ خطوات التحلل والسونيك على الجليد واتبع إرشادات السلامة المؤسسية.

9. اختبار برادفورد

1. جهز مجموعة من المحاليل القياسية باستخدام BSA في كلوريد الصوديوم بمقدار 0.15 M. التركيزات هي: 0، 0.02 ملغ/مل، 0.04 ملغ/مل، 0.06 ملغ/مل، 0.08 ملغ/مل، 0.10 ملغ/مل.
2. قم بتخفيف محلل الخلية المجهول 50 مرة و100 مرة في كلوريد الصوديوم بمقدار 0.15 مل.
3. تقوم بيبيت بتكرار كل محلول منحني قياسي وعينات غير معروفة في صفيحة مكونة من 96 بئرا.
4. أضف كاشف برادفورد إلى كل بئر. لكل بئر، استخدم محلول بروتين بسعة 160 ميكرولتر مع 40 ميكرولتر 5x كاشف برادفورد (متوفر تجاريا). اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات.
5. حضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وقس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة.
6. توليد منحنى قياسي عن طريق رسم تركيزات BSA على محور x والامتصاص المتوسط عند 595 نانومتر من قياسات مكررة على محور y.
7. تحديد تركيزات البروتين في العينات باستخدام المنحنى القياسي. اضرب القيم المحسوبة في عامل التخفيف للحصول على التركيز الأصلي.

10. القطع المناعية

1. قم بتحميل كميات متساوية من تحليل الخلايا على جل بولي أكريلاميد بنسبة 12٪ وفصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE.
2. فعل غشاء PVDF عن طريق غمره لفترة وجيزة في الإيثانول. قم بموازنة كل من الغشاء وأوراق المسح في مخزن النقل.
3. ينقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF باستخدام نظام نقل شبه جاف.
4. حجب الغشاء في حليب جاف خالي من الدسم بنسبة 5٪ (بدون دسم) في TBS (20 ملليموتر تريس، 150 ملليمولار NaCl، درجة حموضة 7.6) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع تحريك خفيف.
5. حضن الغشاء مع الجسم المضاد الأساسي المخفف في حاجز حاجز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع تحريك لطيف. استخدم أداة Rabbit Anti-ClpP (1:2000) ومضاد بيتا-أكتين الفأر (ACTB، 1:10,000).
6. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST (20 ملليموتر تريس، 150 ملليمولار NaCl، 0.1٪ (v/v) Tween 20، pH 7.6) لمدة 5 دقائق في كل غسلة لإزالة الأجسام المضادة غير المربوطة.
7. حضن الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ب HRP المخفف في محلول حاجز (1:3000) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع تحريك خفيف.
8. كرر خطوة الغسيل.
9. اكتشاف أشرطة البروتين باستخدام كواشف الكشف الكيميائية المضيئة.

11. التحليل الكثافة الميترية

1. افتح صورة البقعة الغربية في فيجي.
2. غير نوع الصورة إلى 8-بت حسب Image → النوع → 8-بت.
3. اطرح خلفية الصورة عن طريق العملية → اطرح الخلفية. تحقق من خلفية الضوء واضبط نصف قطر الكرة المتحركة على 50.0 بكسل.
4. حدد الشريط عند المسار الأول باستخدام أداة المستطيل، ثم اختر تحليل الجل → → اختر المسار الأول.
5. انقل أداة المستطيل إلى المسار الثاني، واختر تحليل → الجل → اختيار المسار التالي. كرر هذه الخطوة حتى يتم اختيار جميع المسارات.
6. رسم كثافة الشريط من خلال تحليل → الجل → مسارات الرسم التخطيطي.
7. استخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط في أسفل ذروة كثافة الشريط، واستخدم أداة العصا لقراءة كثافة الشريط.
8. كرر نفس الإجراء من الخطوات 11.1–11.8 على صورة نقطة التحكم في التحميل.
9. أبلغ عن كثافة النطاق النسبي بقسمة الكثافة (ClpP) على الكثافة (ACTB).

النتائج

يغير تثبيط ClpP شكل الميتوكوندريا وتنظيم الشبكة
تم تقييم شكل الميتوكوندريا لتحديد ما إذا كان تثبيط ClpP يغير تنظيم الميتوكوندريا في خلايا HeLa. أظهرت صور الفلورة التمثيلية فروقا واضحة في تنظيم الميتوكوندريا بين الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة ب FAM-FAPAL-CMK (الشكل 1A). أظهر التحليل الكمي أن مساحة الميتوكوندريا انخفضت من 1.15 ± 4.8 ميكرومتر^مربع (n = 8013) في الخلايا الضابطة إلى 0.47 ± 1.1 ميكرومتر^مربع (n = 8516) عن...

المناقشة

لقد ثبت سابقا أن كيتون ببتيديل كلوروميثيل FAPAL-CMK¹⁵ هو مثبط محتمل لا رجعة فيه لوحدة البروتياز الفرعية (ClpP) في بروتياز ClpXP المعتمد على ATP الميتوكوندري. بينما أظهرت التجارب الحركية فعالية المثبط وآلية عمله، لم يتمكن النهج في المختبر من تقييم فعالية FAPAL-CMK كمثبط انتقائي ل ClpP الميتوكوندري في الخلايا السليمة. أكد المجهر الكونفوكلي الفلوري أن FAM-FAPAL-CMK تم توضيعها بشكل انتقائي في الميتوكوندريا، حيث يوجد ClpP. نظرا لأن تحديد المواقع الميتوكوندرية ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3