تبحث هذه الدراسة في إصابة المخاطية المعدية المرتبطة بالعلاج بـ clopidogrel في الجرذان وخلايا الظهارة المعدية، مع تسليط الضوء على ارتباطها بالتغيرات الجزيئية المتعلقة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية، والموت الخلوي المبرمج، والالتهاب الجهازي.
مقالة بحثية
إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل والمرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية في الجرذان
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُستخدم الكلوبيدوجريل (Clopidogrel) على نطاق واسع كعامل مضاد لتكدس الصفائح الدموية للوقاية من أمراض الخثار الشرياني وعلاجها، ولكن قد يحد من تطبيقه السريري حدوث آثار عكسية في الجهاز الهضمي، بما في ذلك إصابة المخاطية المعدية. ونظراً لأن بقاء الخلايا الظهارية أمر ضروري للحفاظ على سلامة المخاطية المعدية، فقد افترضنا أن إصابة الظهارة المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل ستكون مصحوبة بتغيرات في العلامات المرتبطة بالإجهاد الشبكي الإندوبلازمي (ER stress) والموت الخلوي المبرمج (apoptosis). لاختبار هذه الفرضية، عولجت خلايا GES-1 الظهارية المعدية البشرية بتركيزات مختلفة من الكلوبيدوجريل، وتم تقييم حيوية الخلايا، والموت الخلوي المبرمج، وتوزيع دورة الخلية، والتغيرات الجزيئية باستخدام مقايسة Cell Counting Kit-8 (CCK-8)، وقياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)، وبصمة ويسترن (Western blotting). وبالتوازي مع ذلك، أُعطيت جرعات من الكلوبيدوجريل لجرذان Sprague-Dawley عن طريق التغذية القسرية لإنشاء نموذج لإصابة المعدة in vivo. تم تقييم التغيرات الباثولوجية في المخاطية المعدية عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين، وقِيست مستويات السيتوكينات الالتهابية في المصل باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). أدى الكلوبيدوجريل إلى تقليل حيوية خلايا GES-1، وتحفيز الموت الخلوي المبرمج، وتغيير تقدم دورة الخلية. وفي الجرذان، حث الكلوبيدوجريل على تآكل المخاطية المعدية، والوذمة، وتسلل الخلايا الالتهابية، وصاحب ذلك زيادة في مستويات إنترلوكين-1 بيتا (IL-1β)، وإنترلوكين-6 (IL-6)، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) في المصل. كما زاد الكلوبيدوجريل من تعبير علامات الإجهاد الشبكي الإندوبلازمي المتمثلة في البروتين المتجانس لـ C/EBP (CHOP) وعامل نسخ التنشيط 5 (ATF5)، وزاد من تعبير البروتين X المرتبط بـ Bcl-2 (Bax)، وخفض تعبير Bcl-2 المرتبط بليمفوما الخلايا البائية (Bcl-2)، ورفع نسبة Bax/Bcl-2 في كل من الأنسجة المعدية وخلايا GES-1. تشير هذه النتائج إلى أن إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل ترتبط بزيادة تعبير العلامات المرتبطة بالإجهاد الشبكي الإندوبلازمي واختلال توازن Bax/Bcl-2، على الرغم من عدم إثبات وجود مسار سببي مباشر يربط بين الإجهاد الشبكي الإندوبلازمي والموت الخلوي المبرمج الميتوكوندري في هذه الدراسة.
المقدمة
تعمل الأجهزة المناعية الفطرية والتكيفية للمخاطية المعدية، والتي تضم الخلايا الظهارية والخلايا المناعية وجزيئات الإشارة، معاً للحفاظ على سلامة المخاطية والعمل كحاجز فسيولوجي حيوي ضد العوامل الضارة1,2. وتعد هذه الوظيفة الوقائية ضرورية للتوازن الداخلي للجهاز الهضمي، ويمكن أن يؤدي اختلالها إلى المساهمة في تطور أمراض المعدة، بما في ذلك التهاب المعدة3. ومن الناحية السريرية، تعتبر إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الأدوية مضاعفة شائعة، حيث تعد مضادات الالتهاب غير الستيرويدية ومضادات الصفائح الدموية من بين أكثر الأسباب شيوعاً4. تعتمد سلامة المخاطية المعدية على توازن ديناميكي بين تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج5. ويمكن أن يؤدي التعرض المزمن للعوامل البيئية، بما في ذلك الأدوية، إلى اختلال هذا التوازن، وتحفيز موت الخلايا المبرمج، مما يؤدي إلى إصابة المخاطية6,7. تلعب الشبكة الإندوبلازمية دوراً مركزياً في الحفاظ على التوازن الداخلي للخلايا. وفي حالات الإجهاد الخلوي، يؤدي تراكم البروتينات غير المطوية أو المطوية بشكل خاطئ إلى تنشيط استجابة البروتين غير المطوي، بما في ذلك إشارات PERK/eIF2α/ATF4/CHOP، والتي قد تحفز موت الخلايا المبرمج وتغير تعبير بروتينات عائلة B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)8. كما يشارك ATF5 في استجابات الإجهاد الميتوكوندري والتفاعل المتبادل بين خلل وظائف الميتوكوندريا وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية9. وتشير الأدلة السريرية الحديثة إلى أن العلاج المستمر بمضادات الصفائح الدموية، بما في ذلك clopidogrel، يرتبط بإصابة تدريجية في مخاطية المعدة والأمعاء الدقيقة10.
يُعد الكلوبيدوجريل (Clopidogrel) عاملاً مضاداً للصفائح الدموية يوصف على نطاق واسع، ويتطلب تنشيطاً أيضياً قبل الارتباط غير العكوس بمستقبلات P2Y12 في الصفائح الدموية، مما يؤدي إلى تثبيط تجمع الصفائح الدموية بوساطة أدينوسين ثنائي الفوسفات وإحداث تأثيرات مضادة للتخثر11. يحدث هذا التنشيط الحيوي بشكل أساسي من خلال إنزيمات سيتوكروم P450 الكبدية. وبناءً على ذلك، فإن التعريض المباشر للخلايا الظهارية المعدية المستزرعة للمركب الأصلي للكلوبيدوجريل لا يعيد إنتاج السياق الأيضي والحركي الدوائي الكامل لعلاج الكلوبيدوجريل in vivo. ومع ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن العلاج بالكلوبيدوجريل قد يكون مرتبطاً بتكرار الإصابة بالقرح المعدية والنزيف المعدي المعوي، مما يسلط الضوء على أهمية الموازنة بين الفعالية المضادة للتخثر والسلامة المعدية المعوية12,13,14. وعلى الرغم من الإبلاغ عن هذه الآثار الضارة، إلا أن الآليات الكامنة وراء إصابة الغشاء المخاطي للمعدة المرتبطة بالكلوبيدوجريل لا تزال غير مفهومة بشكل كامل، مما يحد من تطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية مستهدفة. في الدراسة الحالية، بحثنا في تأثيرات الكلوبيدوجريل على الغشاء المخاطي للمعدة باستخدام جرذان من سلالة Sprague–Dawley وخلايا GES-1. تلقت الجرذان الكلوبيدوجريل عن طريق التزقيم المعدي، وأجريت تجارب مكملة in vitro باستخدام خلايا GES-1. كما أجريت تحليلات نسيجية مرضية وجزيئية وخلوية للتحقق مما إذا كانت إصابة الغشاء المخاطي للمعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل مرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج. وبناءً عليه، ركزت الدراسة الحالية على توصيف التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة المعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل بدلاً من تحديد مسار إشارات سببي. توفر نتائجنا رؤية إضافية حول التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة الغشاء المخاطي للمعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل، وقد تساهم في الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى منع هذه الآثار الضارة وإدارتها.
البروتوكول
تمت مراجعة جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات والموافقة عليها من قبل مختبر التفتيش الأخلاقي للتجارب الحيوانية في شركة .Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. وقد أُجريت الدراسة وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة برعاية واستخدام حيوانات التجارب. وكان رقم الموافقة الأخلاقية للحيوانات هو DRK-20251015210.
الحيوانات والخطوط الخلوية
شملت الموافقة الأخلاقية استخدام 20 جرذاً من سلالة Sprague–Dawley بدرجة SPF. وقد تضمنت الدراسة الحالية ما مجموعه 12 جرذاً ذكراً من سلالة Sprague–Dawley بدرجة SPF، تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع وتتراوح أوزانهم بين 280-300 g في بداية التجربة. تم الحصول على الجرذان من شركة Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China; Production License No. SCXK [Zhejiang] 2024-0004) ووُزعت عشوائياً على مجموعتي الضابطة والمجموعة المعالجة بـ clopidogrel، بواقع ستة جرذان لكل مجموعة. تم إيواء الجرذان في بيئة خاضعة للرقابة عند درجة حرارة 22°C تقريباً تحت دورة ضوء/ظلام مدتها 12 h، مع إتاحة الوصول الحر إلى العلف القياسي ومياه الشرب المعقمة. سُمح لجميع الجرذان بالتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل التجربة. عُلّق clopidogrel hydrogensulfate في 0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) بتركيز 0.781 mg/mL. وتلقت الجرذان في المجموعة المعالجة بـ clopidogrel مادة clopidogrel hydrogensulfate عن طريق التغذية القسرية الفموية بجرعة 10 mL/kg من وزن الجسم (ما يعادل 1 mL/100 g من وزن الجسم وبجرعة مقدارها 7.81 mg/kg) مرة واحدة يومياً لمدة 3 أيام متتالية. بينما تلقت الجرذان في المجموعة الضابطة حجماً مساوياً من 0.5% CMC-Na. تم اختيار الجرعة ومدة العلاج التي استمرت 3 أيام بناءً على نموذج جرذان قصير المدى سبق الإبلاغ عنه للإعطاء الفموي لـ clopidogrel. وبعد آخر عملية تغذية قسرية في اليوم الثالث، تم منع الطعام لمدة 12 h، بينما توفر الماء ad libitum. تم تخدير الجرذان في غرفة تحريض باستخدام 3% isoflurane في الأكسجين، وحوفظ على التخدير بنسبة 1.5%–2.0% isoflurane يتم توصيله عبر قناع أنفي. تم التأكد من عمق التخدير الكافي من خلال غياب المنعكسات القرنية ومنعكس سحب القدم. جُمعت عينات الدم عن طريق بزل القلب النهائي تحت تخدير عميق. وبينما كانت الجرذان لا تزال تحت التخدير العميق، تم القضاء عليها عن طريق إفراغ الدم متبوعاً بفتح الصدر ثنائي الجانب. تم التأكد من الوفاة من خلال غياب التنفس التلقائي والنشاط القلبي لمدة 5 min على الأقل، جنباً إلى جنب مع غياب المنعكسات القرنية ومنعكس سحب القدم. ثم أُزيلت المعدة بسرعة، وفُتحت على طول الانحناء الكبير، وشُطفت برفق بمحلول ملحي مبرد بالثلج.
تم الحصول على خط الخلايا الظهارية للمخاطية المعدية البشرية GES-1 من شركة iCell Bioscience Inc. (شنغهاي، الصين؛ رقم الكتالوج iCell-h062)، وقد تم التحقق من هوية الخلايا عن طريق تحليل التكرارات الترادفية القصيرة من قبل المورد. زُرعت الخلايا في وسط RPMI-1640 مدعم بـ 10% مصل جنين البقر (FBS) و 1% بنسيلين-ستريبتومايسين في حاضنة رطبة عند 37°C مع 5% CO₂. استُخدمت الخلايا في ممراتها المبكرة (بين الممر 3 و 10) في التجارب. وعندما وصل تلاقي الخلايا إلى 80%–90% تقريباً، تم تمرير الخلايا بنسبة تقسيم 1:3. واستُخدمت الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي في التجارب اللاحقة. وبالنسبة لمقايسة CCK-8، تم استزراع الخلايا في أطباق ذات 96 بئراً بكثافة 6 × 103 خلية/بئر. أما بالنسبة لتحليلات موت الخلايا المبرمج والدورة الخلوية، فقد استُزرعت الخلايا في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 5 × 105 خلية/بئر تقريباً، وتُرِكت لتلتصق قبل المعالجة بعقار clopidogrel.
الكيميائيات والمحاليل
استُخدم كبريتات كلوبيدوجريل الهيدروجينية (Cat. No. C874834؛ نقاوة ≥ 99%) في التجارب التي أجريت على الحيوانات والخلايا. تم تحضير محلول مخزون من الكلوبيدوجريل عن طريق إذابة 100 mg من مسحوق الكلوبيدوجريل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للحصول على محلول مخزون بتركيز 1 M. ثم خُفف المحلول المخزون لاحقاً إلى تركيزات العمل المطلوبة قبل الاستخدام. خُفف المحلول المخزون بتركيز 1 M تسلسلياً باستخدام DMSO لتحضير محاليل جرعات بتركيز 1000× عند تركيزات 10، 100، 200، 400، 600، 800، و 1000 mM. وقبل العلاج مباشرة، أضيف كل محلول جرعات بتركيز 1000× إلى وسط استزراع كامل بنسبة 1:1000 (v/v) للحصول على تركيزات نهائية من الكلوبيدوجريل تبلغ 0.01، 0.1، 0.2، 0.4، 0.6، 0.8، و 1.0 mM، على التوالي. وتلقت مجموعة الضبط التي استخدمت المادة الناقلة حجماً مساوياً من DMSO بدون كلوبيدوجريل. وبذلك، تم الحفاظ على التركيز النهائي لـ DMSO عند 0.1% (v/v) في جميع المجموعات. لا تحاكي خلايا GES-1 المستزرعة التنشيط الحيوي للكلوبيدوجريل الذي يتوسطه سيتوكروم P450 الكبدي؛ لذا استُخدم العلاج المباشر بالكلوبيدوجريل كنموذج استكشافي للتعرض للمركب الأصلي. وقد اختير نطاق التركيز لتوصيف الاستجابات الخلوية المعتمدة على التركيز تحت الظروف التجريبية، ولا ينبغي تفسيرها على أنها مكافئة للتركيزات التي يمكن تحقيقها سريرياً في البلازما أو أنسجة المعدة.
استزراع الخلايا الفرعي
تم تحضير الوسط الكامل عن طريق استكمال الوسط الزراعي الأساسي بإضافة FBS والبنسلين-ستريبتومايسين. وعندما وصلت درجة تلاقي الخلايا إلى 80% تقريباً، تمت إزالة الوسط الزراعي، وغُسلت الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم. بعد ذلك، هُضمت الخلايا باستخدام محلول التريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) لمدة تتراوح بين 1-2 دقيقة تقريباً. وبعد انفصال الخلايا جزئياً، أضيف الوسط الكامل لإيقاف عملية الهضم. ثم تم إجراء طرد مركزي لمعلق الخلايا عند 1,200 × g لمدة 3 دقائق. وبعد إزالة supernatant، أُعيد تعليق كتلة الخلايا في 1-2 mL من الوسط الكامل وزُرعت في أطباق زراعة جديدة وفقاً للمتطلبات التجريبية.
مقايسة حيوية الخلايا باستخدام CCK-8
تم استزراع خلايا GES-1 في مرحلة النمو اللوغاريتمي في أطباق ذات 96 بئراً بكثافة 6 × 103 خلية/بئر، وحُضنت طوال الليل للسماح بالتصاق الخلايا. وبعد الالتصاق، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من الكلوبيدوجريل (0، 0.01، 0.1، 0.2، 0.4، 0.6، 0.8، و 1.0 mM) لمدة 24 h. وتلقت مجموعة الضبط نفس التركيز النهائي من المذيب (vehicle). وبعد المعالجة، أُضيف محلول CCK-8 إلى كل بئر وحُضن عند 37°C وفقاً لتعليمات الطقم. وقيس الامتصاص عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader). وحُسبت حيوية الخلايا كنسبة مئوية من مجموعة الضبط. وبناءً على نتائج الاستجابة للتركيز، تم اختيار المعالجة بـ 0.1 mM من الكلوبيدوجريل لمدة 24 h لإجراء تحليلات الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، والدورة الخلوية، و qPCR، و Western blot اللاحقة.
تحليل قياس التدفق الخلوي
تم استزراع خلايا GES-1 في أطباق ذات 6 آبار ومعالجتها بـ 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 h بعد التصاق الخلايا. وعقب المعالجة، تم جمع كل من الخلايا العائمة والملتصقة. جرى هضم الخلايا الملتصقة باستخدام التريبسين الخالي من EDTA، ثم غُسلت مرتين بـ PBS بارد، وأُعيد تعليقها في محلول ربط (binding buffer). صُبغت الخلايا باستخدام طقم Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وبعد التحضين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، تم الكشف عن الخلايا المبرمجة (apoptotic cells) باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي RaiseCyte 2L6C. جُمعت البيانات باستخدام برنامج RaiseFlower للتحصيل وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo (الإصدار 10.8.1). كما تم تقدير كمية مجموعات الخلايا في مراحل الموت الخلوي المبرمج المبكرة والمتأخرة والكلية باستخدام برنامج FlowJo.
التحليل القياسي التدفقي لتوزيع الدورة الخلوية
تم استزراع خلايا GES-1 في أطباق مكونة من 6 آبار ومعالجتها بـ 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 h. وبعد المعالجة، جُمعت الخلايا وغُسلت بمحلول PBS، ثم ثُبِّتت في إيثانول بتركيز 70% مبرد مسبقاً عند 4°C. ثم غُسلت الخلايا المثبتة لإزالة بقايا الإيثانول وحُضنت مع محلول صبغ RNase A واليوديد البروبيديوم في الظلام وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وتم تحليل توزيع الدورة الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. كما جُمعت البيانات باستخدام برنامج الحصول على البيانات وحُللت باستخدام برنامج FlowJo. وتمت مطابقة توزيعات الدورة الخلوية باستخدام نموذج Watson، وحُسبت النسب المئوية للخلايا في مراحل G0/G1 و S و G2/M.
تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)
تَمَّ استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من خلايا GES-1 وعينات من أنسجة المعدة لدى الجرذان باستخدام طقم استخلاص RNA وفقاً لتعليمات الطقم. وبالنسبة لعينات الأنسجة، جُمِعت أنسجة المخاطية المعدية بسرعة، وجُنُسُجت (homogenized) في ظروف درجة حرارة منخفضة، ثم خضعت لعملية استخلاص RNA. حُدِّد تركيز RNA ونقاوته عن طريق قياس الامتصاصية عند 260 و280 نانومتر. نُسِخَت كميات متساوية من RNA عكسياً إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين متمم (cDNA) باستخدام طقم نسخ عكسي يتضمن إزالة الحمض النووي الجينومي. أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Quantitative real-time PCR) باستخدام مزيج PCR رئيسي يعتمد على صبغة SYBR Green. أُجري كل تفاعل في حجم كلي قدره 20 µL يحتوي على 10 µL من 2× المزيج الرئيسي، 1 µL من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA)، 0.4 µL من البادئ الأمامي، 0.4 µL من البادئ العكسي، و 8.2 µL من الماء المقطر مزدوج التقطير الخالي من RNase₂أ. كانت ظروف الدورات الحرارية كما يلي: تمسخ أولي عند 95°C لمدة 10 دقائق، تليها 40 دورة من المسخ عند 95°C لمدة 10 ثوانٍ، والتهجين عند 60°C لمدة 30 ثانية، والتمديد عند 72°C لمدة 30 ثانية. وتم تحديد مستويات تعبير كل من CHOP وATF5 وBcl-2 وBax. واستُخدم GAPDH كجين مرجعي داخلي. وحُسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔطريقة Ct. تدرج تسلسلات البادئات في الجدول التكميلي 1.
لطخة ويسترن
تَم استخلاص البروتين الكلي من خلايا GES-1 وعينات من أنسجة معدة الجرذ. بالنسبة لعينات الخلايا، غُسلت خلايا GES-1 المعالجة بمحلول PBS بارد ثم حُللت باستخدام محلول RIPA (radioimmunoprecipitation assay) الذي يحتوي على مثبط للبروتياز. وبالنسبة لعينات الأنسجة، جرى تجانس أنسجة المخاطية المعدية في محلول RIPA تحت ظروف درجة حرارة منخفضة، ثم خضعت للطرد المركزي لجمع المادة الطافية. حُددت تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA للبروتين. تم فصل ما مجموعه 20 µg من البروتين لكل مسار عن طريق الفصل الكهربائي للهلام بـ SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) ثم نُقلت البروتينات إلى أغشية PVDF (polyvinylidene difluoride). وبعد الحجب باستخدام ألبومين المصل البقري (BSA)، حُضنت الأغشية طوال الليل عند 4°C مع أجسام مضادة أولية ضد CHOP (1:1000)، و ATF5 (1:1000)، و Bcl-2 (1:1000)، و Bax (1:1000)، و β-actin (1:5000). وبعد الغسل، حُضنت الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بإنزيم بيروكسيداز الفجل (horseradish peroxidase) المقابلة (1:10000). تم تصور حزم البروتين باستخدام كاشف كيميائي مضيء مُعزز والتقاط الصور بواسطة نظام تصوير كيميائي مضيء. تم قياس شدة الحزم باستخدام برنامج تحليل الصور ومعايرتها بالنسبة لـ β-actin.
التقييم النسيجي المرضي
جُمِعت عينات من أنسجة المعدة من جرذان Sprague–Dawley بعد علاجها بعقار clopidogrel، وثُبِّتت في محلول فورمالين مُنظم متعادل بتركيز 10%. خضعت العينات لعمليات التجفيف، والترويق، والطمر في البارافين، ثم قُطِّعت بسماكة 4 µm. صُبغت قطاعات البارافين بصبغتي الهيماتوكسيلين والإيوسين. وقُيِّمت التغيرات الهيستوباثولوجية نوعياً باستخدام المجهر الضوئي بناءً على مورفولوجيا المخاطية، وسلامة الظهارة، والوذمة، وتسلل الخلايا الالتهابية. كما التُقِطت صور تمثيلية، ولم يُطبق أي نظام تسجيل نسيجي.
الكيمياء النسيجية المناعية
تمت إزالة البارافين من مقاطع أنسجة المعدة المضمنة في البارافين باستخدام الزايلين، ثم أُعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول. وأُجري استرداد المستضدات بالحرارة في محلول سترات منظم. وتم تثبيط نشاط البيروكسيديز الداخلي باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3% لمدة 10 min، كما ثُبط الارتباط غير النوعي باستخدام مصل الماعز الطبيعي لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، حُضنت المقاطع طوال الليل عند 4°C مع أجسام مضادة أولية ضد CHOP وATF5 وBcl-2 وBax. وبعد الغسل بمحلول PBS، حُضنت المقاطع مع الجسم المضاد الثانوي المقترن ببيروكسيديز الفجل الحار المناظر. وتم إظهار الإشارات المناعية باستخدام محلول DAB الملون، يليه التلوين المضاد بالهيماتوكسيلين. ثم جُففت المقاطع، ونُقيت، وثُبتت، وفُحصت تحت المجهر الضوئي. والتقطت صور تمثيلية، وقُدرت مساحة التلوين الإيجابية باستخدام برنامج لتحليل الصور.
التلوين المناعي الفلوري
تم إزالة البارافين من مقاطع أنسجة المعدة المغمورة في البارافين، ثم أُعيد ترطيبها، وأُخضعت لعملية استعادة المستضدات المستحثة حرارياً في محلول ستريت المنظم. وبعد الحجب باستخدام مصل ماعز طبيعي لمدة 30 min، حُضنت المقاطع طوال الليل عند 4°C مع أجسام مضادة أولية ضد CHOP (1:50)، وATF5 (1:100)، وBcl-2 (1:50)، وBax (1:200). وبعد الغسل باستخدام PBS، حُضنت المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المقابلة (1:500) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام، ثم صُبغت صبغة تباينية باستخدام DAPI. التُقطت الصور باستخدام مجهر فلوري بقوة تكبير ×200. تم تحليل ثلاثة حقول غير متداخلة مختارة عشوائياً من كل حيوان باستخدام برنامج Image-Pro Plus 6.0، وعُبر عن شدة الفلورة بصيغة IOD/Area. شمل التحليل ثلاثة حيوانات لكل مجموعة.
مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
جُمعت عينات الدم من جرذان Sprague–Dawley بعد العلاج وتُرِكت لتتجلط في درجة حرارة الغرفة. فُصل المصل عن طريق الطرد المركزي وحُفظ في درجة حرارة −80°C حتى وقت التحليل. قِيست مستويات IL-1β وIL-6 وTNF-α في المصل باستخدام أطقم ELISA وفقًا لتعليمات الطقم. قِيست الامتصاصية باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة، وحُسبت تركيزات السيتوكينات وفقًا لمنحنيات القياس стандарт.
التحليل الإحصائي
أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي. وعُرضت البيانات في صورة المتوسط ± SD. كما تم تقييم التوزيع الطبيعي وتجانس التباين باستخدام اختبار Shapiro–Wilk واختبار Levene، على التوالي. وأُجريت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار Student's t-test، بينما أُجريت المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way analysis of variance) متبوعاً باختبار Dunnett’s post hoc. واعتُبرت القيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية. كما نُفذت جميع تجارب الخلايا باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة على الأقل.
النتائج
كلوبيدوجريل يقلل من حيوية خلايا GES-1 ويزيد من الموت الخلوي المبرمج In Vitro
بحثنا أولاً فيما إذا كان الكلوبيدوغريل يؤثر على حيوية خلايا GES-1 وموتها المبرمج. أظهرت مقايسات CCK-8 أن المعالجة بالكلوبيدوغريل قللت بشكل ملحوظ من حيوية خلايا GES-1 (الشكل 1A،B)، مما يشير إلى انخفاض حيوية الخلايا. وبناءً على الانخفاض العام في حيوية الخلايا عبر نطاق التركيزات المختبرة، تم اختيار تركيز 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 ساعة لجميع تجارب الخلايا اللاحقة. أُجري بعد ذلك تحليل التدفق الخلوي لتحليل الموت المبرمج وتوزيع الدورة الخلوية (الشكل 1C–F). أظهر تحليل التدفق الخلوي زيادة في نسبة الخلايا في طور S، ترافقها نسبة منخفضة من جمهرة G0/G1 وعدم وجود زيادة واضحة في جمهرة G2/M، مما يشير إلى تراكم في طور S بدلاً من التوقف في طور G2/M. أثبتت النتائج أن الكلوبيدوغريل زاد بشكل ملحوظ من الموت المبرمج وغير توزيع الدورة الخلوية في خلايا GES-1 مقارنة بمجموعة التحكم. وإجمالاً، تشير هذه النتائج إلى أن الكلوبيدوغريل يقلل من حيوية خلايا GES-1 ويرتبط بزيادة الموت المبرمج وتغيرات في تقدم الدورة الخلوية. وتبرهن هذه النتائج على حدوث استجابات سامة للخلايا عقب التعرض المباشر للمركب الأصلي للكلوبيدوغريل في ظل الظروف التجريبية المختارة؛ وهي لا تثبت حدوث تأثيرات مماثلة عند مستويات التعرض ذات الصلة سريرياً أو أن الاستجابات الملحوظة تتم بوساطة المستقلب النشط للكلوبيدوغريل.
الشكل 1. الكلوبيدوغريل يقلل من حيوية خلايا GES-1 ويزيد من الموت الخلوي المبرمج. (A) تم تقييم حيوية خط خلايا الظهارة المعدية البشرية GES-1 باستخدام مقايسة CCK-8 بعد المعالجة بتركيزات متزايدة من الكلوبيدوغريل (0–1.0 mM) لمدة 24 h. (B) مقارنة كمية لحيوية الخلايا بين مجموعة التحكم والمجموعة المعالجة بـ 0.1 mM من الكلوبيدوغريل لمدة 24 h. (C) ملفات تمثيلية لدورة الخلية عبر قياس التدفق الخلوي تم تحليلها باستخدام نموذج Watson. (D) تقدير كمي لنسب الخلايا في مراحل G0/G1 و S و G2/M. أدت المعالجة بالكلوبيدوغريل إلى زيادة عدد الخلايا في مرحلة S دون زيادة واضحة في عدد الخلايا في مرحلة G2/M. (E) مخططات نقطية تمثيلية للموت الخلوي المبرمج عبر قياس التدفق الخلوي بعد الصبغ بـ Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) و propidium iodide (PI). (F) تقدير كمي لإجمالي مجتمع الخلايا المبرمج موتها. أُجريت جميع تجارب الخلايا باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). تم تحديد الدلالة الإحصائية عن طريق المقارنة مع مجموعة التحكم. ***P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ترتبط الإصابة المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل بالالتهاب الجهازي
تم تقسيم جرذان Sprague–Dawley عشوائياً إلى مجموعتين (العدد = 6 لكل مجموعة): مجموعة ضابطة ومجموعة عولجت بـ clopidogrel عن طريق التغذية القسرية اليومية. تم اختيار جرعة clopidogrel ونظام العلاج لمدة 3 أيام بناءً على نموذج سابق لجرذان مصابة بإصابات معدية مستحثة بواسطة clopidogrel16. وبعد 3 أيام، جُمعت أنسجة المعدة لصبغها بـ hematoxylin and eosin (H&E). وكشف الفحص النسيجي المرضي عن وجود تآكلات في مخاطية المعدة، ووذمة، وتسلل للخلايا الالتهابية في المجموعة المعالجة بـ clopidogrel مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 2A). كما تم قياس مستويات السيتوكينات الالتهابية في المصل باستخدام تقنية ELISA. وأظهرت المجموعة المعالجة بـ clopidogrel مستويات أعلى بكثير في المصل من interleukin (IL)-1β و IL-6 و tumor necrosis factor-α (TNF-α) مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 2B–D). وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج بـ clopidogrel يرتبط بإصابة مخاطية المعدة وزيادة الاستجابات الالتهابية الجهازية15,16.
الشكل 2. الكلوبيدوجريل يحفز إصابة المخاطية المعدية ويزيد من مستويات السيتوكينات الالتهابية الجارية في جرذان. (A) مقاطع ممثلة مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) للمخاطية المعدية من جرذان Sprague–Dawley في مجموعة التحكم والمجموعة المعالجة بالكلوبيدوجريل. يظهر الفحص النسيجي الحفاظ على بنية المخاطية المعدية في مجموعة التحكم وتغيرات مورفولوجية في المجموعة المعالجة بالكلوبيدوجريل. تشير الأسهم الصفراء إلى الخلايا الظهارية للمخاطية المعدية، والأسهم الحمراء إلى احتقان بؤري داخل الطبقة المخاطية، والأسهم السوداء إلى ارتشاح بسيط للخلايا الالتهابية. التكبير الأصلي، ×200؛ شريط المقياس = 100 µm. n = 6 حيوانات لكل مجموعة. (B–D) قياس تركيزات مصل الإنترلوكين (IL)-1β وIL-6 وعامل نخر الورم-α (TNF-α) باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). البيانات معروضة كالمتوسط ± SD؛ n = 6 حيوانات لكل مجموعة. ***P < 0.001 مقارنة بمجموعة التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يؤدي الكلوبيدوجريل (Clopidogrel) إلى تغيير علامات الإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية والمؤشرات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج في المخاطية المعدية للجرذان
لبحث التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة المعدة الناجمة عن الكلوبيدوغريل (clopidogrel)، تم إجراء صبغ كيميائي نسيجي مناعي على مقاطع من أنسجة المعدة. أظهرت الصور التمثيلية صبغاً أقوى لكل من CHOP وATF5 وBax في المجموعة المعالجة بالكلوبيدوغريل مقارنة بمجموعة الضبط، بينما ظهر صبغ Bcl-2 أضعف (الشكل 3A). وأظهر التحليل الكمي لـ IOD/area زيادة ملحوظة في صبغ CHOP وATF5 وBax بعد المعالجة بالكلوبيدوغريل (الشكل 3B، C، E). كما أظهر صبغ Bcl-2 اتجاهاً نحو الانخفاض، على الرغم من أن الفرق لم يصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 3D). تشير هذه النتائج إلى أن المعالجة بالكلوبيدوغريل ترتبط بتغير في تعبير البروتينات المرتبطة بالإجهاد والموت الخلوي المبرمج في مخاطية معدة الجرذان. وأظهر تحليل التألق المناعي إشارات أقوى لـ CHOP وATF5 في أنسجة مخاطية المعدة من المجموعة المعالجة بالكلوبيدوغريل. وأكد التحليل الكمي وجود زيادات ملحوظة في CHOP (الشكلان 4A و5A) وATF5 (الشكلان 4B و5B)، بينما أظهر Bcl-2 (الشكلان 4C و5C) وBax (الشكلان 4D و5D) اتجاهات تناقصية وتزايدية على التوالي، دون الوصول إلى دلالة إحصائية. وتؤكد هذه النتائج مجتمعة أن المعالجة بالكلوبيدوغريل ترتبط بتغير في تعبير مؤشرات إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER stress) والمؤشرات المرتبطة بالموت الخلوي المبرمج في مخاطية معدة الجرذان.
الشكل 3. الكشف الكيميائي النسيجي المناعي عن البروتينات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج في أنسجة المعدة. (A) صور تمثيلية للتلوين الكيميائي النسيجي المناعي للبروتين المتماثل لـ C/EBP (CHOP)، وعامل النسخ المنشط 5 (ATF5)، وبروتين B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)، والبروتين X المرتبط بـ Bcl-2 (Bax) في أنسجة المخاطية المعدية من جرذان Sprague–Dawley في مجموعة الضبط والمجموعة المعالجة بـ clopidogrel. يشير التلوين البني إلى التفاعل المناعي الإيجابي، وتم تلوين النوى بصبغة الهيماتوكسيلين. الصور المعروضة تمثيلية لجميع العينات التي تم تحليلها، مع إدراج ثلاثة حيوانات في كل مجموعة. التكبير الأصلي، ×200؛ شريط المقياس = 100 µm. (B–E) التحليل الكمي للكثافة الضوئية المتكاملة لكل وحدة مساحة (IOD/Area) لكل من CHOP و ATF5 و Bcl-2 و Bax على التوالي. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. *P < 0.05 و **P < 0.01 مقارنة بمجموعة الضبط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. الكشف عن البروتينات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية وموت الخلايا المبرمج في أنسجة المعدة باستخدام التألق المناعي. صور تألق مناعي تمثيلية توضح تموضع البروتين المتجانس لـ C/EBP (CHOP)، وعامل النسخ المنشط 5 (ATF5)، وبروتين الليمفوما B-cell 2 (Bcl-2)، والبروتين X المرتبط بـ Bcl-2 (Bax) في أنسجة المخاطية المعدية لجرذان Sprague–Dawley من مجموعة الضبط والمجموعة المعالجة بالكلوبيدوغريل. صُبغت النوى بصبغة 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (باللون الأزرق)، ويظهر صبغ التألق المناعي الإيجابي باللون الأحمر. الصور المدمجة معروضة في العمود الأيمن. (A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. التكبير الأصلي، ×200؛ شريط المقياس = 100 µm. الصور المعروضة تمثيلية لجميع العينات التي تم تحليلها، حيث n = 3 حيوانات لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5. التحليل الكمي للتألق المناعي للبروتينات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية وموت الخلايا المبرمج في أنسجة المعدة. (A–D) التحديد الكمي للكثافة الضوئية المتكاملة لكل وحدة مساحة (IOD/Area) لكل من البروتين المتماثل لـ C/EBP (CHOP)، وعامل النسخ المنشط 5 (ATF5)، وبروتين Bcl-2 المرتبط بلمفوما الخلايا البائية (Bcl-2)، والبروتين X المرتبط بـ Bcl-2 (Bax) في أنسجة المخاطية المعدية لجرذان Sprague–Dawley من مجموعة الضبط والمجموعة المعالجة بالكلوبيدوجريل. لكل حيوان، تم تحليل ثلاثة حقول مجهرية غير متداخلة مختارة عشوائياً لكل مقطع نسيجي باستخدام برنامج تحليل الصور، واستُخدمت القيمة المتوسطة للتحليل الإحصائي. البيانات معروضة كالمتوسط ± SD؛ العدد n = 3 حيوانات لكل مجموعة. *P < 0.05 و **P < 0.01 مقارنة بمجموعة الضبط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يعمل الكلوبيدوجريل على تغيير التعبير الجيني والبروتيني المرتبط بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج في خلايا GES-1 وأنسجة المعدة لدى الجرذان
أشارت الدراسات السابقة إلى أن إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER stress) يلعب دورًا رئيسيًا في استجابات الإجهاد الخلوي والموت الخلوي المبرمج (apoptosis)17,18. ولتقييم التغيرات في المؤشرات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية بعد العلاج بـ clopidogrel، تم فحص تعبير CHOP وATF5 في خلايا GES-1. وقد أظهر تحليل qRT-PCR زيادة في تعبير mRNA لكل من CHOP وATF5 بعد العلاج بـ clopidogrel. كما أكد تحليل Western blot زيادة تعبير بروتينات CHOP وATF5 (الشكل 6A–E). وبناءً على ذلك، تم تقييم تعبير البروتينات المرتبطة بالموت الخلوي المبرمج في خلايا GES-1 وأنسجة المعدة لدى الجرذان. وبالمقارنة مع مجموعة الضبط، أدى العلاج بـ clopidogrel إلى زيادة تعبير Bax وانخفاض تعبير Bcl-2، مما أدى إلى زيادة نسبة Bax/Bcl-2 (الشكل 6A–J). وقد لوحظت أنماط التعبير هذه بشكل متسق على مستويي mRNA والبروتين في كل من خلايا GES-1 وأنسجة المعدة لدى الجرذان. وتؤكد هذه النتائج مجتمعة أن العلاج بـ clopidogrel يرتبط بتغير تعبير المؤشرات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج في كلا النموذجين التجريبيين.
الشكل 6. تعبير مؤشرات الإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية والمؤشرات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج في خلايا GES-1 وأنسجة المعدة لدى الجرذان بعد العلاج بـ clopidogrel. (A–D) التعبير النسبي للحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) لكل من البروتين المتماثل لـ C/EBP (CHOP)، وعامل النسخ المنشط 5 (ATF5)، والبروتين 2 المرتبط بليمفوما الخلايا البائية (Bcl-2)، والبروتين X المرتبط بـ Bcl-2 (Bax) في خط خلايا الظهارة المعدية البشرية GES-1، والمحدد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). (E) صور تمثيلية من لطخة ويسترن مع القياس الكثافي المقابل لتعبير بروتينات CHOP وATF5 وBcl-2 وBax في خلايا GES-1. تم ضبط مستويات تعبير البروتين بالنسبة لـ β-actin. أجريت تجارب الخلايا باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). (F–I) التعبير النسبي لـ mRNA لكل من CHOP وATF5 وBcl-2 وBax في أنسجة المعدة لدى الجرذان والمحدد بواسطة qRT-PCR. (J) صور تمثيلية من لطخة ويسترن مع القياس الكثافي المقابل لتعبير بروتينات CHOP وATF5 وBcl-2 وBax في أنسجة المعدة لدى الجرذان. تم ضبط مستويات تعبير البروتين بالنسبة لـ β-actin. شملت تجارب الأنسجة n = 3 حيوانات لكل مجموعة. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال المقارنة مع مجموعة التحكم. *P < 0.05، و**P < 0.01، و***P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تظهر النتائج مجتمعة أن العلاج بـ clopidogrel أدى إلى تقليل حيوية خلايا GES-1، وزيادة موت الخلايا المبرمج، وتغيير تعبير المؤشرات المرتبطة بـ ER stress وموت الخلايا المبرمج، وارتبط بإصابة المخاطية المعدية المصحوبة بزيادة مستويات السيتوكينات الالتهابية المتداولة في الجرذان. وتدعم هذه النتائج فرضية الدراسة بأن العلاج بـ clopidogrel يرتبط بإصابة المخاطية المعدية وتغيرات متزامنة في المؤشرات المرتبطة بـ ER stress وموت الخلايا المبرمج.
توافر البيانات:
جميع البيانات التي تم إنتاجها أو تحليلها خلال هذه الدراسة مدرجة في هذا المقال المنشور والمواد التكميلية الملحقة به. تتوفر تتابعات البادئات المستخدمة في تقنية RT-PCR في الجدول التكميلي 1. كما تتوفر البيانات الخام التي تدعم جميع الأشكال ولوحات الأشكال الفردية، بما في ذلك مجموعات البيانات التجريبية الأصلية وملفات المصدر، في الأرشيف التكميلي المرفق البيانات الخام (ملف مضغوط).
الجدول التكميلي 1. تسلسلات البادئات المستخدمة لتحليل RT-PCR. تظهر تسلسلات البادئات الأمامية (F) والعكسية (R) المستخدمة لتحليل RT-PCR لكل من GAPDH وCHOP وATF5 وBcl-2 وBax في هذه الدراسة بالاتجاه 5′–3′.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
يُستخدم كلوبيدوجريل (Clopidogrel) على نطاق واسع للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية وعلاجها؛ ومع ذلك، يرتبط استخدامه السريري بمخاطر حدوث نزيف ومضاعفات في الجهاز الهضمي، بما في ذلك القرحة الهضمية والنزيف والانثقاب19. لذا، فإن فهم التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة المعدة الناجمة عن الكلوبيدوجريل أمر مهم لتحسين الوقاية من هذه الآثار الضارة وإدارتها. في الدراسة الحالية، بحثنا في تأثيرات الكلوبيدوجريل على الخلايا الظهارية للمعدة وأنسجة المعدة لدى الجرذان، ورصدنا التغيرات في حيوية الخلايا، والموت الخلوي المبرمج، والاستجابات الالتهابية، والتعبير عن المؤشرات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER stress) والموت الخلوي المبرمج. تشير هذه النتائج إلى أن إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل ترتبط بتغيرات في التعبير عن المؤشرات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج. ومع ذلك، نظرًا لعدم إجراء تجارب الإنقاذ الدوائي أو تجارب فقدان الوظيفة الجينية، فإن هذه النتائج لا تثبت وجود علاقة سببية بين إجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج.
أشارت الدراسات السابقة إلى أن عقار clopidogrel قد يضعف إصلاح المخاطية المعدية ويؤخر التئام القرحة المعدية20. وفي الدراسة الحالية، أظهرت فحوصات CCK-8 أن clopidogrel قلل من حيوية خلايا GES-1، كما أظهر قياس التدفق الخلوي زيادة في الموت الخلوي المبرمج وتغيراً في تقدم الدورة الخلوية (الشكل 1). وتتفق هذه النتائج مع تقارير سابقة حول تحفيز clopidogrel للموت الخلوي المبرمج في الخلايا الظهارية المعدية21. وتشير هذه الملاحظات إلى أن العلاج بـ clopidogrel يرتبط بتدهور حيوية الخلايا الظهارية المعدية وزيادة الموت الخلوي المبرمج، مما قد يساهم في إصابة المخاطية المعدية11. وفي نموذج الجرذان، أظهر صبغ H&E إصابة في المخاطية المعدية بعد العلاج بـ clopidogrel (الشكل 2A). كما ارتفعت مستويات IL-1β وIL-6 وTNF-α في المصل بشكل ملحوظ (الشكل 2B–D)، مما يشير إلى استجابة التهابية مرتبطة بإصابة المخاطية المعدية22. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت تحاليل الكيمياء النسيجية المناعية والفلورة المناعية تغيراً في تعبير المؤشرات المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج في أنسجة المعدة لدى الجرذان المعالجة بـ clopidogrel مقارنة بمجموعة الضبط (الشكل 3, الشكل 4, الشكل 5).
تُعد البروتينات CHOP وATF5 وBcl-2 وBax منظمات مهمة لاستجابات الإجهاد الخلوي والموت الخلوي المبرمج23,24,25,26. في هذه الدراسة، ارتبط العلاج بالكلوبيدوجريل بزيادة تعبير CHOP وATF5 وتغير تعبير Bax وBcl-2 في كل من خلايا GES-1 وأنسجة المعدة لدى الجرذان (الشكل 6). وتشير هذه النتائج إلى حدوث تغيرات متزامنة في المؤشرات المرتبطة بالإجهاد والموت الخلوي المبرمج. ومع ذلك، فقد قيمت الدراسة الحالية تغيرات التعبير فقط ولم تحدد ما إذا كانت هذه الجزيئات تتوسط بشكل مباشر إصابة المخاطية المعدية الناجمة عن الكلوبيدوجريل. وبالمثل، على الرغم من ملاحظة زيادة في نسبة Bax/Bcl-2، إلا أن الدراسة لم تثبت بشكل مباشر تفعيل مسار الموت الخلوي المبرمج الميتوكوندري. لذلك، يجب تفسير هذه النتائج على أنها ارتباطات وليست دليلاً على آلية إشارات سببية.
تجمع الدراسة الحالية بين نموذج جرذان in vivo وتجارب التعرض المباشر الاستكشافية في خلايا GES-1 لتقييم التغيرات المورفولوجية والجزيئية المرتبطة بالعلاج بـ clopidogrel. يوفر نموذج in vivo الدليل الأساسي على إصابة المخاطية المعدية، بينما توفر تجارب GES-1 أدلة داعمة فيما يتعلق بالاستجابات الخلوية بعد التعرض المباشر للمركب الأصلي. يتيح الجمع بين التحليل النسيجي المرضي، وقياس السيتوكينات الالتهابية، والكيمياء النسيجية المناعية، والومضان المناعي، وqRT-PCR، وWestern blotting تقييماً شاملاً للتغيرات المورفولوجية والجزيئية المرتبطة بإصابة المعدة. قد يكون هذا النهج التجريبي مفيداً لاستقصاء التأثيرات المعدية المعوية للعوامل المضادة للصفائح الدموية ولتقييم التدخلات الوقائية المحتملة في الدراسات المستقبلية.
يجب الإقرار بعدد من القيود. يُعد Clopidogrel دواءً أولياً يتطلب تنشيطاً استقلابياً كبدياً، في حين أن تعريض خلايا GES-1 مباشرة للمركب الأصلي لا يحاكي هذه العملية ولا يعكس الحركية الدوائية السريرية بشكل كامل. بالإضافة إلى ذلك، فإن التركيزات العالية نسبياً المستخدمة في المختبر قد تكون تسببت في سمية خلوية غير محددة. وبناءً على ذلك، يجب اعتبار تجارب GES-1 كدليل استكشافي للاستجابات الخلوية تحت ظروف التعريض المباشر. لم يتضمن مقايسة CCK-8 ضابطاً موجباً لانخفاض حيوية الخلايا، مما حدّ من التحقق المستقل من أداء المقايسة. كما لم يتم استقصاء الآليات العلوية المسؤولة عن التغيرات الملحوظة المرتبطة بإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER stress)، ولم تُجرَ تجارب التثبيط الدوائي، أو إسكات الجينات (gene knockdown)، أو تعطيل الجينات (gene knockout) لتحديد ما إذا كان إجهاد الشبكة الإندوبلازمية ينظم توازن Bax/Bcl-2 وموت الخلايا المبرمج بشكل مباشر. وينبغي أن تقارن الدراسات المستقبلية بين المركب الأصلي ومستقلبه النشط، وأن تدمج نظام تنشيط استقلابي مناسب، وأن تُجري تجارب تدخل وظيفي لتوضيح هذه العلاقات. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم تضمين ضابط موجب معروف لتحفيز موت الخلايا المبرمج في مقايسة Annexin V-FITC/PI. لذا، ورغم أن العلاج بـ clopidogrel ارتبط بزيادة في مجموعة الخلايا الموجبة لـ Annexin V مقارنة بضابط المركب الناقل، فإن الأداء التقني لمقايسة موت الخلايا المبرمج لم يتم التحقق منه بشكل مستقل باستخدام حالة ضابطة موجبة. لذا يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية محفزاً لموت الخلايا المبرمج، مثل staurosporine، في نفس الدفعة التجريبية.
وفي الختام، أدى العلاج الفموي بعقار clopidogrel إلى حدوث إصابة في المخاطية المعدية لدى الجرذان، وصاحب ذلك تغيرات في المؤشرات المرتبطة بالإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية (ER stress) ومؤشرات الموت الخلوي المبرمج (apoptosis). كما أدى تعريض خلايا GES-1 بشكل مباشر للمركب الأصلي لـ clopidogrel إلى تقليل حيوية الخلايا وتغيير المؤشرات الجزيئية ذات الصلة تحت الظروف التجريبية. ومع ذلك، ونظراً لأن النموذج الخلوي لا يحاكي التنشيط الحيوي الكبدي، ولأنه تم استخدام تركيزات عالية نسبياً، فلا يمكن تعميم النتائج المختبرية (in vitro) مباشرة على التعرض السريري، كما لا يمكن استبعاد حدوث سمية خلوية غير نوعية. وبشكل عام، تشير النتائج إلى أن إصابة المخاطية المعدية المستحثة بـ clopidogrel ترتبط بتغيرات في تعبير المؤشرات المرتبطة بالإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية والموت الخلوي المبرمج، رغم الحاجة إلى مزيد من الدراسات الميكانيكية لإثبات العلاقات السببية.
الإفصاحات
تضارب المصالح:
يقر المؤلفون بأنه ليس لديهم أي مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن تبدو مؤثرة على العمل الوارد في هذه الدراسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال مشروع "الأبحاث الأساسية حول مسار إشارات CHOP/ATF5/Bcl-2 في موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية للمخاطية المعدية الناجم عن الكلوبيدوجريل" (مشروع رقم 2023BWKY009).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم كشف موت الخلايا المبرمج Annexin V-FITC/PI | Elabscience | E-CK-A211 | طقم الكشف عن الموت الخلوي المبرمج |
| جسم مضاد لـ ATF5 | Proteintech | 67066-1-AP | الجسم المضاد الأولي |
| طقم تحليل البروتين بطريقة BCA | Solarbio | PC0020 | مقايسة تركيز البروتين |
| الأجسام المضادة لبروتين Bax | Proteintech | 50599-1-AP | الأجسام المضادة الأولية |
| الأجسام المضادة لـ Bcl-2 | Proteintech | 26593-1-AP | الأجسام المضادة الأولية |
| βجسم مضاد لبروتين الأكتين (actin) | Proteintech | 66009-1-Ig | الجسم المضاد الأولي |
| محلول الحجب (Blocking Buffer) | Beyotime | P0252 | محلول حجب لطريقة ويسترن بلوت (Western blot) |
| طقم عد الخلايا CCK-8 | KeyGen Biotech | KGA317 | مقايسة حيوية الخلايا |
| طقم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA Synthesis Kit) | ترانس جين بيوتك (TransGen Biotech) | AU341 | طقم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين التكميلي (cDNA) للشريط الأول مع إزالة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي |
| طقم الكشف عن الدورة الخلوية | ليانك بيوتكنولوجي (Lianke Biotechnology) | CCS012 | طقم تحليل دورة الخلية |
| جسم مضاد لبروتين CHOP | Proteintech | 15204-1-AP | الجسم المضاد الأولي |
| كلو بيدوجريل هيدروجن-سلفات (درجة النقاء ≥99%) | ماكلين | C874834 | عقار تجريبي |
| طقم صبغ DAB الكروموجيني | Beyotime | P0201M | ركيزة الكيمياء النسيجية المناعية |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | مذيب |
| كاشف التألق الكيميائي المُعزز (ECL) | Meilunbio | MA0186 | ركيزة كيميائية مضيئة |
| مصل جنين البقر (FBS) | Gibco | 10099-141 | مكمل استنبات الخلايا |
| خط الخلايا الظهارية المعدية البشرية GES-1 | iCell Bioscience | iCell-h062 | خط خلايا الظهارة المعدية البشرية |
| الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)&هـ) طقم الصبغ | Beyotime | C0105S | التصبيغ النسيجي |
| جسم مضاد ثانوي مقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | جسم مضاد ثانوي |
| محلول بيروكسيد الهيدروجين | أبسين | ABS9333-100مل | كاشف حجب البيروكسيداز الداخلي |
| إنترلوكين-1 (IL-1)β طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) | ميميان | MM-0047R2 | مقايسة السيتوكينات في المصل |
| طقم مقايسة الممتز المجهري المرتبط بالإنزيم لـ IL-6 | ميميان | MM-0190R2 | مقايسة السيتوكينات في المصل |
| قارئ الأطباق الدقيقة | شركة بكين ليويي للتكنولوجيا الحيوية (Beijing Liuyi Biotechnology) | WD-2102B | قياس الامتصاصية |
| محلول البنسلين-ستربتوميسين | Solarbio | P1400 | محلول مضاد حيوي |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) | Servicebio | G4202-500مل | 1× محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) |
| غشاء بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | غشاء لطخة ويسترن |
| مخفف الأجسام المضادة الأولية | Beyotime | P0023A | مخفف الأجسام المضادة |
| مؤشر الوزن الجزيئي للبروتين | Yeasen | WJ103 | سلم بروتيني ملوّن مسبقاً |
| مزيج رئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | كاشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) |
| محلول التحلل الخاص بمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) | Solarbio | R0010 | محلول استخلاص البروتين المنظم |
| ريبونوكلياز أ (RNase A) | ليانكي للتكنولوجيا الحيوية (Lianke Biotechnology) | CCS012 | كاشف تحليل الدورة الخلوية |
| وسط RPMI-1640 | Servicebio | G4535-500ML | وسط زراعة الخلايا الأساسي |
| جرذان 스프راغ-دولي (Sprague-Dawley) | شركة Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | نظرًا لعدم توفر نص مصدر، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته، وسأقوم بتحويله إلى اللغة العربية بدقة أكاديمية وعلمية وفقًا للمعايير المحددة. | درجة SPF |
| TNF-αα طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA Kit) | مِي مِيان | MM-0180R2 | مقايسة السيتوكينات في المصل |
| طقم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA Extraction Kit) | ترانس جين بيوتيك (TransGen Biotech) | ER501-01 | طقم استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) |
| محلول التريبسين-إيديتات ثنائي الصوديوم (Trypsin-EDTA) | Solarbio | T1300 | كاشف تفكيك الخلايا |
المراجع
- Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
- Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
- Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
- Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
- Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
- Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
- Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
- Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
- Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
- He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
- Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
- Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
- Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
- Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
- Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
- Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
- Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
- Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
- Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
- Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
- Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
- Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
- Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
- Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
- Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
- Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.
إعادة الطباعة والأذونات
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً