يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة الدماغ الجديدين لاستبدال الخلايا الدبقية الصغيرة وتحليل النسب في الجسم الحي

176 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

يوليو 28, 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

يتيح هذا البروتوكول زراعة الدماغ الداخلي الدماغي الفعال لحديثي الولادة لمجموعات محددة من الخلايا الدبقية الدقيقة، ويدعم عمليات زرع وتحليل طويلة الأمد قوية لسلالة الخلايا الدبقية الصغيرة والدمج في الجسم الحي عبر مصادر متبرعة متعددة ونماذج متلقين.

الملخص

برز استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة عبر زراعة الخلايا النخاعية كنهج تجريبي واعد لدراسة العمليات العصبية والأمراض. ومع ذلك، غالبا ما تكون استراتيجيات الزرع الحالية محدودة بسبب عدم كفاءة الزراعة في التركيب، أو الاعتماد على التكييف القائم على الإشعاع، أو تقييد المرونة بين أنظمة المتبرعين والمتلقين. هنا، نصف بروتوكول زراعة الخلايا الدماغية لحديثي الولادة لإدخال مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة المنقاة (Hoxb8 وغير Hoxb8) في دماغ الفأر النامي. تمكن هذه الطريقة من دمج الخلايا المانحة بكفاءة داخل نسيج الدماغ تحت ظروف فسيولوجية تسمح بذلك. ومن المهم أن البروتوكول متوافق مع مصادر متبرعة متعددة، بما في ذلك الموسعات المسببة للدم الجنينية والدبقية الدبقية المشتقة من الدماغ بعد الولادة، ويمكن تطبيقه على نماذج متلقية مميزة تحتوي على دبقية صغيرة أو غائبة داخلية، بما في ذلك الفئران الشرطية التي تعاني من نقص Csf1r وفئران Csf1r ΔFIRE. يتم تنقية الخلايا المانحة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة وتسليمها ثنائيا إلى أدمغة الفئران الوليدية باستخدام أنابيب زجاجية دقيقة للتوصيل الفعال وقليلة التوغل. يتم عمر الفئران المتلقية للسماح لخلايا المتبرع بالتوسع وملء محفظة الدبقية الدقيقة، ويتم تقييم النتائج من خلال تحليل نسيجي لتوزيع الخلايا المانحة وتعبيرها عن العلامات. يوفر هذا النهج منصة قوية وقابلة للتوسع لدراسة تكوين الخلايا الدبقية الصغيرة والتكامل في الجسم الحي عبر سياقات تجريبية متنوعة.

المقدمة

برز استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال زراعة خلايا النخاع كاستراتيجية قوية لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة وكنموذج علاجي محتمل للأمراض العصبية. على مدى السنوات القليلة الماضية، تقدم المجال إلى استراتيجيات قادرة على استبدال الخلايا الدبقية الصغيرة على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي1. أظهرت الدراسات الحديثة أن البلعم المشتقة من المتبرعين والسلف يمكنها زرع الدماغ، واعتماد برامج نسخ شبيهة بالميكروغليا، وفي بعض الحالات تحسين الأنماط الظاهرية المرتبطة بالأمراض 2,3,4,5,6,7,8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الطرق والتجارب في هذه الدراسة على الفئران. تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة يوتا، ضمان خدمة الصحة العامة #D16-00018 (A3031-01).

1. تحضير أزواج التكاثر للولادات المتبرعة والمستلمة

  1. ضع أزواج المربين في نفس القفص في المساء لبدء التزاوج المحدد.
  2. افحص الإناث كل صباح بحثا عن سدادة مهبلية للتأكد من نجاح التزاوج.
  3. أزل الإناث المسدودة من الذكور واحتضنها بشكل فردي حتى الولادة، والتي تستغرق حوالي 18-20 يوما.
  4. تعامل مع الأم الحوامل بلطف لمدة 5 دقائق يوميا لمدة 7–10 أيام قبل الولادة لتق....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تؤدي زراعة الخلايا الدماغية النقية في الولادات الجدد إلى بقاء طويل الأمد وزرع واسع النطاق لخلايا مشتقة من المتبرع داخل نسيج الدماغ المتلقي. تم عزل مجموعات الخلايا الدبقية المتبرعة المنقاة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورية باستخدام مراسلي الفلورسنت (دبقية Hoxb8 الدقيقة: tdTomato⁺ GFP⁺؛ الخلايا الدبقية غير Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) قبل الزراعة (الشكل 1A). بعد زراعة الدماغ الدماغي لحديثي الولادة، نجت الخلايا المشتقة من المتبرع على المدى الطو.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر زراعة الخلايا الدماغية الوليدية للسلف الدقيقة المنقاة أو المجموعات الفرعية المحددة للدبقية الدقيقة نهجا قويا لإعادة بناء الحجرة الدقيقة الدبقية في الجسم الحي وفحص الخصائص الخاصة بالسلالة في البلاعم الدماغية. تمكن هذه الطريقة من إعادة التكوين الانتقائية باستخدام خلايا مانحة معرفة وراثيا، مما يسمح بتقييم مباشر لزرع ونضج الخلايا المانحة داخل بيئة الدماغ.

ميزة رئيسية لهذه الاستراتيجية هي توافقها مع مصادر متبرعين متعددة وأنظمة المستلمين. في هذه الدراس.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 MH093595) (M.R.C.)، ومؤسسة عائلة داوتن، ومنشأة قياس تدفق الخلايا بجامعة يوتا. تم توليد فئران Csf1rΔFIRE بواسطة الدكتور بن شو في جامعة يوتا.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bell jarVariousN/AUsed for euthanasia
Borosilicate glass capillaries with
filament		Sutter InstrumentBF100-78-15Used for injection needles
Bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA8806Used to prepare PB buffer. Various brands are available. The one listed here is just an example.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Myeloid cells
CD45 APCBioLegend103112Hematopoietic cells
Cell strainers (70 µm)Falcon352350Used to generate single-
cell suspensions. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Chicken anti-GFP antibodyAves LabsGFP-1020Immunofluorescence
staining
c-Kit PE-Cy7 antibodyBioLegend105814Hematopoietic progenitors
Confocal microscopeLeicaTCS SP5Used for fluorescence
imaging
Conical tubes (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Tissue/cell processing. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Cryostat machineLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Generate frozen tissue
sections. Various brands are available. The one listed here is just an example.
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306Used for viability and
nuclear staining
Dissecting microscopeLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Used for trimming and preparing injection
needles. Various brands are available. The one listed here is just an example.
FACSAria Flow Cytometer SorterBD BioscienceFACSAria Cell purification
Fc block (purified CD16/32)Biolegend101302Blocks unwanted antibody binding to mouse cells expressing Fc receptors
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlUsed in cell preparation
buffers. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Flexible tubing for mouth pipetteVariousN/AComponent of manual
injection apparatus
Flow cytometry analysis softwareFlowJov10.8.1Used for FACS data
analysis
Flow cytometry cell sorterBD BiosciencesFACSAriaUsed for cell purification
gentleMACS Octo Dissociator with
heaters		Miltenyi Biotec130-096-427Used for brain tissue
dissociation
Goat anti-chicken Alexa Fluor 488
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-11039Secondary antibody
Goat anti-guinea pig Alexa Fluor
555 secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-21428Secondary antibody
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-21245Secondary antibody
Goat anti-rat Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-48265Secondary antibody
Guinea pig anti-tdTomato antibodyFrontier InstituteAB_2631185Immunofluorescence
staining
Hanks’ balanced salt solution
(HBSS)		Gibco14175-079Used during cell
preparation
HemocytometerVariousN/ACell counting
Inline filter for mouth pipetteVariousN/APrevents contamination
MicrogrinderNarishigeEG-400Used to bevel glass
injection needles
Micropipette pullerSutter InstrumentP-1000Used to generate fine
injection needles
Mouth pipette mouthpieceVariousN/AUsed for manual control of
injection
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628Used for enzymatic dissociation of brain tissue
Petri dishesThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Used for storing pulled needles or tissue harvest. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Rabbit anti-Iba1 antibodyWako019-19741Microglia marker
Rabbit anti-TMEM119 antibodyAbcam209064Microglia-specific marker
Rat anti-CD206 antibodyBioLegend141712Used to identify macrophage populations
Rat anti-P2RY12 antibodyBioLegend848002Microglia marker
Razor blades/scalpelsVariousN/AUsed to trim needle tips or
tissue harvest
RBC lysis bufferChemCruzsc-296258Used for removal of red
blood cells
Stereotaxic apparatusKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Used for surgical
implantation. Various brands are available. The one listed here is just an example.
Ter119 PerCP-Cy5.5 antibodyBioLegend116228Erythroid lineage cells
```

المراجع

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

علوم الأعصابالعدد 233العدد 233قيمة فارغةعددالخلايا الدبقية الصغيرة Hoxb8الخلايا الدبقية الصغيرة غير Hoxb8الدماغاضطراب الوسواس القهريالقلق المزمن
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.