يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تأثيرات مستحضر Qi-fu-yin في تحسين القصور المعرفي وتقليل الشيخوخة الخلوية في أدمغة الفئران من سلالة 5xFAD

111 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72118

⸱

سبتمبر 8, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقيم هذه الدراسة علاج Qi-fu-yin (QFY) في فئران 5xFAD. وتظهر النتائج أن إعطاء QFY يرتبط بتحسن أداء التعلم والذاكرة، وتقليل ترسب Aβ الدماغي والشيخوخة الخلوية، وتخفيف الضرر الهيكلي التشابكي في القشرة المخية.

الملخص

على الرغم من أن آلية عمل Qi-fu-yin (QFY)، وهي وصفة طبية صينية تقليدية، لا تزال غير مفهومة بشكل كامل، إلا أنها أظهرت إمكانات علاجية في مرض ألزهايمر (AD). هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء العلاقة بين العلاج بـ QFY والضعف الإدراكي في فئران 5xFAD. استخدمنا قياس قوة القبضة، والمشية، وبناء الأعشاش الاستعمارية، وصندوق المكوك، واختبار متاهة موريس المائية، وتقنية ELISA لتقييم مستويات بروتين أميلويد-بيتا 1-42 (Aβ1-42)، وAβ1-40، والبروتين المرتبط بالنمو 43 (GAP-43)، والسينابتوفيزين (SYN)، وبروتين كثافة ما بعد التشابك 95 (PSD-95) في أدمغة فئران 5xFAD. واستُخدم تحليل Luminex للسيتوكينات لتحديد كميات مستويات النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) في القشرة المخية. كما تم قياس كمية بيتا-جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-Gal)، وترسب Aβ، والأشواك الشجيرية في أدمغة الحيوانات عن طريق صبغ SA-β-Gal، والكيمياء النسيجية المناعية، وصبغ Golgi-Cox، على التوالي. وأظهرت اختبارات التألق المناعي أن العلاج بـ QFY قلل بشكل كبير من عبء لوائح Aβ القشرية وخفض تعبير p21 في فئران 5xFAD. وفي فئران 5xFAD، أدى العلاج بـ QFY إلى تحسين ملحوظ في أداء التعلم والذاكرة، وتخفيف الشيخوخة، وزيادة كميات بروتينات GAP-43 وPSD-95 وSYN في قشرة الفئران. وعقب العلاج بـ QFY، حدث انخفاض كبير في لوائح Aβ ونشاط SA-β-Gal في الدماغ، وكذلك في مستويات Aβ1-42 ونسبة Aβ1-42/Aβ1-40 في الحصين. كما انخفضت مستويات IL-1α وIL-1β وIL-6 وIL-17A وIFN-γ بشكل ملحوظ في قشرة فئران 5xFAD. وأظهر تحليلا PCA وارتباط بيرسون وجود علاقة سلبية قوية بين سيتوكينات SASP ومستويات البروتينات التشابكية. تشير هذه النتائج إلى وجود صلة بين العلاج بـ QFY والتحسن في التدهور المعرفي المرتبط بالعمر والأنماط الظاهرية للشيخوخة الخلوية في فئران 5xFAD، جنباً إلى جنب مع تخفيف الضرر الهيكلي التشابكي. وتدعم هذه النتائج إجراء المزيد من الأبحاث حول QFY كمرشح علاجي محتمل لمرض ألزهايمر.

المقدمة

يُعد مرض ألزهايمر (AD)1 الشكل الأكثر شيوعاً من الخرف، ويتميز بوجود بروتين amyloid-β (Aβ)، وبروتينات tau مفرطة الفسفرة (P-Tau)، وفقدان التشابكات العصبية، والالتهاب المزمن. وتعاني الأدوية المتاحة حالياً لعلاج مرض ألزهايمر من عدد من الآثار الجانبية، كما أنها غير قادرة على وقف تطور المرض2,3,4,5.

تعد الشيخوخة، التي تظهر في شكل اضطرابات تشمل الكائن الحي بأكمله عبر البيئات الخلوية والبينية الدقيقة بدلاً من تغيرات موضعية خاصة بأعضاء معينة، عاملاً رئيسياً من عوامل الخطر في إمراضية مرض ألزهايمر (AD). ويميز هذا الخلل التنظيمي الجهازِي تطور مرض ألزهايمر عن نماذج باثولوجيا الأنسجة المفردة من خلال تغيير الآليات الاستتبابية بشكل جذري عبر الأنظمة البيولوجية6,7. وعلى الرغم من أن الشيخوخة الخلوية تعمل في البداية كآلية تنظيم استتبابية، إلا أن تراكم الخلايا الهرمة يؤدي في النهاية إلى تدهور تدريجي في الأنسجة وشلالات التهابية مستمرة، مما يعطل الاستتباب الفسيولوجي بشكل أساسي8. وقد يؤدي الالتهاب الناتج عن ذلك إلى إلحاق الضرر بالمشابك العصبية وإضعاف الوظيفة الإدراكية9,10.

تعد الشيخوخة الخلوية استجابة معقدة للإجهاد الخلوي تتميز بقصر التيلوميرات، وتوقف دائم في دورة الخلية، وتغير في النشاط الإفرازي11. وتشمل السمات الإضافية مورفولوجيا خلوية متضخمة ومسطحة، وصبغاً إيجابياً لإنزيم β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-Gal)، وتراكماً لليبوفوسين، وإفراز عوامل SASP12. ويتأثر تكوين الذاكرة بالانخفاض الملحوظ في مستويات البروتينات المرتبطة باللدونة التشابكية للمحاور والاستطالات الشجرية، وهو ما يحدث مع الشيخوخة الخلوية13,14. ونظراً لأن اللدونة التشابكية ضرورية للتعلم والذاكرة، فإن الاضطرابات في البروتينات التشابكية تساهم في التدهور المعرفي. وتشمل هذه البروتينات GAP-43 وSYN وPSD-95. ومما لا شك فيه أن الوظيفة التشابكية تتأثر بنقص أعداد الاستطالات الشجرية والتشوهات الوظيفية في أدمغة كبار السن15.

تُعد QFY تركيبة من الطب الصيني التقليدي مستخلصة من جينغ يوي كوان شوويتكون من Panax ginseng C.A.Mey (Araliaceae)، Polygala tenuifolia Willd (Polygalaceae)، Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Fisch. &؛ ج. A. Mey (Orobanchaceae)، *Angelica sinensis* (Oliv.) Diels (Apiaceae)، *Glycyrrhiza uralensis* .Fisch. ex DC (Fabaceae)، Atractylodes macrocephala كويذ (Asteraceae)، Ziziphus jujuba سلالة. سبينوسا (Bunge) Hu ex H.F. Chou (Rhamnaceae). أظهرت الأبحاث أن QFY يحسن بشكل ملحوظ من خلل الوظائف الإدراكية لدى الجرذان التي تعاني من إصابة دماغية مستحثة بمرض السكري16وجدت دراستنا السابقة أن QFY يمكن أن يحسن ضعف وظائف التعلم المعرفي والذاكرة في الفئران من سلالتي 5xFAD وAPP/PS1. بالإضافة إلى ذلك، أظهر QFY درجة عالية من الأمان في الدراسات غير السريرية، ولم تُلاحظ أي تفاعلات سمية حادة أو دون حادة أو طويلة المدى واضحة.17,18,19أظهر تحليل التأثير العلاجي السريري لـ QFY أن مرضى داء ألزهايمر شهدوا زيادة ملحوظة في قدرتهم على ممارسة أنشطة الحياة اليومية وفي درجات اختبار الحالة العقلية المصغر (MMSE) بعد العلاج بـ QFY.20بعد ثلاثة أيام متتالية من إعطاء مستخلص QFY لجرذان Sprague-Dawley الذكور، تم الكشف عن عشرة مكونات نموذجية مشتقة من QFY في السائل الدماغي الشوكي، بما في ذلك butylidenephthalide وbutylphthalide و20(S)-ginsenoside Rh1 و20(R)-ginsenoside Rh1 وzingibroside R1.21,22ومع ذلك، لا تزال الآلية العلاجية لـ QFY في مرض ألزهايمر غير واضحة. وفي هذه الدراسة، بحثنا في الارتباط بين العلاج بـ QFY، والشيخوخة الخلوية، والتغيرات المرضية المرتبطة بمرض ألزهايمر في فئران 5xFAD.

وعلى الرغم من أن الدراسات السابقة قد أثبتت التأثيرات الواقية للأعصاب لـ QFY في نماذج مرض الزهايمر، إلا أن الـ المشاركة المحددة للشيخوخة الخلوية لا يزال دور الوساطة في هذه التأثيرات غير مستكشف. علاوة على ذلك، فإن ما إذا كان QFY يمنح فوائد معرفية من خلال الحفاظ على التشابكات العصبية المرتبط بالشيخوخة، بدلاً من الاعتماد فقط على الأميلويد-β لم يتم التطرق إلى مسألة الاختزال. لذا، صُممت الدراسة الحالية لبحث ما إذا كان العلاج بـ QFY يقلل من الشيخوخة الخلوية، وما إذا كان هذا التقليل مرتبطًا بتحسين اللدونة التشابكية في فئران 5xFAD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان التجريبية في جامعة شاندونغ للطب الصيني التقليدي (SDUTCM20221101001).

الأدوية

قام مركز Lunan Pharmaceutical Houpu للبحث والتطوير بتحضير واختبار مسحوق كريم QFY الحبيبي الجاف. تم شراء Donepezil وMemantine من شركة Shanghai Yuanye Technology. استُخدمت في هذه الدراسة فئران 5xFAD ذكور يتراوح وزن جسمها الأولي بين 19–27 g. تم اشتقاق جرعة QFY من الجرعة البشرية السريرية البالغة 43 g/d، والتي تعادل 16.297 g/d بعد التعديل وفقاً لمسحوق كريم QFY الحبيبي الجاف. حُسبت الجرعة المتوسطة للتجربة الحالية بناءً على الجرعة البشرية السريرية (16.297 g/70 kg x 9.1 = 2.11861 g/kg/d). حُددت الجرعة العالية بضعفي الجرعة المتوسطة (4.24 g/kg/d)، والجرعة المنخفضة بنصف الجرعة المتوسطة (1.06 g/kg/d). أُعطيت جميع المحاليل الدوائية بحجم 0.1 mL لكل 10 g من وزن الجسم.

بالنسبة للمجموعة الضابطة الموجبة، تم استخدام الإعطاء المشترك لعقاري donepezil وmemantine hydrochloride. تم تحديد الجرعات بالرجوع إلى جرعات تطبيقاتهما السريرية الحالية (10 mg/d و20 mg/d، على التوالي) والبيانات السابقة من مجموعتنا البحثية، مما أدى إلى وضع نظام علاجي يتكون من donepezil بجرعة 1.0 mg/kg/d بالإضافة إلى memantine بجرعة 2.8 mg/kg/d، ليكون إجمالي الجرعة المشتركة 3.8 mg/kg/d. تم تحضير التركيز النهائي لمزيج donepezil–memantine ليكون 0.38 mg/mL، وهو ما تم حسابه بقسمة 3.8 mg/kg على حجم الإعطاء البالغ 0.1 mL لكل 10 g من وزن الجسم.

تم تحضير محاليل QFY بجرعات منخفضة ومتوسطة وعالية على النحو التالي: وُضع 5.3 g و10.6 g و21.2 g من مسحوق QFY الجاف في دوارق منفصلة سعة 100 mL، ثم خُلِطت مع 30 mL من الماء المقطر مع التقليب الجيد، ونُقلت إلى مخابير مدرجة، وأُكمل الحجم النهائي إلى 50 mL باستخدام الماء المقطر، مما أعطى تركيزات كتلية نهائية قدرها 0.106 g/mL و0.212 g/mL و0.424 g/mL على التوالي. وبالنسبة للمجموعة الضابطة الإيجابية، أُذيب 5 mg من donepezil و14 mg من memantine في ماء مقطر وضُبط الحجم النهائي ليصبح 50 mL. أُعطيت الحيوانات في كل مجموعة محلول الدواء المقابل مرة واحدة يومياً عن طريق التغذية القسرية الفموية.

الحيوانات

تم تربية الفئران المعدلة وراثياً من سلالة 5xFAD [B6. Cg-Tg (APPSwFlLon, PSEN1* M146L* L286V)6799Vas/Mmjax] في المختبر. وقد تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات في بيئة خالية من مسببات الأمراض النوعية (SPF) في جامعة شاندونغ للطب الصيني التقليدي، عند درجة حرارة تتراوح بين 22–24 oC، ورطوبة تتراوح بين 50–60%، ودورة ضوء وظلام مدتها 12 h. كما تم توفير الغذاء والماء للحيوانات في جميع الأوقات.

في عمر 2.5 شهر، تم توزيع ذكور الفئران من سلالة 5xFAD عشوائياً على خمس مجموعات: مجموعة 5xFAD غير المعالجة، ومجموعة الدونبيزيل مع الميمانتين، ومجموعة QFY بجرعة منخفضة، ومجموعة QFY بجرعة متوسطة، ومجموعة QFY بجرعة عالية. واستُخدمت ذكور من سلالة النوع البري (WT) من نفس العمر والبطن كمجموعة ضابطة (WT). أُعطيت العلاجات مرة واحدة يومياً لمدة 220 يوماً. (الشكل 1).

الاختبارات السلوكية

اختبار قوة القبضة

تم قياس قوة العضلات الهيكلية للطرف الأمامي في الفئران باستخدام مقياس قوة القبضة23. وخلال التجربة، وُضع جهاز الاختبار بشكل أفقي لضمان بقاء الفأر موازياً لسطح الطاولة. وبعد تشغيل الجهاز، وُضع الفأر برفق على لوحة القبض. وعندما أحكم الفأر قبضته على اللوحة، سُحب ذيله للخلف بقوة متساوية حتى يترك الفأر قبضته. ثم وُثقت أقصى قوة قبضة. كُررت هذه القياسات ثلاث مرات، واستُخدم متوسط هذه القيم لتحديد قوة قبضة الفأر.

اختبار المشية

تم قياس انتظام مشية الفئران باستخدام جهاز CatWalk XT. قُسمت التجربة إلى فترة تدريب وفترة اختبار24. وقبل ذلك بيوم واحد، نُقلت الفئران التجريبية إلى غرفة التجارب للسماح لها بالتكيف مع البيئة الجديدة. خلال فترة التدريب، وُضعت الفئران عند نقطة البداية وركضت على طول القناة وصولاً إلى نقطة النهاية. تم تدريب كل فأر ثلاث مرات يومياً. وبعد 3 أيام من التدريب (حتى يتمكن كل فأر من اجتياز القناة بسرعة)، أُعيدت الفئران إلى الأقفاص. كانت فترة الاختبار مماثلة لفترة التدريب، حيث يقوم برنامج الكمبيوتر بتحليل مسار كل حركة تلقائياً. تظهر نقاط خضراء إذا كان المسار مؤهلاً، ونقاط برتقالية إذا كان غير مؤهل، ويُعتبر الفأر مؤهلاً إذا ظهرت ثلاث نقاط خضراء على الأقل، والتي تم تحليلها بواسطة برنامج CatWalkXT 10.0.

اختبار صندوق المكوك

استُخدم اختبار صندوق المكوك (shuttle box test) لتقييم القدرة على التجنب النشط الشرطي في الفئران25. تألف الجهاز من صندوق مكوك (18 cm x 18 cm) وُضع داخل غرفة عازلة للصوت.  شملت التجربة فترة تعلم لمدة 4 أيام تلتها فترة اختبار لمدة يوم واحد.  وفي كل يوم من أيام التعلم، مُنحت الفئران فترة تكيف مدتها 120 s داخل صندوق المكوك قبل بدء التدريب. بدأت كل محاولة بمثير شرطي لمدة 6 s (نغمة بتردد 1000 Hz وشدة 70 dB مصحوبة بإضاءة بقوة 500 lux)، تلتها صدمة كهربائية للقدم لمدة 3 s وبشدة 0.3 mA يتم توصيلها عبر الأرضية الشبكية، واختتمت بفترة فاصلة بين المحاولات مدتها 12 s. إذا انتقل الفأر إلى المقصورة المقابلة أثناء المثير الشرطي، يتم إلغاء الصدمة، وتُسجل الاستجابة على أنها تجنب نشط. أما إذا لم ينتقل الفأر أثناء المثير الشرطي ولكنه انتقل أثناء صدمة القدم، فتُسجل على أنها استجابة  تجنب سلبي. وفي حال فشل الفأر في الانتقال طوال المحاولة، تُسجل كـ فشل في الهروب. كُرِّر التدريب لمدة 4 أيام متتالية بمعدل 30 محاولة في اليوم. وخلال فترة الاختبار (اليوم الخامس)، أُلغيت صدمة القدم بينما ظلت جميع المعايير الأخرى كما هي في فترة التعلم. وسُجل عدد استجابات التجنب النشط كقياس أساسي للتعلم والذاكرة.

متاهة موريس المائية

استُخدم اختبار متاهة موريس المائية لتقييم قدرات التعلم المكاني والذاكرة لدى الحيوانات التجريبية26. أُجريت التجربة في حوض بقطر 120 cm وعمق 50 cm. مُلئ الحوض بمياه بيضاء عكرة، وحوفظ على درجة الحرارة عند 21 °C. ثُبتت منصة بقطر 10 cm على عمق 1 cm تحت سطح الماء في أحد الأرباع. ووضعت دلالات بصرية حول الحوض لتكون بمثابة علامات مكانية للفئران. نُفذت عملية التعلم على مدار أربعة أيام متتالية، حيث بدأت جلسة كل يوم في أحد الأرباع الثلاثة. وتنوعت مواضع البدء بشكل شبه عشوائي بين النقاط الأصلية الأربع. وفي كل محاولة، انتهى الإجراء عندما يصل الحيوان بنجاح إلى المنصة. حُدد الحد الأقصى لمدة المحاولة بـ 60 s؛ وإذا فشل الحيوان في تحديد موقع المنصة خلال هذا الإطار الزمني، يتم توجيهه بعناية إليها. وبعد الوصول إلى المنصة، يُمنح الحيوان فترة راحة قصيرة لمدة 10 s قبل إعادته إلى قفصه. وبعد انتهاء فترة التعلم، تبدأ فترة الاختبار بعد 24 h. وفي اليوم الخامس، توضع الفئران في الربع المقابل للمنصة. تم تسجيل زمن كمون الهروب خلال فترة الاختبار، ووقت الحركة في الربع المستهدف، وعدد مرات عبور منطقة المنصة الأصلية المغمورة تحت الماء.

اختبار تعشيش المستعمرات

تَم تقييم الأنشطة اليومية للحيوانات التجريبية باستخدام اختبار تعشيش المستعمرة27. استمرت التجربة لمدة 24 h، مع ثلاث حيوانات في كل مجموعة. بعد إعطاء الدواء في اليوم نفسه، تم تجهيز أقفاص جديدة وبُطنت بـ 6 g من الورق الناعم للتعشيش، وأُخذت الصور عند 6 h و12 h و24 h. في نهاية التجربة، إذا كان الورق مبعثراً في جميع أنحاء القفص دون وجود أي عض، تُمنح نقطة واحدة. وإذا كانت قطع الورق متجمعة في جانب القفص ولكن بشكل غير متماسك، دون تشكيل أعشاش، وبدون تمزيق أو طي واضح، تُمنح نقطتان؛ وإذا جُمعت قطع الورق وطُويت في عش مُشكل ولكنه مسطح نسبياً دون تمزيق واضح، تُمنح 3 نقاط؛ أما العش العميق الذي يحتوي على ورق ممزق بشكل مكثف فيُمنح درجة 4.  وفي نهاية التجربة، تم جمع  الأنسجة غير الممزقة  (التي عُرِفت بأنها شظايا ورقية تزن >0.1 g ولم يتم تمزيقها أو دمجها في العش) بعناية، وتجفيفها في الهواء، ووزنها باستخدام ميزان إلكتروني (الدقة: 0.01 g). 

أخذ العينات وجمعها

قمنا بجمع العينات فقط من مجموعات WT و5xFAD وQFY (2.12 g/kg/d). بعد التخدير بـ CO2 ، تم فصل الرؤوس، وفُتح نصف الكرة المخية الأيمن بسرعة لفصل الحصين والقشرة المخية، ثم غُسلت بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، ووُضعت في أنابيب تجميد سعة 1.5 mL في النيتروجين السائل. حُفظت العينات عند -80 oC لإجراء الاختبارات البيوكيميائية. أما نصف الكرة المخية الأيسر فقد تم تثبيته عن طريق الغمر في 4% بارافورمالدهيد لمدة 24 h، ثم جُفف بالغمر في الإيثانول المطلق، وطُمِر في شمع البارافين، وقُطّع إلى شرائح بسمك 5 µm، ثم أزيل منه البارافين للكشف المناعي النسيجي الكيميائي.

المقايسة الامتصاصية المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)

أُجريت اختبارات المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) لقياس مستويات البروتين المستهدف في أنسجة الدماغ. تم قياس محتويات Aβ1–40 وAβ1–42 في متجانسات الحصين باستخدام أطقم تجارية، بينما تم تحديد مستويات GAP-43 وPSD-95 وSYN في القشرة الدماغية باستخدام أطقم من شركة Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry. نُفذت جميع الإجراءات بدقة وفقاً لبروتوكولات الشركات المصنعة. تم تحضير السلاسل القياسية عن طريق التخفيف التسلسلي باتباع تعليمات الطقم. تضمن مخطط اللوحة الدقيقة آباراً فارغة، وآباراً للمعايير، وآباراً لعينات 5xFAD، وآباراً لعينات المعالجة بـ QFY (بجرعة 2.12 g/kg/d)، وآباراً للنمط البري. وقبل التحميل، خُففت جميع العينات بمقدار ضعفين باستخدام المخفف المرفق. أضيفت الكواشف مع إبقاء طرف الماصة عمودياً على قاع البئر، ثم رُجّت بلطف لضمان الخلط التام.

بعد ختم الصفيحة، أُجري التحضين الأولي عند 37 °C لمدة 30 min. وخلال هذه الفترة، جُهِّز محلول الغسيل المنظم عن طريق تخفيف المخزون المركز بالماء عالي النقاوة بنسبة 1:29 (1 mL من المركز إلى 29 mL من الماء). وبعد التحضين، أُزيل غشاء الختم، وتُخلص من السائل، ثم جُففت الصفيحة بالتربيت. بعد ذلك، مُلئت كل بئر بـ 200 µL من محلول الغسيل المنظم، وتُركت لمدة 30 s، ثم أُفرغت؛ كُررت هذه الدورة 5 مرات. أُضيف بعد ذلك الكاشف المسمى بالإنزيم (50 µL) إلى جميع الآبار باستثناء العينات الفارغة، وأُعيد ختم الصفيحة وتحضينها مرة أخرى عند 37 °C لمدة 30 min، تلتها خطوة غسيل مماثلة مكونة من خمس دورات.

لتطوير اللون، أُضيف 50 µL من محلول الكروموجين A إلى كل بئر، يليه 50 µL من محلول الكروموجين B، مع الخلط اللطيف بعد كل إضافة. حُضنت الصفيحة عند 37 °C في الظلام لمدة 10 min. أُوقف التفاعل الإنزيمي بإضافة 50 µL من محلول الإيقاف لكل بئر، مما أدى إلى تحويل اللون الأزرق إلى الأصفر فوراً. قيست الامتصاصية (الكثافة الضوئية) عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة، مع استخدام الآبار الفارغة كمرجع؛ وتم الحصول على جميع القراءات في غضون 15 min بعد إيقاف التفاعل.

لومينيكس (Luminex)

تم قياس مستويات عوامل SASP القشرية باستخدام مجموعة Bio‑Plex Pro Mouse Cytokine 23‑plex Assay، مع تنفيذ جميع الإجراءات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أُخرجت الكواشف من التخزين عند 4 °C وتُرِكت لتتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min قبل الاستخدام. خُففت المخزونات القياسية تسلسلياً لإنشاء منحنى قياسي من سبع نقاط، بالإضافة إلى بئر فارغ واحد، وفقاً لبروتوكول المجموعة. خُلطت الخرزات المغناطيسية مسبقاً وخُففت إلى تركيز العمل الموصى به؛ وحُضرت الأجسام المضادة للكشف كمحاليل عمل؛ وخُفف مركز محلول الغسيل إلى 1x باستخدام ماء منزوع الأيونات. كما خُفف مرافق PE‑streptavidin إلى 1x باستخدام محلول التخفيف المرفق.

لإجراء المقايسة، تمت إضافة 50 µL من معلق الخرز، والمعايير، وضوابط الجودة، وعينات الأنسجة المخففة (5.6 µg/µL) بالتتابع إلى الآبار المحددة وفقاً لمخطط الطبق. ثم أُغلق الطبق وحُضن طوال الليل عند 4 °C مع رج مداري بسرعة 800 rpm. وبعد التحضين، غُسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 200 µL من محلول الغسيل لكل بئر. لاحقاً، أُضيف 50 µL من الجسم المضاد للكشف المُحضّر إلى كل بئر، وحُضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h مع الرج بسرعة 800 rpm. وبعد ثلاث دورات غسيل أخرى، أُضيف 50 µL من محلول عمل PE‑streptavidin، وحُضن الطبق لمدة 30 min إضافية في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف الرج نفسها. أُجريت خطوة غسل نهائية (ثلاث مرات باستخدام 200 µL من محلول الغسيل)، وبعد ذلك أُضيف 150 µL من محلول الغسيل إلى كل بئر، ورُج الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 min بسرعة 800 rpm قبل قراءته باستخدام جهاز Bio‑Plex.

صبغ SA-β-Gal والكيمياء النسيجية المناعية

أُجري صبغ SA-β-Gal وفقاً لتعليمات طقم صبغ Senescence β-Galactosidase Staining Kit. وبعد صبغ SA-β-Gal، خضعت المقاطع لاستعادة المستضد عن طريق التسخين في محلول سترات منظم (pH 6.0). وتم تثبيط نشاط بيروكسيداز الداخلي عن طريق تحضين المقاطع في محلول تثبيط البيروكسيداز لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة. ثم حُضنت المقاطع مع جسم مضاد أحادي النسيلة من الأرنب مضاد لـ Aβ₁-₄₂ (1:400) عند 4 °C طوال الليل. وبعد الغسيل، حُضنت المقاطع مع جسم مضاد ثانوي مضاد لـ IgG الأرنب/الفأر لمدة 20 min في درجة حرارة الغرفة. وعقب غسيل إضافي، تم إظهار التفاعل المناعي باستخدام DAB لمدة 2 min. وأخيراً، جُففت المقاطع، ونُقيت، ثم ثُبتت باستخدام راتنج محايد للفحص المجهري.

التألق المناعي

من أجل الصبغ المناعي الفلوري، تم إزالة البارافين من المقاطع في الزايلين (3 × 15 دقيقة) وأُعيد ترطيبها عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (100%، و95%، و75%؛ مرتان لمدة 5 دقائق لكل تركيز). أُجري استرجاع المستضد عن طريق غمر المقاطع في محلول منظم من سترات الصوديوم 1x عند 95 °C لمدة 30 دقيقة، ثم تبريدها تدريجياً حتى درجة حرارة الغرفة. وبعد غسل المقاطع ثلاث مرات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات مع Tween 20 (PBST) (لمدة 5 دقائق في كل مرة)، تم نفاذ المقاطع وحجبها باستخدام مصل ماعز طبيعي بتركيز 10% يحتوي على 0.3% Triton X‑100 لمدة 90 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. ثم حُضنت المقاطع مع أجسام مضادة أولية ضد p21/CIP1/CDKN1A بنسبة (1:200) وAβ₁‑₄₂ بنسبة (1:400) عند 37 °C لمدة ساعتين. وعقب أربع عمليات غسل بـ PBST (لمدة 5 دقائق لكل منها)، حُضنت المقاطع مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ Alexa Fluor ومتوافقة مع النوع (1:500) عند 37 °C لمدة ساعتين في الظلام. وبعد غسيل إضافي (4 × 5 دقائق في PBST)، تم تثبيت المقاطع باستخدام وسط تثبيت مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI وتصويرها باستخدام مجهر فلوري.

صبغة جولجي-كوكس

أُجري صبغ Golgi‑Cox باستخدام طقم تجاري وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. خُلط المحلولان A وB قبل 24 ساعة من التجربة. وبعد القتل الرحيم للفئران، أُزيلت أنسجة الدماغ بسرعة، وغُسلت بـ PBS، ثم غُمرت في خليط المحلولين A وB. خُزنت الأنسجة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لمدة 6 ساعات، وبعد ذلك استُبدل محلول التشريب بمحلول جديد واستمر التحضين لمدة أسبوعين إضافيين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام (بواقع 2 mL على الأقل من محلول التشريب لكل نسيج دماغي). ثم نُقلت الأنسجة إلى المحلول C وحُضنت لمدة 24 ساعة، ثم استُبدل بمحلول C جديد وحُضنت لمدة 7 أيام إضافية في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. قُطعت أنسجة الدماغ بسمك 100 µm باستخدام مقطع اهتزازي (vibratome). ثُبتت المقاطع على شرائح مطلية بالجيلاتين وتُركت لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أيام. غُسلت الشرائح مرتين بالماء المقطر (5 دقائق لكل غسلة)، ثم غُمرت في خليط من المحلول D والمحلول E والماء المقطر (بنسبة 1:1:2) لمدة 15 دقيقة. وبعد غسلتين إضافيتين بالماء المقطر (5 دقائق لكل منهما)، جُففت المقاطع من الماء عبر محلول إيثانول بتراكيز متدرجة (50%، 75%، و95%؛ 5 دقائق لكل تركيز)، تلا ذلك أربع غسلات في الإيثانول المطلق (4 دقائق لكل منها) وثلاث غسلات في الزيلين (5 دقائق لكل منها). وأخيراً، غُطيت المقاطع بشرائح تغطية باستخدام وسط تثبيت. التُقطت الصور باستخدام المجهر، وقُدرت كثافة الأشواك الشجيرية باستخدام برنامج ImageJ.

التحليل الإحصائي

تمت كتابة جميع النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). حُللت البيانات ورُسمت بيانيًا باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.1.0. واستُخدم اختبار t للطلاب (Student’s t-test) لمقارنة مجموعتين. أما بالنسبة للمقارنات التي شملت مجموعات متعددة، فقد استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA)، مع إجراء مقارنات زوجية باستخدام اختبار Dunnett. وقد حُددت الدلالة الإحصائية عند p < 0.05.

التحليلات المتعددة المتغيرات وتحليلات الارتباط

تم إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.0.1 لتصور التجميع حسب المجموعات لعوامل SASP (وهي IL-1α وIL-1β وIL-6 وIL-17A وIFN-γ وCCL3 وCCL4 وCCL5) بين مجموعات WT و5xFAD وQFY (بجرعة 2.12 g/kg/day) (حيث n = 8 لكل مجموعة). تم إنشاء مخطط الدرجات بناءً على أول مكونين رئيسيين. لم يتم تطبيق أي تحويل للبيانات قبل إجراء تحليل PCA. كما أُجري تحليل ارتباط بيرسون لتقييم العلاقات الخطية بين عوامل SASP والبروتينات المشبكية (PSD-95 وGAP-43 وSYN)، بالإضافة إلى Aβ₁₋₄₀ وAβ₁₋₄₂ ونسبة Aβ₁₋₄₂/Aβ₁₋₄₀. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج GraphPad Prism، مع تحديد عتبة الدلالة ذات الطرفين عند p < 0.05. وتم إنشاء مصفوفات الارتباط وخريطة حرارية لتصور قوة واتجاه الارتباطات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

Administration of QFY enhances learning and memory in 5xFAD mice

After QFY administration, a shuttle box test was conducted to assess the conditional active avoidance response of mice (Figure 2A–C). The results showed the number of active avoidances on days 1-4 (Figure 2A, p < 0.05) and the area under the curve (AUC) of active avoidance (Figure 2B, p ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تلعب اللدونة التشابكية العصبية دوراً رئيسياً في الوظيفة المعرفية. وفي أدمغة مرضى مرض الزهايمر (AD)، تنتشر ترسبات Aβ عبر مناطق مختلفة، مما يسبب بشكل مباشر تلفاً هيكلياً في التشابكات العصبية، وفقدان التشابكات الاستثارة، وتدهوراً معرفياً28. ويلعب كل من GAP-43 (بروتين الغشاء قبل التشابكي)29، وPSD-95 (بروتين ساند يقع في الغشاء بعد التشابكي)30، وSYN (بروتين فسفوري مرتبط بالحويصلات التشابكية)31 دوراً هاماً في لدونة الهيكل التشابكي وف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82205078, 82374062)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة شاندونغ (ZR2026MS1293, ZR2021QH157)، ومشروع علوم وتكنولوجيا الطب الصيني التقليدي في مقاطعة شاندونغ (M20251730)، ومشاريع العلوم والتكنولوجيا في منطقة شيزانغ ذات الحكم الذاتي بالصين (XZ202601ZY0167)، وبرنامج توجيه الابتكار التكنولوجي في مقاطعة شاندونغ (صندوق تنمية العلوم والتكنولوجيا المحلي الموجه من الحكومة المركزية) (YDZX2023137)، ضمن المشروع الذي يحمل عنوان "أبحاث تطوير وتصنيع كبسولات Tongli المعوية كدواء صيني تقليدي جديد من الفئة 1".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأدوية
دونبيزيلشركة شنغهاي يواني لتكنولوجيا (Shanghai Yuanye Technology)lot.J15HB188725
ميمانتينشركة شنغهاي يواني Tecnología (Shanghai Yuanye Technology)تشغيلة رقم J21HB189391
تشي-فو-يين (Qi-fu-yin)مركز لونان فارماسوتيكال هوبو للبحث والتطويرتشغيلة رقم 2209001
الاختبارات السلوكية
CatWalk XTNoldusبرمجيات CatWalkXT 10.0
مقياس قوة القبضةBileadbiosciBLD-ZL-20
متاهة موريس المائيةشركة شنغهاي شينروان لتكنولوجيا المعلومات المحدودة (Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd)١٢٠ سم
صندوق المكوكشركة شنغهاي شينروان لتكنولوجيا المعلومات المحدودة (Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd)XR-XC404
الأجسام المضادة
مضاد Aβ1-42 جسم مضادAbcamرقم الكتالوج ab201061
الأجسام المضادة لـ p21/CIP1/CDKN1ANovus Biologicalsرقم الكتالوج NBP3-15661
أطقم المقايسة
Aβ1-40 طقم مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA kit)Thermo Fisher Scientificرقم الكتالوج KHB3482
Aβ1-42 طقم مقايسة الممتز المربوط بالإنزيم (ELISA kit)Thermo Fisher Scientificرقم الكتالوج KHB3442
طقم مقايسة Bio-Plex Pro للسايتوكينات لدى الفئران (23-plex)R&أنظمة Dرقم الكتالوج LXLBM23-1
طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم لبروتين GAP-43صناعة المقايسة المناعية الإنزيمية في جيانغسورقم الكتالوج MM-47506M1
طقم صبغ غولجي-كوكسشركة BeiJing Biolead للعلوم البيولوجية & شركة تيك (Tech Co)رقم الكتالوج PK401
طقم مقايسة الممتز المترابط بالإنزيم (ELISA) لبروتين PSD-95صناعة المقايسة المناعية الإنزيمية في جيانغسورقم الكتالوج MM-45953M1
الشيخوخة الخلوية β-طقم صبغ الجالاكتوزيدازBeyotimeرقم الكتالوج C0602
طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لبروتين السينابتوفيزين (SYN)صناعة المقايسة المناعية الإنزيمية في جيانغسورقم الكتالوج MM-46504M1
المواد الكيميائية & الكواشف
مضاد IgG للأرانب والفئران (جسم مضاد ثانوي)البادئرقم الكتالوج S0C1001
مادة DAB الملونةبادئرقم الكتالوج S0C1001
برمجيات
CatWalk XTنولدوس لتكنولوجيا المعلومات (Noldus Information Technology)الإصدار 10.0
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة (NIH)الإصدار 1.53

المراجع

  1. Joe E, Ringman JM. Cognitive symptoms of Alzheimer's disease: clinical management and prevention. BMJ. 2019;367:l6217.
  2. Scheff SW, et al. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Neurology. 2007;68(18):1501-8.
  3. Muralidar S, et al. Role of tau protein in Alzheimer's disease: the prime pathological player. Int J Biol Macromol. 2020;163:1599-617.
  4. Hardy JA, Higgins GA. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 1992;256(5054):184-5.
  5. Calsolaro V, Edison P. Neuroinflammation in Alzheimer's disease: current evidence and future directions. Alzheimers Dement. 2016;12(6):719-32.
  6. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 2005;120(4):513-22.
  7. Yao R. An in-silico assessment suggests the potential effects of goji (fruit of Lycium barbarum L.) against aging-related diseases. Food Med Homol. 2025;2(2):9420036.
  8. Campisi J, d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(9):729-40.
  9. Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. ER stress activates immunosuppressive network: implications for aging and Alzheimer's disease. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):633-50.
  10. Mirabella F, et al. Prenatal interleukin 6 elevation increases glutamatergic synapse density and disrupts hippocampal connectivity in offspring. Immunity. 2021;54(11):2611-31.e8.
  11. Baker DJ, Petersen RC. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 2018;128(4):1208-16.
  12. Lucas V, Cavadas C, Aveleira CA, Hook V. Cellular senescence: from mechanisms to current biomarkers and senotherapies. Pharmacol Rev. 2023;75(4):675-713.
  13. Bloss EB, et al. Evidence for reduced experience-dependent dendritic spine plasticity in the aging prefrontal cortex. J Neurosci. 2011;31(21):7831-9.
  14. Ye XS, et al. The food and medicine homologous Chinese medicine from Leguminosae species: a comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2025;2(2):9420033.
  15. Dickstein DL, Weaver CM, Luebke JI, Hof PR. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 2013;251:21-32.
  16. Wang SY, et al. Qifu-Yin attenuates AGEs-induced Alzheimer-like pathophysiological changes through the RAGE/NF-kappaB pathway. Chin J Nat Med. 2014;12(12):920-8.
  17. Yang X, et al. Qi-fu-yin attenuated cognitive disorders in 5xFAD mice of Alzheimer's disease animal model by regulating immunity. Front Neurol. 2023;14:1183764.
  18. Xiao QY, et al. Effects of Qi-Fu-Yin on aging of APP/PS1 transgenic mice by regulating the intestinal microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 2023;12:1048513.
  19. Chen K, et al. Safety and toxicity of Qi-Fu Yin, a classical traditional Chinese medicine prescription: a nonclinical research. J Appl Toxicol. 2025;45(9):1811-38.
  20. Wang L, Qiao P, Yue L, Sun R. Is Qi Fu Yin effective in clinical treatment of dementia? A meta-analysis of 697 patients. Medicine (Baltimore). 2021;100(5):e24526.
  21. Li H, et al. Identification of chemical components of Qi-Fu-Yin and its prototype components and metabolites in rat plasma and cerebrospinal fluid via UPLC-Q-TOF-MS. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:1995766.
  22. Lei X, et al. Integrating network pharmacology and component analysis to study the potential mechanisms of Qi-Fu-Yin Decoction in treating Alzheimer's disease. Drug Des Devel Ther. 2023;17:2841-58. doi:10.2147/DDDT.S402624.
  23. Takeshita H, et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 2017;7:42323.
  24. Caggiano V, et al. Midbrain circuits that set locomotor speed and gait selection. Nature. 2018;553(7689):455-60.
  25. Ehret B, et al. Population-level coding of avoidance learning in medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 2024;27(9):1805-15.
  26. Curdt N, et al. Search strategy analysis of Tg4-42 Alzheimer mice in the Morris water maze reveals early spatial navigation deficits. Sci Rep. 2022;12:5451.
  27. Deacon RMJ. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 2006;1(3):1117-9.
  28. Tu S, Okamoto SI, Lipton SA, Xu H. Oligomeric Aβ-induced synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2014;9:48.
  29. Benowitz LI, Routtenberg A. GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity. Trends Neurosci. 1997;20(2):84-91.
  30. Dore K, et al. PSD-95 protects synapses from β-amyloid. Cell Rep. 2021;35(9):109194.
  31. Kokotos AC, et al. Synaptophysin sustains presynaptic performance by preserving vesicular synaptobrevin-II levels. J Neurochem. 2019;151(1):28-37.
  32. Martin SB, et al. Synaptophysin and Synaptojanin-1 in Down syndrome are differentially affected by Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2014;42(3):767-75.
  33. Namioka N, et al. Oxidative stress and inflammation are associated with physical frailty in patients with Alzheimer's disease. Geriatr Gerontol Int. 2016;17(6):913-8.
  34. Kojima G, Liljas A, Iliffe S, Walters K. Prevalence of frailty in mild to moderate Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Curr Alzheimer Res. 2017;14(12):1256-63.
  35. Dimri GP, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(20):9363-7.
  36. Baker DJ, et al. Naturally occurring p16Ink4a-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 2016;530(7589):184-9.
  37. Zhang P, et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nat Neurosci. 2019;22(5):719-28.
  38. Ota H, Ogawa S, Ouchi Y, Akishita M. Protective effects of NMDA receptor antagonist, memantine, against senescence of PC12 cells: a possible role of nNOS and combined effects with donepezil. Exp Gerontol. 2015;72:109-16.
  39. Herdy JR, et al. Increased post-mitotic senescence in aged human neurons is a pathological feature of Alzheimer's disease. Cell Stem Cell. 2022;29(12):1637-52.e6.
  40. Hu Y, et al. Replicative senescence dictates the emergence of disease-associated microglia and contributes to Abeta pathology. Cell Rep. 2021;35(10):109228.
  41. Tchkonia T, et al. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. J Clin Invest. 2013;123(3):966-72.
  42. Guerrero A, De Strooper B, Arancibia-Cárcamo IL. Cellular senescence at the crossroads of inflammation and Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 2021;44(9):714-27.
  43. Acosta JC, et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 2013;15(8):978-90.
  44. Wang B, Han J, Elisseeff JH, Demaria M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25(12):958-78.
  45. Gaikwad S, Senapati S, Haque MA, Kayed R. Senescence, brain inflammation, and oligomeric tau drive cognitive decline in Alzheimer's disease: evidence from clinical and preclinical studies. Alzheimers Dement. 2024;20(1):709-27.
  46. Si Z, Sun L, Wang X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 2021;137:111327.
  47. Chen X, et al. Senescence-like changes induced by expression of p21Waf1/Cip1 in NIH3T3 cell line. Cell Res. 2002;12(3-4):229-33.
  48. Engeland K. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell Death Differ. 2022;29(5):946-60.
  49. Choi I, et al. Autophagy enables microglia to engage amyloid plaques and prevents microglial senescence. Nat Cell Biol. 2023;25(7):963-74.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

فئران 5xFADمرض الزهايمرأميلويد بيتاالبروتينات المشبكيةمتاهة موريس المائيةالنمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخةالكيمياء النسيجية المناعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.