مقالة منهجية

بروتوكول استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من أنواع متعددة من بطيئات المشية (Tardigrades)

15 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

سبتمبر 1, 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

يفصل هذا البروتوكول إجراءات عزل الـ RNA من أنواع مختلفة من بطيئات المشية (tardigrades) باستخدام طقم عزل RNA يعتمد على الأعمدة، والمصمم لعزل الـ RNA من كميات صغيرة من الأنسجة وإنتاج كميات كافية من الـ RNA عالي الجودة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الـ RNA وتخليق الـ DNA المكمل.

الملخص

تعد بطيئات المشية (Tardigrades) حيوانات مجهرية تشتهر بقدرتها الاستثنائية على تحمل الإجهاد البيئي. حيث يمكن لهذه الحيوانات البقاء على قيد الحياة في ظروف الجفاف، والضغط الشديد، ودرجات الحرارة المنخفضة، والمستويات العالية من الإشعاع المؤين. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه القدرات على تحمل الظروف القاسية غير مفهومة بشكل كامل. تتطلب النهج الجزيئية المستخدمة لاستقصاء هذه الآليات، والتي تشمل تسلسل RNA، وتداخل RNA (RNAi)، والتعبير غير المتجانس لجينات بطيئات المشية في أنظمة مثل البكتيريا، عزل حمض ريبوزي نووي مرسال (mRNA) عالي الجودة من مواد بيولوجية محدودة. في هذه الدراسة، نصف بروتوكولاً قابلاً للتكرار لعزل RNA الكلي من بطيئات المشية يتسم بما يلي: (1) الفعالية عبر أنواع متعددة، بما في ذلك نوع من بطيئات المشية غير المتجانسة (heterotardigrade)، و(2) يتطلب فقط من 25 إلى 200 حيوان، اعتماداً على حجم الجسم، و(3) ينتج RNA بكمية وجودة كافيتين للتطبيقات اللاحقة. يتيح البروتوكول الحالي بنجاح استرداد RNA بكفاءة من أعداد معقولة من بطيئات المشية ويدعم الاستقصاءات الجزيئية لتحمل الإجهاد عبر أنواع مختلفة من بطيئات المشية.

المقدمة

تُعرف بطيئات المياه (Tardigrades) بقدرتها العالية على البقاء في ظروف الإجهاد الشديد التي لا تستطيع الحيوانات الأخرى تحملها، بما في ذلك الجفاف، والضغوط القصوى، ودرجات الحرارة المرتفعة والمنخفضة للغاية، والعوامل المسببة لتلف الحمض النووي (DNA) مثل الأدوية الكيميائية والعلاج الإشعاعي المؤين1,2,3,4,5,6,7,8. وفي السنوات الأخيرة، بحث العلماء في الآليات التي تكمن وراء هذه المرونة الفائقة لبطيئات المياه باستخدام مناهج جزيئية مثل تسلسل الـ RNA، وتداخل الـ RNA (RNAi)، والتعبير غير المتجانس لجينات بطيئات المياه في أنظمة أخرى، بما في ذلك الخلايا البشرية والبكتيريا8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. وقد شكلت هذه المناهج، عند تطبيقها، أداة قوية منحتنا رؤية دقيقة حول كيفية تمكن بطيئات المياه من مقاومة هذا الإجهاد الشديد8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. ومع ذلك، فإن جميع هذه المناهج الجزيئية لفهم تحمل الإجهاد لدى بطيئات المياه تعتمد على القدرة على عزل الـ RNA من هذه الحيوانات متناهية الصغر بكميات كافية وبجودة مناسبة لاستخدامها في العمليات اللاحقة.

أثبتت طريقة سابقة لعزل الـ RNA من بطيئات المشية نجاحها للباحثين الذين يعملون على Hypsibius exemplaris23. ومع ذلك، عند محاولة تكرار هذا البروتوكول في H. exemplaris، وجدنا أنه غير موثوق من حيث تركيز الـ RNA الناتج وجودته (بيانات غير منشورة). وقد تبين أن طريقة بديلة لعزل الـ RNA تعتمد على الفينول فعالة مع H. exemplaris وRamazzottius varieornatus ونوع من بطيئات المشية غير المتجانسة13,21,22,24,25,26. وقد ثبت أن هذا البروتوكول يوفر RNA بجودة وكمية كافيتين للعمليات اللاحقة، سواء من حيوانات مفردة أو من مجموعات من الحيوانات (~50). ومع ذلك، يتطلب هذا البروتوكول من المستخدم التعامل مع كواشف تحتوي على الفينول. والفينول مادة كيميائية خطرة تتطلب تعاملاً حذراً، وقد يؤدي التنفيذ غير الصحيح لهذا البروتوكول إلى انتقال بقايا الفينول، مما يؤثر على نقاء الـ RNA والتطبيقات اللاحقة. ويركز بروتوكول آخر نُشر سابقاً لعزل الـ RNA من بطيئات المشية على القدرة على عزل الـ RNA من حيوانات مفردة27. ورغم أن هذا البروتوكول قيم لتطبيقات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)27، إلا أنه أقل ملاءمة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الـ RNA، حيث يكون الهدف هو الحصول على رؤية أكثر شمولية لكيفية استجابة الحيوانات لمجهد أو حالة معينة.

أدت هذه المحدوديات في بروتوكولات عزل الحمض الريبي النووي (RNA) المتاحة إلى البحث عن طرق بديلة لعزل الـ RNA من بطيئات المشية (tardigrades). إن مجموعة أدوات عزل الـ RNA القائمة على الأعمدة المستخدمة في هذا البروتوكول مُسوقة لعزل الـ RNA من كميات صغيرة من الأنسجة. كما استُخدمت هذه المجموعة سابقاً لعزل الـ RNA من أنسجة الحشرات لإجراء تحليلات تسلسل الـ RNA اللاحقة، مما يشير إلى أنها قد تكون مناسبة لعمليات العزل من حيوانات صغيرة أخرى ذات كيوتيكل مثل بطيئات المشية.28توضح هذه الدراسة البروتوكول التفصيلي لاستخدام طقم عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) القائم على الأعمدة مع بطيئات المشية، بما في ذلك شروحات حول تحذيرات محددة يجب مراعاتها عند تنفيذ هذا البروتوكول مع بطيئات المشية. ويشير هذا المقال إلى نجاح هذا البروتوكول في ستة أنواع من بطيئات المشية (H. exemplaris, .Milnesium sp, Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti، والبطيئات متباينة المخالب Viridiscus celatus). أثبتت الدراسة أنه يمكن الحصول على حمض نووي ريبوزي (RNA) بجودة وكمية كافيتين من عدد قليل من الحيوانات يصل إلى 25 حيواناً. كما تم تقديم أمثلة على البيانات الناتجة لتركيز وجودة الـ RNA، والتي تُعد مناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الـ RNA (مع حد أدنى من الانحياز، وتضخيم مكتبة أسي) وتخليق الحمض النووي المتمم (cDNA). وقد أثبت بروتوكول عزل الـ RNA هذا فائدته بالفعل في الكشف عن آليات تحمل الإشعاع في H. exemplaris8يشير نجاح هذا البروتوكول عبر أنواع مختلفة من بطيئات المشية إلى إمكانية تطبيقه على نطاق أوسع لاستقصاء آليات تحمل الإجهاد، والآليات التنموية، والعمليات التطورية.

البروتوكول

لا يتطلب البروتوكول التالي موافقة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية، حيث تُعفى الحيوانات اللافقارية من هذا المتطلب. والكيماويات والمعدات المستخدمة مدرجة في الـ جدول المواد.

1. تحضير المعدات والمنطقة لعزل الـ RNA

  1. قم بتشغيل كتلة التسخين أو الحمام المائي وضبط درجة الحرارة على 42 °C استعداداً لاستخلاص الـ RNA.
  2. جهز حامل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، والمصّاصات (2 µL، و20 µL، و200 µL، و1000 µL)، ورؤوس مصاصات مرشحة ذات أحجام مناسبة.
  3. نظف سطح العمل، وحامل الأنابيب، والمصّاصات، وصناديق الرؤوس باستخدام RNase Away، أو محلول مبيض مخفف (10%)، أو إيثانول بتركيز 70% لتعطيل أي إنزيم RNase متبقٍ.
    ملاحظة: قد يؤدي وجود كميات زائدة من RNase على المعدات أو في المنطقة التي يتم فيها عزل الـ RNA إلى عدم كفاية جودة الـ RNA بعد العزل بسبب التحلل. قلل من هذا الخطر من خلال إعطاء وقت كافٍ للمواد الكيميائية المعطلة لـ RNase لتعمل، وترك المنطقة والمعدات تجف تماماً قبل المتابعة.
  4. ارتدِ القفازات في جميع خطوات هذا البروتوكول، وقم بمعالجة القفازات بشكل متكرر بمحلول معطل لـ RNase طوال فترة العمل لمنع تحلل الـ RNA بفعل إنزيم RNase.

2. جمع الحيوانات لعزل RNA

  1. باستخدام بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب شفاط مزودة بشعيرة زجاجية (الشكل 1A)، أو حلقة إيروين (Irwin loop)، أو ماصة دقيقة، انقل من 25 إلى 200 حيوان (حسب حجم النوع) من أطباق الزرع الخاصة بها إلى طبق يحتوي على مياه ينابيع نظيفة لتقليل كمية المواد غير التابعة لبطيئات المشية (الطحالب أو مصادر غذاء أخرى مثل النيماتودا أو الدوارات، حسب النوع).
  2. أحضر أنبوباً سعة 1.5 mL خالياً من الـ RNase ومدقاً.
  3. باستخدام بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب شفاط مزودة بشعيرة زجاجية أو حلقة إيروين، انقل الحيوانات إلى قاع الأنبوب الخالي من الـ RNase سعة 1.5 mL، مع الحرص الشديد على نقل أقل كمية ممكنة من الماء مع الحيوانات.
  4. قم بالطرد المركزي عند 4,500 g لمدة 3 min لترسيب بطيئات المشية في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  5. أثناء مراقبة الأنبوب الذي يحتوي على الراسب من بطيئات المشية تحت مجهر تشريحي، استخدم ماصة سعة 20 µL أو بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب شفاط مزودة بشعيرة زجاجية ذات فتحة أصغر من حجم بطيئات المشية التي تعزل منها الـ RNA، لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء بعناية دون تحريك راسب بطيئات المشية. انظر الشكل 1B لرؤية تمثيل للكمية المقبولة من الماء المتبقي.
    ملاحظة: كن حذراً بترك طبقة رقيقة من الماء هنا حتى لا تجف الحيوانات في الوقت القصير بين إزالة الماء وإضافة محلول الاستخلاص (XB). إذا جفت الحيوانات، فقد يؤدي ذلك إلى رداءة جودة الـ RNA بعد العزل.
  6. أضف 100 µL من محلول الاستخلاص (XB) إلى الأنبوب الذي يحتوي على بطيئات المشية.

3. التفكيك الميكانيكي لبطيئات المشية واستخلاص الـ RNA

  1. باستخدام مدقة خالية من الـ RNase، قم بتفتيت بطيئات المشية عن طريق طحن المدقة برفق ولكن بحزم في قاع الأنبوب لمدة ~30 s. يجب أن تكون 20–30 حركة طحن إجمالاً كافية لتفتيت بطيئات المشية.
  2. أخرج المدقة من الأنبوب، مع توخي الحذر لضمان بقاء أكبر قدر ممكن من السائل في قاع الأنبوب.
  3. افحص محتويات أنبوب الطرد المركزي الدقيق (microfuge tube) تحت مجهر التشريح للتأكد من عدم وجود حيوانات سليمة مرئية متبقية.
  4. قم بتحضين الخليط عند 42 °C لمدة 30 min على وحدة تسخين هزازة مع رج خفيف (300 rpm).
    ملاحظة: يعمل محلول الاستخلاص المنظم (XB) على تثبيت الـ RNA لمنع تحلله عند درجة الحرارة هذه.

4. تهيئة عمود عزل الـ RNA

  1. خلال الدقائق العشر الأخيرة من فترة تحضين الاستخلاص، قم بتجميع العمود الخاص بجمع وتنقية الـ RNA. ضع عمود تنقية في أنبوب تجميع وقم بتمييز العمود بشكل مناسب.
  2. أضف 250 µL من محلول التكييف (Conditioning Buffer (CB)) مباشرة إلى العمود.
  3. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min.
  4. قم بالطرد المركزي عند 16,000 × g لمدة 1 min وتخلص من السائل المار. أصبح العمود الآن جاهزاً لاستقبال الطافي الذي يحتوي على الـ RNA من الخطوة التالية.
  5. أخرج محلول التفاعل 10x DNase I Reaction Buffer والماء الخالي من النوكلييز (Nuclease-Free Water) من المجمد ليذوبا تماماً في الوقت المناسب للخطوة 6 أدناه.

5. ربط الحمض النووي الريبوزي (RNA) بالعمود

  1. بعد فترة تحضين الاستخلاص، قم بطرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على بطيئات المشية الممزقة ميكانيكياً ومحلول الاستخلاص (XB) بسرعة 3,000 × g لمدة 2 min.
  2. أحضر أنبوباً جديداً خالياً من RNase وقم بتمييزه وفقاً لذلك.
  3. باستخدام ماصة سعة 200 µL ذات رأس مرشح، قم بإزالة السائل الطافي بعناية من فوق الرواسب المكونة من جلود بطيئات المشية. كن حريصاً على عدم تعكير رواسب الجلد وإزالة السائل الطافي فقط.
    ملاحظة: سيؤدي نقل الجلد إلى الخطوات اللاحقة إلى انخفاض كفاءة عائد RNA من العمود بسبب الانسداد الميكانيكي للعمود. لتجنب هذا الخطأ المحتمل، يمكنك فحص رأس الماصة الذي يحتوي على السائل الطافي تحت المجهر للتأكد من خلوه من الجلد. في حالة وجود أي من الجلد، أعد السائل الطافي إلى الأنبوب وكرر خطوة الطرد المركزي.
  4. انقل السائل الطافي إلى الأنبوب الخالي من RNase والمميز حديثاً.
  5. أضف 100 µL من الإيثانول بتركيز 70% إلى الأنبوب الذي يحتوي على RNA واخلطه جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة عدة مرات. في هذه الخطوة، يجب أن تظهر خيوط لزجة شفافة عند إضافة الإيثانول؛ وهذه علامة جيدة على وجود RNA في السائل الطافي.
  6. انقل الخليط بالكامل (200 µL) إلى العمود الذي تم تحضيره في الخطوة 4.
    ملاحظة: عند إضافة أي محاليل إلى العمود في هذه الخطوة والخطوات اللاحقة، احرص على توزيع السائل في وسط العمود وتجنب ملامسة العمود ميكانيكياً برأس الماصة. سيؤدي الثقب الميكانيكي للعمود إلى حدوث مشكلات لاحقة في جودة وكمية RNA.
  7. لربط RNA بالعمود، قم بالطرد المركزي لمدة 2 min بسرعة 100 × g، يليه طرد مركزي بسرعة 16,000 × g لمدة 30 s لإزالة السائل المار.

6. تحضير محلول DNase I

  1. اترك منظم تفاعل DNase I بتركيز 10x والماء الخالي من النوكلياز ليذوبا تماماً قبل تحضير المحلول.
  2. لكل عملية عزل لـ RNA، قم بتحضير محلول بحجم 40 µL في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL، يتكون من 32 µL من الماء الخالي من النوكلياز، و 4 µL من منظم تفاعل DNase I بتركيز 10x، و 4 µL من إنزيم DNase I. احفظ المحلول على الثلج حتى يحين وقت استخدامه في العمود في الخطوة 7.3.

7. غسل الحمض النووي الريبي (RNA) والمعالجة بإنزيم DNase I

  1. أضف 100 µL من محلول الغسيل 1 (W1) بواسطة الماصة مباشرة على عمود التنقية الذي يحتوي على الـ RNA المرتبط (من الخطوة 5.7).
  2. قم بالطرد المركزي لمدة 1 min بسرعة 8,000 × g وتخلص من السائل المار.
  3. أضف 40 µL من محلول DNase I المحضر في الخطوة 6 بواسطة الماصة مباشرة على عمود التنقية، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min لإزالة التلوث بالـ DNA.
  4. أضف 40 µL من محلول الغسيل 1 (W1) بواسطة الماصة على عمود التنقية، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 × g لمدة 30 s.
  5. أضف 100 µL من محلول الغسيل 2 (W2) بواسطة الماصة على عمود التنقية، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 × g لمدة 1 min.
  6. أضف 100 µL أخرى من محلول الغسيل 2 (W2) بواسطة الماصة على عمود التنقية، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 16,000 × g لمدة 2 min، وتخلص من السائل المار.
  7. قم بالطرد المركزي للعمود بسرعة 16,000 × g لمدة 1 min لتجفيف العمود.

8. استخلاص الـ RNA

  1. أحضر أنبوباً سعة 0.5 mL (مرفق في الطقم) لكل عملية عزل RNA وقم بتسميته بشكل مناسب. سيكون هذا هو الأنبوب الذي يحتوي على RNA بعد عملية العزل.
  2. انقل العمود الذي يحتوي على RNA المرتبط والمغسول إلى أنبوب 0.5 mL المسمى. يجب أن يستقر العمود في هذا الأنبوب بإحكام (سماع صوت نقرة).
  3. أثناء النظر إلى الأنبوب من الجانب، ضع طرف الماصة مباشرة فوق غشاء العمود، ثم أضف 11 µL من محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) على العمود، واتركه لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: سيؤدي عدم توزيع محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) مباشرة على العمود إلى انخفاض إنتاجية RNA. إذا لوحظ وجود قطرات من السائل حول محيط العمود، فهذا يشير إلى عدم توزيع محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) بشكل صحيح على العمود. في هذه الحالة، يوصى بتكرار هذه الخطوة باستخدام السائل المار من الخطوة 8.5، مع التأكد من إفراغ محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) مباشرة في مركز العمود.
  4. ضع أنبوب 0.5 mL الذي يحتوي على العمود في أنبوب التجميع المرفق مع الطقم لضمان التثبيت الصحيح أثناء الطرد المركزي (الشكل 2).
  5. قم بطرد العمود مركزياً عند 1,000 × g لمدة 1 min لتوزيع محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB)، ثم قم بالتدوير عند 16,000 × g لمدة 1 min لاستخلاص RNA.
  6. ضع أنبوب 0.5 mL الذي يحتوي على RNA على الثلج فوراً.

9. التحقق من كمية وجودة الـ RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الدقيق

ملاحظة: يمكن استخدام طرق أخرى لتقييم كمية وجودة الـ RNA. هنا، يتم استخدام طريقة تعتمد على مقياس الطيف الضوئي للميكرو-حجم. كما يمكن أيضاً استخدام مقياس الفلورية أو أداة الفصل الكهربائي للهلام الموائع الدقيقة29.

  1. امسح قاعدة مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية للمجاهر (microvolume spectrophotometer) بمسحة خالية من الوبر لضمان خلوها من أي سوائل أخرى.
  2. حدد الـ الحمض النووي الريبوزي إعدادات جهاز المطياف الضوئي للتحليل.
  3. قم بتصفير جهاز المطياف الضوئي باستخدام 1 µL من محلول الاستخلاص (EB) المستخدم في الخطوة 8.3.
  4. بعد عملية التفريغ، امسح محلول الاستخلاص (EB) عن القاعدة باستخدام منديل خالٍ من الوبر.
  5. مع الحفاظ على الأنبوب سعة 0.5 مل الذي يحتوي على الـ RNA في الثلج، يتم سحب... 1 µL من الحمض النووي الريبوزي (RNA) على قاعدة جهاز المطياف الضوئي. اخفض ذراع جهاز المطياف الضوئي لقياس امتصاصية العينة من أجل تقدير كمية الحمض النووي الريبوزي المعزول وتقييم جودته.
    ملاحظة: يرجى مراجعة قسم "النتائج" أدناه للحصول على تفاصيل حول الجودة والكمية المقبولتين للتطبيقات اللاحقة.

النتائج

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول، كما ذكر أعلاه، في إزالة كمية مناسبة من الماء من بطيئات المشية (tardigrades) التي تم جمعها قبل إضافة محلول الاستخلاص (XB) لاستخلاص الـ RNA. إذ سيؤدي ترك كمية كبيرة من الماء إلى تخفيف محلول الاستخلاص (XB) والحصول على استخلاص RNA دون المستوى المطلوب (أي RIN < 7، ونسبة 260/280 < 1.8، ونسبة 260/230 < 1.8، و/أو تركيز < 5 ng/µL) من الحيوانات، مما يؤدي إلى انخفاض تركيز الـ RNA وجودته بعد عملية الشطف. وفي المقابل، فإن إزالة كمية كبيرة جداً من الماء ستؤدي إلى تجفيف الحيوانات بسرعة، مما قد يؤدي إلى نفوقها وانخفاض جودة الـ RNA بسبب زيادة نشاط إنزيم RNase بعد الموت. وللمساعدة في إتمام هذا البروتوكول بنجاح، تم توفير تمثيل بصري يوضح كمية الماء المناسبة التي يجب تركها في الأنبوب مع بطيئات المشية قبل إضافة محلول الاستخلاص (XB) (الشكل 1B).

حتى الآن، تم تطبيق هذا البروتوكول على ستة أنواع مختلفة من بطيئات المشية، بما في ذلك نوع من بطيئات المشية غير المتجانسة (V. celatus). وقد أسفرت عمليات العزل هذه عن تركيزات من RNA تتراوح بين 11 ng/µL و 106.6 ng/µL (تم تأكيدها بواسطة مقياس الطيف الضوئي ميكروي الحجم، الجدول 1) ومن 9 ng/µL إلى 113 ng/µL (تم تأكيدها عبر الرحلان الكهربائي للهلام ميكروي الموائع، الجدول 2). يختلف عدد الحيوانات المطلوبة لعزل RNA اعتماداً على حجم النوع الذي يتم العزل منه؛ حيث تعطي بطيئات المشية الأكبر حجماً، مثل أنواع Paramacrobiotus و Milnesium sp.، تركيزات وافرة من RNA من عدد قليل يصل إلى 25 حيواناً (الجدول 1). أما بالنسبة للأنواع الأصغر، مثل H. exemplaris و V. celatus، فإن عمليات العزل تكون أكثر نجاحاً عند استخدام 100 حيوان أو أكثر (الجدول 1). تميزت غالبية عمليات العزل بنسبة 260/280 تقارب 2، مما يشير إلى RNA نقي30. وبشكل عرضي، أسفرت عمليات العزل من بعض الأنواع (V. celatus و H. exemplaris، وأنواع Paramacrobiotus) عن نسبة 260/230 منخفضة، مما يشير إلى تلوث من الكواشف30. حدث هذا غالباً عند استخدام عدد أقل من الحيوانات (100 لـ V. celatus و H. exemplaris، و 25 لأنواع Paramacrobiotus)، مما يشير إلى أن استخدام عدد قليل جداً من الحيوانات قد يزيد من خطر تلوث الكواشف في RNA المستخلص النهائي. ومن خلال تقييم جودة RNA عبر الرحلان الكهربائي للهلام ميكروي الموائع، يمكن حساب رقم سلامة RNA (RIN). وتشير قيمة RIN بين 9-10 إلى RNA عالي الجودة مع تحلل طفيف31، ويُنصح عموماً بعدم المضي قدماً في العمليات اللاحقة مثل تسلسل RNA إذا كانت قيمة RIN أقل من 7. تم تقديم بعض النتائج النموذجية للرحلان الكهربائي للهلام ميكروي الموائع (الشكل 3) لعينات ذات قيم RIN عالية وأخرى منخفضة/غير قابلة للكشف. تم استبعاد بعض هذه العينات من التحليل الإضافي (الجدول 2، الشكل 3A,D). ومع ذلك، تم اختيار بعض العينات ذات قيم RIN المنخفضة/غير القابلة للكشف للمضي قدماً في تحضير المكتبة لتسلسل RNA، والتي لا تزال تعطي نتائج تسلسل RNA ذات جودة عالية (الجدول 2، الشكل 3B,F، بيانات غير منشورة، راجع "المناقشة" لمزيد من المعلومات).

figure-results-1
الشكل 1: إعداد عزل الـ RNA. صور توضح بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب الشفط والمزودة بشعيرة زجاجية لتحريك الحيوانات وإزالة الماء (A) وتمثيلاً لكمية المياه المقبولة المتبقية قبل إضافة محلول الاستخلاص (XB) إلى بطيئات الماء من نوع Paramacrobiotus (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: إعداد أنبوب الشطف لعملية الشطف النهائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: نتائج نموذجية للفصل الكهربائي للهلام في الموائع الدقيقة لـ H. exemplaris و P. gadabouti. (A) هلام RNA من H. exemplaris تعرض للإشعاع المؤين. (B) هلام RNA من P. gadabouti و H. exemplaris تحت ظروف ضابطة. (C–F) ملفات تعريف الذروة النموذجية من عينة RNA عالية الجودة لـ H. exemplaris (C)، ومن عينة H. exemplaris ذات جودة مشكوك فيها (D)، ومن عينة P. gadabouti ذات جودة جيدة (E)، ومن عينة H. exemplaris تظهر تحللاً واضحاً (ذروة عند 147 bp) (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تركيزات RNA التمثيلية ومعلومات الجودة من أنواع مختلفة من بطيئات المشية التي جُمعت باستخدام مقياس الطيف الضوئي ميكروي الحجم. *التركيزات التي تقل عن 20 ng/µL، كما تم رصدها بمقياس الطيف الضوئي ميكروي الحجم، قد تؤدي إلى نسب امتصاص غير دقيقة. **نسبة 260/230 منخفضة ناتجة عن سرعة طرد مركزي غير صحيحة في الخطوة 5.7. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: تركيزات RNA التمثيلية ومعلومات الجودة لنوعين من بطيئات المشية تم جمعها باستخدام نظام الفصل الكهربائي للهلام الموائع الدقيقة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

الهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل عزل الـ RNA من بطيئات المشية بكمية وجودة كافيتين لتكون قابلة للتطبيق في التطبيقات اللاحقة التي تسهل استقصاءات تحمل الإجهاد لدى بطيئات المشية. وقد حدد البروتوكول المعروض هنا المجالات التي قد يواجه فيها المستخدمون مشكلات، بما في ذلك إزالة كمية كافية من الماء قبل إضافة محلول الاستخلاص (XB) (الخطوة 2.5)، وتفتيت أجسام بطيئات المشية (الخطوات 3.1–3.3)، ونقل الطافي إلى العمود للتنقية (الخطوة 5.3)، واستخلاص الـ RNA (الخطوة 8.3). قد تؤدي الأخطاء في أي من هذه الخطوات إلى انخفاض تركيز الـ RNA الناتج أو جودته. إذا كان تركيز الـ RNA الناتج أقل من 5 ng/µL (كما يتم التحقق منه بواسطة مقياس الطيف الضوئي ميكروي الحجم)، فقد يرغب المستخدم في التفكير في إعادة عزل الـ RNA باستخدام (1) عدد أكبر من الحيوانات الأولية (>100 للأنواع الصغيرة أو >50 للأنواع الأكبر)، أو (2) تكرار البروتوكول مع إيلاء اهتمام خاص لخطوات إزالة الماء، وتفتيت بطيئات المشية، والاستخلاص.

يقدم هذا المقال أمثلة على تقييمات جودة الحمض الريبي النووي (مؤشر تكامل الحمض الريبي النووي RIN، ونسبة 260/280، ونسبة 260/230) التي اعتبرت مناسبة أو غير مناسبة لتسلسل الحمض الريبي النووي (الجدول 1, جدول 2, الشكل 3). وفي بعض الأحيان، تكون قيم (<1.0) تلاحظ نسب 260/230 في بعض عمليات عزل الحمض الريبي النووي (RNA) باستخدام هذا البروتوكول (الجدول 1)، مما يشير إلى وجود مركبات عضوية متبقية. وعادة ما كان هذا يرتبط بانخفاض أعداد الحيوانات. وإذا لم يكن خيار زيادة عدد الحيوانات متاحاً، أو إذا واجه المستخدمون باستمرار انخفاضاً في نسبة 260/230، فيوصى بإضافة خطوة غسيل إضافية باستخدام محلول الغسيل 2 (W2) (تكرار الخطوة 7.6) و/أو تمديد وقت الطرد المركزي للجفاف في الخطوة 7.7 لضمان إزالة هذه الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن العينة الممثلة الواحدة H. exemplaris عزل بنسبة 260/230 منخفضة (جدول 1أُجريت هذه العملية بواسطة مستخدم للبروتوكول من طلاب المرحلة الجامعية لأول مرة، والذي أدرك لاحقاً أن الخطوة 5.7 (الطرد المركزي لإزالة الإيثانول بعد ربط الحمض النووي الريبوزي RNA بالعمود) قد تم تنفيذها بسرعة طرد مركزي غير صحيحة (بطيئة جداً). ومن المرجح أن ذلك أدى إلى بقاء الإيثانول في العمود وانتقاله عبر مراحل البروتوكول، مما نتج عنه انخفاض نسبة 260/230. وقد أسفرت عمليات العزل اللاحقة التي قام بها هذا المستخدم عن قيم 260/230 ضمن نطاق معقول (لا تقل عن 1.5). لذا، يجب على جميع المستخدمين، وخاصة مستخدمي البروتوكول للمرة الأولى، إيلاء اهتمام وثيق لسرعات الطرد المركزي عند تطبيق البروتوكول لتجنب هذه المشكلات المحتملة. وبالرغم من انخفاض نسب 260/230 أحياناً أو انخفاض رقم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RIN) في H. exemplarisويمكن الاستمرار في استخدام الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يظهر قراءات جودة مماثلة في عمليات تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة لفحص التعبير الجيني التفاضلي بعد التعرض للإشعاع المؤين أو عوامل الإجهاد الأخرى8 (الجدول 1, الجدول 2، وبيانات غير منشورة). وبالمثل، فإن الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعزول من *P. gadabouti* أدى هذا البروتوكول إلى الحصول على تركيز وجودة عاليتين للحمض النووي الريبي (RNA) (كما تم التحقق منه بواسطة رقم سلامة الحمض النووي الريبي RIN، جدول 2, الشكل 3) وأدى ذلك إلى الحصول على بيانات ذات دلالة من تسلسل الحمض النووي الريبي (بيانات غير منشورة). ومن الناحية التجريبية، استخدمت هذه الدراسة بنجاح حمضاً نووياً ريبياً من H. exemplaris بتركيزات منخفضة (5-9 نانوغرام/µLلتحضير الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA) لضمان نجاح عملية الاستنساخ اللاحقة لـ *H. exemplaris* الجينات8عندما يتم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من H. exemplaris أدى ذلك إلى انخفاض التركيز أو عدم القدرة على اكتشافه، وكذلك انخفاض قيمة رقم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RIN) (الذي تم قياسه باستخدام الفصل الكهربائي للهلام المائع الدقيق)، لذا أُعيد عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) لهذه المعالجة قبل المضي قدماً في تحضير المكتبة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing)الجدول ٢, الشكل 3أ، د). إن قرار إعادة عزل الـ RNA لهذه العينة (الشكل 3أ،د)، بدلاً من المضي قدماً في عملية التسلسل كما تم القيام به مع عينات أخرى من H. exemplaris مع رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) غير القابل للكشف (الشكل 3B,ف)، اتُّخذ هذا القرار بناءً على عدم ظهور حزم واضحة على هلام الموائع الدقيقة، وهو ما قد يشير إلى خطأ في التحميل، أو تحلل الحمض النووي الريبوزي (RNA)، أو عدم كفاية تركيزه. وفي المقابل، عندما تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من H. exemplaris كان تركيزه منخفضاً نسبياً، وقيمة RIN غير قابلة للكشف، مع وجود أدلة على حدوث بعض التحلل في الحمض النووي الريبوزي (RNA)، كما يشير ارتفاع مستويات الـ RNA صغير الحجم، ومع ذلك فقد أعطى بيانات تسلسل RNA قابلة للاستخدام بعد تحضير المكتبة (بيانات غير منشورة، الجدول ٢, الشكل 3B,فوبناءً على ذلك، ورغم توفير بعض الإرشادات هنا لتحديد ما إذا كانت عينات الـ RNA مناسبة للتطبيقات اللاحقة، يجب على المستخدم استخدام تقديره الخاص ومراعاة تطبيقه اللاحق المحدد عند تقييم ما إذا كانت جودة الـ RNA وكميته كافيتين للمضي قدماً.

يجب على العلماء الذين يرغبون في عزل RNA من بطيئات المشية (tardigrades) مراعاة جوانب متعددة عند تحديد البروتوكول الأكثر ملاءمة لغرضهم. لقد قدمت جميع طرق عزل RNA المبلغ عنها سابقاً (بما في ذلك الطريقة المذكورة هنا) RNA بكمية وجودة كافيتين لدعم التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل RNA، وتخليق cDNA، وqPCR8,12,13,17,21,22,25,27. غالباً ما تكون التكلفة محل اعتبار، خاصة بالنسبة لمختبرات الأبحاث ذات الميزانيات الصغيرة أو المختبرات التعليمية. إن البروتوكول المذكور هنا أكثر تكلفة من البروتوكولات المبلغ عنها سابقاً لكل تفاعل عزل. ومع ذلك، فإننا نرى أن هذه الزيادة في التكلفة تأتي مع مزايا مقارنة بالبروتوكولات السابقة. فبالمقارنة مع بروتوكولات عزل RNA الأخرى القائمة على الأعمدة23، يمكن لبروتوكول عزل RNA المذكور هنا إنتاج RNA وفير وبجودة كافية من كمية أقل من المواد المدخلة (عدد أقل من الحيوانات). بالإضافة إلى ذلك، وكما ذكر في المقدمة، فإن بروتوكول عزل RNA القائم على الأعمدة والمبلغ عنه سابقاً عمل بشكل غير متسق في تجاربنا، مما أدى غالباً إلى الحصول على كميات ضئيلة جداً من RNA لا تكفي للعمليات اللاحقة (بيانات غير منشورة). كما أن البروتوكول المذكور هنا أكثر أماناً بشكل ملحوظ مقارنة بنهج عزل RNA القائم على الفينول، لأنه لا يتطلب من المستخدمين التعامل مع مواد كيميائية خطرة تستلزم وجود خزانة استنشاق (fume hood). علاوة على ذلك، فإن إحدى المشكلات الشائعة التي تواجه المستخدمين في بروتوكولات استخلاص RNA القائمة على الفينول هي انتقال بقايا الفينول (phenol carryover)، مما يؤثر على نقاء RNA ويمكن أن يعيق التطبيقات اللاحقة. هذه المشكلات تجعل استخلاص RNA القائم على الفينول أقل سهولة لطلاب المرحلة الجامعية (سواء في مختبرات الأبحاث أو الفصول الدراسية). ومع ذلك، تظل الطريقة القائمة على الفينول هي الأكثر فعالية من حيث التكلفة. إن البروتوكول المذكور هنا غير مناسب لعزل RNA من حيوان واحد لتقييم الاستجابات الترانسكريبتومية للحيوان الواحد (كما نُشر في Kirk et al.)، ولكنه بدلاً من ذلك ذو قيمة لفحص التغيرات المشتركة عبر الأفراد استجابةً لمؤثر إجهادي، مما يوفر رؤية أكثر شمولية لاستجابات الإجهاد. لذلك، يجب على المستخدمين موازنة أهمية التكلفة، وتوفر الحيوانات، وسهولة وصول المستخدم إلى البروتوكولات الحالية لتحديد البروتوكول الذي يناسب احتياجاتهم بشكل أفضل.

أثبت هذا التقرير أن هذا البروتوكول ينتج حمض RNA بكمية وجودة كافيتين من ستة أنواع مختلفة من بطيئات المشية، بما في ذلك نوع ممثل من رتبة Heterotardigrada. بالإضافة إلى ذلك، توفر طريقة عزل RNA هذه كمية كافية من RNA من عدد معقول من الحيوانات (25–200، اعتماداً على حجم النوع). إن التحقق من صحة بروتوكول عزل RNA هذا في أنواع متعددة يفتح الباب لفهم جوانب رائعة من بيولوجيا بطيئات المشية. ولا يقتصر هذا على دراسة تحمل الإجهاد فحسب، بل يمتد ليشمل فهم تطور هذه الحيوانات، بما في ذلك تطور آليات المقاومة وتطورها. ويعد هذا البروتوكول مفيداً بشكل خاص لأنواع بطيئات المشية غير النموذجية والتي يتم جمعها من الميدان حيث تكون الكتلة الحيوية محدودة، وتفتقر إلى طرق عزل RNA معيارية. وأخيراً، فإن هذا البروتوكول متاح للباحثين ويمكن تنفيذه بشكل قابل للتكرار من قبل باحثين في مرحلة البكالوريوس، مما يجعله رصيداً قيماً في مختبرات التدريس أو الأبحاث في المؤسسات التي تركز أساساً على مرحلة البكالوريوس.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال صناديق تأسيسية من جامعة UNC Asheville (لـ CCH) ومنحة NSF رقم 2225683 المقدمة إلى Jason Pienaar (المشرف على مرحلة ما بعد الدكتوراه لـ PK). ونتوجه بالشكر إلى مرفق تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية في UNC على المساعدة التقنية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 mLUSA Scientific1615-5500أنبوب طرد مركزي دقيق مدرج Seal-Rite بسعة 1.5 mL، طبيعي، بولي بروبيلين، 500/كيس
إيثانول 70%VWR71001-654لتنظيف الطاولات/المعدات
Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204طقم يحتوي على المكونات الخاصة ببروتوكول العزل الموصوف في هذه المخطوطة
جهاز طرد مركزيEppendorf5405000441جهاز Centrifuge 5425، بمقابض دوارة، غير مبرد، مع Rotor FA-24x2، بجهد 120 V/50-60 Hz (US)
مياه ينابيع Deer ParkAny Grocery StoreN/Aهذا هو الوسط لزراعة بطيئات المشية (tardigrades) ويُستخدم لشطفها قبل عزل RNA
مجهر تشريحZeissN/Aجهاز Zeiss Stemi 305، بنسبة تكبير 5:1 وتكبير إجمالي 8x-40x، مع وحدة إضاءة نافذة M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I، خالٍ من RNase (بتركيز 1 U/uL)
رؤوس ماصات مفلترة 10 uLVWR76322-528أي رأس ماصة مفلتر مناسب
رؤوس ماصات مفلترة 1000 uLVWR76322-154أي رأس ماصة مفلتر مناسب
رؤوس ماصات مفلترة 20 uLVWR76322-134أي رأس ماصة مفلتر مناسب
رؤوس ماصات مفلترة 200 uLVWR76322-150أي رأس ماصة مفلتر مناسب
أنابيب شعرية زجاجيةFisher50-821-811World Precision Instrument Standard Glass Capillaries - 1B120-6 (بطول 6 بوصة، وقطر خارجي OD 1.2 mm، بدون فتيلة). يتم سحب هذه الأنابيب فوق لهب لتشكيل أنبوبين شعريين زجاجيين بنهايات ضيقة، ثم تُكسر للوصول إلى القطر المناسب لاستخدام الماصة الفموية لنقل أنواع بطيئات المشية المختارة.
كتلة تسخينEppendorf5382000023جهاز Eppendorf ThermoMixer C، جهاز أساسي بدون كتلة حرارية، بجهد 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/South America/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581سلم لتحليل RNA الكلي عالي الحساسية على أنظمة TapeStation
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579للتحليل عالي الحساسية لـ RNA الكلي على أنظمة TapeStation
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580منظم لتحليل RNA الكلي عالي الحساسية على أنظمة TapeStation
جهاز الفصل الكهربائي للهلام ميكروفلويديكAgilentG2991BAنظام Agilent 4200 TapeStation
مطياف ضوئي للأحجام الدقيقةFisher13400607جهاز Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL، نوع الكاشف: مستشعر صور خطي CMOS من 2048 عنصر، الشاشة: شاشة ملونة عالية الدقة مقاس 10 بوصات، اللغات: الصينية والإنجليزية والفرنسية واليابانية والألمانية، مصدر الضوء: Xenon Flash، عرض النطاق الطيفي: أقل من أو يساوي 1.8 nm (FWHM عند Hg 254 nm)، الجهد: 12 VDC
ماصة فمويةMillipore SigmaA5177مجموعات أنابيب شفط للماصات الشعرية الدقيقة المعايرة
ماء خالٍ من النوكلييزFisherFERR0581Thermo Scientific Water، خالٍ من النوكلييز
ماصات (2.5 uL و 20 uL و 200 uL و 1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus، مجموعة من 4 قطع
RNase AwayFisher21-402-178منظف الأسطح Thermo Scientific RNase AWAY
أنبوب ومدقة خالية من RNaseFisher12-141-368أنابيب ومدقات خالية من RNase لعزل RNA

المراجع

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.