مقالة منهجية

تحليل الألياف المرنة في أنسجة الرئة باستخدام التحليلات التصويرية الكمية

DOI:

10.3791/72114

⸱

أغسطس 4, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا يوضح تحضير الأنسجة لتصوير الألياف المرنة والتحليل الكمي في أنسجة رئة الفئران. تمكن هذه الطريقة من تقييم قوي لبنية الأنسجة، وتنظيم الألياف المكانية، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلايا الرئوية (ECM) هي سمة رئيسية في إصابات الرئة والأمراض. الألياف المرنة هي مكون أساسي في ECM الرئية، حيث توفر المرونة والارتداد اللازمين لوظيفة الجهاز التنفسي الطبيعية، كما أن اضطرابها يساهم في تدهور ميكانيكا الأنسجة. يصف هذا البروتوكول سير عمل قوي وقابل للتكرار لتحضير وتحليل نسيج رئة الفئران، مع التركيز على التصوير والتحليل الكمي للألياف المرنة. يوضح الكتاب معالجة الأنسجة المحسنة وطرق التلوين النسيجي للحفاظ على هياكل الإيلاستين واكتشافها. بالإضافة إلى ذلك، يوضح البروتوكول خط تحليل الصور الذي يتيح التقييم الكمي لوفرة الألياف المرنة وتنظيمها وتوزيعها المكاني داخل الرئة. يتضمن سير العمل أيضا تقدير متجه الصبغة في QuPath، وفك التفاف الألوان في Fiji/ImageJ، وتحليل الصور المعتمد على TWOMBLI لتمكين التقييم الكمي لوفرة الألياف المرنة، والتفرع، وتعقيد الشبكة. تتضمن استراتيجيات لاكتساب الصور، واختيار منطقة الاهتمام، وتحسين المعاملات، ومراقبة الجودة لضمان قابلية التكرار وتقليل التحيز المعتمد على المستخدم. وباستخدام هذا السير العملي، نجحنا في تحديد التغيرات في تنظيم الألياف المرنة وبنية الشبكة في رئات الفئران السمينة، مما يثبت مدى تطبيقه في اكتشاف إعادة تشكيل ECM المرتبطة بالأمراض. معا، توفر هذه الأساليب إطارا شاملا للتحقيق في إعادة تشكيل الألياف المرنة ومساهمتها في بنية الأنسجة في الظروف الفسيولوجية والمرضية. تسهل هذه الطريقة دراسة التغيرات الهيكلية المدفوعة بالأرومات الليفية وتدعم رؤى ميكانيكية حول التغيرات الكيميائية الخلفية وراء أمراض الرئة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الألياف المرنة هي مكونات أساسية في المصفوفة خارج الخلية الرئوية (ECM)، وتتكون أساسا من الإيلاستين والبروتينات الدقيقة الليفية المرتبطة بها التي تتجمع في شبكات منظمة ومرنةللغاية 1. في الرئة، ترتب الألياف المرنة على طول الحاجز الحويقي والبنية المحيطية بالقصبية، حيث توفر المرونة والارتداد اللازمين لميكانيكا التنفس الطبيعية 1,2. باعتبارها واحدة من أكثر المكونات الهيكلية انتشارا في الأنسجة مثل الرئة والأبهر والرحم، فإن سلامتها ضرورية للحفاظ على الامتثال للأنسجة 1,2. لوحظ اضطراب تنظيم الألياف المرنة في مجموعة من أمراض الرئة، بما في ذلك التليف، وانتفاخ الرئة، والحالات الالتهابية المزمنة، حيث تساهم تغيرات بنية الألياف في ضعف وظيفة الرئة والخصائص الميكانيكية2،3.

تم توصيف الماترسوم الرئتي مؤخرا، كاشفا عن بروتينات ECM الأساسية مثل الكولاجينات واللامينينات، إلى جانب مكونات مرتبطة بالأماثيسوم بما في ذلك السيتوكينات، ومنظمات ECM، وبروتينات مرتبطة ب ECM (مثل روابط الإنتغرين، الجالكتينات)4,5. بعيدا عن توفير الدعم البنيوي، تنظم هذه المكونات وظائف الأنسجة بنشاط وتشكل فوضى متخصصة تدعم الخلايا المقيمة والمهاجرة 6,7. ومن الجدير بالذكر أن دراسات حديثة أبرزت أن الحالات الأيضية مثل السمنة مرتبطة بتغيرات كبيرة في تنظيم الألياف المرنة، مما يربط بين الاختلال الأيضي الجهازي والتغيرات في بنية ECM الرئة ووظيفة الأرميات الليفية3. تؤكد هذه النتائج أهمية فهم إعادة تشكيل الألياف المرنة كعملية ديناميكية وذات صلة بالأمراض.

غالبا ما يعتمد التقييم التقليدي للألياف المرنة على التقييم الأنسجي النوعي، أو أنظمة التسجيل شبه الكمي، أو قياسات وفرة الإيلاستين، والتي توفر معلومات محدودة حول تنظيم الألياف، والاتصال، وتعقيد الشبكة8،9. بينما تكون هذه الأساليب مفيدة لاكتشاف التغيرات الكبيرة في محتوى الإلاستين، إلا أنها قد لا تلتقط التغيرات المعمارية الدقيقة المرتبطة بإعادة تشكيل الأنسجة. تمتلك التحليلات الكمية القائمة على الصور القدرة على تجاوز هذه القيود من خلال تمكين توصيف موضوعي وقابل للتكرار لشبكات الألياف المرنة وتسهيل المقارنات عبر الظروف التجريبية والدراسات. لمعالجة ذلك، يمكن البروتوكول الموضح هنا من التحليل المتكامل لتنظيم ECM الرئوي مع تركيز خاص على بنية الألياف المرنة. بالإضافة إلى الأساليب المعتمدة لتوصيف ECM 4,5، يتضمن هذا السير التلوين باستخدام Elastica وخط تحليل صور يعتمد على TWOMBLI بحجم10 صور محسن لبنية أنسجة الرئة. من خلال دمج تلوين الإلاسيكا مع التحليل الكمي للشبكة، يمتد هذا السير إلى ما هو أبعد من التقييم النسيجي التقليدي ويتيح توصيفا تفصيليا لوفرة الألياف، والتجزئة، والتنظيم المكاني، والتعقيد البنيوي. البروتوكول مناسب بشكل خاص للدراسات التي تبحث في التليف، وانتفاخ الرئة، وإعادة تشكيل الرئة المرتبطة بالسمنة، وأمراض الرئة الالتهابية، والشيخوخة، وغيرها من الحالات التي تتميز بإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية في الرئة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع تجارب الفئران الموصوفة هنا أجريت وفقا لموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان في ولاية شمال الراين-وستفاليا، ألمانيا (أريزونا: 81-02.04.2021.A221).

ملاحظة: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات، واقي للعيون) طوال فترة الإجراء.

1. أخذ عينات وتحضير أنسجة رئة الفأر

ملاحظة: تم إعدام الفئران بجرعة زائدة من الإيزوفلوران وفقا للإرشادات المؤسسية والحكومية قبل جمع الأنسجة.

  1. افتح تجويف الصدر بحذر بشق في منتصف النقطة، ثم اقطع الحجاب الحاجز على طول الوصل، واكشف الرئتين بلطف.
  2. قم بإزالة الرئة بالكامل عن طريق إزالة الفصين الأيمن والأيسر معا، مع الحرص على الحفاظ على جميع الفصوص سليمة.
  3. ضع فص الرئة بشكل فردي في أنبوب بحجم 5 مل يحتوي على 2 مل من الفورمالين المحايد 10٪ واحتضن لمدة 15–20 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يحافظ التثبيت على بنية الأنسجة لإجراء تحليلات الألياف النسيجة والمرنة اللاحقة. نظرا لأن الهدف الأساسي من هذا السير كان التصور والتقييم الكمي لتنظيم الألياف المرنة بدلا من التحليلات الشكلية الحنخي، لم تكن الرئتان ثابتتين ضد الانتفاخ قبل معالجة الأنسجة.
    تحذير: يحتوي الفورمالين المحايد على الفورمالديهايد، وهو سام ومسرطن وقد يسبب تهيج الجلد والعين والتنفس. تعامل مع الفورمالين في غطاء بخار كيميائي معتمد وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة.
  4. غرس نسيج الرئة الثابت في البارافين باستخدام بروتوكول التضمين النسيجي القياسي11.
    ملاحظة: تأكد من الجفاف الكامل وتسرب البارافين للحفاظ على شكل الأنسجة للصبغ لاحقا. لتقليل التباين بين العينات وضمان التوافق عبر الظروف التجريبية، استخدم دائما نفس فص الرئة في كل تحليل. يوصى باستخدام الفص الأيسر في علم الأنسجة.
  5. قطع أنسجة رئة FFPE إلى أقسام بسماكة 5–7 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وركبها على شرائح زجاجية قياسية. قم بخبز الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة قبل البدء في التطبيقات اللاحقة. يمكن تخزين الشرائح في RT في بيئة خالية من الغبار لعدة أسابيع أو عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأمد.
    ملاحظة: تجنب التعرض للرطوبة أثناء التخزين، لأن الرطوبة قد تسبب أكسدة البارافين وتؤثر سلبا على جودة الصبغة. تخزين الشرائح في صندوق بلاستيكي مغلق مع مجفف إذا احتجت الحاجة للتخزين طويل الأمد.
    نقطة التوقف: خزن الشرائح عند زاوية RT أو 4 °م حتى يتم صبغها.

2. تلوين الألياف المرنة

  1. قم بإجراء تلوين بالإلاستيكا (ريسورسين-فوشين) على أقسام نسيج رئة مدمجة بالبارافين بحجم 5–7 ميكرومتر لرؤية الألياف المرنة داخل البنى السنيخية والأوعية الدموية.
    ملاحظة: قم بصبغ عدد ممكن من الشرائح في نفس الوقت فقط لضمان شدة التلوين المتسقة وقابلية التكرار عبر العينات.
    1. يتم إزالة البارافينات من الشرائح عن طريق غمر الشرائح في الزيلين (الآيزومر المختلط) مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
      تحذير: الزيلين سام وقابل للاشتعال. ضع غطاء بخار كيميائي وارتد معدات الحماية المناسبة.
    2. أعد ترطيب الشرائح بسلسلة إيثانول متنازلة حتى تصل إلى 80٪ إيثانول.
      1. حضن الشريحة لمدة 3 دقائق عند RT في غرفة صبغ مملوءة بالإيثانول 100٪.
      2. انقل السلايد إلى إيثانول طازج 100٪ وحضن لمدة 3 دقائق عند RT.
      3. انقل السلايد إلى 95٪ إيثانول واحتضن لمدة 3 دقائق عند RT.
      4. انقل السلايد إلى 80٪ إيثانول واحتضن لمدة 3 دقائق عند RT.
    3. انقل السلايد إلى غرفة تلوين جديدة تحتوي على محلول ريسورسين-فوشين واحتضن لمدة 20–30 دقيقة عند RT.
      ملاحظة: يمكن استخدام محلول تلوين ريسورسين-فوكسين عدة مرات وهو مستقر عند RT.
      تحذير: يحتوي محلول تلوين ريسورسين-فوكسين على مواد كيميائية قد تكون خطيرة، بما في ذلك الأحماض المركزة والأصباغ، والتي قد تسبب تهيج في الجلد والعين. تعامل مع المحلول في مكان جيد التهوية أو غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.
    4. ضع السلايد في غرفة تلوين تحت ماء مقطر جاري واغسله لمدة دقيقة واحدة.
    5. التمايز في 95–96٪ إيثانول: 15–60 ثانية، راقب تحت المجهر.
      ملاحظة: توقف عندما تبقى الألياف المرنة بنفسجية عميقة اللون البنفسجي، ويتم تنظيف الخلفية بشكل كاف. الألياف المرنة الملطخة تظهر باللون البنفسجي الداكن. تظل ألياف الكولاجين غير مصبوغة وعادة ما تبدو شاحبة. يمكن أن يؤدي التلوين الزائد إلى زيادة الخلفية؛ قم بضبط وقت الحضانة حسب سمك الأنسجة وتثبيت الأنسجة.
    6. أوقف التمايز بنقل السلايد فورا إلى ماء مقطر وشطفه لمدة 30 ثانية. اختياري: يمكن إجراء التلوين المضاد إذا لزم الأمر لتقييم إضافي للرئة، لكنه قد يقلل من كفاءة تقسيم الألياف. نوصي بإجراء صبغة H&E لتقييم الرئة على الجروح المجاورة.
    7. جفف شرائح الشرائح بشكل متسلسل في 95٪ إيثانول لمدة 1–2 دقيقة، ثم 100٪ إيثانول مرتين لمدة 1–2 دقيقة لكل منها لإزالة الماء المتبقي.
    8. نظف الأقسام في الزيلين مرتين لمدة 3 دقائق حتى يبدو النسيج شفافا بصريا.
    9. تركيب الغطاء باستخدام راتنج صناعي دائم متوافق مع الزيلين ويسمح للشرائح بالتجفيف بشكل مسطح عند RT.
      ملاحظة: الجفاف الكامل والتنظيف ضروريان لمنع العكر وضمان الحفاظ على الأجزاء الملطخة على المدى الطويل.
      نقطة التوقف: خزن الشرائح الملونة المثبتة عند RT حتى التصوير.

3. تصوير الألياف المرنة وتحليل الشبكات

  1. الحصول على الصور
    1. احصل على صور عالية الدقة لمقاطع أنسجة الرئة باستخدام ماسح شرائح بهدف 40×. تأكد من تعريض التعرض وتوازن اللون الأبيض المتسق عبر جميع العينات.
      ملاحظة: تم التقاط الصور باستخدام إعدادات ماسح ضوئي متطابقة طوال الدراسة، بما في ذلك التكبير، الدقة المكانية (0.25 ميكرومتر/بكسل)، الإضاءة، والتعريض.
    2. ارسم منطقة اهتمام (ROI) تشمل كامل قسم نسيج الرئة لضمان التغطية الكاملة أثناء الفحص.
    3. حدد منطقة مرجعية خلفية بدون نسيج لقياس وطرح شدة الخلفية أثناء تحليل الصورة.
    4. استخدم الكشف التلقائي للتركيز في الماسح الضوئي لتعيين عدد مثالي من نقاط التركيز عبر الأنسجة، لضمان وضوح وجودة صورة متجانسة.
    5. احصل على الصورة باستخدام إعدادات الإضاءة والتعريض الموحدة.
      ملاحظة: إذا فشل التركيز التلقائي في المناطق الكثيفة أو غير المستوية، استخدم ضبط التركيز الدقيق يدويا لضمان التقاط جميع هياكل الأنسجة، بما في ذلك المناطق السنخية والأوعية الدموية، بشكل حاد.
  2. فك الالتفاف الصورة: تقدير متجه الصبغة في QuPath12. تمثل متجهات الصبغة قيم امتصاص RGB الخاصة لكل صبغة نسيجية، مما يسمح بفصل الصبغات المتداخلة أثناء فك التفاف الألوان.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم تعريف متجهات الصبغة في QuPath، حيث أن متجهات الصبغة المحددة مسبقا للريسورسين-فوشين غير متوفرة في فيجي.
    1. افتح الصورة في QuPath واختر نوع صورة الحقل المضيء.
      ملاحظة: لتقليل التحيز، احسب متجهات الصبغة باستخدام صور تمثيلية من مجموعة البيانات وطبق نفس القيم على جميع الصور.
    2. ارسم منطقة اهتمام (ROI) تحتوي في الغالب على ألياف مرنة لتحديد أول مكون صبغة.
    3. في تبويب الصورة، انتقل إلى أقسام متجهات الصبغة.
    4. انقر على Stain 1، ثم اضبط متجه الصبغة من ROI لتحديد متجه اللون للألياف المرنة (عادة البنفسجي-البنفسجي).
    5. اختر عائد الاستثمار يحتوي على نسيج غير مرن (مثل الخلفية أو الكولاجين) واضغط على الصبغة 2، ثم اضبط متجه الصبغة من العائد على العائد لتحديد مكون اللون الثانوي.
    6. يقوم QuPath بحساب Stain 3 تلقائيا، وهو ما يتوافق مع الخلفية.
    7. مثال على المتجهات المحسوبة والتطبيقية في فيجي: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225، G:0.6541292، B:0.43308553؛ إشارة غير محددة R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; الخلفية R:-0.105005614، G:-0.4780256، B:0.87204665.
      ملاحظة: تم تلوينها لهذه القيم للصور التي تم تلوينها فقط بمحلول ريسورسين-فوشين. إذا كان هناك صبغة مضادة، يجب حساب متجهات صبغة جديدة.
    8. احتفظ بهذه كمتجهات صبغة مخصصة وطبقها لتحقيق فك التفاف لوني متسق عبر جميع العينات.
      ملاحظة: تحديد متجهات صبغة مخصصة من المناطق الممثلة يحسن دقة فك التفاف الألوان، خاصة في تلوين الريسورسين-فوشين، حيث قد تختلف درجات الإيلاستين والخلفية عبر الدفعات.
  3. فك لون الصورة في فيجي13,14.
    1. افتح فيجي (ImageJ) وحمل صورة الحقل الساطع لقسم الأنسجة المصبوغة.
    2. اختياري: تحويل الصورة إلى صيغة RGB (صورة → النوع → لون RGB) فقط إذا لم تكن الصورة موجودة بالفعل في RGB (مثل صور 8-بت). تفتح هذه الخطوة نافذة صورة جديدة؛ احفظها للحفاظ على البيانات الخام الأصلية.
    3. قم بإجراء فك الالتفاف اللوني باختيار صورة > لون > فك الالتفاف > قيم المستخدم.
    4. هنا يأتي متجه التلوين المخصص الذي تم الحصول عليه سابقا من QuPath.
    5. شغل الإضافة لتوليد ثلاث صور رمادية منفصلة تتوافق مع الألياف المرنة، والأنسجة باستثناء الألياف المرنة، والخلفية.
    6. استخدم الصور مباشرة ل TWOMBLI بدون معالجة مسبقة إضافية. يتطلب TWOMBLI صورا حادة بدقة كافية؛ يجب تجنب التنميم (مثل الضباب الغاوسي) للحفاظ على التفاصيل الهيكلية.
      ملاحظة: تأكد من أن المناطق المختارة في QuPath لتقدير المتجهات تمثل التلوين النموذجي، حيث سيتم تطبيق هذه المتجهات المخصصة بشكل موحد عبر جميع الصور للمقارنة المتسقة.
    7. احفظ قناة الألياف المرنة كملف TIFF للقياس والتحليل في المراحل النهائية.
  4. اختيار العائد على الاستثمار لتحليل الألياف
    1. لكل قسم من الرئة، اختر خمسة ROIs مربعة غير منحازة في المنطقة الحويصلية وخمسة ROIs في المنطقة حول القصبة الهوائية (100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر لكل منها).
    2. قم بتكرار كل عائد عائد على الصورة الخام (الصورة > التكرار) للحفاظ على البيانات الأصلية.
    3. قم بتكرار نفس العائد على المؤشرات في تحليل الألياف المرنة المفككة.
    4. احفظ جميع العائد على الاستثمار المكرر كملفات TIFF فردية للتحليل لاحقا.
      ملاحظة: تم استبعاد المناطق التي تحتوي على طيات الأنسجة، أو قطع قطع القطع، أو تمزقات، أو أوعية دموية كبيرة، أو بنية السنخة المحفوظة بشكل سيء من التحليل. تم استخدام فقط عائدات العائد على الألياف المرنة المفكوكة الاللواء كمدخل لتحليل TWOMBLI، بينما تم الاحتفاظ بنسخ الصور الخام المقابلة كملفات مرجعية لمراقبة الجودة والفحص البصري. يجب اختيار مناطق الاهتمام (ROIs) باستخدام أخذ عينات عشوائية منهجية لضمان تمثيل غير متحيز للنسيج. لتقليل تحيز المشغلين بشكل أكبر، يتم توفير سكريبت اختيار ROI آلي متوافق مع QuPath في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2، ويتم شرح تنفيذه في القسم 3.5.
  5. تطبيق اختيار العائد على الاستثمار الآلي في QuPath باستخدام سكريبت اختيار عائد استثمار آلي.
    1. افتح الصورة في QuPath وحدد نوع الصورة على Brightfield.
    2. من قائمة الأدوات ، اختر أداة التعليق التوضيحي المطلوبة لإنشاء التعليقات الأولية. ينصح بالتعليقات المربعة.
    3. ارسم تعليقات مربعة داخل نسيج الرئة. يجب أن يشمل كل تعليق منطقة واحدة فقط ذات اهتمام (ROI) للتحليل، إما منطقة سنخية أو منطقة حول القصبية.
    4. بمجرد إنشاء التعليقات، انتقل إلى التعليقات واختر التعليقات القفل لمنع الحركة أو التعديل العرضي.
    5. أضف الفئات "الحويصلات الهوائية" و"المنطقة المحيطة بالقصبية" إلى قائمة الحصص بالنقر على زر "+" بجانب قائمة الفئات في لوحة التعليقات.
    6. قم بتعيين كل تعليق للفئة المناسبة. اختر تعليق، اختر الفئة المقابلة، ثم اضغط على تعيين محدد. سيتغير لون التعليق، وسيتم عرض الفئة المخصصة ("الحويصلات" أو "المنطقة حول القصبية") في لوحة خصائص التعليقات.
    7. افتح السكربت المقابل ونفذه. عند الانتهاء، ستظهر رسالة إلى أن العائد على الاستثمار قد تم توليده بنجاح. ستظهر العائد على الاستثمار الجديدة في تسلسل التعليقات كتعليقات فرعية للتعليق الأصلي الذي يعرف الفئة.
    8. لتصدير العائد على الاستثمار، حددها وانتقل إلى ملف → تصدير الصور → البكسلات الأصلية. احفظ العائد على الاستثمار المصدر كملفات TIFF.
      ملاحظة: تم تصميم النصوص للتعرف فقط على أسماء الفئات "الحويصلات" و"المنطقة حول القصبية". يجب إدخال هذه الأسماء تماما كما هو محدد. بشكل افتراضي، تولد السكريبتات عشوائيا خمسة عودقات مربعات غير متداخلة بقياس 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر ضمن كل تعليق. يقبل عائد الاستثمار للمرشحين فقط إذا كانت زواياها ومركزها محويين بالكامل ضمن حدود التعليقات، مما يضمن الإدراج الكامل ضمن المنطقة المختارة. يمكن تعديل كل من عدد وأبعاد العائد على الاستثمار داخل السكربت لتلبية متطلبات تجريبية محددة. يوصى بإجراء ثلاثة نسخ بيولوجية على الأقل وخمسة عائد على الاستثمار على العينة على الأقل للتحليل.
  6. تحليل تومبلي
    1. احفظ جميع صور ROI للألياف المرنة في مجلد مخصص للتحليل.
    2. أنشئ مجلدين فرعيين داخل الدليل العامل: أ. مجلد القناع – للأقنعة الثنائية التي يولدها TWOMBLI. ب. مجلد HDM – لصور المصفوفة عالية الكثافة (HDM) التي يولدها TWOMBLI.
    3. شغل إضافة TWOMBLI: افتح فيجي وشغل TWOMBLI (الإضافات -> الماكروز -> التشغيل).
    4. اختر ملف معلمات التحليل المناسب. تم استخدام معلمات TWOMBLI التالية لتحليل الألياف المرنة، كما هو موضح في الجدول 1.
      ملاحظة: قد تختلف هذه المعايير حسب شدة الصبغ. تم تحسين المعلمات تجريبيا باستخدام عدة صور تمثيلية من أقسام نسيج الرئة الملونة تحت ظروف موحدة. تم تنفيذ التحسين من خلال مقارنة الأقنعة المولدة مع نمط التلوين الأصلي واختيار الإعدادات التي توفر أفضل تداخل بين القناع المقسم وشبكة الألياف المرنة الأساسية. بمجرد تأسيسها، تم تطبيق نفس المعايير على جميع الصور داخل مجموعة البيانات.
    5. اختر خيار "ألياف داكنة فوق خلفية فاتحة".
    6. قم بإنشاء وحفظ الأقنعة الثنائية في مجلد Mask.
    7. قم بإنشاء وحفظ الصور الثنائية في مجلد HDM.
    8. استخلاص معلمات الشبكة الكمية مثل طول الألياف، نقاط التفرع، الانحناء، الكثافة، والمحاذاة.
      ملاحظة: يتطلب تحليل TWOMBLI صورا حادة وعالية الدقة (>1 بكسل/ميكرومتر). يمكن أن تؤثر دقة فك التفاف الألوان الضعيف، أو المناطق غير الواضحة، أو ضغط الصور على دقة قياس شبكة الألياف.
  7. القياس والتحليل الإحصائي
    1. تصدير معلمات شبكة TWOMBLI كملف CSV.
    2. استورد بيانات CSV الخام إلى منشور GraphPad للتحليل الإحصائي والتصور.
      ملاحظة: يوصى بالمعامل التالي: طول القناع الكلي، الذي يعكس إجمالي كمية الألياف المرنة ضمن عائد الاستثمار، مما يسمح بقياس كمية وفقدانها للألياف. تشير نقاط نهاية الألياف إلى درجة تجزئة الألياف؛ يشير عدد متزايد من نقاط النهاية إلى تعطيل أو انكسار الألياف. تقيس نقاط الفروع الليفية مدى ترابط الألياف، مما يعكس تعقيد وسلامة هيكلية شبكة ECM. يشير عدد نقاط التفرع الأكبر إلى شبكة أكثر تعقيدا وتشابكا. تحدد التوقيت التجانس في توزيع الألياف عبر عائد الاستثمار. يشير انخفاض الفراغ إلى شبكة موحدة ذات فجوات بحجم متشابه، بينما تعكس الفراغ العالي شبكة غير متجانسة مع أحجام فجوات متغيرة تصف بنية أكثر تعقيدا. بعد عد الصناديق - البعد الكسري يلتقط تعقيد بنية الألياف. تشير القيم الأعلى للأبعاد الفراكتالية إلى شبكات أكثر تعقيدا وتفصيلا، بينما تعكس القيم الأدنى هياكل أبسط أو مضطربة.
    3. إنشاء رسوم بيانية أعمدة توضح متوسط متوسط SEM ± لكل معامل شبكة مكمية (مثل طول الألياف، التفرع، الانحناء، والكثافة).
    4. اختبار طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. للحصول على البيانات البراميترية، قم بتطبيق اختبار t للطالب غير المزدوج ذو الذيلين. للبيانات غير البراميترية، تطبيق اختبار مان-ويتني U. للمقارنات التي تشمل أكثر من مجموعتين تجريبية، يجب تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) يليه اختبار مقارنة متعدد بعد الحدث مناسب، أو اختبار كروسكال–واليس للبيانات غير البراميترية.
      ملاحظة: حافظ على جميع ملفات CSV الخام دون تعديل لضمان قابلية التكرار وتتبع البيانات. أبلغ عن عدد العائد على الاستثمار والتكرارات البيولوجية التي تم تحليلها لكل حالة في أساطير الشكل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول معايير كمية لشبكة الألياف المرنة عبر مناطق رئة مختلفة وظروف تجريبية. تحليل TWOMBLI، كما وصف سابقا، يعطي معلمات مثل طول الألياف، كثافة التفرع، الفجوة، والبعد الكسري لتقييم المصفوفة خارج الخلية10. استنادا إلى هذا الإطار، يمكن نهجنا من توصيف شامل لتنظيم الألياف المرنة، مما يسمح بتقييم التغيرات في وفرة الألياف، والترابط، والتجانس، والتعقيد الهيكلي في أنسجة الرئة الفسيولوجية والمرضية.

في الأنسجة الرئوية السليمة، تشكل الألياف المرنة شبكات طويلة ومستمرة ومتناسقة على طول الحاجز السنخي والبنية المحيطة بالقصبات. وعلى النقيض من ذلك، غالبا ما تظهر الرئتان المتغيرتان مرضيا أو أيضيا، مثل تلك الخاصة بالفئران البدينة، تفرعات متزايدة وتعقيد شبكي أكبر، مما يعكس تغيرات في تنظيم الألياف المرنة3. المخرجات الممثلة، بما في ذلك الأقنعة الثنائية والمعاملات الكمية، موضحة في الشكل 1A، B. يمكن دمج هذه النتائج مع التحليلات النسيجة والجزيئية لتقييم سلامة ECM ومدى إعادة التشكيل3. يتم توضيح ضعف الغدة وملء الفجوات في أنسجة الرئة السليمة لرؤية الفروقات في تنظيم ECM (الشكل 1C). بالاقتران مع مقاييس كمية أخرى، تلتقط هذه المعايير تعقيد الشبكة وتكشف عن تغييرات في بنية الأنسجة ناتجة عن إعادة تنظيم ECM، مما يوفر رؤى حول أنماط مميزة لإعادة تشكيل الهيكل داخل شبكة الألياف المرنة.

يعتمد التفسير الدقيق لهذه المخرجات الكمية بشكل حاسم على جودة التقاط الصور ومعالجتها. يمكن أن تؤدي ظروف التصوير أو المعالجة غير المثالية، بما في ذلك ضعف التركيز، أو الإضاءة غير المتسقة، أو تقدير متجه الصبغة غير الدقيق، إلى أقنعة مجزأة أو صاخبة، وبالتالي إلى مخرجات كمية غير موثوقة (الشكل 1D). لذلك، فإن الفحص البصري الدقيق للصور الخام ونتائج التقسيم ضروري لضمان جودة البيانات قبل التفسير. يمكن عادة التعرف على الأقنعة غير المثالية من خلال التجزئة المفرطة للألياف المستمرة، أو التقسيم غير المستمر أو غير المكتمل، أو دمج الضوضاء الخلفية كهياكل للألياف، أو التداخل الضعيف بين نمط التلوين الأصلي والقناع المولد، مما يشير إلى ضرورة إعادة تقييم معاملات التقاط الصورة، أو تقدير متجه الصبغة، أو التقسيم الصحيح. لتوضيح هذه الخصائص، تم تحليل المقاطع التي تحتوي على التلوين المضاد عمدا، مما يتداخل مع تحديد الألياف المرنة وينتج عنه تقسيم غير مثالي. مثال على مثل هذا القناع منخفض الجودة موضح في الشكل 1E. لتقييم متانة وقابلية تكرار سير العمل بشكل أعمق، تم تحليل مجموعات بيانات الصور بشكل مستقل من قبل باحثين اثنين باستخدام نفس معلمات التحليل المحسنة (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، تم تضمين عينات مستمدة من حيوانات مستقلة لتقييم التنوع البيولوجي (الشكل 2B). تم الحصول على مخرجات كمية مماثلة عبر المشغلات والنسخ البيولوجية، مما يدعم قابلية تكرار واستقلالية المستخدم لخط أنابيب تحليل الصور المقترح. تظهر هذه التحليلات معا أن سير العمل يتيح تقييما قويا لتنظيم الألياف المرنة ويسهل المقارنات بين الحالات الفسيولوجية والمرضية.

figure-results-1
الشكل 1. سير عمل تحليل التلوين في Elastica. (أ) صورة خام ممثلة، إشارة ألياف مرنة معزولة تم الحصول عليها بواسطة فك الالتفاف الصورة، قناع ثنائي مولد باستخدام TWOMBLI، وتراكب الألياف المرنة الأصلية مع القناع المقابل، مما يوضح تقسيما دقيقا. (ب) المعاملات الكمية الممثلة التي تولدها تحليل TWOMBLI. (ج) أمثلة على تحليلات الفراغ وملء الفجوات في نسيج رئة الفأر السليم لتوضيح الفروقات في تنظيم المصفوفة خارج الخلية. (د) توضيح الأقنعة المجزأة والمزعجة الناتجة عن التقاط صورة أو معالجة صورة غير مثالية. (ه) مقطع الأنسجة تم تلوينه بالهيماتوكسيلين والإيوزين، مما يظهر ضعف في تحديد الألياف المرنة وتوليد قناع دون الأمثل. تشير إلى المناطق التي تظهر عدم التطابق بين نمط التلوين الأصلي والقناع الناتج. شريط المقياس A، D = 100 ميكرومتر، E = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. قابلية التكرار والمتانة لسير عمل تحليل الألياف المرنة. (أ) تم تحليل مجموعات بيانات الصور بشكل مستقل من قبل باحثين اثنين باستخدام معلمات تحليل TWOMBLI لتقييم قابلية تكرار التفاعل بين المشغلين. تعرض المقاييس الكمية المشتقة من TWOMBLI. تشير A و B إلى المشغلين المستقلين. (ب) تم تحليل عينات مستمدة من حيوانات مستقلة لتقييم التغيرات البيولوجية. تعرض مقاييس كمية مشتقة من TWOMBLI، مما يثبت مخرجات مماثلة عبر النسخ البيولوجية وتدعم متانة خط التحليل. تشير M1 وM2 وM3 إلى حيوانات سليمة فردية. n = 3، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل النوافي أحادي الاتجاه تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدانيت. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المعاييرالقيم
تشبع التباين0.75
الحد الأدنى لعرض الخط5
أقصى عرض للخط10
نافذة الانحناء الصغرى20
نافذة الانحناء الأقصى80
طول الفرع المصغر10
شاشة ماكسيمون HDM175
قطر الفجوة الدنيا0

الجدول 1: ملخص المعلمات الكمية المشتقة من TWOMBLI. نظرة عامة على المعايير التي يولدها TWOMBLI وتفسيرها لتقييم بنية الألياف المرنة في أنسجة الرئة. تشمل المقاييس مقاييس وفرة الألياف، والتفرع، والمحاذاة، والاتصال، وتنظيم الشبكة.

الملف التكميلي 1: الحويصلات الحويصلية غير المتحيزة على العائد على الاستثمار يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: منطقة حول القصبات الهوائية غير المتحيزة على العائد على الاستثمار يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول سير عمل قوي وقابل للتكرار لدراسة بنية المصفوفة خارج الخلايا الرئوية (ECM) في الفئران، مع تركيز خاص على إعادة تشكيل الألياف المرنة المدفوعة بالأروى الليفية. الألياف المرنة ضرورية للحفاظ على امتثال الرئة وارتدادها، واضطرابها هو علامة مميزة لأمراض رئوية متعددة، بما في ذلك التليف، وإصابات الرئة، والشيخوخة، والاضطراباتالأيضية. على الرغم من دورها الوظيفي المركزي، ظل التقييم الكمي لتنظيم وتجميع الألياف المرنة محدودا. يعالج سير العمل هذه الفجوة من خلال تمكين التوصيف المنهجي والكمي لبنية شبكة الألياف المرنة.

تكمن قوة هذه الطريقة الرئيسية في دمج سير عمل التصوير الكمي مع تحليل الأنسجة الهيكلية. بينما غالبا ما تقيم الطرق التقليدية تركيب ECM أو الميزات النسيجية بشكل منفصل، يتيح هذا البروتوكول القياس الموضوعي لتنظيم الألياف المرنة، بما في ذلك طول الألياف، والتفرع، وتعقيد الشبكة. يتيح ذلك مقارنة مباشرة بين الحالات الفسيولوجية والمرضية ويوفر رؤى حول إعادة تشكيل ECM بوساطة الخلايا الليفية3.

ومع ذلك، هناك عدة جوانب تقنية حاسمة لضمان اتساق التجارب وجودة البيانات. صبغة الريزورسين-فوكسين حساسة لمتغيرات مثل زمن التثبيت، سمك القطعة، وقوام الكواشف، مما يجعل التوحيد أمرا ضروريا لإمكانية التكرار. تعتمد المخرجات الكمية من TWOMBLI على جودة الصورة، والدقة، واختيار منطقة الاهتمام المتسقة، ولذلك يجب تفسيرها جنبا إلى جنب مع التقييم الأنسجي والتحقق منها عبر عدة عينات. بالإضافة إلى ذلك، تختلف كثافة الألياف والشكل بين المناطق الحينخية والمناطق المحيطة بالقصبات، مما يتطلب تحسينا حسب المنطقة. تلتقط هذه الطريقة التنظيم العالمي لشبكة الألياف المرنة في بعدين ولا تحل الميزات فوق الهيكلية التي تتطلب تقنيات عالية الدقة مثل المجهر الإلكتروني. قد تعزز أساليب التصوير ثلاثي الأبعاد، بما في ذلك المجهر الكونفوكالي أو متعدد الفوتون، تحليل هندسة الألياف والاتصال.

تعد عدة خطوات ضمن سير العمل ضرورية بشكل خاص لضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. تؤثر تثبيت الأنسجة، وجودة القطع، والتلوين المتسق بالريسورسين-فوكسين بشكل كبير على رؤية الألياف المرنة ولذلك يجب توحيدها بعناية.  يمكن أن ينتج عن انخفاض شدة التلوين، أو التلوين غير المتساوي، أو ارتفاع الخلفية نتيجة لتغير جودة الكواشف، أو ظروف التلوين غير المتسقة، أو عدم الحفاظ على الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، ينصح بإدراج أنسجة رئوية سليمة ومريضة، وضوابط تقنية للتلوين، وعينات مرجعية معالجة عبر دفعات تجريبية لمراقبة اتساق التلوين ومتانته التحليلية. قد تعمل الأنسجة الغنية بالألياف المرنة كعناصر تحكم إيجابية للتحقق من صحة استحواذ الصور وإجراءات التقسيم. التقدير الدقيق لمتجه الصبغة أثناء فك التفاف الصورة هو خطوة أساسية أخرى، حيث أن اختيار المتجهات غير المناسب قد يؤدي إلى استخلاص ألياف غير مكتمل وأقنعة مجزأة. اعتمادا على السؤال التجريبي، يمكن تعديل سير العمل عن طريق تعديل حجم وعدد العائد على الاستثمار، أو تعديل معلمات معالجة الصور، أو دمج أساليب التصوير ثلاثي الأبعاد لدراسة تنظيم الألياف المرنة بشكل أعمق.

بشكل عام، تمثل هذه الطريقة منصة متعددة الاستخدامات لدراسة إعادة تشكيل ECM في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية. نظرا لأن سلامة الألياف المرنة مرتبطة مباشرة بالامتثال للرئة ووظيفتها الميكانيكية، فإن هذا النهج مهم بشكل خاص لفهم كيفية ترجمة التغيرات الهيكلية في ECM إلى تغيرات في وظيفة الرئة. وهو مناسب جدا لدراسة التغيرات الهيكلية المدفوعة بالأرومات الليفية ويوفر فرصا جديدة لفهم أفضل لإعادة تشكيل ECM ومساهمته في تقدم المرض ووظائف الأنسجة. يمكن أيضا توسيع هذا النهج ليشمل أنسجة أخرى، بما في ذلك أنسجة القلب والأوعية الدموية، والجلد، والرحم، واضطرابات الأنسجة الضامة، والأعضاء الليفية، والعينات البشرية، أو دمجه مع تقنيات تصوير مكانية وعالية الدقة متقدمة لتوسيع قابلية تطبيقه أكثر.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر منشأة علم الأنسجة الأساسية في كلية الطب بجامعة بون. بالإضافة إلى ذلك، نشكر العمل الداعم الذي قدمته دانييلا كراوس والفريق بأكمله في منشأة iFET للحيوانات. يتم تمويل VLK من قبل المؤسسة الألمانية للأبحاث (DFG) ضمن استراتيجية التميز الألمانية – EXC 2151 – 390873048.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Axio CS2 Slide Scanner Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jarSigma-AldrichS6016
DPX MountantSigma-Aldrich6522
Ethanol (100%) for histologyCarl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%SigmaHT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding CassettesSigma-AldrichH0542
microtomeThermo Fischer ScietificHM355S
Micrsocope SlidesVWR631-0108
Mouse: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Strain #:000664 
paraffin embedding systemEpredia HistoStar embedding module
Prismhttps://www.graphpad.com version 11
Qupathhttps://qupath.github.ioversion 0.7.0
Resorcin-FuchsinWaldeck2.00E-30
TWOMBLI pluginhttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
XyleneApplichem GmBH14020172

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MedicineLungmatrisomeelastic fiber
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة