يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من أنواع متعددة من بطيئات المشية (Tardigrades)

255 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

سبتمبر 1, 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

يفصل هذا البروتوكول إجراءات عزل الـ RNA من أنواع مختلفة من بطيئات المشية (tardigrades) باستخدام طقم عزل RNA يعتمد على الأعمدة، والمصمم لعزل الـ RNA من كميات صغيرة من الأنسجة وإنتاج كميات كافية من الـ RNA عالي الجودة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الـ RNA وتخليق الـ DNA المكمل.

الملخص

تعد بطيئات المشية (Tardigrades) حيوانات مجهرية تشتهر بقدرتها الاستثنائية على تحمل الإجهاد البيئي. حيث يمكن لهذه الحيوانات البقاء على قيد الحياة في ظروف الجفاف، والضغط الشديد، ودرجات الحرارة المنخفضة، والمستويات العالية من الإشعاع المؤين. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه القدرات على تحمل الظروف القاسية غير مفهومة بشكل كامل. تتطلب النهج الجزيئية المستخدمة لاستقصاء هذه الآليات، والتي تشمل تسلسل RNA، وتداخل RNA (RNAi)، والتعبير غير المتجانس لجينات بطيئات المشية في أنظمة مثل البكتيريا، عزل حمض ريبوزي نووي مرسال (mRNA) عالي الجودة من مواد بيولوجية محدودة. في هذه الدراسة، نصف بروتوكولاً قابلاً للتكرار لعزل RNA الكلي من بطيئات المشية يتسم بما يلي: (1) الفعالية عبر أنواع متعددة، بما في ذلك نوع من بطيئات المشية غير المتجانسة (heterotardigrade)، و(2) يتطلب فقط من 25 إلى 200 حيوان، اعتماداً على حجم الجسم، و(3) ينتج RNA بكمية وجودة كافيتين للتطبيقات اللاحقة. يتيح البروتوكول الحالي بنجاح استرداد RNA بكفاءة من أعداد معقولة من بطيئات المشية ويدعم الاستقصاءات الجزيئية لتحمل الإجهاد عبر أنواع مختلفة من بطيئات المشية.

المقدمة

تُعرف بطيئات المياه (Tardigrades) بقدرتها العالية على البقاء في ظروف الإجهاد الشديد التي لا تستطيع الحيوانات الأخرى تحملها، بما في ذلك الجفاف، والضغوط القصوى، ودرجات الحرارة المرتفعة والمنخفضة للغاية، والعوامل المسببة لتلف الحمض النووي (DNA) مثل الأدوية الكيميائية والعلاج الإشعاعي المؤين1,2,3,4,5,6,7,8. وفي السنوات الأخيرة، بحث العلماء في الآليات التي تكمن وراء هذه المرونة الفائقة لبطيئات المياه باستخدام مناهج جزيئية مثل تسلسل الـ RNA، وتداخل الـ RNA (RNAi)، والتعبير غير المتجانس لجينات بطيئات المياه في أنظمة أخرى، بما في ذلك الخلايا البشرية والبكتيريا8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. وقد شكلت هذه المناهج، عند تطبيقها، أداة قوية منحتنا رؤية دقيقة حول كيفية تمكن بطيئات المياه من مقاومة هذا الإجهاد الشديد8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. ومع ذلك، فإن جميع هذه المناهج الجزيئية لفهم تحمل الإجهاد لدى بطيئات المياه تعتمد على القدرة على عزل الـ RNA من هذه الحيوانات متناهية الصغر بكميات كافية وبجودة مناسبة لاستخدامها في العمليات اللاحقة.

أثبتت طريقة سابقة لعزل الـ RNA من بطيئات المشية نجاحها للباحثين الذين يعملون على Hypsibius exemplaris23. ومع ذلك، عند محاولة تكرار هذا البروتوكول في H. exemplaris، وجدنا أنه غير موثوق من حيث تركيز الـ RNA الناتج وجودته (بيانات غير منشورة). وقد تبين أن طريقة بديلة لعزل الـ RNA تعتمد على الفينول فعالة مع H. exemplaris وRamazzottius varieornatus ونوع من بطيئات المشية غير المتجانسة13,21,22,24,25,26. وقد ثبت أن هذا البروتوكول يوفر RNA بجودة وكمية كافيتين للعمليات اللاحقة، سواء من حيوانات مفردة أو من مجموعات من الحيوانات (~50). ومع ذلك، يتطلب هذا البروتوكول من المستخدم التعامل مع كواشف تحتوي على الفينول. والفينول مادة كيميائية خطرة تتطلب تعاملاً حذراً، وقد يؤدي التنفيذ غير الصحيح لهذا البروتوكول إلى انتقال بقايا الفينول، مما يؤثر على نقاء الـ RNA والتطبيقات اللاحقة. ويركز بروتوكول آخر نُشر سابقاً لعزل الـ RNA من بطيئات المشية على القدرة على عزل الـ RNA من حيوانات مفردة27. ورغم أن هذا البروتوكول قيم لتطبيقات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)27، إلا أنه أقل ملاءمة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الـ RNA، حيث يكون الهدف هو الحصول على رؤية أكثر شمولية لكيفية استجابة الحيوانات لمجهد أو حالة معينة.

أدت هذه المحدوديات في بروتوكولات عزل الحمض الريبي النووي (RNA) المتاحة إلى البحث عن طرق بديلة لعزل الـ RNA من بطيئات المشية (tardigrades). إن مجموعة أدوات عزل الـ RNA القائمة على الأعمدة المستخدمة في هذا البروتوكول مُسوقة لعزل الـ RNA من كميات صغيرة من الأنسجة. كما استُخدمت هذه المجموعة سابقاً لعزل الـ RNA من أنسجة الحشرات لإجراء تحليلات تسلسل الـ RNA اللاحقة، مما يشير إلى أنها قد تكون مناسبة لعمليات العزل من حيوانات صغيرة أخرى ذات كيوتيكل مثل بطيئات المشية.28توضح هذه الدراسة البروتوكول التفصيلي لاستخدام طقم عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) القائم على الأعمدة مع بطيئات المشية، بما في ذلك شروحات حول تحذيرات محددة يجب مراعاتها عند تنفيذ هذا البروتوكول مع بطيئات المشية. ويشير هذا المقال إلى نجاح هذا البروتوكول في ستة أنواع من بطيئات المشية (H. exemplaris, .Milnesium sp, Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti، والبطيئات متباينة المخالب Viridiscus celatus). أثبتت الدراسة أنه يمكن الحصول على حمض نووي ريبوزي (RNA) بجودة وكمية كافيتين من عدد قليل من الحيوانات يصل إلى 25 حيواناً. كما تم تقديم أمثلة على البيانات الناتجة لتركيز وجودة الـ RNA، والتي تُعد مناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الـ RNA (مع حد أدنى من الانحياز، وتضخيم مكتبة أسي) وتخليق الحمض النووي المتمم (cDNA). وقد أثبت بروتوكول عزل الـ RNA هذا فائدته بالفعل في الكشف عن آليات تحمل الإشعاع في H. exemplaris8يشير نجاح هذا البروتوكول عبر أنواع مختلفة من بطيئات المشية إلى إمكانية تطبيقه على نطاق أوسع لاستقصاء آليات تحمل الإجهاد، والآليات التنموية، والعمليات التطورية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لا يتطلب البروتوكول التالي موافقة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية، حيث تُعفى الحيوانات اللافقارية من هذا المتطلب. والكيماويات والمعدات المستخدمة مدرجة في الـ جدول المواد.

1. تحضير المعدات والمنطقة لعزل الـ RNA

  1. قم بتشغيل كتلة التسخين أو الحمام المائي وضبط درجة الحرارة على 42 °C استعداداً لاستخلاص الـ RNA.
  2. جهز حامل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، والمصّاصات (2 µL، و20 µL، و200 µL، و1000 µL)، ورؤوس مصاصات مرشحة ذات أحجام مناسبة.
  3. نظف سطح العمل، وحامل الأنابيب، والمصّاصات، وصناديق الرؤوس باستخدام RNase Away، أو محلول مبيض مخفف (10%)، أو إيثانول بتركيز 70% لتعطيل أي إنزيم RNase متبقٍ.
    ملاحظة: قد يؤدي وجود كميات زائدة من RNase على المعدات أو في المنطقة التي يتم فيها عزل الـ RNA إلى عدم كفاية جودة الـ RNA بعد العزل بسبب التحلل. قلل من هذا الخطر من خلال إعطاء وقت كافٍ للمواد الكيميائية المعطلة لـ RNase لتعمل، وترك المنطقة والمعدات تجف تماماً قبل المتابعة.
  4. ارتدِ القفازات في جميع خطوات هذا البروتوكول، وقم بمعالجة القفازات بشكل متكرر بمحلول معطل لـ RNase طوال فترة العمل لمنع تحلل الـ RNA بفعل إنزيم RNase.

2. جمع الحيوانات لعزل RNA

  1. باستخدام بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب شفاط مزودة بشعيرة زجاجية (الشكل 1A)، أو حلقة إيروين (Irwin loop)، أو ماصة دقيقة، انقل من 25 إلى 200 حيوان (حسب حجم النوع) من أطباق الزرع الخاصة بها إلى طبق يحتوي على مياه ينابيع نظيفة لتقليل كمية المواد غير التابعة لبطيئات المشية (الطحالب أو مصادر غذاء أخرى مثل النيماتودا أو الدوارات، حسب النوع).
  2. أحضر أنبوباً سعة 1.5 mL خالياً من الـ RNase ومدقاً.
  3. باستخدام بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب شفاط مزودة بشعيرة زجاجية أو حلقة إيروين، انقل الحيوانات إلى قاع الأنبوب الخالي من الـ RNase سعة 1.5 mL، مع الحرص الشديد على نقل أقل كمية ممكنة من الماء مع الحيوانات.
  4. قم بالطرد المركزي عند 4,500 g لمدة 3 min لترسيب بطيئات المشية في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  5. أثناء مراقبة الأنبوب الذي يحتوي على الراسب من بطيئات المشية تحت مجهر تشريحي، استخدم ماصة سعة 20 µL أو بصلة ماصة متصلة بغرفة تجميع أنبوب شفاط مزودة بشعيرة زجاجية ذات فتحة أصغر من حجم بطيئات المشية التي تعزل منها الـ RNA، لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء بعناية دون تحريك راسب بطيئات المشية. انظر الشكل 1B لرؤية تمثيل للكمية المقبولة من الماء المتبقي.
    ملاحظة: كن حذراً بترك طبقة رقيقة من الماء هنا حتى لا تجف الحيوانات في الوقت القصير بين إزالة الماء وإضافة محلول الاستخلاص (XB). إذا جفت الحيوانات، فقد يؤدي ذلك إلى رداءة جودة الـ RNA بعد العزل.
  6. أضف 100 µL من محلول الاستخلاص (XB) إلى الأنبوب الذي يحتوي على بطيئات المشية.

3. التفكيك الميكانيكي لبطيئات المشية واستخلاص الـ RNA

  1. باستخدام مدقة خالية من الـ RNase، قم بتفتيت بطيئات المشية عن طريق طحن المدقة برفق ولكن بحزم في قاع الأنبوب لمدة ~30 s. يجب أن تكون 20–30 حركة طحن إجمالاً كافية لتفتيت بطيئات المشية.
  2. أخرج المدقة من الأنبوب، مع توخي الحذر لضمان بقاء أكبر قدر ممكن من السائل في قاع الأنبوب.
  3. افحص محتويات أنبوب الطرد المركزي الدقيق (microfuge tube) تحت مجهر التشريح للتأكد من عدم وجود حيوانات سليمة مرئية متبقية.
  4. قم بتحضين الخليط عند 42 °C لمدة 30 min على وحدة تسخين هزازة مع رج خفيف (300 rpm).
    ملاحظة: يعمل محلول الاستخلاص المنظم (XB) على تثبيت الـ RNA لمنع تحلله عند درجة الحرارة هذه.

4. تهيئة عمود عزل الـ RNA

  1. خلال الدقائق العشر الأخيرة من فترة تحضين الاستخلاص، قم بتجميع العمود الخاص بجمع وتنقية الـ RNA. ضع عمود تنقية في أنبوب تجميع وقم بتمييز العمود بشكل مناسب.
  2. أضف 250 µL من محلول التكييف (Conditioning Buffer (CB)) مباشرة إلى العمود.
  3. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min.
  4. قم بالطرد المركزي عند 16,000 × g لمدة 1 min وتخلص من السائل المار. أصبح العمود الآن جاهزاً لاستقبال الطافي الذي يحتوي على الـ RNA من الخطوة التالية.
  5. أخرج محلول التفاعل 10x DNase I Reaction Buffer والماء الخالي من النوكلييز (Nuclease-Free Water) من المجمد ليذوبا تماماً في الوقت المناسب للخطوة 6 أدناه.

5. ربط الحمض النووي الريبوزي (RNA) بالعمود

  1. بعد فترة تحضين الاستخلاص، قم بطرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على بطيئات المشية الممزقة ميكانيكياً ومحلول الاستخلاص (XB) بسرعة 3,000 × g لمدة 2 min.
  2. أحضر أنبوباً جديداً خالياً من RNase وقم بتمييزه وفقاً لذلك.
  3. باستخدام ماصة سعة 200 µL ذات رأس مرشح، قم بإزالة السائل الطافي بعناية من فوق الرواسب المكونة من جلود بطيئات المشية. كن حريصاً على عدم تعكير رواسب الجلد وإزالة السائل الطافي فقط.
    ملاحظة: سيؤدي نقل الجلد إلى الخطوات اللاحقة إلى انخفاض كفاءة عائد RNA من العمود بسبب الانسداد الميكانيكي للعمود. لتجنب هذا الخطأ المحتمل، يمكنك فحص رأس الماصة الذي يحتوي على السائل الطافي تحت المجهر للتأكد من خلوه من الجلد. في حالة وجود أي من الجلد، أعد السائل الطافي إلى الأنبوب وكرر خطوة الطرد المركزي.
  4. انقل السائل الطافي إلى الأنبوب الخالي من RNase والمميز حديثاً.
  5. أضف 100 µL من الإيثانول بتركيز 70% إلى الأنبوب الذي يحتوي على RNA واخلطه جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة عدة مرات. في هذه الخطوة، يجب أن تظهر خيوط لزجة شفافة عند إضافة الإيثانول؛ وهذه علامة جيدة على وجود RNA في السائل الطافي.
  6. انقل الخليط بالكامل (200 µL) إلى العمود الذي تم تحضيره في الخطوة 4.
    ملاحظة: عند إضافة أي محاليل إلى العمود في هذه الخطوة والخطوات اللاحقة، احرص على توزيع السائل في وسط العمود وتجنب ملامسة العمود ميكانيكياً برأس الماصة. سيؤدي الثقب الميكانيكي للعمود إلى حدوث مشكلات لاحقة في جودة وكمية RNA.
  7. لربط RNA بالعمود، قم بالطرد المركزي لمدة 2 min بسرعة 100 × g، يليه طرد مركزي بسرعة 16,000 × g لمدة 30 s لإزالة السائل المار.

6. تحضير محلول DNase I

  1. اترك منظم تفاعل DNase I بتركيز 10x والماء الخالي من النوكلياز ليذوبا تماماً قبل تحضير المحلول.
  2. لكل عملية عزل لـ RNA، قم بتحضير محلول بحجم 40 µL في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL، يتكون من 32 µL من الماء الخالي من النوكلياز، و 4 µL من منظم تفاعل DNase I بتركيز 10x، و 4 µL من إنزيم DNase I. احفظ المحلول على الثلج حتى يحين وقت استخدامه في العمود في الخطوة 7.3.

7. غسل الحمض النووي الريبي (RNA) والمعالجة بإنزيم DNase I

  1. أضف 100 µL من محلول الغسيل 1 (W1) بواسطة الماصة مباشرة على عمود التنقية الذي يحتوي على الـ RNA المرتبط (من الخطوة 5.7).
  2. قم بالطرد المركزي لمدة 1 min بسرعة 8,000 × g وتخلص من السائل المار.
  3. أضف 40 µL من محلول DNase I المحضر في الخطوة 6 بواسطة الماصة مباشرة على عمود التنقية، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min لإزالة التلوث بالـ DNA.
  4. أضف 40 µL من محلول الغسيل 1 (W1) بواسطة الماصة على عمود التنقية، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 × g لمدة 30 s.
  5. أضف 100 µL من محلول الغسيل 2 (W2) بواسطة الماصة على عمود التنقية، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 × g لمدة 1 min.
  6. أضف 100 µL أخرى من محلول الغسيل 2 (W2) بواسطة الماصة على عمود التنقية، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 16,000 × g لمدة 2 min، وتخلص من السائل المار.
  7. قم بالطرد المركزي للعمود بسرعة 16,000 × g لمدة 1 min لتجفيف العمود.

8. استخلاص الـ RNA

  1. أحضر أنبوباً سعة 0.5 mL (مرفق في الطقم) لكل عملية عزل RNA وقم بتسميته بشكل مناسب. سيكون هذا هو الأنبوب الذي يحتوي على RNA بعد عملية العزل.
  2. انقل العمود الذي يحتوي على RNA المرتبط والمغسول إلى أنبوب 0.5 mL المسمى. يجب أن يستقر العمود في هذا الأنبوب بإحكام (سماع صوت نقرة).
  3. أثناء النظر إلى الأنبوب من الجانب، ضع طرف الماصة مباشرة فوق غشاء العمود، ثم أضف 11 µL من محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) على العمود، واتركه لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: سيؤدي عدم توزيع محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) مباشرة على العمود إلى انخفاض إنتاجية RNA. إذا لوحظ وجود قطرات من السائل حول محيط العمود، فهذا يشير إلى عدم توزيع محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) بشكل صحيح على العمود. في هذه الحالة، يوصى بتكرار هذه الخطوة باستخدام السائل المار من الخطوة 8.5، مع التأكد من إفراغ محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB) مباشرة في مركز العمود.
  4. ضع أنبوب 0.5 mL الذي يحتوي على العمود في أنبوب التجميع المرفق مع الطقم لضمان التثبيت الصحيح أثناء الطرد المركزي (الشكل 2).
  5. قم بطرد العمود مركزياً عند 1,000 × g لمدة 1 min لتوزيع محلول الاستخلاص Elution Buffer (EB)، ثم قم بالتدوير عند 16,000 × g لمدة 1 min لاستخلاص RNA.
  6. ضع أنبوب 0.5 mL الذي يحتوي على RNA على الثلج فوراً.

9. التحقق من كمية وجودة الـ RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الدقيق

ملاحظة: يمكن استخدام طرق أخرى لتقييم كمية وجودة الـ RNA. هنا، يتم استخدام طريقة تعتمد على مقياس الطيف الضوئي للميكرو-حجم. كما يمكن أيضاً استخدام مقياس الفلورية أو أداة الفصل الكهربائي للهلام الموائع الدقيقة29.

  1. امسح قاعدة مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية للمجاهر (microvolume spectrophotometer) بمسحة خالية من الوبر لضمان خلوها من أي سوائل أخرى.
  2. حدد الـ الحمض النووي الريبوزي إعدادات جهاز المطياف الضوئي للتحليل.
  3. قم بتصفير جهاز المطياف الضوئي باستخدام 1 µL من محلول الاستخلاص (EB) المستخدم في الخطوة 8.3.
  4. بعد عملية التفريغ، امسح محلول الاستخلاص (EB) عن القاعدة باستخدام منديل خالٍ من الوبر.
  5. مع الحفاظ على الأنبوب سعة 0.5 مل الذي يحتوي على الـ RNA في الثلج، يتم سحب... 1 µL من الحمض النووي الريبوزي (RNA) على قاعدة جهاز المطياف الضوئي. اخفض ذراع جهاز المطياف الضوئي لقياس امتصاصية العينة من أجل تقدير كمية الحمض النووي الريبوزي المعزول وتقييم جودته.
    ملاحظة: يرجى مراجعة قسم "النتائج" أدناه للحصول على تفاصيل حول الجودة والكمية المقبولتين للتطبيقات اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول، كما ذُكر أعلاه، في إزالة كمية مناسبة من الماء من دببات الماء (tardigrades) التي تم جمعها قبل إضافة منظم الاستخلاص (XB) لاستخلاص الـ RNA. حيث إن ترك كمية زائدة من الماء سيؤدي إلى تخفيف منظم الاستخلاص (XB) والحصول على استخلاص RNA دون المستوى المطلوب (أي: RIN < 7، ونسبة 260/280 < 1.8، ونسبة 260/230 < 1.8، و/أو تركيز < 5 ng/µL) من الحيوانات، مما يؤدي إلى انخفاض تركيز الـ RNA وجودته بعد عملية الشطف (elution). أما إزالة كمية كبيرة من الماء فستؤدي إلى تجفيف الحيوانات بسر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل عزل الـ RNA من بطيئات المشية بكمية وجودة كافيتين لتكون قابلة للتطبيق في التطبيقات اللاحقة التي تسهل استقصاءات تحمل الإجهاد لدى بطيئات المشية. وقد حدد البروتوكول المعروض هنا المجالات التي قد يواجه فيها المستخدمون مشكلات، بما في ذلك إزالة كمية كافية من الماء قبل إضافة محلول الاستخلاص (XB) (الخطوة 2.5)، وتفتيت أجسام بطيئات المشية (الخطوات 3.1–3.3)، ونقل الطافي إلى العمود للتنقية (الخطوة 5.3)، واستخلاص الـ RNA (الخطوة 8.3). قد تؤدي الأخطاء في أي من هذه الخطوات إلى انخفاض تركيز الـ RNA الناتج ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال صناديق تأسيسية من جامعة UNC Asheville (لـ CCH) ومنحة NSF رقم 2225683 المقدمة إلى Jason Pienaar (المشرف على مرحلة ما بعد الدكتوراه لـ PK). ونتوجه بالشكر إلى مرفق تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية في UNC على المساعدة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 mLUSA Scientific1615-5500أنبوب طرد مركزي دقيق مدرج Seal-Rite بسعة 1.5 mL، طبيعي، بولي بروبيلين، 500/كيس
إيثانول 70%VWR71001-654لتنظيف الطاولات/المعدات
Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204طقم يحتوي على المكونات الخاصة ببروتوكول العزل الموصوف في هذه المخطوطة
جهاز طرد مركزيEppendorf5405000441جهاز Centrifuge 5425، بمقابض دوارة، غير مبرد، مع Rotor FA-24x2، بجهد 120 V/50-60 Hz (US)
مياه ينابيع Deer ParkAny Grocery StoreN/Aهذا هو الوسط لزراعة بطيئات المشية (tardigrades) ويُستخدم لشطفها قبل عزل RNA
مجهر تشريحZeissN/Aجهاز Zeiss Stemi 305، بنسبة تكبير 5:1 وتكبير إجمالي 8x-40x، مع وحدة إضاءة نافذة M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I، خالٍ من RNase (بتركيز 1 U/uL)
رؤوس ماصات مفلترة 10 uLVWR76322-528أي رأس ماصة مفلتر مناسب
رؤوس ماصات مفلترة 1000 uLVWR76322-154أي رأس ماصة مفلتر مناسب
رؤوس ماصات مفلترة 20 uLVWR76322-134أي رأس ماصة مفلتر مناسب
رؤوس ماصات مفلترة 200 uLVWR76322-150أي رأس ماصة مفلتر مناسب
أنابيب شعرية زجاجيةFisher50-821-811World Precision Instrument Standard Glass Capillaries - 1B120-6 (بطول 6 بوصة، وقطر خارجي OD 1.2 mm، بدون فتيلة). يتم سحب هذه الأنابيب فوق لهب لتشكيل أنبوبين شعريين زجاجيين بنهايات ضيقة، ثم تُكسر للوصول إلى القطر المناسب لاستخدام الماصة الفموية لنقل أنواع بطيئات المشية المختارة.
كتلة تسخينEppendorf5382000023جهاز Eppendorf ThermoMixer C، جهاز أساسي بدون كتلة حرارية، بجهد 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/South America/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581سلم لتحليل RNA الكلي عالي الحساسية على أنظمة TapeStation
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579للتحليل عالي الحساسية لـ RNA الكلي على أنظمة TapeStation
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580منظم لتحليل RNA الكلي عالي الحساسية على أنظمة TapeStation
جهاز الفصل الكهربائي للهلام ميكروفلويديكAgilentG2991BAنظام Agilent 4200 TapeStation
مطياف ضوئي للأحجام الدقيقةFisher13400607جهاز Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL، نوع الكاشف: مستشعر صور خطي CMOS من 2048 عنصر، الشاشة: شاشة ملونة عالية الدقة مقاس 10 بوصات، اللغات: الصينية والإنجليزية والفرنسية واليابانية والألمانية، مصدر الضوء: Xenon Flash، عرض النطاق الطيفي: أقل من أو يساوي 1.8 nm (FWHM عند Hg 254 nm)، الجهد: 12 VDC
ماصة فمويةMillipore SigmaA5177مجموعات أنابيب شفط للماصات الشعرية الدقيقة المعايرة
ماء خالٍ من النوكلييزFisherFERR0581Thermo Scientific Water، خالٍ من النوكلييز
ماصات (2.5 uL و 20 uL و 200 uL و 1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus، مجموعة من 4 قطع
RNase AwayFisher21-402-178منظف الأسطح Thermo Scientific RNase AWAY
أنبوب ومدقة خالية من RNaseFisher12-141-368أنابيب ومدقات خالية من RNase لعزل RNA

المراجع

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

بروتوكول متعدد الأنواعالحمض الريبوزي المرسالتسلسل الحمض الريبوزيتداخل الحمض الريبوزيتحمل الإجهادالتعبير غير المتجانسالإجهاد البيئيالآليات الجزيئية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.