يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة الدماغ الجديدين لاستبدال الخلايا الدبقية الصغيرة وتحليل النسب في الجسم الحي

132 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

يوليو 28, 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

يتيح هذا البروتوكول زراعة الدماغ الداخلي الدماغي الفعال لحديثي الولادة لمجموعات محددة من الخلايا الدبقية الدقيقة، ويدعم عمليات زرع وتحليل طويلة الأمد قوية لسلالة الخلايا الدبقية الصغيرة والدمج في الجسم الحي عبر مصادر متبرعة متعددة ونماذج متلقين.

الملخص

برز استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة عبر زراعة الخلايا النخاعية كنهج تجريبي واعد لدراسة العمليات العصبية والأمراض. ومع ذلك، غالبا ما تكون استراتيجيات الزرع الحالية محدودة بسبب عدم كفاءة الزراعة في التركيب، أو الاعتماد على التكييف القائم على الإشعاع، أو تقييد المرونة بين أنظمة المتبرعين والمتلقين. هنا، نصف بروتوكول زراعة الخلايا الدماغية لحديثي الولادة لإدخال مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة المنقاة (Hoxb8 وغير Hoxb8) في دماغ الفأر النامي. تمكن هذه الطريقة من دمج الخلايا المانحة بكفاءة داخل نسيج الدماغ تحت ظروف فسيولوجية تسمح بذلك. ومن المهم أن البروتوكول متوافق مع مصادر متبرعة متعددة، بما في ذلك الموسعات المسببة للدم الجنينية والدبقية الدبقية المشتقة من الدماغ بعد الولادة، ويمكن تطبيقه على نماذج متلقية مميزة تحتوي على دبقية صغيرة أو غائبة داخلية، بما في ذلك الفئران الشرطية التي تعاني من نقص Csf1r وفئران Csf1r ΔFIRE. يتم تنقية الخلايا المانحة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة وتسليمها ثنائيا إلى أدمغة الفئران الوليدية باستخدام أنابيب زجاجية دقيقة للتوصيل الفعال وقليلة التوغل. يتم عمر الفئران المتلقية للسماح لخلايا المتبرع بالتوسع وملء محفظة الدبقية الدقيقة، ويتم تقييم النتائج من خلال تحليل نسيجي لتوزيع الخلايا المانحة وتعبيرها عن العلامات. يوفر هذا النهج منصة قوية وقابلة للتوسع لدراسة تكوين الخلايا الدبقية الصغيرة والتكامل في الجسم الحي عبر سياقات تجريبية متنوعة.

المقدمة

برز استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال زراعة خلايا النخاع كاستراتيجية قوية لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة وكنموذج علاجي محتمل للأمراض العصبية. على مدى السنوات القليلة الماضية، تقدم المجال إلى استراتيجيات قادرة على استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي1. أظهرت الدراسات الحديثة أن البلعم المشتقة من المتبرعين والسلف يمكنها زرع الدماغ، واعتماد برامج نسخ شبيهة بالميكروغليا، وفي بعض الحالات تحسين الأنماط الظاهرية المرتبطة بالأمراض 2,3,4,5,6,7,8. تدعم هذه النتائج فكرة أن استبدال البلاعم الدماغية يمكن الاستفادة منه لدراسة وتعديل العمليات العصبية المرضية.

أحد التحديات المركزية في زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة هو تحقيق تطعيم قوي مع تقليل الارتباكات التجريبية. تعتمد العديد من استراتيجيات الاستبدال الراسخة على نماذج الإشعاع أو العلاج الكيميائي أو استنزاف الخلايا الدبقية الصغيرة لتوليد محفظة يمكن الاعتماد عليها 6,9,10,11,12,13. على الرغم من فعاليتها، يمكن لهذه الطرق أن تسبب شيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة، وتعطيل الحاجز الدموي الدماغي، وتغير الإشارات الالتهابية، وكلها قد تعقد تفسير سلوك الخلايا المانحة 9,14. بدأت أعمال حديثة لاستكشاف طرق مستقلة عن التكييف أو تقليل السمية لاستبدال الخلايا الدبقيةالصغيرة 5,8,15.

توقيت النمو هو عامل مهم في نجاح الزراعة. يوفر دماغ حديثي الولادة بيئة تسمح بدعم توسع الخلايا المانحة والتكامل طويل الأمد، ويرجح أن ذلك يعود إلى تقليل الحواجز الهيكلية واستمرار تأسيس الفراغ الصغير الداخلي للدبقية الصغيرة. تظهر دراسات زراعة الزرع الحديثة التي استخدمت الولادة المبكرة بعد الولادة (P0–P5) تطعيم متين في النسيج العميق واكتساب هوية شبيهة بالميكروغليا، مما يعزز أهمية السياق التنموي للاستبدال الفعال 7,8,16,17.

توفر الخلايا الدبقية الصغيرة هوكس ب8 نظاما مفيدا بشكل خاص لدراسة المساهمات الخاصة بالسلاسل في بيولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة. تنشأ هذه الخلايا من الخلايا الجنينية المسببة للدموية وتمثل مجموعة محددة من الخلايا الدبقية الدقيقة ذات النسيج البارانشيمي مع عواقب سلوكية عند الخللالوظيفي 17,18,19,20,21. تظهر الأعمال الحديثة باستخدام أسلاف Hoxb8 الأولية وأنظمة الخلايا الدبقية الصغيرة ومستقبلات الإستروجين (ER)-Hoxb8 أن هذه الخلايا يمكن توسيعها، وتعديلها وراثيا، وغرسها بنجاح في الدماغ، حيث تتبنى ملفات نسخ شبيهة بالميكروغليا وخصائص وظيفية 7,8,17. تسلط هذه التطورات الضوء بشكل أكبر على فائدة أساليب الزرع في تشريح نسب الخلايا الدبقية الدقيقة وعدم التجانس.

هنا، نصف منصة زراعة الدماغ الداخلي لحديثي الولادة مصممة لتحسين التنوع بين أنظمة المتبرع والمتلقي. على عكس الطرق التي تعتمد على التشعيف أو التكييف الجهازي، تستخدم هذه الطريقة التوصيل الثنائي المباشر، داخل الدماغ، إلى الفئران الوليدية، مما يمكن من وضع خلايا المتبرع في بيئة دماغية تسمح تطوريا مع تقليل الاضطرابات الجهازية. تتوافق هذه التقنية مع مصادر متعددة من المتبرعين، بما في ذلك الخلايا المسببة للدم الجنينية والخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الدماغ بعد الولادة، ويمكن تطبيقها على نماذج متلقية مميزة تحتوي على دبقية صغيرة أو غائبة داخلية. ميزة عملية رئيسية هي أن الجمجمة الرقيقة لحديثي الولادة تسمح بالحقن اليدوي السريع باستخدام أنابيب زجاجية دقيقة، مما يلغي الحاجة إلى الحفر أو التثبيت المجسم مع تحقيق تطعيم واسع في النسيج المحيطي.

معا، يوفر هذا النهج نظاما قويا ومرنيا وقابلا للتوسع لدراسة تكوين الخلايا الدبقية الدقيقة، والتغاير، والتكامل في الجسم الحي . هذا يضع زراعة الخلايا الدماغية لحديثي الولادة كبديل مكمل ومتحكم فيه تجريبيا لاستراتيجيات استبدال الخلايا الدبقية الدقيقة الجهازية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الطرق والتجارب في هذه الدراسة على الفئران. تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة يوتا، ضمان خدمة الصحة العامة #D16-00018 (A3031-01).

1. تحضير أزواج التكاثر للولادات المتبرعة والمستلمة

  1. ضع أزواج المربين في نفس القفص في المساء لبدء التزاوج المحدد.
  2. افحص الإناث كل صباح بحثا عن سدادة مهبلية للتأكد من نجاح التزاوج.
  3. أزل الإناث المسدودة من الذكور واحتضنها بشكل فردي حتى الولادة، والتي تستغرق حوالي 18-20 يوما.
  4. تعامل مع الأم الحوامل بلطف لمدة 5 دقائق يوميا لمدة 7–10 أيام قبل الولادة لتقليل التوتر المرتبط بالتعامل مع حديثي الولادة.
  5. تعرض الأم لمكشاة قطنية تحتوي على رائحة بيتادين خلال جلسات التعامل اليومية لتقليل توتر الأم عند إعادة الجراء بعد الجراحة.
  6. جهز أقفاص نظيفة بمواد تعشيش للإناث الحوامل قبل الولادة المتوقعة.

2. حصاد ومعالجة أدمغة حديثي الولادة

  1. قم بقتل فئران المتبرع حديثي الولادة (P0–P4) عن طريق جرعة زائدة من الأيزوفلوران باستخدام جرة جرس أو غرفة مغلقة مماثلة مزودة بأرضية زائفة لمنع الاتصال المباشر بالتخدير.
  2. بمجرد توقف التنفس وتأكيد غياب ردود الفعل، قم بقطع الرأس فورا.
  3. احصد الدماغ بالكامل، بما في ذلك المخيخ والبصيلات الشمية. ضع الأدمغة في 3 مل من محلول الملح المتوازن 1× هانكس البارد (HBSS) في طبق بتري بلاستيكي على الثلج.
  4. باستخدام مشرط ومشاط معقمة، يتم تقطيع الدماغ إلى حوالي 1–2 مم3 قطع.
  5. انقل نسيج الدماغ المفروم (دماغ واحد لكل أنبوب تفكك) إلى أنابيب تفكك الأنسجة التي تحتوي على كواشف هضم إنزيمية مزودة بنظام تفكك الأنسجة العصبية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة الموصى بها.
  6. ضع الأنابيب في جهاز تفكيك ميكانيكي مزود بقدرة تسخين وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام برنامج تفكك الأنسجة العصبية الموصى به من الشركة المصنعة.
  7. مصفاة خلايا بحجم 70 ميكرومتر قبل النقع مع 400 ميكرولتر من 1× HBSS.
  8. مرر الأنسجة المفككة عبر المصفاة المنقوعة مسبقا والتي توضع فوق أنبوب مخروطي بحجم 50 مل على الثلج.
  9. اغسل الأنابيب ب 10 مل من 1× HBSS ومرر الفلاتر لضمان أقصى استرداد للخلايا.
  10. تخلص من الفلاتر وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق السوبرناتان.
  11. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء في مياه فائقة النقية معقمة لكل عينة وحضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. قم بتهدئة تفاعل التحلل بجرعة 10 مل من 1× HBSS/1٪ BSA/5٪ FBS.
  13. تخلص من الفلاتر وقم بتدوير الخلايا عند 300 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان.
  14. تحديد عدد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي. النطاق النموذجي لإنتاج الخلايا هو 3.2–4.0 × 106 قبل الفرز.
  15. أعد تعليق الخلايا في 5٪ FBS في 1× HBSS بالتركيز المطلوب لصبغ الأجسام المضادة في المراحل النهائية.

3. صبغ الأجسام المضادة للخلايا لفرز مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة في FACS

  1. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول التلوين (5٪ FBS في 1× HBSS) يحتوي على أجسام مضادة لحظر مستقبلات Fc (CD16/32 منقى، 1:2000) وحضانة الخلايا لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بتدوير الخلايا على 240 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان.
  3. حضن الخلايا بأجسام مضادة متقاربة فلورية (CD45 APC، 1:160؛ CD11b Alex Fluor 700، 1:160) في محلول تلوين بسعة 1 مل لمدة 30 دقيقة على الثلج في الظلام.
  4. قم بتدوير الخلايا عند 240 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان.
  5. أضف صبغة قابلية للحياة (مثل 3 ميكرومولار DAPI في 1× HBSS) لاستبعاد الخلايا الميتة.
  6. قم بفرز FACS باستخدام جهاز فرز خلايا عالي السرعة مزود بأشعة ليزر مناسبة لاكتشاف DAPI، GFP، tdTomato، CD45-APC، وCD11b-Alexa Fluor 700.
  7. استخدم فوهة بحجم 100 ميكرومتر مع ضغط غلاف منخفض عند الإمكان لتعظيم بقاء الخلية. احتفظ بأنابيب جمع العينات والخلايا المصنفة على الثلج طوال العملية.
  8. استخدم خلايا غير مصبوغة، وضوابط تعويض بلون واحد، وضوابط فلورية ناقص واحد عند الحاجة لضبط الفولتية والتعويض والبوابات.
  9. الخلايا البوابية الأولى حسب منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية لاستبعاد الحطام.
  10. شرائح البوابة المنفردة باستخدام ارتفاع تشتت الجانب مقابل عرض التشتت الجانبي.
  11. استبعد الخلايا الميتة عن طريق تحديد البوابات على خلايا DAPI⁻.
  12. من السينغليتس الحية، البوابة على CD45منخفض CD11b⁺ ميكروغليا.
  13. ضمن بوابة الدبقيةالمنخفضة CD11b⁺ CD45، استخدم GFP وtdTomato فلورية لفصل تجمعات الخلايا الدبقية المانحة (Hoxb8 microglia: DAPI⁻ CD45منخفض CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺، ميكروغليا غير Hoxb8 : DAPI⁻ CD45منخفض CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. قم بفرز كل مجموعة في أنابيب تجميع معقمة تحتوي على 1x HBSS بارد.
  15. بعد الفرز، أعد تحليل عدد صغير من الخلايا المرتبة للتأكد من نقاء وصلاحية الزراعة قبل الزراعة.
  16. اجمع الخلايا المفترسة في HBSS المعقمة 1× وحافظ عليها على الجليد في الظلام حتى الزراعة.
    ملاحظة: تتراوح النتائج النموذجية للميكروغليا Hoxb8 بين 3.70–4.60 ×10 4 خلايا، وبين الخلايا الدبقية غير الدقيقة 1.10–1.14 × 105 خلايا لكل دماغ حديث الولادة (P0–P4)، رغم أن النتائج قد تختلف حسب العمر والنمط الجيني وكفاءة معالجة الأنسجة. زرع الخلايا الحية المنقاء في أسرع وقت ممكن، ويفضل خلال 60 دقيقة من فرز الخلايا.

4. حصاد ومعالجة السلف المسبب للدم في كبد الجنين

  1. قتل السدود الحوامل باستخدام 5٪ إيزوفلوران يوصل بالأكسجين عبر جهاز تبخير دقيق حتى يتوقف التنفس ويتأكد غياب ردود الفعل.
  2. بعد تناول جرعة زائدة من الإيزوفلوران، قم بإجراء إجراء علاج بدائي ثانوي عن طريق خلع عنق الرحم لضمان الوفاة، وفقا لإرشادات رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية.
  3. قم بإزالة قرون الرحم من الفئران الحوامل وضعها في 3 مل من HBSS 1× في أطباق بتري بلاستيكية (60 مم × 15 مم).
  4. قم بتشريح أجنة E12.5 من الرحم وضعها في 3 مل من 1× HBSS في أطباق بتري بلاستيكية باردة.
  5. قم بتشريح كبد الجنين باستخدام ملقط ناعم وضعه في 3 مل طازج من 1× HBSS البارد الذي يحتوي على 5٪ FBS في أطباق بتري.
  6. تفكك ميكانيكي لأنسجة كبد الجنين المتجمعة باستخدام إبرة 26 جرام وحقنة 3 مل.
  7. قم بتدوير الخلايا عند 240 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان.
  8. اغسل الخلايا باستخدام 1× HBSS.
  9. مرر تعليق الخلية عبر مصفاة خلوية بحجم 80 ميكرومتر.
  10. حضن الخلايا في 20 ميكرولتر من محلول تحليل خلايا الدم الحمراء (0.15 مليون كلوريد أمونيوم، 1 مللي مولار KHCO3) لمدة 5 دقائق ثم إضافة 13 مل من 1× HBSS للتبريد.
  11. استمر في الحضانة لمدة 5 دقائق لتحليل خلايا الدم الحمراء.
  12. قم بتدوير الخلايا عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

5. تلوين الأجسام المضادة للخلايا في فرز الخلايا السلفية المسببة للدم في FACS

  1. حضن خلايا كبد الجنين بأجسام مضادة متقاربة فلورية (Ter119 PerCP-Cy5.5، 1:50؛ طقم PE-Cy7، 1:100) في 5٪ FBS/1٪ BSA في 1× HBSS لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
  2. اغسل الخلايا ب 1× HBSS وادبر على 240 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. أضف صبغة قابلية للحياة (مثل 3 ميكرومولار DAPI في 1× HBSS) لاستبعاد الخلايا الميتة.
  4. قم بفرز FACS باستخدام جهاز فرز خلايا عالي السرعة مزود بالليزر والفلاتر المناسبة لاكتشاف DAPI، Ter119 PerCP-Cy5.5، Kit PE-Cy7، tdTomato، وكشف GFP.
  5. استخدم فوهة بحجم 100 ميكرومتر مع ضغط غلاف منخفض عند الإمكان لتعظيم بقاء الخلية. احتفظ بأنابيب جمع العينات والخلايا المصنفة على الثلج طوال العملية.
  6. استخدم خلايا غير مصبوغة، وضوابط تعويض بلون واحد، وضوابط فلورية ناقص واحد عند الحاجة لضبط الفولتية والتعويض والبوابات.
  7. الخلايا البوابات الأولى تستخدم منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية لاستبعاد الحطام.
  8. تستخدم شرائح البوابة الفردية ارتفاع التبعثر الأمامي مقابل عرض التشتت الأمامي، تليها ارتفاع التشتت الجانبي مقابل عرض التشتت الجانبي.
  9. استبعد الخلايا الميتة عن طريق تحديد البوابات على خلايا DAPI⁻.
  10. من الخلايا الأحاديث الحية، استبعد خلايا السلالة الحمراء عن طريق البوابة على خلايا Ter119⁻.
  11. داخل مجموعة Ter119⁻، يوجد بوابة على خلايا كيت ذات المكون الدمويالعالي .
  12. ضمن مجموعة DAPI⁻ Ter119⁻العالية من العدد، يتم عزل السلف الإيجابي لسلالة Hoxb8 عن طريق ربط خلايا tdTomato⁺.
  13. إذا كان خط المتبرع يحمل أيضا مراسل Cx3cr1-GFP، استخدم فلورة GFP للتأكد من أن مجموعة الكبد الجنيني المرتبة منخفضة GFP⁻ أو GFPفي هذه المرحلة، مما يميز الخلايا السلفية عن الخلايا النخاعية المميزة التي تعبر عن Cx3cr1.
  14. قم بفرز المجموعة النهائية DAPI⁻ Ter119⁻Kit عالية tdTomato⁺ GFP - في أنابيب تجميع معقمة تحتوي على 1× HBSS البارد.
  15. بعد الفرز، أعد تحليل عدد صغير من الخلايا المرتبة للتأكد من نقاء وصلاحية الزراعة قبل الزراعة.
  16. اجمع الخلايا المفترسة في HBSS المعقمة 1× وحافظ عليها على الجليد في الظلام حتى الزراعة.
    ملاحظة: تتراوح النتائج النموذجية من حوالي 5.0 إلى 7.0 × 104 أسلاف Hoxb8 المكونة للدم لكل تحضير كبد جنيني E12.5، وذلك حسب حجم الجنين وكفاءة الفرز. زرع الخلايا الحية المنقاة في أقرب وقت ممكن، ويفضل خلال 60 دقيقة من الفرز.

6. تحضير إبر الحقن

  1. تحميل الشعيرات الدموية الزجاجية البوروسيليكاتية (قطر خارجي 1.0 مم، قطر داخلي 0.58 مم، مع خيوط) في جهاز سحب ميكروبايبت.
  2. سحب الشعيرات الدموية باستخدام برنامج سحب ذو خطين محسن لتوليد إبر طويلة مدببة مناسبة لزراعة الدماغ الوليدية.
    1. الإعدادات النموذجية تشمل: الحرارة = 645، السحب = 30، السرعة = 120، التأخير = إيقاف الضغط = 200. قم بتحسين الإعدادات النهائية لنوع الزجاج المحدد، والظروف البيئية، ومعايرة الساحب. بعد ذلك، قم بقص الإبر الناتجة ومنحنها لإنتاج رأس خارجي نهائي يبلغ قطره حوالي 30 ميكرومتر.
  3. ضع الإبر المسحوبة على شريطين من المعجون داخل طبق بتري بلاستيكي كبير لحماية الأطراف من التلف قبل التقليم والميل.
  4. ضع الإبرة المسحوبة تحت مجهر ستيريو مفكك بتكبير يقارب 10×–20× وادعمها بدعامة ناعمة.
    ملاحظة: قد يستخدم تكبير أعلى (20×–40×) أثناء فحص الطرف للتحقق من التكوين الصحيح للتخفيف وتحديد أي عيوب قبل التقليم والميل.
  5. استخدم شفرة حلاقة معقمة لقص طرف الإبرة للحصول على قطر خارجي يقارب 30 ميكرومتر.
  6. ثبت الإبرة المقطوعة في حامل طاحونة دقيقة.
  7. اضبط زاوية الميل إلى 30°–35°.
  8. شغل المطحنة والإضاءة.
  9. دع الماء المقطر يتساقط على حجر الطحن بمعدل ثابت يقارب قطرة واحدة كل 4–5 ثوان.
  10. اجعل رأس الإبرة يلامس بلطف حجر الطحن الدوار حتى يتشكل حافة مائلة.
  11. قس القطر الخارجي للطرف المشطوف باستخدام جهاز قياس الطرف عند توفره.
  12. اختر إبر بقطر خارجي يقترب من 30 ميكرومتر للزراعة.
  13. املأ الإبرة بمحلول معقم واطرد السائل بلطف للتأكد من أن الطرف مفتوح وغير مسدود.

7. تجهيز جهاز الحقن

  1. قم بتجميع ماصة يدوية يتم التحكم بها بالفم تتكون من أنابيب مرنة، قطعة فموية، فلتر متداخل، وحامل للشعيرات الدموية.
    ملاحظة: يتم دمج فلتر متداخل في جهاز التوصيل بالفم لمنع التلوث.
  2. ضع علامة على الإبرة كل 2 مم (حتى علامتين لكل إبرة). كل 2 مم يعادل ~2 ميكرولتر.
  3. أدخل إبرة حقن الزجاج المحضرة ~1.5 سم في حامل الشعيرات الدموية وتأكد من أن التجميع آمن ومحكم الإغلاق بالهواء.
  4. طبق شفطا لطيفا عبر قطعة الفم للتأكد من تدفق الهواء غير المعوق والمقاومة المناسبة.
  5. تأكد من أن النظام يسمح بالتحكم السلس في الشفط والحقن قبل تحميل خلايا المتبرع.
  6. قم بملء إبرة حقن الزجاج بتعليق خلية المانحة المحضرة (إجمالي 4.5 ميكرولتر) باستخدام رأس ماصة دقيقة.
    ملاحظة: تأكد من عدم بقاء فقاعات هواء في الإبرة قبل بدء الزراعة. استخدم إبرة واحدة لكل فأرة.

8. تخدير المتلقين لحديثي الولادة وتحضير المجال الجراحي

  1. وضع الفأر الوليد في وضع الاستلقاء على الظهر على طاولة الجراحة وتحفز التخدير باستخدام إيزوفلوران بنسبة 2.0٪–5.0٪ يتم توصيله في الأكسجين عبر جهاز تبخير دقيق.
  2. ضع أنف الفأر داخل مخروط أنف للحفاظ على توصيل مستمر للأيزوفلوران والأكسجين طوال العملية.
  3. امنح حوالي دقيقة واحدة لتحفيز التخدير مع مراقبة التنفس.
  4. المس الأطراف بلطف وتأكد من غياب رد فعل الانسحاب للتحقق من وجود تخدير كاف.
  5. بمجرد تحقيق مستوى تخدير مناسب، خفض تركيز الأيزوفلوران إلى 0.5٪–2.0٪ للصيانة واستمر في التخدير لمدة تصل إلى 10 دقائق أثناء عملية الزراعة.
  6. حافظ على حرارة الفأر الوليد عند حوالي 38 درجة مئوية باستخدام وسادة حرارة موضوعة تحت طاولة الجراحة.
  7. نظف منطقة موقع الحقن على الرأس باستخدام تطبيقات متناوبة من البيتادين والإيثانول بنسبة 70٪ باستخدام عشايات قطنية معقمة.
  8. ضع طبقة أخيرة من البيتادين ودع الجلد يجف قبل الحقن.
    تحذير: الإيزوفلوران هو عامل مخدر خطير. استخدم أنظمة التنبيه المخدرة المناسبة وتأكد من تهوية الغرف المناسبة، وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.

9. إجراء زراعة الدماغ الدماغية لحديثي الولادة

  1. ثبت الرأس بلطف باستخدام أصابع مغطاة بالقفاز أو دعامة ناعمة لتقليل الحركة أثناء الحقن.
    ملاحظة: يتم زرع الفئران المتلقية بين P1 و P4.
  2. تحديد مواقع الحقن الثنائية في الدماغ الظهري الأمامي (منطقة القشرة الجبهية المستقبلية)، تقريبا 1–2 مم جانبي للخط الوسطي السهمي وذيلية مباشرة للبصيلات الشمية. ضع مواقع الحقن بشكل متماثل في كل نصف كرة مع تجنب الأوعية الدموية السطحية المرئية.
    ملاحظة: بسبب رقة الجمجمة وصغر حجم الفئران الوليدية، تجرى الحقن باستخدام معالم تشريحية بصرية بدلا من الإحداثيات المجسمة.
  3. افحص الجمجمة بصريا وتجنب إدخال الإبرة بالقرب من الأوعية الدموية المرئية.
  4. حرك الماصي الزجاجي المشطف بلطف عبر الجلد والجمجمة النامية.
  5. وجه الإبرة على عمق حوالي 1–2 مم تحت سطح الجمجمة إلى نصف الكرة الجبهي.
  6. توصيل خلايا المتبرع باستخدام ضغط يدوي متحكم فيه عبر جهاز الماصة الذي يتحكم به الفم.
    ملاحظة: عند زراعة الخلايا الكيميائية المكونة للدم المنقاة أو الخلايا الدبقية الدقيقة حديثي الولادة، قم بحقن 2–3 ميكرولتر لكل نصف كرة، أي حوالي 2.5 × 10إلى 4 خلايا في كل حقنة. وهذا يوفر حوالي 5 × 104 خلايا لكل دماغ فأر.
  7. اسحب المايكروبيت ببطء من الدماغ لتقليل ارتجاع الخلايا المحقونة وتقليل تلف الأنسجة.
  8. قم بحقن الجانب المقابل.
    ملاحظة: استخدم إبرة واحدة لكل فأر لتجنب التلوث المتبادل بين الفئران.

10. تعافي الأطفال الموضعين المزروعين

  1. ضع كل جرو على وسادة تدفئة مباشرة بعد الإجراء.
  2. راقب الجراء حتى يعود لون الجسم الطبيعي، والحركة العفوية، والنشاط العام.
    ملاحظة: وقت التعافي يتراوح بين 5 دقائق إلى 10 دقائق.
  3. أعد الجراء إلى السد.
  4. فرك كل جرو جيدا بفراش الأقفاص المنزلي ومواد التعشيش.
  5. أعد الجراء إلى القفص مع الأم.
  6. تأكد من أن الأم تستعيد وتقبل الجراء المعادة.

11. مراقبة الصحة بعد العملية

  1. راقب الجراء يوميا لمدة 10 دقائق خلال أول 3 أيام بعد الزرع.
  2. قيم الجراء من حيث النشاط الطبيعي، وسلوك الرضاعة، والتفاعل مع الأم.
    ملاحظة: لا تزعج أقفاص الفئران خلال هذا الوقت. وهذا يمكن أن يزيد الضغط على السد.
  3. استمر في مراقبة الجراء كل يومين حتى الفطام بعد فترة الثلاثة أيام الأولى.
  4. قيم الجراء من حيث التطور الطبيعي، وسلوك التغذية، ومستوى النشاط، ورعاية الأم.
  5. قس وسجل وزن الجسم يوميا خلال فترة ما بعد العملية المبكرة.
  6. قيم الجراء بحثا عن علامات الضيق، أو وضعية غير طبيعية، أو خمول، أو ضعف في التغذية.
  7. قم بتنفيذ القتل الرحيم الإنساني عند الحاجة وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية.
    1. بالنسبة للفئران الوليدة، قم بالقتل الرحيم بجرعة زائدة من الأيزوفلوران باستخدام جرة جرس أو غرفة مغلقة مماثلة مزودة بأرضية زائفة لمنع الاتصال المباشر بالمخدر. بمجرد توقف التنفس وتأكيد غياب ردود الفعل، قم بقطع الرأس فورا.
    2. بالنسبة للفئران البالغة، يتم القتل الرحيم باستخدام 5٪ من إيزوفلوران يوصل في الأكسجين عبر جهاز تبخير دقيق حتى يتوقف التنفس ويتأكد غياب ردود الفعل، يليه خلع عنق الرحم كطريقة ثانوية لضمان الوفاة.
      ملاحظة: تم استبعاد الحيوانات التي أظهرت وفيات بعد العملية أو غياب زرع خلايا متبرع قابلة للكشف عند نقطة التجربة النهائية من التحليل. لم يتم إعطاء مسكنات بعد العملية لأن زراعة الجهاز الدماغي لحديثي الولادة اعتبرت طفيفة التوغل.

12. جمع أنسجة الدماغ للتشريح بالتجميد والتلوين بالفلورية المناعية

  1. أزل الدماغ بعناية وجهزه للتحليل المقطعي المجمد.
  2. معالجة نسيج الدماغ بعد الولادة للتشريح بالتجميد وقطع المقاطع التاجية باستخدام التجميد وفقا للإجراءات الموضحة سابقا.
    ملاحظة: لكل فأر، يتم تحليل 9–12 مقطعا إكليليا تمتد عبر القشرة الحسية الجسدية.
  3. ثبت المقاطع على شرائح المجهر وخزنها عند -20 درجة مئوية حتى يتم تلوينها.
  4. حضن المقاطع لفترة وجيزة في مخزن نفاذية يحتوي على 0.2٪ ترايتون X-100 و1٪ دي أوكسي صوديوم.
  5. جهز الأجسام المضادة الأولية (مضاد الدجاج GFP، 1:500؛ خنازير غينيا المضادة لطماطم، 1:250؛ الأرنب المضاد لإيبا1؛ 1:500) مخفف في محلول تخفيف الأجسام المضادة المناسب.
  6. حضانة أقسام الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  7. غسل الأقسام بمحلول ملحي مخبأ بالفوسفات لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة.
  8. حضن مقاطع بأجسام مضادة ثانوية متقاربة بالفلوروفور (مضاد للأرانب Alexa Fluor 647، 1:500؛ مضاد خنازير الماعز Alexa Fluor 555، 1:500؛ مضاد للدجاج في الماعز Alexa Fluor 488، 1:500) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  9. قم بطلاء الأقسام باستخدام DAPI لرؤية نوى الخلية.
  10. ثبت الأجزاء باستخدام وسط تثبيت مضاد للتلاشي ووضع غطاء زجاجي.

13. الحصول على صور المجهر الكونفوكلي

  1. احصل على صور فلورية باستخدام مجهر كونفوكالي مزود بأهداف بحجم 10× أو 20× هدف.
  2. احصل على صور بدقة 512 × 512 أو 1024 × 1024 بكسل باستخدام سرعات مسح 200–400 هرتز.
  3. اجمع مقاطع بصرية بفواصل z-step بطول 2–5 ميكرومتر عبر النسيج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تؤدي زراعة الخلايا الدماغية النقية في الولادات الجدد إلى بقاء طويل الأمد وزرع واسع النطاق لخلايا مشتقة من المتبرع داخل نسيج الدماغ المتلقي. تم عزل مجموعات الخلايا الدبقية المتبرعة المنقاة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورية باستخدام مراسلي الفلورسنت (دبقية Hoxb8 الدقيقة: tdTomato⁺ GFP⁺؛ الخلايا الدبقية غير Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) قبل الزراعة (الشكل 1A). بعد زراعة الدماغ الدماغي لحديثي الولادة، نجت الخلايا المشتقة من المتبرع على المدى الطو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر زراعة الخلايا الدماغية الوليدية للسلف الدقيقة المنقاة أو المجموعات الفرعية المحددة للدبقية الدقيقة نهجا قويا لإعادة بناء الحجرة الدقيقة الدبقية في الجسم الحي وفحص الخصائص الخاصة بالسلالة في البلاعم الدماغية. تمكن هذه الطريقة من إعادة التكوين الانتقائية باستخدام خلايا مانحة معرفة وراثيا، مما يسمح بتقييم مباشر لزرع ونضج الخلايا المانحة داخل بيئة الدماغ.

ميزة رئيسية لهذه الاستراتيجية هي توافقها مع مصادر متبرعين متعددة وأنظمة المستلمين. في هذه الدراس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 MH093595) (M.R.C.)، ومؤسسة عائلة داوتن، ومنشأة قياس تدفق الخلايا بجامعة يوتا. تم توليد فئران Csf1rΔFIRE بواسطة الدكتور بن شو في جامعة يوتا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bell jarVariousN/AUsed for euthanasia
Borosilicate glass capillaries with
filament		Sutter InstrumentBF100-78-15Used for injection needles
Bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA8806Used to prepare PB buffer. Various brands are available. The one listed here is just an example.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Myeloid cells
CD45 APCBioLegend103112Hematopoietic cells
Cell strainers (70 µm)Falcon352350Used to generate single-
cell suspensions. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Chicken anti-GFP antibodyAves LabsGFP-1020Immunofluorescence
staining
c-Kit PE-Cy7 antibodyBioLegend105814Hematopoietic progenitors
Confocal microscopeLeicaTCS SP5Used for fluorescence
imaging
Conical tubes (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Tissue/cell processing. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Cryostat machineLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Generate frozen tissue
sections. Various brands are available. The one listed here is just an example.
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306Used for viability and
nuclear staining
Dissecting microscopeLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Used for trimming and preparing injection
needles. Various brands are available. The one listed here is just an example.
FACSAria Flow Cytometer SorterBD BioscienceFACSAria Cell purification
Fc block (purified CD16/32)Biolegend101302Blocks unwanted antibody binding to mouse cells expressing Fc receptors
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlUsed in cell preparation
buffers. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Flexible tubing for mouth pipetteVariousN/AComponent of manual
injection apparatus
Flow cytometry analysis softwareFlowJov10.8.1Used for FACS data
analysis
Flow cytometry cell sorterBD BiosciencesFACSAriaUsed for cell purification
gentleMACS Octo Dissociator with
heaters		Miltenyi Biotec130-096-427Used for brain tissue
dissociation
Goat anti-chicken Alexa Fluor 488
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-11039Secondary antibody
Goat anti-guinea pig Alexa Fluor
555 secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-21428Secondary antibody
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-21245Secondary antibody
Goat anti-rat Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-48265Secondary antibody
Guinea pig anti-tdTomato antibodyFrontier InstituteAB_2631185Immunofluorescence
staining
Hanks’ balanced salt solution
(HBSS)		Gibco14175-079Used during cell
preparation
HemocytometerVariousN/ACell counting
Inline filter for mouth pipetteVariousN/APrevents contamination
MicrogrinderNarishigeEG-400Used to bevel glass
injection needles
Micropipette pullerSutter InstrumentP-1000Used to generate fine
injection needles
Mouth pipette mouthpieceVariousN/AUsed for manual control of
injection
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628Used for enzymatic dissociation of brain tissue
Petri dishesThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Used for storing pulled needles or tissue harvest. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Rabbit anti-Iba1 antibodyWako019-19741Microglia marker
Rabbit anti-TMEM119 antibodyAbcam209064Microglia-specific marker
Rat anti-CD206 antibodyBioLegend141712Used to identify macrophage populations
Rat anti-P2RY12 antibodyBioLegend848002Microglia marker
Razor blades/scalpelsVariousN/AUsed to trim needle tips or
tissue harvest
RBC lysis bufferChemCruzsc-296258Used for removal of red
blood cells
Stereotaxic apparatusKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Used for surgical
implantation. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Ter119 PerCP-Cy5.5 antibodyBioLegend116228Erythroid lineage cells
```

المراجع

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype in a mouse model by transplantation of wild-type hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Rep. 2023;42(8):112956.
  6. Colella P, et al. CNS-wide repopulation by hematopoietic-derived microglia-like cells corrects progranulin deficiency in mice. Nat Commun. 2024;15(1):5654.
  7. Nemec KM, et al. Microglia replacement by ER-Hoxb8 conditionally immortalized macrophages provides insight into Aicardi-Goutières syndrome neuropathology. eLife. 2026;14:RP102900.
  8. Van Deren DA, et al. Defective Hoxb8 microglia are causative for both chronic anxiety and pathological overgrooming in mice. Mol Psychiatry. 2026;31(2):915-928.
  9. Sailor KA, et al. Hematopoietic stem cell transplantation chemotherapy causes microglia senescence and peripheral macrophage engraftment in the brain. Nat Med. 2022;28(3):517-527.
  10. Priller J, et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: Use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med. 2001;7(12):1356-1361.
  11. Elmore MRP, et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 2014;82(2):380-397.
  12. Wilkinson FL, et al. Busulfan conditioning enhances engraftment of hematopoietic donor-derived cells in the brain compared with irradiation. Mol Ther. 2013;21(4):868-876.
  13. Mildner A, et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 2007;10(12):1544-1553.
  14. Monje ML, Mizumatsu S, Fike JR, Palmer TD. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med. 2002;8(9):955-962.
  15. Lombroso SI, et al. Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells. Mol Ther. 2026;34(2):850-866.
  16. Bennett FC, et al. A combination of ontogeny and CNS environment establishes microglial identity. Neuron. 2018;98(6):1170-1183.e8.
  17. De S, et al. Two distinct ontogenies confer heterogeneity to mouse brain microglia. Development. 2018;145(13):dev152306.
  18. Van Deren DA, et al. Defining the Hoxb8 cell lineage during murine definitive hematopoiesis. Development. 2022;149(8):dev200200.
  19. Nagarajan N, Capecchi MR. Optogenetic stimulation of mouse Hoxb8 microglia in specific regions of the brain induces anxiety, grooming, or both. Mol Psychiatry. 2024;29(6):1726-1740.
  20. Tränkner D, et al. A microglia sublineage protects from sex-linked anxiety symptoms and obsessive compulsion. Cell Rep. 2019;29(4):791-799.e3.
  21. Chen SK, et al. Hematopoietic origin of pathological grooming in Hoxb8 mutant mice. Cell. 2010;141(5):775-785.
  22. Foran DR, Peterson AC. Myelin acquisition in the central nervous system of the mouse revealed by an MBP-Lac Z transgene. J Neurosci. 1992;12(12):4890-4897.
  23. Dangata YY, Kaufman MH. Myelinogenesis in the optic nerve of (C57BL CBA) F1 hybrid mice: A morphometric analysis. Eur J Morphol. 1997;35(1):3-18.
  24. Rojo R, et al. Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat Commun. 2019;10(1):3215.
  25. Askew K, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 2017;18(2):391-405.
  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

233 233 Hoxb8 Hoxb8
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.