تثبيت البروتين والبروتين—مكثفات RNA في هيدروجيل الأغاروز منخفض الذوبان للقياسات الفيزيائية الحيوية الكمية

ملخص

هنا، نقدم طريقة قوية لتثبيت المكثفات السائلة-السائلة المفصولة بالطور داخل مصفوفة هيدروجيل أغاروز منخفضة الانصهار المسامية دون التأثير على ديناميكيات سائلها الداخلية. يقلل هذا النهج من ترسيب القطرات، والتجمع، والآثار التي تبلل السطح، مما يتيح التصوير القابل للتكرار والتحليل الفيزيائي الحيوي الكمي على مدى ساعات.

الملخص

تعرف بشكل متزايد بالمكثفات الحيوية الجزيئية الناتجة عن فصل الطور السائل عن السائل كوحدات تنظيمية أساسية للخلية، مع أدوار تتراوح من معالجة الحمض النووي الريبي إلى تجميع حبيبات الإجهاد. إعادة تشكيل هذه المكثفات في المختبر باستخدام البروتينات والحمض النووي الريبي المنقاة توفر أنظمة نموذجية، ومع ذلك فإن القطرات السائلة تتراكم وتتجمع وتنتشر على الأسطح مع مرور الوقت، مما أدخل تباينا كبيرا في القياسات الكمية على مدى فترات تجريبية زمنية. إدخال هذه المكثفات داخل هيدروجيل خفيف وشفاف بصريا وكيميائيا غير نشط — يحضر هنا من أجوروز منخفض الانصهار (LMA) بنسبة 0.3–1.0٪ w/v — يثبت القطرات في ثلاثة أبعاد، مما يمكن من استخدام منهجيات ذات أوقات قياس أطول أو إعدادات تجريبية مع قياسات متكررة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لتحضير مخزون LMA، وتكوين القطرات، وتضمينها، وتوفر أمثلة على قراءات بيوفيزيائية محددة في المراحل النهائية. كما نظهر أن خصائص القطرات المحددة، مثل الانتشار الجزيئي، تحفظ بعد تضمين LMA في الأنظمة التمثيلية التي تم اختبارها. نظرا لأن الطريقة متوافقة مع المجهر الكونفوكالي أو واسع المجال أو فائق الدقة، أو استعادة الفلورية بعد التبييض الضوئي، أو مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، من بين أمور أخرى، يمكنها دعم التوصيف الكمي للمكثفات الجزيئية الحيوية ذات الصلة بالصحة والمرض.

المقدمة

يدفع فصل الطور السائل والسائل (LLPS) تكوين العضيات بدون أغشية والمكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا، بما في ذلك حبيبات الإجهاد، وأجسام P، والنواة 1,2,3,4,5. تركز هذه المكثفات بروتينات وأحماض نووية محددة مع الحفاظ على تبادل سريع مع السيتوبلازم أو النيوكليوبلازم المحيط – وهو سمة مميزة للسلوك الشبيه بالسائل 1,2,3,4,5. تم ربط اختلال تنظيم LLPS بأمراض مختلفة، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية ^3,6,7، ويرتبط أيضا بتكاثر عدة فيروسات مثل SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

أصبح إعادة تشكيل المكثفات في المختبر باستخدام البروتينات النقية والحمض النووي الريبي تحت ظروف العزل المحددة نهجا أساسيا لدراسة آليات LLPS ^3,4. ومع ذلك، فإن القطرات في أنبوب الاختبار أو على سطح زجاجي معرضة لثلاثة تشويش رئيسية: (1) الترسيب الجاذبي، الذي يسبب تراكم القطرات في القاع؛ (2) الاندماج، حيث تندمج القطرات مع مرور الوقت لتكوين هياكل أقل وأكبر؛ و(3) الترطيب السطحي، حيث تنتشر القطرات وتمتص جزئيا على الانزلاق الداخلي. تقلل هذه الظواهر من قابلية تكرار القياسات الكمية وتجعل من الصعب تتبع القطرات الفردية في أبعادها الفسيولوجية ذات الصلة¹³. تحد هذه الظواهر أكثر من استخدام الطرق التي تتطلب أوقات قياس ممتدة من دقائق إلى ساعات (مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي [NMR] أو تقنيات المجهر فائق الدقة مثل STORM) وتمنع تكرار القياسات على مدى فترات زمنية ممتدة.

التثبيت الفيزيائي داخل شبكة الهيدروجيل يعالج جميع القطع الأثرية الثلاثة في آن واحد. يشكل الأجاروز هلام متشابك فيزيائيا عند درجات حرارة أقل من 34–38 درجة مئوية. عند تركيزات 0.3–1.0٪ w/v، يكون حجم شبكة الأغاروز كبيرا بما يكفي لتغليف قطرات بحجم ميكرومتر سليمة مع بقاء مسامية بما يكفي لعدم عرقلة الديناميكيات الجزيئية داخل القطرات¹³. بالإضافة إلى ذلك، تسمح مسامية مصفوفة الأجاروز بانتشار الجزيئات الكبيرة والجزيئات الصغيرة داخل وخارج القطرات المدمجة. بالنسبة للأنظمة الحساسة للدرجة حرارة بشكل خاص والتي تتضمن بروتينات ذات مجالات مطوية أو تتبع فصل طور من نوع درجة حرارة المحلول الحرجة العلوية/السفلى (UCST/LCST)، يمكن استخدام الأجاروز منخفض الذوبان (LMA) بنقطة تجل بين 26–30 درجة مئوية بدلا من ذلك. الطرق البديلة لمكافحة التربول، مثل التأثير السطحي، يمكن أن تقلل من التصاق المكثفات وبالتالي التبليل، لكنها غالبا ما تتطلب تحضيرا متخصصا ولا تمنع ترسيب القطرات أو اندماجها. على النقيض من ذلك، يوفر تضمين الأجاروز طريقة مباشرة وواسعة الوصول إليها لتثبيت المكثفات مكانيا. ومن المهم أن الأجاروز تم التحقق من صحتها لعدم إزعاج الحالة التشكيلية للاندماج في الساركوما (FUS) وبروتينات أخرى مرتبطة بالحمض النووي الريبي عند تكوين القطرات حتى تركيزات أغاروز تبلغ 1.0٪ مع¹³ ضربة/ضوئي. يقوم هذا البروتوكول بتوحيد نهج تضمين الأغاروز للاستخدام العام مع العديد من أنظمة البروتين أو الحمض النووي البروتيني الفصل الطوري ذات الاهتمام، مما يوفر إرشادات خطوة بخطوة لتحضير الكواشف وتحضير العينات.

البروتوكول

1. تحضير مخزون الأغاروز

مهم: جهز مخزون الأغاروز في نفس المخزن المستخدم لصنع العينات المفصولة بالطور (ويسمى لاحقا "مخزن القطرات") لمنع عدم تطابق المخزن¹⁴. مثال: يتم تحضير عينة النيوكليوكبسيد في المخزن A (25 ملليمولار HEPES، 50 ملليمولار NaCl، pH 7.2)، والذي يجب استخدامه أيضا لتحضير مخزون الأغاروز.
ملاحظة: تعتمد الظروف التجريبية النهائية، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تركيب المخزن المؤقت وتركيز البروتين واستخدام الإضافات وحجم العينات النهائي، بشكل كبير على النظام البيولوجي المحدد قيد الدراسة والتطبيق اللاحق المحدد. وبالمثل، تعتمد معايير الاستحواذ، وإعداد الأجهزة، وتحليل البيانات بشكل كبير على العينة والتجربة المحددة. على سبيل المثال، يتم وصف تحضير نيوكليوكابسيد SARS-CoV-2 باستخدام بولي(A) في الشكل 1A (مجهر فلوري كونفوكلي).

1. وزن الكمية المناسبة من LMA أو الأغاروز العادي في أنبوب بحجم 1.5 مل يحتوي على محلول قطرات. مثال: للحصول على مخزون 2٪ من الذخيرة ضد الجهد (w/v)، قم بإذابة 20 ملغ من الأجوروز في 1 مل من المخزن A.
   ملاحظة: يجب أن يكون تركيز مخزون الأغاروز النهائي 1–2٪ w/v، اعتمادا على التركيز النهائي المطلوب للأغاروز في العينة. لا ينصح بتجاوز 2٪ من الضربة لأن التثبيت يصبح صعبا بشكل متزايد. اقطع الطرف الضيق من طرف الماصة لتسهيل عملية التوصيل، خاصة عند نسب الأغاروز العالية. راجع قسم المناقشة لتحديد ما إذا كان مطلوبا لاستخدام LMA أو الأجاروز العادي للعينات.
2. سخن مخزون الأغاروز إلى درجة حرارة 80–90 درجة مئوية في كتلة تسخين أو حمام مائي وذيب الأغاروز بالكامل عن طريق الدوامة (يستغرق حوالي 10 دقائق).
   تحذير: الأجاروز المنصهر ساخن. تعامل معها بحذر.
3. قم بتسوية مخزون الأغاروز إلى 37 درجة مئوية (LMA) أو 55 درجة مئوية (أجاروز عادي) في كتلة التسخين أو حمام الماء. تحقق من بقاء المحلول شفافا وسائلا عند هذه الحرارة. تحقق من درجة حرارة مرق الأجاروز باستخدام مقياس حرارة إذا لزم الأمر.
   نقطة توقف: يمكن إبقاء مخزون الأغاروز المنصهر دافئا لمدة 30–60 دقيقة.
   ينصح بشدة بتسخين الأغاروز في حمام مائي لضمان تسخين أكثر تجانسا والحفاظ على درجة الحرارة المستهدفة بدقة كافية. وهذا مهم بشكل خاص عند العمل مع LMA، حيث يمكن أن تؤدي الانحرافات الصغيرة في درجة الحرارة إلى التجلي المبكر.
4. بعد تحضير العينة (القسم 2)، خزن مخزون الأغاروز المتبقي عند +4 درجة مئوية. اتبع الخطوات 1.2 و1.3 أعلاه لإعادة إذابة وتوازن مخزون الأغاروز قبل الاستخدام.
   ملاحظة: نوصي بإبقاء مرق الأغاروز لمدة أسبوعين كحد أقصى عند +4 درجة مئوية وتعريضه لأكثر من 2–3 دورات تصلب أو ذوبان. استخدم ممارسات تصنيع جيدة لمنع التلوث. تخلص من المخزونات في وقت أبكر إذا لم تذوب أو تتصلب من جديد، أو إذا حدث تلوث ظاهر.

2. تحضير العينة

1. قم بتسخين جميع المواد التي تلامس الأغاروز مباشرة (مثل رؤوس الماصات، الأنابيب، شرائح المجهر) إلى حوالي 37 درجة مئوية عن طريق وضعها على كتلة التسخين أو في الحاضنة لمدة 2–3 دقائق.
2. جهز مخزون الأجاروز كما هو موضح في القسم 1.
3. جهز محلول القطرات، والمكونات الفصلية (مثل مخزون البروتين أو الحمض النووي الريبي)، وأي إضافات أخرى (مثل عوامل التكظر، الأصباغ) للعينات وفقا للبروتوكول القياسي. التوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT). مثال: مخزن A (25 ملليمولار HEPES، 50 ملليمولار NaCl، pH 7.2)، مخزون بروتين نيوكليوكابسيد (60 ميكرومولار، في المخزن A)، مخزون بولي(A) (30 ميكرومولار، في المخزن A).
   ملاحظة: لاستعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP)، أو المجهر الفلوري الكونفوكلي، أو المجهر البصري العشوائي (STORM)، أضف جزءا صغيرا من البروتين أو الحمض النووي الريبي الموسوم بالفلورية إلى مخزون البروتين أو الحمض النووي الريبي على التوالي (موصى به: نسبة <5٪ الموسومة).
4. احسب حجم مخزن القطرات، مخزون الأغاروز، المكونات الفصلية الطورية (مثل البروتين أو الحمض النووي الريبي المعني)، وأي إضافات إضافية (مثل عوامل التكظظ) اللازمة للعينة. مثال: 6 ميكرولتر من مخزن A، 5 ميكرولتر من مخزون أغاروز بنسبة 2٪ (النهائي 0.5٪)، 5 ميكرولتر من بروتين النيوكليوكابسيد (النهائي 15 ميكرومولار)، 4 ميكرولتر من بولي(A) (النهائي 6 ميكرومول). المجلد النهائي 20 ميكرولتر.
   ملاحظة: رغم الاعتماد الكبير على الطبق أو الأنبوب أو اللوحة أو أي وعاء آخر مستخدم في التجربة، فإن الأحجام الشائعة الاستخدام هي 150 ميكرولتر لأنبوب NMR بقطر 3 مم، و20 ميكرولتر للمجهر أو تجارب FRAP في شريحة مجهر بست قنوات، و20–30 ميكرولتر لتجارب STORM في شرائح مجهر ب 18 بئر (انظر جدول المواد).
   1. كقيم ابتدائية، استخدم القيم النهائية بنسبة 0.3–0.5٪ w/v أغاروز للاختبارات الفيزيائية الحيوية القياسية، و0.8–1.0٪ w/v للاستقرار طويل الأمد (مثل تجارب الشيخوخة).
      ملاحظة: من أجل التثبيت والتخزين طويل الأمد للعينات، يجب اتخاذ تدابير لمنع جفاف العينة (مثل إغلاق حاوية العينة، وتخزينها في غرفة رطبة، وإضافة حاجز تبخر) وضمان بقاء تركيب العزل ودرجة الحموضة مستقرة خلال الحضانات الطويلة.
   2. بالنسبة لعينات الرنين المغناطيسي النووي، أضف 5٪ V/v D2O النهائية إلى العينة للقفل.
      ملاحظة: تركيز جميع المكونات الأخرى وحجم العينة الكلي يعتمد بشكل كبير على التطبيق المحدد والإعداد التجريبي.
5. أضف الأحجام المقابلة من المخزن العازل، ومكونات فصل الطور، ومخزون الأغاروز، والإضافات في أنبوب مشمس بسعة 1.5 مل.
   ملاحظة: نوصي بإضافة المحلول المؤقت والأغاروز أولا، ثم أي إضافات إضافية. نوصي أيضا بإضافة المكونات الفصلية للطور في النهاية لتحفيز تكوين المكثفات. ومع ذلك، يعتمد ترتيب الخلط الأمثل على النظام ويجب تحديده مسبقا. وهذا مهم بشكل خاص للأنظمة التي يمكن أن تؤثر فيها القياس التوقفي وترتيب الجمع بشكل كبير على حجم القطرات أو تقسيمها. مثال: ترتيب الخلط لعينة النيوكليوكابسيد هو أولا مخزن أغاروز، ثاني مخزون أغاروز، ثالث بروتين نيوكليوكابسيد، وأخيرا بولي(A)، باستخدام الأحجام الموضحة في الخطوة 2.4. في هذه العينة، يتم تحفيز LLPS بإضافة poly(A). بالنسبة للأنظمة التي تنتج فيها LLPS عكارة مرئية، يمكن أن تكون العكارة مؤشرا نوعيا للمراقبة الكمومية؛ ومع ذلك، فإن وقت البداية والرؤية يعتمدان على النظام، وعدم وجود عكارة فورية لا يشير بحد ذاته إلى فشل البروتوكول.
   1. أبق الأنبوب في كتلة التدفئة أو حمام الماء أثناء التوصيل صعودا وهبوطا عدة مرات. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
      ملاحظة: بينما الأغاروز لا يزال سائلا، يمكن أن تندمج القطرات. لذا، فإن تغيير وقت ما قبل الحضانة على كتلة التسخين أو في حمام مائي قبل بدء التجلي يمكن أن يكون أداة مفيدة لفحص القطرات بأحجام مختلفة. توصيف حركيات نمو القطرات في غياب الأغاروز قبل اختيار فترة ما قبل الحضانة يسمح للباحثين باستهداف نطاق حجم معين من القطرات بشكل متكرر.
6. لعينات المجهر / FRAP:
   1. استخدم ماصة عادية لنقل العينة بسرعة إلى شريحة المجهر المختارة (مثل شريحة المجهر القنائية مع قاعدة الغطاء).
   2. اترك التجلي عند RT لمدة 5–10 دقائق (انظر الملاحظة في قسم النقاش).
      ملاحظة: لا تحرك شريحة المجهر خلال هذه الفترة. حماية العينات الفلورية من الضوء.
   3. قس العينة وفقا للبروتوكول القياسي. مثال: مجهر كونفوكال قرصي دوار، هدف زيت apo بقياس 100x مخطط 1.45، طول موجة الإثارة 561 نانومتر لصبغة Cy3، اكتساب 100 مللي ثانية عند 30٪ قوة ليزر (Cy3) و50 مللي ثانية عند 6٪ شدة ضوء (مجال سطوان). بالنسبة ل FRAP: منطقة التبييض بحجم 1/¹⁰ من قطر القطرة موضوعة في وسط القطرة، 25 إطارا قبل التبييض (الاقتباس بدون تأخير)، 60 إطار بعد التبييض (تم أخذها بفواصل 1 ثانية)، نبضة ليزر لتبييض 15 مللي ثانية عند 70٪ من طاقة الليزر. تحليل استعادة FRAP من خلال التطبيع الكامل النطاق في البرمجيات مفتوحة الوصول؛ الإبلاغ عن معلمات التركيب الحركي فقط إذا تم إجراء التركيب.
7. لعينات STORM:
   1. استخدم ماصة عادية لنقل العينة بسرعة إلى شريحة STORM المفضلة (مثل شريحة حجرة ب 18 بئر مع قاع غطاء). وزع العينة كقطرة.
   2. اترك التجلي عند RT لمدة 5–10 دقائق (انظر الملاحظة في قسم النقاش).
      ملاحظة: لا تحرك شريحة المجهر خلال هذه الفترة. حماية العينات الفلورية من الضوء.
   3. املأ البئر بالكامل بمخزن STORM. أغلق البئر وفقا للبروتوكول القياسي.
   4. يوازن العينة لمدة لا تقل عن ساعة إلى ساعتين قبل القياس للسماح لمخزن STORM بالانتشار في هيدروجيل الأغاروز.
      ملاحظة: يمكن التحقق بسهولة من انتشار مخزن STORM في العينة إذا كانت أصباغ الفلورسنت تومض أثناء اكتساب STORM. اعتمادا على مواصفات العينة، قد تكون هناك حاجة إلى أوقات توازن أطول.
   5. قس العينة وفقا للبروتوكول القياسي المستخدم. مثال: مجهر Ti2 مقلوب، SR أبوكرمات TIRF 100x 1.49 هدف زيت، إضاءة رقيقة مائلة للغاية. الحصول على 20,000 إطار لكل عينة، مجال رؤية 64 × 64 بكسل، زمن التعريض 10 مللي ثانية مع ليزر 647 نانومتر بقوة 125 ميلاواط لصبغة Cy5، واستخدام ليزر 405 نانومتر بقوة 20 ميليواط للمساعدة في الانتقال من الحالة المظلمة طويلة العمر إلى الحالة الأرضية. تمت معالجة الصور باستخدام تقدير الاحتمالية القصوى مع تركيب متعدد الإصدارات. تم تطبيق تصحيح الانجراف، ولم يتم تضمين سوى نقاط بيانات بدقة توطين تبلغ 25 نانومتر أو أكثر في التصور النهائي. تنتج الصور النهائية باستخدام طريقة المدرجات التكرارية المتوسطة بمعدل تكبير 20x (1 بكسل = 8 نانومتر في الصورة النهائية).
8. لعينات الرنين المغناطيسي النووي:
   1. استخدم ماصة زجاجية طويلة ورقيقة (مسخنة مسبقا) لنقل العينة بسرعة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي (NMR). وزع العينة في أسفل الأنبوب.
   2. اترك التجلي عند RT لمدة 5–10 دقائق (انظر الملاحظة في قسم النقاش).
      ملاحظة: لا تهز أنبوب الرنين المغناطيسي النووي خلال هذه الفترة.
   3. قس العينة وفقا للبروتوكول القياسي المستخدم. مثال: شدة المجال لجهاز NMR 750 ميجاهرتز مع مسبار درجة حرارة الغرفة PATXI، أنبوب 3 مم، الاستحواذ عند 25 درجة مئوية، تسلسل نبضات قياسي (stebpgp1s19) لتجارب الانتشار (DOSY)، المعلمات: 4,096 نقطة مع 32 مسحا، قوة التدرج 2–95٪، زمن الانتشار 0.08 ثانية، نبضة تدرج 12 مللي ثانية، تأخير الاسترخاء (d1) 5 ثوان.

النتائج

تم تطبيق البروتوكول على المكثفات التي تتكون من مجال N-طرفي FUS (FUS NTD) أو بواسطة بروتين SARS-CoV-2 نوكليوكابسيد (N) مع RNA بولي(A) أو s2m كأمثلة تمثيلية لكل من قطرات البروتين فقط والبروتين-RNA. لتقييم ما إذا كان الأغاروز يؤثر بشكل ملحوظ على تكوين المكثفات تحت الظروف المختبرة، شكلنا قطرات تحتوي على بروتين نيتروجين وبولي(A) في وجود وغياب 0.5٪ مع الحمض النووي المنخفض (LMA). نظرا لأن LMA يتصلب بعد حوالي 5 دقائق عند RT، قمنا بتسجيل صور مجهر فلورية في هذه النقطة ولاحظنا أن القطرات كانت تقريبا بنفس الحجم في كلتا الحالتين (الشكل 1A,B). لإظهار التأثير الوقائي للأجاروز على ترطيب القطرات ودمجها، قمنا بتسجيل مجموعة أخرى من الصور بعد 60 دقيقة من تحضير العينة. بينما لم تتغير القطرات المدمجة في الأجاروز في الحجم، أظهرت المكثفات في غياب LMA زيادة كبيرة في الحجم بسبب الاندماج والترطيب السطحي (الشكل 1A,B). بينما قمنا بزرع القطرات في وقت مبكر نسبيا بعد النواة، يمكن تضمين قطرات بأحجام مختلفة عن طريق تغيير وقت الحضانة قبل الغرس. على الرغم من تضمين القطرات في هيدروجيل الأغاروز، لم تتغير ديناميكيات المكثفات المقاسة بشكل ملحوظ. كان استرداد FRAP، وبالتالي انتشار القطرات الظاهري متشابهين جدا مع وبدون LMA في العينة (الشكل 1C). علاوة على ذلك، أظهرت تجارب سابقة لتحليل طيفي الرنين المغناطيسي النووي المرتب بالانتشار (DOSY) مع مكثفات FUS NTD أن معدلات الانتشار لم تكن متأثرة بشكل ملحوظ بتركيز الأغاروز، على الأقل في النطاق 0.25–1٪ w/v (الشكل 1D) (مقتبس من Emmanouilidis وآخرون ¹³). تظهر هذه النتائج أن هيدروجيل الأجاروز مناسب لحبس المكثفات المنفصلة بالطور في الزمان والمكان، مما يمكن من إجراء قياسات متكررة على مدى فترات زمنية ممتدة.

بينما يتم تسجيل كل من قياسات المجهر وFRAP بسرعة نسبيا (من ثوان إلى دقائق)، تتطلب بعض التجارب عدة دقائق (مثل STORM، 1D ¹H NMR) أو حتى ساعات (مثل 2D [¹⁵N1H] hsqc NMR) للحصول عليها. لمثل هذه التجارب، من الضروري أن تبقى القطرات ثابتة طوال فترة الاكتساب ولا ترسب مع مرور الوقت. هنا، نظهر أننا استقمنا بتثبيت قطرات N من البروتين + s2m RNA في LMA لفترة كافية لالتقاط صور STORM (الشكل 1E). علاوة على ذلك، كان أطياف الرنين المغناطيسي النووي لقطرات FUS NTD في وجود وغياب الأجوروز ذات عرض خطوط مماثل، مما يشير إلى عدم وجود تفاعل قابل للكشف بين هيدروجيلز الأغاروز والبروتين تحت هذه الظروف (الشكل 1F) (مقتبس من Emmanouilidis وآخرون ¹³). على النقيض من ذلك، أظهرت أطياف المكثفات المدمجة في الأجاروز شدة إشارة أعلى، ويرجح أن القطرات غير المستقرة ترسبت في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي أثناء الاكتساب، وبالتالي لم تعد متاحة للقياس (الشكل 1F) (مقتبس من Emmanouilidis وآخرون ¹³). في الختام، لا يمكن تثبيت المكثفات في هيدروجيلز الأجاروز فقط من التجارب على المسار الزمني بل يسمح أيضا باستخدام منهجيات ذات أوقات اكتساب ممتدة، مع الحفاظ على خصائص القطرات المقاسة في الأنظمة الممثلة التي تم اختبارها.

الشكل 1: تثبيت المكثفات عن طريق تضمين الأجاروز دون إحداث تأثير واضح على خصائص القطرات المقاسة. (أ) مجهر فلوري لبروتين نيوكليوكابسيد بحجم 15 ميكرومولار مع 6 ميكرومولار Cy3-بولي(A) (5٪ موسومة) في المخزن A (25 ملليمولار HEPES، 50 ملليمولار NaCl، pH 7.2) في وجود (+ أغاروز) أو غياب (بدون أغاروز) بنسبة 0.5٪ مع الميكرومول/فولت LMA. تم التقاط الصور بعد 5 دقائق أو 60 دقيقة من المزج / تضمين الأغاروز. الصور تمثل 7 صور تم الحصول عليها في n = 2 تجربة مستقلة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (B) قياس أنصاف قطرات المكثفات الموضح في (A). تعرض البيانات كمخططات مربعات (الصندوق = النطاق بين الربع، الخط المركزي = الوسيط، الشوارب = نطاق البيانات المتبقية، النقطة = القيم الشاذة). يعرض متوسط نصف قطر ± الانحراف المعياري (sd) وعدد القطرات المحللة في كل حالة مباشرة على الرسم البياني. تتبع البيانات توزيعا طبيعيا. لم تعامل القطرات الفردية كنسخ بيولوجية مستقلة للاستدلال الإحصائي. لم يتم إجراء أي اختبار إحصائي؛ يتم عرض التوزيعات بشكل وصفي. (C) FRAP للقطرات المعروضة في (A) عند نقطة زمنية 5 دقائق. تم إجراء التبييض الضوئي باستخدام ليزر 561 نانومتر (Cy3). تظهر البيانات الشدة الممطرة (متوسط ± sd ل n = 3 نسخ مستقلة لكل شرط)، والتي يتم الحصول عليها من خلال تطبيع الإشارة المبيضة إلى قيم ما قبل التبييض، ومنطقة غير مبيضة من نفس العينة، والفلورة الخلفية. (د) إشارة DOSY غير مخففة لبروتين 200 ميكرومولوجين FOS NTD في المخزن B (30 مللي مولار HEPES، 200 مللي مولار KCl، 600 ملليمولار يوريا، pH 7.3) في وجود 0.25، 0.5، أو 1.0٪ واي/فولت أغاروز منتظم. N = 1. (ه) مجهر فلوري كونفوكي وصور STORM لبروتين نيوكليوكابسيد Cy5 بحجم 15 ميكرومولار (5٪ موسوم) مع RNA فيروسي s2m بوزن 6 ميكرومولار في المخزن A يحتوي على 0.5٪ مع الحمض النووي المنخفض (W/v). ممثل n = 3 تجارب مستقلة. شريط المقياس = 1 ميكرومتر في كلتا الصورتين. (و) أطياف 1D ¹H NMR (يسار) و2D [¹⁵نيوتر ¹ساعة] أطياف HSQC NMR (يمين) بقوة 200 ميكرومتر FOS NTD في المخزن B في وجود أو غياب 0.5٪ w/v أغاروز منتظم. N = 1. تم إعادة إنتاج اللوحات (D) و(F) من Emmanouilidis ^{وآخرين.} يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يعتمد نجاح تضمين المكثفات الجزيئية الحيوية في الأجوروز على عدة عوامل. أولا، يجب الحفاظ على الأغاروز عند درجات حرارة عالية بما يكفي لمنع التجلي المبكر، وفي نفس الوقت منخفضة بما يكفي لعدم إزعاج البنى أو التفاعلات الجزيئية الحيوية. أجاروز منخفض الانصهار له نقطة تثبيث بين 26–30 درجة مئوية ونقطة انصهار بين 60–65 درجة مئوية، بينما الأجاروز العادي له نقطة تجل بين 34–38 درجة مئوية ونقطة انصهار بين 90–95 درجة مئوية. ثانيا، الخلط السريع والانتقال إلى وعاء التفاعل النهائي (مثل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أمر حاسم، حيث يمكن أن تؤدي الانحرافات الصغيرة في التوقيت أو درجة الحرارة إلى تضمين غير متساو وبالتالي تضعف قابلية التكرار.

على الرغم من هذه النقاط الحاسمة، يمكن تكييف الطريقة بسهولة لتلبية احتياجات تجريبية مختلفة. بالنسبة للأنظمة التي تفصل الطور ذات البروتينات غير المنتظمة جوهريا أو الأنظمة التي لا تتعرض لإزالة الطبيعة الحرارية، يمكن استخدام الأجاروز العادي بدلا من LMA لتوفير التكلفة. عند تحضير عينات تحتوي على بروتينات ذات مجالات مطوية، أو أي جزيء حساس للحرارة (بيولوجي) حساس للحرارة ومعرض لإزالة الطبيعة، يجب استخدام LMA لمنع إزالة الطبيعية. يمكن تحضير عينة تحكم حرارية فقط/بدون أغاروز لفصل تأثيرات تضمين الأغاروز عن تأثيرات الاحترار العابر للعينات. لتقليل خطر تأثيرات إزالة الطبيعة المعتمدة على درجة الحرارة، فإن الأجاروز منخفض الانصهار مناسب بشكل خاص للعينات الحساسة للحرارة، بينما يمكن ضبط تركيز الأغاروز لتعديل حجم الشبكة ودرجة الحصر الميكانيكي. بالنسبة لقياسات الانتشار عالية الحساسية، مثل طريقة الرنين المغناطيسي النووي المطورة حديثا المسماة LLPS REDIFINE^15,16، يكون أدنى تركيز أغاروز يمنع الترسيب هو الخيار المفضل عادة، عادة بين 0.3–0.5٪ w/v. بالنسبة لتجارب النضج التي تتطلب أسابيع إلى أشهر من الاستقرار، يفضل أن يكون 0.8–1٪ w/v. يجب تحسين هذه المعايير لضمان الاستقرار الفعال دون تغيير شكل أو ديناميكيات المكثفات بشكل ملحوظ، ويجب دائما تكييفها مع النظام المحدد. يتطلب هذا التحقق مقارنة العينات مع وبدون تضمين الأغاروز (وظروف متطابقة) أو مقارنة تركيزات مختلفة من الأغاروز (لاستبعاد تأثيرات الشبكات المعتمدة على التركيز)، على سبيل المثال، استخدام المجهر لتقييم شكل القطرات، أو FRAP لتقييم الانتشار، أو أي طريقة أخرى مناسبة لتقييم خصائص القطرات مهمة للباحث.

وقت التجليم هو اعتبار مهم آخر. يعتمد الوقت الذي يستغرقه تصلب الأجاروز على عدة عوامل، مثل نوع الحاجز، الرقم الهيدروجيني، تركيز الأغاروز النهائي، درجة حرارة البداية، وما إذا كان يستخدم الأجاروز منخفض الانصهار أو العادي. عادة ما يتصلب الأغاروز خلال 5–10 دقائق. يمكن استخدام تجل مخزون الأجاروز كمؤشر على تجليف العينة. وبالمثل، فإن تغيير أوقات ما قبل الحضانة قبل تضمين الأغاروز يتيح توصيفا قابلا لتكرار أحجام القطرات المختلفة. اختيار المخزن المؤقت أيضا حاسم¹⁴. من الضروري تحضير مخزون الأجاروز في نفس المخزن المؤقت المستخدم لتحضير العينات لمنع عدم تطابق المخزون. يجب أن يكون المخزن المؤقت واحدا يعرف فيه النظام بأنه ينفصل طوعا.

يجب مراعاة حساسية درجة الحرارة لكل نظام. تظهر العديد من أنظمة فصل الطور سلوك طور حراري قابل للعكس، يعرف باسم LLPS من نوع UCST/LCST. لذلك، يجب التحقق من صحة التعرض القصير لدرجات حرارة مرتفعة قليلا أثناء خلط الأجاروز لضمان عدم إزعاج سلوك الطور أو خصائص القطرات المقاسة. إذا ظهرت مشاكل، يمكن عادة معالجتها بتحسين ظروف درجة الحرارة، تقليل وقت التعامل، أو تعديل تركيز الأغاروز. على سبيل المثال، رغم أن مخزون LMA يسخن إلى 37 درجة مئوية يفضل أن يسخن، إلا أن مخزونات LMA ستظل سائلة عند 33–35 درجة مئوية.

يعد استكشاف الأخطاء مهمة لأن أنماط الفشل المختلفة قد تظهر حسب العينة وإعداد التجربة. إذا ذابت القطرات عند الخلط مع الأغاروز، فقد يكون ذلك بسبب حرارة LMA الزائدة أو بسبب عدم تطابق المخزن الكهربائي. في هذه الحالة، يجب الحفاظ على مخزون LMA عند درجة الحرارة المستهدفة أو بضع درجات تحتها، وتحضيره في نفس المخزن مع البروتين/الحمض النووي الريبي المعني. إذا حدث تجل مبكر في طرف الماصة، فقد يكون ذلك بسبب برودة ال LMA أو عدم تسخين الأطراف مسبقا. لتجنب ذلك، يجب تسخين الأطراف والأنابيب إلى 37 درجة مئوية، ويجب أن يعمل المشغل بسرعة، ويجب الحفاظ على كتلة التسخين عند درجة الحرارة المستهدفة. إذا حدث الترطيب أو الاندماج أو الترسيب مع مرور الوقت، فقد يكون ذلك بسبب قلة الجل أو عدم تساوي التجل. في هذه الحالة، يمكن زيادة تركيز ال LMA، ويجب ضمان حتى التجلي في درجة حرارة الغرفة. إذا كان محلول الأجاروز يحتوي على جزيئات مرئية، فقد يكون ذلك بسبب ذوبان الأغاروز غير الكامل. في هذه الحالة، يجب تسخين الأغاروز حتى يصبح شفافا تماما ويخلط جيدا قبل الاستخدام (مثل الدوامة). إذا تم إدخال فقاعات الهواء أثناء الخلط أو التقطيع، فقد تتداخل مع التصوير وتؤدي إلى توزيع غير متساو للمكثفات. لتقليل تكون الفقاعات، يجب خلط المحاليل بلطف عن طريق التنبيه ببطء صعودا وهبوطا. إذا لوحظ تجل غير متجانس أو توزيع غير متساو للمكثفات، فقد يكون ذلك بسبب خلط غير كاف أو تدرجات حرارة محلية أثناء التجل. في هذه الحالة، يجب الاحتفاظ بالعينات على كتلة التسخين (أو حمام الماء) حتى تضاف جميع المكونات وتخلط فورا ولكن بلطف، وتترك لتتصلب تحت ظروف حرارة موحدة. يجب تجنب الانحدارات الحادة لدرجات الحرارة؛ يوصى بالتصلب في درجة حرارة الغرفة (ويجب تجنب التصلب في الثلاجة). في التجارب طويلة الأمد، قد يغير تبخر العينة تركيزات المذاب وخصائص المكثفات. لتقليل التبخر، يجب إغلاق العينات بشكل مناسب والحفاظ عليها في بيئة تتحكم فيها الرطوبة كلما أمكن.

على عكس طرق مثل تثبيت بارافورمالديهايد، لا يثبت تضمين الأغاروز العينات كيميائيا. لذلك، تظل المكثفات ديناميكية، وهو أمر مفيد للدراسات الوظيفية لكنه يحد من التخزين طويل الأمد. بالنسبة للأطر الزمنية التجريبية الممتدة، يجب اتخاذ الاحتياطات لمنع التبخر وتغيرات المخزن الاحتياطي، مثل تحولات الرقم الهيدروجيني. بالإضافة إلى ذلك، رغم أن الأجاروز عادة ما يكون منخفض التفاعل في هذه الاختبارات، يجب أخذ التأثيرات غير المباشرة المحتملة على الانتشار أو البيئة المحلية في الاعتبار. إذا اشتبه في تفاعلات الأجاروز والجزيئات الحيوية، مثل ارتباط البروتين غير المحددي بالأجاروز، يمكن النظر في مصفوفات الهيدروجيل البديلة مثل البولي إيثيلين جلايكول دياكريلات المتشابك ضوئيا (PEG-DA)، مع حجم شبكة ومسامية متطابقة. يجب التحقق من عدم وجود تفاعلات من خلال قياس FRAP في وجود وغياب المصفوفة (FRAP).

بالإضافة إلى التثبيت الكيميائي، تستخدم استراتيجيات الانحراف السطحي مثل الأسطح المغلفة بمادة BSA، أو PEG، أو الأسطح السطحية السطحية والطبقات الدهنية المدعومة عادة لتقليل التصاق المكثفات والترطيب. بينما تقلل هذه الأساليب فعليا من التفاعلات السطحية، إلا أنها لا تمنع حركة المكثفات أو الترسيب أو الاندماج. لذلك، يكمل تضمين الأجاروز هذه الطرق من خلال توفير تثبيت فيزيائي مع الحفاظ على ديناميكيات المكثفات، مما يجعله مفيدا بشكل خاص للتجارب الطويلة، والتصوير ثلاثي الأبعاد، والقياسات الكمية التي تتطلب تموضع العينة مستقرا. لذا يجب أن يكون اختيار الطريقة موجها بالهدف التجريبي.

بشكل عام، توفر هيدروجيلات الأجاروز وسيلة بسيطة لكنها فعالة لتثبيت المكثفات في ثلاثة أبعاد. يمنع ذلك ترطيب القطرات والاندماج دون أن يؤثر بشكل ملحوظ على الخصائص الجوهرية المقاسة في الأنظمة الممثلة التي تم اختبارها، مما يتيح تجارب وتقنيات زمنية تتطلب أوقات اكتساب طويلة، مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي¹⁵. ورغم أن هذه الطريقة قد لا تكون مناسبة لجميع أنظمة فصل الطور لأسباب عدة، إلا أن الطريقة المقدمة هنا قابلة للتطبيق على دراسة عدة مكثفات جزيئية حيوية ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة عمليات النضج ذات الصلة بآليات الأمراض التنكسية العصبية¹⁷.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.5 mL tubes	any brand is OK	N/A
18-well chamber slides	ibidi	81816	for STORM
agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	molecular biology grade
agarose, ultra pure	Invitrogen	16500500
channel slides	ibidi	80606	for microscopy
confocal microscope	Nikon	N/A
Cy5-dye, NHS chemistry	Jena Biosciences	FP-201-CY5	for labeling protein
D2O (deuterium oxide)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD protein	N/A	N/A	expressed recombinantly in our lab, as described in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
heating block or water bath	any brand is OK	N/A	any make or model will do
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
image analysis software	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR spectrometer	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI room-temperature probe, see ref 13 for more details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR tube	Bruker	N/A	3 mm, glass
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	any brand is OK	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	for labelling RNA
poly(A) RNA	N/A	N/A	in-house in vitro transcribed in our lab, length approx 50 nucleotides, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m RNA	N/A	N/A	in-house in vitro transcribed in our lab, length 45 nucleotides, sequence: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
SARS-CoV-2 nucleocapsid protein	N/A	N/A	expressed recombinantly in our lab, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
software for plotting (e.g. R)	R-Project	Version 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM microscope	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM plugin	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
tips for the used pipettes	any brand is OK	N/A
TopSpin	Bruker	Version 3.2 and 4.1
urea	Sigma-Aldrich	U5128