يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل والمرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية في الجرذان

65 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72097

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, Dagang Hospital of Binhai New Area, 2Clinical Laboratory, Tianjin Adicon Clinical Laboratories Co., Ltd.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تبحث هذه الدراسة في إصابة المخاطية المعدية المرتبطة بالعلاج بـ clopidogrel في الجرذان وخلايا الظهارة المعدية، مع تسليط الضوء على ارتباطها بالتغيرات الجزيئية المتعلقة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية، والموت الخلوي المبرمج، والالتهاب الجهازي.

الملخص

يُستخدم الكلوبيدوجريل (Clopidogrel) على نطاق واسع كعامل مضاد لتكدس الصفائح الدموية للوقاية من أمراض الخثار الشرياني وعلاجها، ولكن قد يحد من تطبيقه السريري حدوث آثار عكسية في الجهاز الهضمي، بما في ذلك إصابة المخاطية المعدية. ونظراً لأن بقاء الخلايا الظهارية أمر ضروري للحفاظ على سلامة المخاطية المعدية، فقد افترضنا أن إصابة الظهارة المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل ستكون مصحوبة بتغيرات في العلامات المرتبطة بالإجهاد الشبكي الإندوبلازمي (ER stress) والموت الخلوي المبرمج (apoptosis). لاختبار هذه الفرضية، عولجت خلايا GES-1 الظهارية المعدية البشرية بتركيزات مختلفة من الكلوبيدوجريل، وتم تقييم حيوية الخلايا، والموت الخلوي المبرمج، وتوزيع دورة الخلية، والتغيرات الجزيئية باستخدام مقايسة Cell Counting Kit-8 (CCK-8)، وقياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)، وبصمة ويسترن (Western blotting). وبالتوازي مع ذلك، أُعطيت جرعات من الكلوبيدوجريل لجرذان Sprague-Dawley عن طريق التغذية القسرية لإنشاء نموذج لإصابة المعدة in vivo. تم تقييم التغيرات الباثولوجية في المخاطية المعدية عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين، وقِيست مستويات السيتوكينات الالتهابية في المصل باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). أدى الكلوبيدوجريل إلى تقليل حيوية خلايا GES-1، وتحفيز الموت الخلوي المبرمج، وتغيير تقدم دورة الخلية. وفي الجرذان، حث الكلوبيدوجريل على تآكل المخاطية المعدية، والوذمة، وتسلل الخلايا الالتهابية، وصاحب ذلك زيادة في مستويات إنترلوكين-1 بيتا (IL-1β)، وإنترلوكين-6 (IL-6)، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) في المصل. كما زاد الكلوبيدوجريل من تعبير علامات الإجهاد الشبكي الإندوبلازمي المتمثلة في البروتين المتجانس لـ C/EBP (CHOP) وعامل نسخ التنشيط 5 (ATF5)، وزاد من تعبير البروتين X المرتبط بـ Bcl-2 (Bax)، وخفض تعبير Bcl-2 المرتبط بليمفوما الخلايا البائية (Bcl-2)، ورفع نسبة Bax/Bcl-2 في كل من الأنسجة المعدية وخلايا GES-1. تشير هذه النتائج إلى أن إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل ترتبط بزيادة تعبير العلامات المرتبطة بالإجهاد الشبكي الإندوبلازمي واختلال توازن Bax/Bcl-2، على الرغم من عدم إثبات وجود مسار سببي مباشر يربط بين الإجهاد الشبكي الإندوبلازمي والموت الخلوي المبرمج الميتوكوندري في هذه الدراسة.

المقدمة

تعمل الأجهزة المناعية الفطرية والتكيفية للمخاطية المعدية، والتي تضم الخلايا الظهارية والخلايا المناعية وجزيئات الإشارة، معاً للحفاظ على سلامة المخاطية والعمل كحاجز فسيولوجي حيوي ضد العوامل الضارة1,2. وتعد هذه الوظيفة الوقائية ضرورية للتوازن الداخلي للجهاز الهضمي، ويمكن أن يؤدي اختلالها إلى المساهمة في تطور أمراض المعدة، بما في ذلك التهاب المعدة3. ومن الناحية السريرية، تعتبر إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الأدوية مضاعفة شائعة، حيث تعد مضادات الالتهاب غير الستيرويدية ومضادات الصفائح الدموية من بين أكثر الأسباب شيوعاً4. تعتمد سلامة المخاطية المعدية على توازن ديناميكي بين تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج5. ويمكن أن يؤدي التعرض المزمن للعوامل البيئية، بما في ذلك الأدوية، إلى اختلال هذا التوازن، وتحفيز موت الخلايا المبرمج، مما يؤدي إلى إصابة المخاطية6,7. تلعب الشبكة الإندوبلازمية دوراً مركزياً في الحفاظ على التوازن الداخلي للخلايا. وفي حالات الإجهاد الخلوي، يؤدي تراكم البروتينات غير المطوية أو المطوية بشكل خاطئ إلى تنشيط استجابة البروتين غير المطوي، بما في ذلك إشارات PERK/eIF2α/ATF4/CHOP، والتي قد تحفز موت الخلايا المبرمج وتغير تعبير بروتينات عائلة B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)8. كما يشارك ATF5 في استجابات الإجهاد الميتوكوندري والتفاعل المتبادل بين خلل وظائف الميتوكوندريا وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية9. وتشير الأدلة السريرية الحديثة إلى أن العلاج المستمر بمضادات الصفائح الدموية، بما في ذلك clopidogrel، يرتبط بإصابة تدريجية في مخاطية المعدة والأمعاء الدقيقة10.

يُعد الكلوبيدوجريل (Clopidogrel) عاملاً مضاداً للصفائح الدموية يوصف على نطاق واسع، ويتطلب تنشيطاً أيضياً قبل الارتباط غير العكوس بمستقبلات P2Y12 في الصفائح الدموية، مما يؤدي إلى تثبيط تجمع الصفائح الدموية بوساطة أدينوسين ثنائي الفوسفات وإحداث تأثيرات مضادة للتخثر11. يحدث هذا التنشيط الحيوي بشكل أساسي من خلال إنزيمات سيتوكروم P450 الكبدية. وبناءً على ذلك، فإن التعريض المباشر للخلايا الظهارية المعدية المستزرعة للمركب الأصلي للكلوبيدوجريل لا يعيد إنتاج السياق الأيضي والحركي الدوائي الكامل لعلاج الكلوبيدوجريل in vivo. ومع ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن العلاج بالكلوبيدوجريل قد يكون مرتبطاً بتكرار الإصابة بالقرح المعدية والنزيف المعدي المعوي، مما يسلط الضوء على أهمية الموازنة بين الفعالية المضادة للتخثر والسلامة المعدية المعوية12,13,14. وعلى الرغم من الإبلاغ عن هذه الآثار الضارة، إلا أن الآليات الكامنة وراء إصابة الغشاء المخاطي للمعدة المرتبطة بالكلوبيدوجريل لا تزال غير مفهومة بشكل كامل، مما يحد من تطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية مستهدفة. في الدراسة الحالية، بحثنا في تأثيرات الكلوبيدوجريل على الغشاء المخاطي للمعدة باستخدام جرذان من سلالة Sprague–Dawley وخلايا GES-1. تلقت الجرذان الكلوبيدوجريل عن طريق التزقيم المعدي، وأجريت تجارب مكملة in vitro باستخدام خلايا GES-1. كما أجريت تحليلات نسيجية مرضية وجزيئية وخلوية للتحقق مما إذا كانت إصابة الغشاء المخاطي للمعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل مرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج. وبناءً عليه، ركزت الدراسة الحالية على توصيف التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة المعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل بدلاً من تحديد مسار إشارات سببي. توفر نتائجنا رؤية إضافية حول التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة الغشاء المخاطي للمعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل، وقد تساهم في الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى منع هذه الآثار الضارة وإدارتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات والموافقة عليها من قبل مختبر التفتيش الأخلاقي للتجارب الحيوانية في شركة .Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. وقد أُجريت الدراسة وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة برعاية واستخدام حيوانات التجارب. وكان رقم الموافقة الأخلاقية للحيوانات هو DRK-20251015210.

الحيوانات والخطوط الخلوية

شملت الموافقة الأخلاقية استخدام 20 جرذاً من سلالة Sprague–Dawley بدرجة SPF. وقد تضمنت الدراسة الحالية ما مجموعه 12 جرذاً ذكراً من سلالة Sprague–Dawley بدرجة SPF، تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع وتتراوح أوزانهم بين 280-300 g في بداية التجربة. تم الحصول على الجرذان من شركة Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China; Production License No. SCXK [Zhejiang] 2024-0004) ووُزعت عشوائياً على مجموعتي الضابطة والمجموعة المعالجة بـ clopidogrel، بواقع ستة جرذان لكل مجموعة. تم إيواء الجرذان في بيئة خاضعة للرقابة عند درجة حرارة 22°C تقريباً تحت دورة ضوء/ظلام مدتها 12 h، مع إتاحة الوصول الحر إلى العلف القياسي ومياه الشرب المعقمة. سُمح لجميع الجرذان بالتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل التجربة. عُلّق clopidogrel hydrogensulfate في 0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) بتركيز 0.781 mg/mL. وتلقت الجرذان في المجموعة المعالجة بـ clopidogrel مادة clopidogrel hydrogensulfate عن طريق التغذية القسرية الفموية بجرعة 10 mL/kg من وزن الجسم (ما يعادل 1 mL/100 g من وزن الجسم وبجرعة مقدارها 7.81 mg/kg) مرة واحدة يومياً لمدة 3 أيام متتالية. بينما تلقت الجرذان في المجموعة الضابطة حجماً مساوياً من 0.5% CMC-Na. تم اختيار الجرعة ومدة العلاج التي استمرت 3 أيام بناءً على نموذج جرذان قصير المدى سبق الإبلاغ عنه للإعطاء الفموي لـ clopidogrel. وبعد آخر عملية تغذية قسرية في اليوم الثالث، تم منع الطعام لمدة 12 h، بينما توفر الماء ad libitum. تم تخدير الجرذان في غرفة تحريض باستخدام 3% isoflurane في الأكسجين، وحوفظ على التخدير بنسبة 1.5%–2.0% isoflurane يتم توصيله عبر قناع أنفي. تم التأكد من عمق التخدير الكافي من خلال غياب المنعكسات القرنية ومنعكس سحب القدم. جُمعت عينات الدم عن طريق بزل القلب النهائي تحت تخدير عميق. وبينما كانت الجرذان لا تزال تحت التخدير العميق، تم القضاء عليها عن طريق إفراغ الدم متبوعاً بفتح الصدر ثنائي الجانب. تم التأكد من الوفاة من خلال غياب التنفس التلقائي والنشاط القلبي لمدة 5 min على الأقل، جنباً إلى جنب مع غياب المنعكسات القرنية ومنعكس سحب القدم. ثم أُزيلت المعدة بسرعة، وفُتحت على طول الانحناء الكبير، وشُطفت برفق بمحلول ملحي مبرد بالثلج.

تم الحصول على خط الخلايا الظهارية للمخاطية المعدية البشرية GES-1 من شركة iCell Bioscience Inc. (شنغهاي، الصين؛ رقم الكتالوج iCell-h062)، وقد تم التحقق من هوية الخلايا عن طريق تحليل التكرارات الترادفية القصيرة من قبل المورد. زُرعت الخلايا في وسط RPMI-1640 مدعم بـ 10% مصل جنين البقر (FBS) و 1% بنسيلين-ستريبتومايسين في حاضنة رطبة عند 37°C مع 5% CO₂. استُخدمت الخلايا في ممراتها المبكرة (بين الممر 3 و 10) في التجارب. وعندما وصل تلاقي الخلايا إلى 80%–90% تقريباً، تم تمرير الخلايا بنسبة تقسيم 1:3. واستُخدمت الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي في التجارب اللاحقة. وبالنسبة لمقايسة CCK-8، تم استزراع الخلايا في أطباق ذات 96 بئراً بكثافة 6 × 103 خلية/بئر. أما بالنسبة لتحليلات موت الخلايا المبرمج والدورة الخلوية، فقد استُزرعت الخلايا في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 5 × 105 خلية/بئر تقريباً، وتُرِكت لتلتصق قبل المعالجة بعقار clopidogrel.

الكيميائيات والمحاليل

استُخدم كبريتات كلوبيدوجريل الهيدروجينية (Cat. No. C874834؛ نقاوة ≥ 99%) في التجارب التي أجريت على الحيوانات والخلايا. تم تحضير محلول مخزون من الكلوبيدوجريل عن طريق إذابة 100 mg من مسحوق الكلوبيدوجريل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للحصول على محلول مخزون بتركيز 1 M. ثم خُفف المحلول المخزون لاحقاً إلى تركيزات العمل المطلوبة قبل الاستخدام. خُفف المحلول المخزون بتركيز 1 M تسلسلياً باستخدام DMSO لتحضير محاليل جرعات بتركيز 1000× عند تركيزات 10، 100، 200، 400، 600، 800، و 1000 mM. وقبل العلاج مباشرة، أضيف كل محلول جرعات بتركيز 1000× إلى وسط استزراع كامل بنسبة 1:1000 (v/v) للحصول على تركيزات نهائية من الكلوبيدوجريل تبلغ 0.01، 0.1، 0.2، 0.4، 0.6، 0.8، و 1.0 mM، على التوالي. وتلقت مجموعة الضبط التي استخدمت المادة الناقلة حجماً مساوياً من DMSO بدون كلوبيدوجريل. وبذلك، تم الحفاظ على التركيز النهائي لـ DMSO عند 0.1% (v/v) في جميع المجموعات. لا تحاكي خلايا GES-1 المستزرعة التنشيط الحيوي للكلوبيدوجريل الذي يتوسطه سيتوكروم P450 الكبدي؛ لذا استُخدم العلاج المباشر بالكلوبيدوجريل كنموذج استكشافي للتعرض للمركب الأصلي. وقد اختير نطاق التركيز لتوصيف الاستجابات الخلوية المعتمدة على التركيز تحت الظروف التجريبية، ولا ينبغي تفسيرها على أنها مكافئة للتركيزات التي يمكن تحقيقها سريرياً في البلازما أو أنسجة المعدة.

استزراع الخلايا الفرعي

تم تحضير الوسط الكامل عن طريق استكمال الوسط الزراعي الأساسي بإضافة FBS والبنسلين-ستريبتومايسين. وعندما وصلت درجة تلاقي الخلايا إلى 80% تقريباً، تمت إزالة الوسط الزراعي، وغُسلت الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم. بعد ذلك، هُضمت الخلايا باستخدام محلول التريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) لمدة تتراوح بين 1-2 دقيقة تقريباً. وبعد انفصال الخلايا جزئياً، أضيف الوسط الكامل لإيقاف عملية الهضم. ثم تم إجراء طرد مركزي لمعلق الخلايا عند 1,200 × g لمدة 3 دقائق. وبعد إزالة supernatant، أُعيد تعليق كتلة الخلايا في 1-2 mL من الوسط الكامل وزُرعت في أطباق زراعة جديدة وفقاً للمتطلبات التجريبية.

مقايسة حيوية الخلايا باستخدام CCK-8

تم استزراع خلايا GES-1 في مرحلة النمو اللوغاريتمي في أطباق ذات 96 بئراً بكثافة 6 × 103 خلية/بئر، وحُضنت طوال الليل للسماح بالتصاق الخلايا. وبعد الالتصاق، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من الكلوبيدوجريل (0، 0.01، 0.1، 0.2، 0.4، 0.6، 0.8، و 1.0 mM) لمدة 24 h. وتلقت مجموعة الضبط نفس التركيز النهائي من المذيب (vehicle). وبعد المعالجة، أُضيف محلول CCK-8 إلى كل بئر وحُضن عند 37°C وفقاً لتعليمات الطقم. وقيس الامتصاص عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader). وحُسبت حيوية الخلايا كنسبة مئوية من مجموعة الضبط. وبناءً على نتائج الاستجابة للتركيز، تم اختيار المعالجة بـ 0.1 mM من الكلوبيدوجريل لمدة 24 h لإجراء تحليلات الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، والدورة الخلوية، و qPCR، و Western blot اللاحقة.

تحليل قياس التدفق الخلوي

تم استزراع خلايا GES-1 في أطباق ذات 6 آبار ومعالجتها بـ 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 h بعد التصاق الخلايا. وعقب المعالجة، تم جمع كل من الخلايا العائمة والملتصقة. جرى هضم الخلايا الملتصقة باستخدام التريبسين الخالي من EDTA، ثم غُسلت مرتين بـ PBS بارد، وأُعيد تعليقها في محلول ربط (binding buffer). صُبغت الخلايا باستخدام طقم Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وبعد التحضين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، تم الكشف عن الخلايا المبرمجة (apoptotic cells) باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي RaiseCyte 2L6C. جُمعت البيانات باستخدام برنامج RaiseFlower للتحصيل وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo (الإصدار 10.8.1). كما تم تقدير كمية مجموعات الخلايا في مراحل الموت الخلوي المبرمج المبكرة والمتأخرة والكلية باستخدام برنامج FlowJo.

التحليل القياسي التدفقي لتوزيع الدورة الخلوية

تم استزراع خلايا GES-1 في أطباق مكونة من 6 آبار ومعالجتها بـ 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 h. وبعد المعالجة، جُمعت الخلايا وغُسلت بمحلول PBS، ثم ثُبِّتت في إيثانول بتركيز 70% مبرد مسبقاً عند 4°C. ثم غُسلت الخلايا المثبتة لإزالة بقايا الإيثانول وحُضنت مع محلول صبغ RNase A واليوديد البروبيديوم في الظلام وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وتم تحليل توزيع الدورة الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. كما جُمعت البيانات باستخدام برنامج الحصول على البيانات وحُللت باستخدام برنامج FlowJo. وتمت مطابقة توزيعات الدورة الخلوية باستخدام نموذج Watson، وحُسبت النسب المئوية للخلايا في مراحل G0/G1 و S و G2/M.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)

تَمَّ استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من خلايا GES-1 وعينات من أنسجة المعدة لدى الجرذان باستخدام طقم استخلاص RNA وفقاً لتعليمات الطقم. وبالنسبة لعينات الأنسجة، جُمِعت أنسجة المخاطية المعدية بسرعة، وجُنُسُجت (homogenized) في ظروف درجة حرارة منخفضة، ثم خضعت لعملية استخلاص RNA. حُدِّد تركيز RNA ونقاوته عن طريق قياس الامتصاصية عند 260 و280 نانومتر. نُسِخَت كميات متساوية من RNA عكسياً إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين متمم (cDNA) باستخدام طقم نسخ عكسي يتضمن إزالة الحمض النووي الجينومي. أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Quantitative real-time PCR) باستخدام مزيج PCR رئيسي يعتمد على صبغة SYBR Green. أُجري كل تفاعل في حجم كلي قدره 20 µL يحتوي على 10 µL من 2× المزيج الرئيسي، 1 µL من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA)، 0.4 µL من البادئ الأمامي، 0.4 µL من البادئ العكسي، و 8.2 µL من الماء المقطر مزدوج التقطير الخالي من RNase₂أ. كانت ظروف الدورات الحرارية كما يلي: تمسخ أولي عند 95°C لمدة 10 دقائق، تليها 40 دورة من المسخ عند 95°C لمدة 10 ثوانٍ، والتهجين عند 60°C لمدة 30 ثانية، والتمديد عند 72°C لمدة 30 ثانية. وتم تحديد مستويات تعبير كل من CHOP وATF5 وBcl-2 وBax. واستُخدم GAPDH كجين مرجعي داخلي. وحُسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔطريقة Ct. تدرج تسلسلات البادئات في الجدول التكميلي 1.

لطخة ويسترن

تَم استخلاص البروتين الكلي من خلايا GES-1 وعينات من أنسجة معدة الجرذ. بالنسبة لعينات الخلايا، غُسلت خلايا GES-1 المعالجة بمحلول PBS بارد ثم حُللت باستخدام محلول RIPA (radioimmunoprecipitation assay) الذي يحتوي على مثبط للبروتياز. وبالنسبة لعينات الأنسجة، جرى تجانس أنسجة المخاطية المعدية في محلول RIPA تحت ظروف درجة حرارة منخفضة، ثم خضعت للطرد المركزي لجمع المادة الطافية. حُددت تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA للبروتين. تم فصل ما مجموعه 20 µg من البروتين لكل مسار عن طريق الفصل الكهربائي للهلام بـ SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) ثم نُقلت البروتينات إلى أغشية PVDF (polyvinylidene difluoride). وبعد الحجب باستخدام ألبومين المصل البقري (BSA)، حُضنت الأغشية طوال الليل عند 4°C مع أجسام مضادة أولية ضد CHOP (1:1000)، و ATF5 (1:1000)، و Bcl-2 (1:1000)، و Bax (1:1000)، و β-actin (1:5000). وبعد الغسل، حُضنت الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بإنزيم بيروكسيداز الفجل (horseradish peroxidase) المقابلة (1:10000). تم تصور حزم البروتين باستخدام كاشف كيميائي مضيء مُعزز والتقاط الصور بواسطة نظام تصوير كيميائي مضيء. تم قياس شدة الحزم باستخدام برنامج تحليل الصور ومعايرتها بالنسبة لـ β-actin.

التقييم النسيجي المرضي

جُمِعت عينات من أنسجة المعدة من جرذان Sprague–Dawley بعد علاجها بعقار clopidogrel، وثُبِّتت في محلول فورمالين مُنظم متعادل بتركيز 10%. خضعت العينات لعمليات التجفيف، والترويق، والطمر في البارافين، ثم قُطِّعت بسماكة 4 µm. صُبغت قطاعات البارافين بصبغتي الهيماتوكسيلين والإيوسين. وقُيِّمت التغيرات الهيستوباثولوجية نوعياً باستخدام المجهر الضوئي بناءً على مورفولوجيا المخاطية، وسلامة الظهارة، والوذمة، وتسلل الخلايا الالتهابية. كما التُقِطت صور تمثيلية، ولم يُطبق أي نظام تسجيل نسيجي.

الكيمياء النسيجية المناعية

تمت إزالة البارافين من مقاطع أنسجة المعدة المضمنة في البارافين باستخدام الزايلين، ثم أُعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول. وأُجري استرداد المستضدات بالحرارة في محلول سترات منظم. وتم تثبيط نشاط البيروكسيديز الداخلي باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3% لمدة 10 min، كما ثُبط الارتباط غير النوعي باستخدام مصل الماعز الطبيعي لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، حُضنت المقاطع طوال الليل عند 4°C مع أجسام مضادة أولية ضد CHOP وATF5 وBcl-2 وBax. وبعد الغسل بمحلول PBS، حُضنت المقاطع مع الجسم المضاد الثانوي المقترن ببيروكسيديز الفجل الحار المناظر. وتم إظهار الإشارات المناعية باستخدام محلول DAB الملون، يليه التلوين المضاد بالهيماتوكسيلين. ثم جُففت المقاطع، ونُقيت، وثُبتت، وفُحصت تحت المجهر الضوئي. والتقطت صور تمثيلية، وقُدرت مساحة التلوين الإيجابية باستخدام برنامج لتحليل الصور.

التلوين المناعي الفلوري

تم إزالة البارافين من مقاطع أنسجة المعدة المغمورة في البارافين، ثم أُعيد ترطيبها، وأُخضعت لعملية استعادة المستضدات المستحثة حرارياً في محلول ستريت المنظم. وبعد الحجب باستخدام مصل ماعز طبيعي لمدة 30 min، حُضنت المقاطع طوال الليل عند 4°C مع أجسام مضادة أولية ضد CHOP (1:50)، وATF5 (1:100)، وBcl-2 (1:50)، وBax (1:200). وبعد الغسل باستخدام PBS، حُضنت المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة (1:500) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، ثم صُبغت صبغة تباينية باستخدام DAPI. التُقطت الصور باستخدام مجهر فلوري بقوة تكبير ×200. تم تحليل ثلاثة حقول غير متداخلة مختارة عشوائياً من كل حيوان باستخدام برنامج Image-Pro Plus 6.0، وعُبر عن شدة الفلورة بصيغة IOD/Area. شمل التحليل ثلاثة حيوانات لكل مجموعة.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

جُمعت عينات الدم من جرذان Sprague–Dawley بعد العلاج وتُرِكت لتتجلط في درجة حرارة الغرفة. فُصل المصل عن طريق الطرد المركزي وحُفظ في درجة حرارة −80°C حتى وقت التحليل. قِيست مستويات IL-1β وIL-6 وTNF-α في المصل باستخدام أطقم ELISA وفقًا لتعليمات الطقم. قِيست الامتصاصية باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة، وحُسبت تركيزات السيتوكينات وفقًا لمنحنيات القياس стандарт.

التحليل الإحصائي

أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي. وعُرضت البيانات في صورة المتوسط ± SD. كما تم تقييم التوزيع الطبيعي وتجانس التباين باستخدام اختبار Shapiro–Wilk واختبار Levene، على التوالي. وأُجريت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار Student's t-test، بينما أُجريت المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way analysis of variance) متبوعاً باختبار Dunnett’s post hoc. واعتُبرت القيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية. كما نُفذت جميع تجارب الخلايا باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة على الأقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كلوبيدوجريل يقلل من حيوية خلايا GES-1 ويزيد من الموت الخلوي المبرمج In Vitro

بحثنا أولاً فيما إذا كان الكلوبيدوغريل يؤثر على حيوية خلايا GES-1 وموتها المبرمج. أظهرت مقايسات CCK-8 أن المعالجة بالكلوبيدوغريل قللت بشكل ملحوظ من حيوية خلايا GES-1 (الشكل 1A،B)، مما يشير إلى انخفاض حيوية الخلايا. وبناءً على الانخفاض العام في حيوية الخلايا عبر نطاق التركيزات المختبرة، تم اختيار تركيز 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 ساعة لجميع تج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يُستخدم كلوبيدوجريل (Clopidogrel) على نطاق واسع للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية وعلاجها؛ ومع ذلك، يرتبط استخدامه السريري بمخاطر حدوث نزيف ومضاعفات في الجهاز الهضمي، بما في ذلك القرحة الهضمية والنزيف والانثقاب19. لذا، فإن فهم التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة المعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل أمر مهم لتحسين الوقاية من هذه الآثار الضارة وإدارتها. في الدراسة الحالية، بحثنا في تأثيرات الكلوبيدوجريل على الخلايا الظهارية للمعدة وأنسجة المعدة لدى الجرذان، ورصدنا التغيرات في حيوية الخلايا، والموت ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تضارب المصالح:

يقر المؤلفون بأنه ليس لديهم أي مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن تبدو مؤثرة على العمل الوارد في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال مشروع "الأبحاث الأساسية حول مسار إشارات CHOP/ATF5/Bcl-2 في موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية للمخاطية المعدية الناجم عن الكلوبيدوجريل" (مشروع رقم 2023BWKY009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم كشف موت الخلايا المبرمج Annexin V-FITC/PIElabscienceE-CK-A211طقم الكشف عن الموت الخلوي المبرمج
جسم مضاد لـ ATF5Proteintech67066-1-APالجسم المضاد الأولي
طقم تحليل البروتين بطريقة BCASolarbioPC0020مقايسة تركيز البروتين
الأجسام المضادة لبروتين BaxProteintech50599-1-APالأجسام المضادة الأولية
الأجسام المضادة لـ Bcl-2Proteintech26593-1-APالأجسام المضادة الأولية
βجسم مضاد لبروتين الأكتين (actin)Proteintech66009-1-Igالجسم المضاد الأولي
محلول الحجب (Blocking Buffer)BeyotimeP0252محلول حجب لطريقة ويسترن بلوت (Western blot)
طقم عد الخلايا CCK-8KeyGen BiotechKGA317مقايسة حيوية الخلايا
طقم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA Synthesis Kit)ترانس جين بيوتك (TransGen Biotech)AU341طقم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين التكميلي (cDNA) للشريط الأول مع إزالة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي
طقم الكشف عن الدورة الخلويةليانك بيوتكنولوجي (Lianke Biotechnology)CCS012طقم تحليل دورة الخلية
جسم مضاد لبروتين CHOPProteintech15204-1-APالجسم المضاد الأولي
كلو بيدوجريل هيدروجن-سلفات (درجة النقاء ≥99%)ماكلينC874834عقار تجريبي
طقم صبغ DAB الكروموجينيBeyotimeP0201Mركيزة الكيمياء النسيجية المناعية
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)MedChemExpressHY-Y0320Cمذيب
كاشف التألق الكيميائي المُعزز (ECL)MeilunbioMA0186ركيزة كيميائية مضيئة
مصل جنين البقر (FBS)Gibco10099-141مكمل استنبات الخلايا
خط الخلايا الظهارية المعدية البشرية GES-1iCell BioscienceiCell-h062خط خلايا الظهارة المعدية البشرية
الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)&هـ) طقم الصبغBeyotimeC0105Sالتصبيغ النسيجي
جسم مضاد ثانوي مقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP)ProteintechRGAM001/RGAR001جسم مضاد ثانوي
محلول بيروكسيد الهيدروجينأبسينABS9333-100ملكاشف حجب البيروكسيداز الداخلي
إنترلوكين-1 (IL-1)β طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)ميميانMM-0047R2مقايسة السيتوكينات في المصل
طقم مقايسة الممتز المجهري المرتبط بالإنزيم لـ IL-6ميميانMM-0190R2مقايسة السيتوكينات في المصل
قارئ الأطباق الدقيقةشركة بكين ليويي للتكنولوجيا الحيوية (Beijing Liuyi Biotechnology)WD-2102Bقياس الامتصاصية
محلول البنسلين-ستربتوميسينSolarbioP1400محلول مضاد حيوي
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)ServicebioG4202-500مل1× محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)
غشاء بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد (PVDF)MilliporeIPVH00010غشاء لطخة ويسترن
مخفف الأجسام المضادة الأوليةBeyotimeP0023Aمخفف الأجسام المضادة
مؤشر الوزن الجزيئي للبروتينYeasenWJ103سلم بروتيني ملوّن مسبقاً
مزيج رئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (SYBR Green)CWBioCW3008كاشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
محلول التحلل الخاص بمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA)SolarbioR0010محلول استخلاص البروتين المنظم
ريبونوكلياز أ (RNase A)ليانكي للتكنولوجيا الحيوية (Lianke Biotechnology)CCS012كاشف تحليل الدورة الخلوية
وسط RPMI-1640ServicebioG4535-500MLوسط زراعة الخلايا الأساسي
جرذان 스프راغ-دولي (Sprague-Dawley)شركة Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.نظرًا لعدم توفر نص مصدر، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته، وسأقوم بتحويله إلى اللغة العربية بدقة أكاديمية وعلمية وفقًا للمعايير المحددة.درجة SPF
TNF-αα طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA Kit)مِي مِيانMM-0180R2مقايسة السيتوكينات في المصل
طقم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA Extraction Kit)ترانس جين بيوتيك (TransGen Biotech)ER501-01طقم استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA)
محلول التريبسين-إيديتات ثنائي الصوديوم (Trypsin-EDTA)SolarbioT1300كاشف تفكيك الخلايا

المراجع

  1. Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
  2. Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
  3. Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
  4. Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
  5. Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
  6. Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
  7. Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
  8. Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
  9. Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
  10. He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
  11. Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
  12. Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
  13. Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
  14. Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
  15. Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
  16. Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
  17. Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
  18. Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
  19. Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
  20. Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
  21. Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
  22. Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
  23. Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
  24. Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
  25. Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
  26. Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إصابة المعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريلخلايا GES-1مؤشرات الموت الخلوي المبرمجمقايسة حيوية الخليةقياس التدفق الخلويلطخة ويسترنالسيتوكينات الالتهابيةنسبة Bax/Bcl-2

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.