مقالة بحثية

الحساسية تجاه مثبطات الكيناز المعتمد على السيكلين 4/6 بوساطة LINC01871 في سرطان الثدي البشري

35 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72156

⸱

سبتمبر 8, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Breast Surgery, Clinical Oncology School of Fujian Medical University, Fujian Cancer Hospital

في هذه المقالة

ملخص

أدت التحليلات المعلوماتية الحيوية والتجريبية المتكاملة إلى تحديد LINC01871 كمؤشر محتمل للحساسية تجاه مثبطات الكيناز المعتمد على السيكلين 4/6، كما أظهرت أن الإفراط في تعبير LINC01871 يثبط تكاثر سرطان الثدي ويرتبط بانخفاض إشارات NF-κB.

الملخص

لا يزال سرطان الثدي هو الورم الخبيث الأكثر تشخيصاً لدى النساء، وتؤدي المقاومة لمثبطات الكيناز المعتمد على السيكلين 4 و6 (CDK4/6) إلى الحد من فعالية العلاج على المدى الطويل. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) المرتبط بالحساسية المتوقعة لمثبطات CDK4/6 واستقصاء وظائفه البيولوجية في سرطان الثدي. تم دمج بيانات النسخ من أطلس جينوم السرطان (TCGA) وبيانات الحساسية الدوائية من قاعدة بيانات جينوميات الحساسية الدوائية في السرطان 2 (GDSC2)، وتم التنبؤ بالحساسية الدوائية باستخدام خوارزمية oncoPredict. تم تحديد الـ lncRNAs المرشحة من خلال تحليل التعبير التفاضلي، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون، والتحليل الإنذاري، والتعلم الآلي. بعد ذلك، تم تقييم الوظائف البيولوجية لـ LINC01871 باستخدام تجارب مخبرية (in vitro) وتجارب حيوية (in vivo). تم تحديد اثنين وستين من الـ lncRNAs المرتبطة بالحساسية المتوقعة لعقاري ribociclib وpalbociclib، واختيار ستة من الـ lncRNAs الأساسية. وأظهر LINC01871 أعلى أداء تمييزي للحساسية الدوائية المتوقعة. ارتبط الإفراط في تعبير LINC01871 بزيادة حساسية خلايا سرطان الثدي لـ ribociclib وpalbociclib، وتثبيط تكاثر الخلايا، وتعزيز الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، وتثبيط إشارات العامل النووي كابا ب (NF-κB). وأظهر تحليل النسخ أحادي الخلية تعبيراً مرتفعاً لـ LINC01871 في الخلايا التائية (T cells) والخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells)، بينما أظهرت تحليلات الارتشاح المناعي القائمة على النسخ أن التعبير المرتفع لـ LINC01871 ارتبط بزيادة الارتشاح المناعي. تحدد هذه النتائج LINC01871 كعلامة بيولوجية مرشحة للحساسية تجاه مثبطات CDK4/6 وتثبت تأثيراته الكابحة للأورام في سرطان الثدي. وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات السريرية والآلية للتحقق من قيمته التنبؤية وأهميته العلاجية.

المقدمة

لا يزال سرطان الثدي سبباً رئيسياً للوفيات الناجمة عن السرطان بين النساء في جميع أنحاء العالم، على الرغم من التقدم المستمر في إدارته السريرية1,2. وقد توسع العلاج تدريجياً ليتجاوز العلاج الهرموني والعلاج الكيميائي ليشمل نهجاً تستهدف الجزيئات3. ومن بين هذه النهج، حققت مثبطات الكينازات المعتمدة على السيكلين 4 و6 (CDK4/6)، مثل ribociclib وpalbociclib وabemaciclib، فوائد سريرية كبيرة في حالات سرطان الثدي الإيجابي لمستقبلات الإستروجين و/أو مستقبلات البروجسترون4,5,6. ومع ذلك، يمكن أن يصاحب العلاج المطول حدوث مقاومة مكتسبة، مما يحد من استدامة الفائدة العلاجية7.

يعمل تثبيط CDK4/6 بشكل أساسي من خلال محور تنظيم الدورة الخلوية Rb–E2F. يؤدي تثبيط نشاط CDK4/6–cyclin D إلى تقليل فسفرة بروتين retinoblastoma (Rb)، مما يسمح لبروتين Rb ناقص الفسفرة بكبح النسخ المعتمد على E2F، وبالتالي تعزيز التوقف في طور G1 والحد من تكاثر الخلايا الورمية8. وعلى الرغم من توصيف عدة آليات تساهم في مقاومة مثبطات CDK4/6، إلا أنها لا تفسر بشكل كامل الاختلافات في الاستجابة للعلاج. تشمل هذه الآليات التنشيط الشاذ لمسار phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin (PI3K/AKT/mTOR) وزيادة تعبير معقدات cyclin–CDK9,10. ومن الجدير بالذكر أن مكونات مسار PI3K/AKT/mTOR هي ذاتها أهداف علاجية في الحالات المتقدمة من المرض11. وبشكل جماعي، تشير هذه الملاحظات إلى أن هناك محددات جزيئية إضافية للحساسية والمقاومة لمثبطات CDK4/6 لا تزال بحاجة إلى تحديد. وتتضح الأهمية السريرية للمؤشرات الحيوية التنبؤية من خلال الاستراتيجيات الناشئة الموجهة بالمؤشرات الحيوية لسرطان الثدي النقيلي إيجابي مستقبلات الهرمونات (HR-positive). فعلى سبيل المثال، يمكن للتحليل المتسلسل للحمض النووي الورمي الدوار (ctDNA) الكشف عن ظهور طفرات ESR1 أثناء العلاج القائم على مثبطات CDK4/6. وقد أظهرت دراستا PADA-1 وSERENA-6 أن هذا الكشف الجزيئي يمكن أن يوجه نحو تغيير مبكر في العلاج الهرموني مع الحفاظ على تثبيط CDK4/612,13. ومع ذلك، تمثل طفرات ESR1 محدداً واحداً فقط من محددات الاستجابة العلاجية ولا يمكنها تفسير جميع حالات الحساسية أو المقاومة. ويكتسب هذا القصور أهمية سريرية متزايدة لأن المريضات المصابات بسرطان الثدي النقيلي إيجابي HR/سلبي HER2 اللواتي يتطور المرض لديهن أثناء العلاج القائم على مثبطات CDK4/6 لديهن الآن عدة خيارات علاجية لاحقة، بما في ذلك مخفضات مستقبلات الإستروجين الانتقائية الفموية، ومثبطات مسار PI3K/AKT، والمقترنات بين الأجسام المضادة والأدوية. لذا، فإن تحديد مؤشرات حيوية مرشحة إضافية مرتبطة بتفاوت الحساسية لمثبطات CDK4/6 قد يساعد في تمييز المريضات الأكثر عرضة للاستفادة من هذه العلاجات عن اللواتي قد يتطلبن تكييفاً مبكراً للعلاج.

تُعد الحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل (lncRNAs) نسخاً تفتقر إلى القدرة على تشفير البروتين وتشارك في تنظيم العديد من العمليات البيولوجية. وقد ارتبطت عدة أنواع من lncRNAs بتطور السرطان والاستجابة للعلاج. ففي سرطان الخلايا الحرشفية الفموي، أُشير إلى أن LOC100506114 يعزز التكاثر والهجرة من خلال تفاعله مع عامل النسخ RUNX والتنظيم اللاحق للتعبير الجيني في المصب14. وفي سرطان الثدي، ارتبط HISLA بزيادة تحلل السكر وتعزيز المقاومة لموت الخلايا المبرمج15، بينما يساهم LINC02568 في المقاومة الغدية من خلال تنظيم ESR1 وCA1216. ورغم الدور المعترف به لـ lncRNAs في بيولوجيا السرطان، إلا أن علاقتها بمقاومة مثبطات CDK4/6 لا تزال غير محددة بشكل كافٍ. وفي هذه الدراسة، استُخدمت استراتيجية متكاملة تعتمد على الأوميكس المتعددة والتعلم الآلي لتحديد lncRNAs المرتبطة بالحساسية المتوقعة لعقاري ribociclib وpalbociclib، والتي برز من خلالها LINC01871 كمرشح محتمل. بعد ذلك، قمنا بفحص ارتباط LINC01871 بالحساسية تجاه كلا العاملين، وقيمنا تأثيراته على تكاثر خلايا سرطان الثدي باستخدام نهج تجريبية مخبرية (in vitro) وحيوية (in vivo).

البروتوكول

نُفذت جميع الإجراءات التي تضمنت حيوانات وفقاً لمتطلبات رعاية الحيوان المؤسسية، وحصلت على موافقة لجنة أخلاقيات ورعاية الحيوان في مستشفى فوجيان للسرطان. &؛ مستشفى السرطان بجامعة فوجيان الطبية (رقم الموافقة SQ2021-159-01).

جمع البيانات
تم تنزيل ملفات النسخ transcriptomic الشاملة من TCGA في يناير 2025 وتحويلها إلى عدد النسخ لكل مليون (TPM) قبل إجراء التحليلات اللاحقة. كما تم الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (single-cell RNA-sequencing) من مستودع Gene Expression Omnibus (GEO)، باستخدام مجموعة البيانات GSE161529.

تقدير الحساسية الدوائية لـ ribociclib و palbociclib
استُخدمت بيانات GDSC2 لتدريب نموذج التنبؤ بالاستجابة الدوائية، واستُخدمت الملفات النسخية لـ TCGA-BRCA كمجموعة بيانات للاختبار. تم استرجاع المعلومات السريرية المطلوبة لتحليل المجموعات الفرعية من مجموعة بيانات TCGA Pan-Cancer Atlas Clinical with Follow-up. تم أخذ أربعة متغيرات سريرية في الاعتبار: حالة ER (breast_carcinoma_estrogen_receptor_status)، وحالة PR (breast_carcinoma_progesterone_receptor_status)، وحالة HER2 المحددة بواسطة IHC (lab_proc_her2_neu_immunohistochemistry_receptor_status)، وحالة HER2 المحددة بواسطة FISH (lab_procedure_her2_neu_in_situ_hybrid_outcome_type). تم تصنيف الورم على أنه HR-positive إذا تم تدوين ER أو PR على أنها "Positive". وتم تصنيف الورم على أنه HER2-negative عندما كانت إحدى نتيجتي HER2 IHC أو FISH سلبية على الأقل ولم تكن أي من الفحصين إيجابية. استُبعدت الحالات التي تعذر فيها تحديد حالة HR أو HER2 بشكل نهائي. وبناءً على هذه المعايير، تم تحديد 601 مريضاً على أنهم HR-positive/HER2-negative. ومن بينهم، كان لدى 599 مريضاً سجلات مقابلة في كل من مجموعة بيانات Pan-Cancer السريرية ومصفوفة التعبير TCGA-BRCA، وتم إدراجهم في تحليل المجموعات الفرعية. تم تقدير قيم IC₅₀ لـ ribociclib و palbociclib باستخدام حزمة oncoPredict R (الإصدار 1.2) مع استخدام المعلمات الافتراضية. استُخدمت المخططات المبعثرة التي تم إنشاؤها بواسطة ggplot2 لعرض توزيع قيم IC₅₀ المتوقعة بين المرضى. تم تصنيف المرضى ضمن أعلى 25% من قيم IC₅₀ المتوقعة على أنهم مقاومون، بينما صنف أولئك الذين يقعون ضمن أدنى 25% على أنهم حساسون.

تحديد الجينات المرتبطة بمقاومة مثبطات CDK4/6
تم تقييم التعبير التفاضلي بين المجموعات المتوقع حساسيتها والمجموعات المقاومة باستخدام حزمة limma، وعُرضت أنماط التعبير الجيني الناتجة في شكل مخططات بركانية (volcano plots) باستخدام ggplot2. بعد ذلك، أُجري تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA) باستخدام حزمة WGCNA لتحديد وحدات التعبير المرتبطة بالمقاومة لكل من مثبطات CDK4/6. تم تحديد الجينات المشتركة عبر مجموعات البيانات الأربع الناتجة وتوضيحها باستخدام حزمة VennDiagram. ثم خضعت الجينات المتقاطعة لتقييم عن طريق تحليل البقاء على قيد الحياة لـ Kaplan–Meier وانحدار Cox أحادي المتغير باستخدام حزمتي survival و survminer، مع إنشاء منحنيات البقاء المقابلة للتصور البياني. أُدخلت الجينات التي حققت دلالة إحصائية في كلا تحليلي البقاء في نموذج انحدار LASSO باستخدام حزمة glmnet لاختيار عوامل التنبؤ الأساسية. ثم تم تقييم قدرة الجينات المختارة على التمييز بين مقاومة الأدوية المتوقعة من خلال تحليل ROC باستخدام pROC، مع قياس الأداء عن طريق المساحة تحت منحنى ROC. وقورنت قيم AUC للأدوية المختلفة بيانياً باستخدام المخططات الشريطية التي تم إنشاؤها بواسطة ggplot2.

تحليل الجين المنفرد LINC01871
تمت أولاً مقارنة تعبير LINC01871 بين الأنسجة الورمية والطبيعية عن طريق تحليل التعبير التفاضلي. بعد ذلك، تم فحص ارتباطه الإنذاري عبر أنواع متعددة من السرطان باستخدام تحليل البقاء على قيد الحياة وفق منهج Kaplan–Meier وانحدار Cox أحادي المتغير باستخدام حزم R وهي survival و survminer. كما تم تقييم الاختلافات في تعبير LINC01871 بين المجموعات المرضية السريرية باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب (Wilcoxon rank-sum test) وعُرضت على شكل مخططات صندوقية باستخدام ggpubr. وبالنسبة لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (single-cell RNA-sequencing)، فقد أجريت المعالجة المسبقة للبيانات والتحليلات اللاحقة باستخدام Seurat. وتم تصحيح التباين بين الدفعات باستخدام Harmony بإعدادات المعلمات الافتراضية. وعقب تصحيح الدفعات، تم تمثيل مجموعات الخلايا الناتجة في تضمين UMAP. ثم تم تعيين هويات الخلايا تلقائياً باستخدام SingleR بالاعتماد على ملفات النسخ المرجعية.

تحليل الإثراء الوظيفي
تم تحديد الجينات التي أظهرت تعبيراً تفاضلياً بين مجموعتي LINC01871 المرتفعة والمنخفضة باستخدام حزمة limma. وبالتوازي مع ذلك، استُخدم تحليل ارتباط بيرسون لتحديد جزيئات mRNA التي ارتبطت مستويات تعبيرها بتعبير LINC01871. بعد ذلك، أُجريت تحليلات إثراء GO وKEGG باستخدام clusterProfiler. وعُرضت ملفات الإثراء الناتجة على شكل مخططات شريطية وفقاعية تم إنشاؤها باستخدام ggplot2.

تحليل الارتشاح المناعي
تم توصيف الارتشاح للخلايا المناعية في البداية باستخدام CIBERSORT مع مصفوفة التوقيع LM22، والتي طُبقت لتقدير التوزيع النسبي لـ 22 مجموعة من الخلايا المناعية. وتم تمثيل الاختلافات في هذه التقديرات بين مجموعات التعبير المرتفع والمنخفض لـ LINC01871 بصرياً باستخدام ggpubr. بعد ذلك، حُسبت درجات السدى (Stromal)، والمناعة (immune)، وESTIMATE للعينات الفردية باستخدام حزمة estimate وعُرضت على شكل مخططات كمان (violin plots). بالإضافة إلى ذلك، أُجري تحليل إثراء مجموعة الجينات للعينة الواحدة (ssGSEA) باستخدام حزمة GSVA لتقدير الوفرة النسبية لمجموعات الخلايا المناعية في كل عينة. ثم قُيمت الاختلافات في تقديرات الارتشاح المناعي الناتجة بين مجموعتي تعبير LINC01871 وتم تمثيلها بصرياً باستخدام ggpubr.

زراعة الخلايا
استُخدمت في هذه الدراسة الخطوط الخلوية MDA-MB-231 وMCF-10A وHEK293T. تم استزراع خلايا MDA-MB-231 وHEK293T في وسط DMEM يحتوي على 10% من مصل الجنين البقري، بينما حُفظت خلايا MCF-10A في وسط مُعد خصيصاً لهذا الخط الخلوي. حُفظت المزارع عند 37°C في ظروف رطبة مع 5% CO₂. ولإنشاء خلايا ذات تعبير مفرط عن LINC01871، تم إجراء تر transfection مشترك لبنية التعبير المفرط عن LINC01871 وبلازميدات التغليف الفيروسية البطيئة في خلايا HEK293T لإنتاج الفيروسات البطيئة. بعد ذلك، جُمِع السائل الطافي المحتوي على الفيروس واستُخدم لنقل العدوى (transduce) لخلايا MDA-MB-231. تم اختيار الخلايا المنقولة باستخدام 1 μg/mL من puromycin. خضعت كل من مجموعة التحكم من النوع البري والخلايا المنقولة للمعالجة بـ puromycin، وأُنهيت عملية الاختيار بعد 3–4 أيام بمجرد موت جميع خلايا التحكم من النوع البري.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR)
تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) الخلوي باستخدام كاشف RNAiso Plus، وضُبطت تركيزات الـ RNA إلى مستويات متكافئة قبل عملية النسخ العكسي. ثم تم توليد الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA) باستخدام مجموعة أدوات النسخ العكسي وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بدأت عملية تضخيم RT-qPCR بمرحلة المسخ عند 95°C لمدة 30 s، تلتها 40 دورة تتكون من 95°C لمدة 5 s، و60°C لمدة 30 s، و72°C لمدة 30 s. وتم تحديد وفرة النسخ باستخدام طريقة 2−ΔΔCt مع استخدام GAPDH للمعيرة. وتدرج تسلسلات البادئات المستخدمة في التحليل في الجدول التكميلي 1.

مقايسات تكاثر الخلايا والسمية الخلوية
لتقييم السمية الخلوية للعقار، تم استزراع 8,000 خلية في كل بئر من أطباق ذات 96 بئرًا، وتُركت لتنمو لمدة 24 h. بعد ذلك، استُبدل وسط المزرعة بوسط جديد يحتوي على تركيزات العقار المحددة، ثم تلا ذلك تحضين لمدة 24 h إضافية. بعد ذلك، أُضيف كاشف CCK-8، وحُفظت الأطباق في الظلام لمدة 2 h قبل تسجيل الامتصاصية عند 450 nm. استُخدمت هذه القياسات لرسم منحنيات الاستجابة للجرعة الدوائية وتحديد قيم IC₅₀. وبالنسبة لقياسات التكاثر، جُهزت الخلايا بكثافة 1,000 cells/mL، وأُضيف 100 μL من معلق الخلايا إلى كل بئر من طبق ذي 96 بئرًا. أُجريت قياسات CCK-8 على فترات زمنية مدتها 24 h. وفي كل نقطة زمنية، أُضيف الكاشف وحُضنت الأطباق في الظلام لمدة 2 h قبل قياس الامتصاصية عند 450 nm لتقييم تكاثر الخلايا.

اختبار تكوين المستعمرات
لإجراء تجارب تكوين المستعمرات، تم زرع 1,000 خلية في كل بئر من أطباق ذات 6 آبار، مع تضمين ثلاث مكررات لكل مجموعة تجريبية. تم الحفاظ على الخلايا لمدة 1–2 أسبوع للسماح بنمو مستعمرات مرئية. بعد ذلك، تم التخلص من الوسط الغذائي، وثُبتت الخلايا في 4% paraformaldehyde، ثم غُسلت بمحلول PBS، وصُبغت لاحقاً بـ 1% crystal violet.

مقايسة دمج 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine
وُزعت الخلايا من كل مجموعة تجريبية في أطباق ذات 12 بئراً وحُفظت طوال الليل. وفي اليوم التالي، عُرِّضت الخلايا لمحلول EdU العامل لمدة 2 h. وبعد التثبيت والنفاذية، أُجري وسم EdU، يليه تلوين مضاد للنواة باستخدام Hoechst. ثم استُخدم المجهر الفلوري لالتقاط الصور لتقييم دمج EdU.

لطخة ويسترن (Western blot)
تم تحلل الخلايا في محلول RIPA المنظم المضاف إليه مثبطات البروتياز والفوسفاتيز للحصول على البروتين الكلي. وقُدرت تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA. وبعد إضافة محلول التحميل، تم مسخ عينات البروتين عند 95°C وفصلها بواسطة تقنية SDS–PAGE قبل نقلها إلى أغشية PVDF. حُجبت الأغشية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h، ثم حُضنت لاحقاً مع الأجسام المضادة الأولية المحددة عند 4°C طوال الليل (الجدول التكميلي 2). وبعد ثلاث غسلات بمحلول TBST، تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 45 min في درجة حرارة الغرفة. وكُشفت إشارات البروتين عن طريق التألق الكيميائي المعزز (ECL) ثم تم تصويرها. واستُخدم GAPDH أو β-actin كضابط تحميل.

تحليل قياس التدفق الخلوي
لتقييم الدورة الخلوية، جُمعت الخلايا عن طريق التريبسين، وغُسلت بمحلول PBS، ثم ثُبتت طوال الليل في إيثانول بتركيز 70% عند درجة حرارة 4°C. غُسلت الخلايا المثبتة مرة أخرى بمحلول PBS وحُضنت مع كاشف الكشف عن الدورة الخلوية قبل إجراء قياس التدفق الخلوي. ولتقييم الموت الخلوي المبرمج، غُسلت الخلايا المحصودة بمحلول PBS وعُلقت في محلول ربط منظم. صُبغت الخلايا المعلقة بـ Annexin V ويوديد البروبيديوم (PI) لمدة 10–15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف محمية من الضوء. أُجري بعد ذلك قياس التدفق الخلوي لتحديد كمية مجموعات الخلايا التي تمر بالموت الخلوي المبرمج.

نماذج الفئران المزروعة غريباً (Xenograft)
أُجريت التجارب في الجسم الحي (In vivo) باستخدام فئران NOD/ShiLtJGpt نقص المناعة البالغة من العمر خمسة أسابيع. حُفظت الحيوانات في منشأة خالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) وفق جدول إضاءة/ظلام لمدة 12 ساعة، مع عدم وضع أكثر من أربعة حيوانات في كل قفص. وقبل زراعة الخلايا الورمية، خُدرت الفئران عن طريق استنشاق الـ isoflurane. وبعد التأكد من التخدير الكافي، وُزعت الحيوانات على مجموعتين وتلقت حقناً في الوسادة الدهنية البطنية إما بخلايا MDA-MB-231 ضابطة أو خلايا MDA-MB-231 التي تعبر عن LINC01871 بشكل مفرط. وقد حُدد نمو الورم كحصيلة أولية. سُجلت أبعاد الورم باستخدام الفرجار (calipers) بفواصل زمنية تتراوح بين 3-4 أيام. وحُسب حجم الورم وفق المعادلة V = ( L x W2 ) / 2، حيث يشير L إلى أكبر قطر للورم و W إلى أصغر قطر، مع التعبير عن الحجم بـ mm3. أُنهيت الدراسة قبل أن يصل أي ورم إلى قطر أقصى قدره 1.5 cm أو حجم 2,000 mm3. وعند نقطة النهاية التجريبية، خُدرت الفئران بـ isoflurane، وأُجري الخلع العنقي فقط بعد التأكد من التخدير العميق. كما تم القتل الرحيم للحيوانات قبل نقطة النهاية المحددة إذا لُوحظت علامات واضحة على الضيق، بما في ذلك الخمول، أو فقدان الوزن، أو وضعية الجسم المنحنية، أو عدم القدرة على الأكل أو الشرب. وعند اكتمال الدراسة، أُزيلت الأورام ومن ثم وُزنت وصُوّرت.

التحليل الإحصائي
أُجريت تحليلات البيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 10.3.1 ولغة R الإصدار 4.3.1. وقد تم اختيار الطريقة الإحصائية المطبقة على كل مقارنة وفقاً لتصميم الدراسة وتوزيع البيانات المقابلة. وشملت التحليلات، حسبما اقتضى الأمر، اختبار Student’s t-test، واختبار t-test المقترن، واختبار Wilcoxon signed-rank، واختبار Mann–Whitney U، وتحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه، وتحليل Kaplan–Meier مع اختبار log-rank، وانحدار المخاطر النسبية لـ Cox أحادي المتغير، وتحليل ارتباط Pearson أو Spearman. وحُددت الدلالة الإحصائية باستخدام قيمة P ثنائية الجانب <0.05.

النتائج

يرتبط LINC01871 ارتباطاً وثيقاً بالحساسية تجاه عقاري ribociclib وpalbociclib
تم تقدير قيم IC50  المتوقعة لعقاري ribociclib وpalbociclib للمرضى في مجموعة TCGA-BRCA باستخدام بيانات GDSC2 وترتيبها ترتيباً تصاعدياً. تم تعيين المرضى ضمن الربع الأدنى من قيم IC50 المتوقعة إلى المجموعة الحساسة، بينما تم تعيين أولئك الموجودين ضمن الربع الأعلى إلى المجموعة المقاومة (الشكل 1A،B). وقد حددت مقارنة هذه المجموعات الـ lncRNAs ذات التعبير التفاضلي لكل عقار (الشكل التكميلي 1A،B). كما حدد تحليل WGCNA وحدات lncRNA مرتبطة بشكل كبير بالحساسية المتوقعة تجاه ribociclib وpalbociclib (الشكل 1C،D؛ الشكل التكميلي 1C،D). وأدى دمج مجموعات الجينات الأربع الناتجة إلى الحصول على 62 من الـ lncRNAs المشتركة (الشكل 1E)، ارتبط 18 منها بشكل كبير بالإنذار في كل من تحليل انحدار Cox أحادي المتغير وتحليلات البقاء على قيد الحياة بطريقة Kaplan–Meier. ثم تم تطبيق انحدار LASSO لمزيد من تنقية هذه المجموعة، مما أدى إلى تحديد ستة من الـ lncRNAs ذات الصلة بالإنذار، وهي: ANKRD44-AS1 وAC083837.1 وAC242842.1 وDBH-AS1 وLINC00926 وLINC01871 (الشكل 1F،G؛ الشكل التكميلي 2A). بعد ذلك، تمت مقارنة قدرتها على تمييز مقاومة العقار المتوقعة من خلال تحليل AUC. ومن بين المرشحين الستة، حقق LINC01871 أعلى متوسط AUC عبر عقاري ribociclib وpalbociclib (الشكل 1H–J؛ الشكل التكميلي 2B،C).

figure-results-1
الشكل 1. تحديد الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل المرتبط بالحساسية المتوقعة لعقاري ribociclib و palbociclib. 
(A,B) توزيع قيم التركيز المثبط النصفي الأقصى المتوقعة (IC50) لعقار palbociclib (A) وعقار ribociclib (B) في مجموعة سرطان الثدي الغازي من أطلس جينوم السرطان (TCGA-BRCA)، والتي تم تقديرها باستخدام مجموعة بيانات جينوميات حساسية الأدوية في السرطان 2 (GDSC2). (C,D) تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك المرجح (WGCNA) الذي يوضح ارتباطات الوحدة بالسمة لعقار palbociclib (C) وعقار ribociclib (D). (E) مخطط فين يوضح الجينات المشتركة بين مجموعات الجينات ذات التعبير المتباين ومجموعات الجينات المشتقة من WGCNA المرتبطة بالعقارين. (F,G) انحدار مشغل التقلص والاختيار المطلق الأدنى (LASSO) لاختيار الأحماض النووية الريبية غير المشفرة الطويلة (lncRNAs) ذات الصلة بالإنذار المرضي. (H) مقارنة قيم المساحة تحت منحنى خصائص تشغيل المستقبل (AUC) لستة lncRNAs تم اختيارها بواسطة LASSO. (I,J) منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) التي تقيم قدرة LINC01871 على التمييز بين الحساسية المتوقعة لعقار ribociclib (I) وعقار palbociclib (J). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أدى التعبير المفرط عن LINC01871 إلى تعزيز الحساسية الدوائية في خلايا سرطان الثدي
ضمن مجموعة TCGA-BRCA، ارتبط التعبير المرتفع عن LINC01871 بانخفاض قيم IC50 المتوقعة لكل من ribociclib وpalbociclib (الشكل 2A,B). تم فحص هذه العلاقة بشكل أكبر في المجموعة الفرعية ذات الصلة سريرياً وهي HR-positive/HER2-negative (n = 599). وفي هذه المجموعة الفرعية، كانت قيم IC50 المتوقعة لكلا العاملين أقل بكثير لدى المرضى الذين يعانون من تعبير مرتفع عن LINC01871 مقارنة بأولئك الذين يعانون من تعبير منخفض. علاوة على ذلك، ارتبط تعبير LINC01871 عكسياً مع قيم IC50 المتوقعة لـ ribociclib وpalbociclib (الشكل التكميلي 3A,B). بعد ذلك، تم فحص الارتباط الحسابي تجريبياً؛ حيث أظهرت مقايسات السمية الخلوية حساسية أكبر لكل من ribociclib وpalbociclib في خلايا سرطان الثدي التي تعبر بشكل مفرط عن LINC01871 مقارنة بخلايا التحكم المتجهة (الشكل 2C,D). وأظهر قياس التدفق الخلوي نسبة أعلى من الخلايا في طور G1 ونسبة أقل في طور S بعد التعبير المفرط عن LINC01871، مما يتفق مع تعزيز توقف الدورة الخلوية في طور G1 (الشكل 2E). وفي مقايسات تكوين المستعمرات، أدت التركيزات المتزايدة من ribociclib أو palbociclib إلى تقليل تكوين المستعمرات تدريجياً (الشكل 2F,G). وعند تركيزات دوائية متكافئة، كانت القدرة على تكوين المستعمرات أقل بكثير في الخلايا التي تعبر بشكل مفرط عن LINC01871 مقارنة بخلايا التحكم المتجهة. بالإضافة إلى ذلك، كشف تحليل Western blot عن مستويات أقل من CDK4 وCDK6 وcyclin D1، مصحوبة بانخفاض في فسفرة RB، في الخلايا التي تعبر بشكل مفرط عن LINC01871 (الشكل 2H). وكانت هذه التغيرات الجزيئية متوافقة مع زيادة توقف طور G1 الملاحظ بعد التعبير المفرط عن LINC01871.

figure-results-2
الشكل 2. ارتباط الإفراط في تعبير LINC01871 بالحساسية تجاه مثبطات الكيناز المعتمد على السيكلين 4/6 في خلايا سرطان الثدي.  (A,B) الحساسية المتوقعة لعقار palbociclib (A) وعقار ribociclib (B) وفقاً لانخفاض أو ارتفاع تعبير LINC01871. (C,D) منحنيات الاستجابة لجرعة الدواء لكل من palbociclib (C) وribociclib (D) في الخلايا الضابطة (vector-control) والخلايا التي تعاني من الإفراط في تعبير LINC01871، مع توضيح قيم التركيز المثبط النصفي الأقصى (IC50) في كل لوحة. (E) تقييم توزيع الدورة الخلوية باستخدام قياس التدفق الخلوي في الخلايا الضابطة والخلايا التي تعاني من الإفراط في تعبير LINC01871. (F,G) تكوين المستعمرات بعد المعالجة بتركيزات متزايدة من palbociclib (F) وribociclib (G). (H) تقييم تحليل ويسترن (Western blot) لكل من الكيناز المعتمد على السيكلين 4 (CDK4)، والكيناز المعتمد على السيكلين 6 (CDK6)، والسيكلين D1 (CCND1)، وبروتين الورم الأرومي الشبكي (RB)، وبروتين RB المفسفر (p-RB)، مع استخدام β-actin كضابط تحميل. OE-LINC01871، تعبير مفرط لـ LINC01871؛ ns، غير دال إحصائياً. أُجريت جميع التجارب بشكل مستقل في ثلاث مكررات. البيانات معروضة كمتوسط ± SD. تم تحديد قيم IC50 عن طريق الانحدار غير الخطي. حُللت بيانات توزيع الدورة الخلوية وتكوين المستعمرات باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA). *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، و****P < 0.0001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نزوع المرضى الذين لديهم تعبير عالٍ عن LINC01871 إلى تحقيق نتائج سريرية مواتية
تم إجراء مزيد من الفحص للارتباط الإنذاري لـ LINC01871 في مجموعة TCGA-BRCA. وأشارت تحليلات Kaplan–Meier إلى أن التعبير الأعلى عن LINC01871 ارتبط عموماً بفترة بقاء إجمالية أطول وفترة خلو من تطور المرض (الشكل 3A؛ الشكل التكميلي 3C). كما كشفت مقارنات العينات المزدوجة وغير المزدوجة عن انخفاض معنوي في تعبير LINC01871 في الأنسجة الورمية مقارنة بالأنسجة الطبيعية (الشكل 3B،C). بعد ذلك، قمنا بفحص العلاقة بين تعبير LINC01871 والسمات المرضية السريرية. وقد نزع التعبير المنخفض عن LINC01871 إلى الارتباط بحجم ورم أكبر، ولوحظ لدى المرضى المسجلين كمتوفين مقارنة بأولئك المسجلين كأحياء (الشكل 3D،E). ومن بين المرضى الذين تلقوا علاجاً إشعاعياً، أظهر تحليل المجموعات الفرعية نتائج بقاء أكثر ملاءمة بشكل معنوي لدى أولئك الذين لديهم تعبير عالٍ عن LINC01871 (الشكل التكميلي 3D). وبناءً على ذلك، تم تطوير مخطط إنذاري (nomogram) يدمج تعبير LINC01871 مع خصائص سريرية متعددة (الشكل التكميلي 3E). وأظهر تحليل المعايرة توافقاً وثيقاً بين احتمالات البقاء المقدرة بواسطة المخطط والنتائج المرصودة (الشكل التكميلي 3F).

figure-results-3
الشكل 3تعبير LINC01871، والارتباطات الإنذارية، وتثبيط تكاثر سرطان الثدي. 
(أ) تحليل كابلان-ماير للبقاء الإجمالي مقسماً حسب تعبير LINC01871. (ب، ج) تحليلات مزدوجة (ب) وغير مزدوجة (ج) لمقارنة تعبير LINC01871 بين الأنسجة الطبيعية والأنسجة الورمية. (د، هـ) تعبير LINC01871 وعلاقته بفئة الورم T (د) وحالة البقاء (هـ). (و) مقارنة التعبير النسبي لـ LINC01871 بين خلايا MCF-10A وخلايا MDA-MB-231. (ز) تأكيد الإفراط في تعبير LINC01871 في خلايا MDA-MB-231 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي. (ح-ي) تقييم تكاثر الخلايا بواسطة مقايسة طقم عد الخلايا-8 (CCK-8) (ح)، ومقايسة تكوين المستعمرات (ط)، و5-إيثينيل-2′مقايسة دمج 5-ديوكسي يوريدين (EdU) (J). يمثل شريط المقياس في اللوحة J 100 μm(K) مظهر وأحجام وأوزان الأورام المزروعة غريبة النوع في مجموعتي التحكم بالناقل والمجموعات التي تعاني من فرط تعبير LINC01871. TPM، عدد النسخ لكل مليون؛ OE-LINC01871، فرط تعبير LINC01871. تم تقييم البقاء على قيد الحياة الإجمالي بواسطة تحليل كابلان-ماير باستخدام اختبار رتبة السجل. كما تم تقييم المقارنات الزوجية بين الأنسجة الورمية والأنسجة الطبيعية باستخدام اختبار ويلكوكسون لرتب الإشارات. أما بالنسبة لمقارنات المجموعتين المتبقية، فقد تم اختيار اختبار t للطلاب غير المزدوج أو اختبار مان-ويتني U بعد تقييم التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. وحُللت قياسات CCK-8 بواسطة تحليل التباين ثنائي الاتجاه. شملت التجارب المختبرية ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، بينما تضمنت تجارب الزرع غريبة النوع ثلاثة فئران في كل مجموعة. وتُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001، و ****P < 0.0001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فرط تعبير LINC01871 يثبط تكاثر الخلايا الورمية ويرتبط بانخفاض إشارات NF-κB
تم فحص التأثير المثبط لـ LINC01871 على تكاثر الخلايا الورمية بشكل أكبر باستخدام نماذج مخبرية (in vitro) ونماذج حية (in vivo). كان تعبير LINC01871 أعلى بكثير في الخط الخلوي الظهاري للثدي الطبيعي مقارنة بالخط الخلوي لسرطان الثدي (الشكل 3F). وقد تم التأكد من النجاح في إنشاء نموذج فرط تعبير LINC01871 بواسطة RT-qPCR، والذي أظهر ارتفاعاً ملحوظاً في تعبير LINC01871 مقارنة بمجموعة التحكم الناقلة (الشكل 3G). وكشفت اختبارات CCK-8 لاحقاً عن انخفاض كبير في القدرة التكاثرية في الخلايا التي تعاني من فرط تعبير LINC01871 (الشكل 3H). وتماشياً مع هذه النتيجة، أدى فرط تعبير LINC01871 إلى انخفاض القدرة على تكوين المستعمرات (الشكل 3I) وتقليل نسبة الخلايا الموجبة لـ EdU (الشكل 3J). وفي نموذج الطعم الغريب (xenograft model)، كانت الأورام المشتقة من الخلايا التي تعاني من فرط تعبير LINC01871 أصغر بكثير من تلك المشتقة من خلايا التحكم الناقلة (الشكل 3K).

لاستكشاف الآليات المحتملة الكامنة وراء هذه التأثيرات، أُجريت تحليلات الإثراء الوظيفي باستخدام مجموعتين من الجينات: الجينات ذات التعبير المتباين بين مجموعات التعبير المرتفع والمنخفض لـ LINC01871، والجينات التي تم تحديدها على أنها مشتركة التعبير مع LINC01871 عن طريق تحليل ارتباط بيرسون. وكشف تحليل GO لهذه المجموعات الجينية عن وجود ارتباطات بعدة وظائف متعلقة بالمناعة، بما في ذلك ارتباط مستقبلات الخلايا التائية، وارتباط معقد بروتين معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC)، والتنظيم الإيجابي لتنشيط الكريات البيضاء، ونشاط المستقبلات المناعية (الشكل 4A،C). وبالمثل، حدد تحليل KEGG مسارات مرتبطة بالمناعة، بما في ذلك إشارات مستقبلات الخلايا التائية، ومسار نقطة تفتيش تعبير ربيطة الموت المبرمج 1 (PD-L1) وبروتين الموت الخلوي المبرمج 1 (PD-1) في السرطان. كما لوحظ إثراء لمسارات إشارات Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT) وNF-κB (الشكل 4B،D). ونظراً لأن إشارات NF-κB قد تم تحديدها في كلا تحليلي الإثراء، فقد تم فحص نشاطها بشكل أكبر عن طريق لطخة ويسترن. كانت فسفرة P65 أقل بشكل ملحوظ في الخلايا التي تعبر عن LINC01871 بشكل مفرط مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 4E)، وهي نتيجة تتفق مع انخفاض تنشيط مسار NF-κB. كما تم تقييم العلاقة بين التعبير المفرط لـ LINC01871 وموت الخلايا المبرمج. وأظهرت لطخة ويسترن زيادة في تعبير البروتين المحفز لموت الخلايا المبرمج Bax وانخفاضاً في تعبير البروتين المضاد لموت الخلايا المبرمج Bcl-2 بعد التعبير المفرط لـ LINC01871 (الشكل 4F). وعلاوة على ذلك، كشف قياس التدفق الخلوي عن نسبة أكبر بكثير من الخلايا المبرمج موتها في مجموعة التعبير المفرط لـ LINC01871 مقارنة بمجموعة التحكم بالناقل (الشكل 4G).

figure-results-4
الشكل 4ارتباط LINC01871 بمسار تأشير العامل النووي كابا ب والمنظم للموت الخلوي المبرمج. 
(A,B) تحليلات الإثراء لـ "علم الوجود الجيني" (GO) (A) و"موسوعة كيوتو للجينات والجينومات" (KEGG) (B) للجينات التي أظهرت تعبيراً تفاضلياً بين مجموعات التعبير المرتفع والمنخفض لـ LINC01871. (C,D) تحليلات الإثراء لـ GO (C) و KEGG (D) للجينات ذات التعبير المشترك مع LINC01871. (E) تقييم لطخة ويسترن للعامل النووي كابا B (NF-κب) بروتينات المسار P65 وP65 المفسفر (p-P65)، مع استخدام إنزيم جليسيرالدهيد-3-فوسفات ديهايدروجيناز (GAPDH) كضابط تحميل. (و) تقييم لطخة ويسترن لبروتينات Bcl-2 (ليمفوما الخلايا البائية 2) وBax (بروتين X المرتبط بـ Bcl-2) المرتبطة بموت الخلايا المبرمج، باستخدام β-actin كضابط تحميل. (G) تقييم وقياس الاستماتة بواسطة قياس التدفق الخلوي في الخلايا الضابطة الحاملة للنواقل والخلايا التي تفرط في التعبير عن LINC01871. تضمنت جميع التجارب المخبرية ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة. وتعتبر صور لطخة ويسترن المعروضة ممثلة لثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. عُرضت البيانات في شكل متوسط ± الانحراف المعياري. أُجريت المقارنات بين الخلايا الضابطة باستخدام الناقل والخلايا التي تفرط في تعبير LINC01871 باستخدام اختبار Student للعينات غير المرتبطة. تـ-اختبار t أو اختبار مان-ويتني U بعد تقييم التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001، و ****P < 0.0001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل LINC01871 عبر أنواع السرطان المختلفة
نظرًا للخصائص الكابحة للأورام المرتبطة بـ LINC01871 في سرطان الثدي، قمنا بتوسيع التحليل ليشمل أنواعًا متعددة من السرطان لتوصيف تعبيره وارتباطاته الإنذارية. وقد لوحظ تعبير تفاضلي لـ LINC01871 في عدة أورام خبيثة بالإضافة إلى سرطان الثدي (الشكل 5A). وفي سرطان الغدة في القولون (COAD)، وسرطان الخلايا الكلوية الصافية (KIRC)، وسرطان الخلايا الحليمية في الكلية (KIRP)، وسرطان الخلايا الحرشفية في الرئة (LUSC)، وسرطان الغدة الدرقية (THCA)، تم اكتشاف فروق جوهرية بين الأنسجة الورمية والطبيعية في كل من المقارنات المزدوجة وغير المزدوجة (الشكل 5B). كما حددت تحليلات البقاء على قيد الحياة ارتباطات إنذارية جوهرية لـ LINC01871 في سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والعنق (HNSC)، وKIRC، وورم الدبقي منخفض الدرجة في الدماغ (LGG)، وسرطان الغدة في المستقيم (READ)، والميلانوما الجلدية (SKCM)، وسرطان بطانة الرحم (UCEC)، وسرطان الخلايا الانتقالية في المثانة (BLCA)، وسرطان الخلايا الكبدية (LIHC)، وسرطان الغدة في البروستاتا (PRAD) (الشكل 5C–E).

figure-results-5
الشكل 5. تحليلات التعبير والإنذار لـ LINC01871 عبر أنواع السرطانات المختلفة. 
(A,B) مقارنة التعبير عن LINC01871 بين الأنسجة الورمية والطبيعية عبر أنواع متعددة من السرطان باستخدام تحليلات غير مقترنة (A) ومقترنة (B). (C–E) الارتباطات الإنذارية لـ LINC01871 والتي توضح نسب المخاطر المحولة لوغاريتمياً للبقاء الإجمالي (C)، والبقاء الخاص بالمرض (D)، والفترة الخالية من تطور المرض (E). HR، نسبة المخاطر؛ TPM، عدد النسخ لكل مليون؛ ns، غير دال إحصائياً. تعتمد اختصارات أنواع السرطان على تسميات أطلس جينوم السرطان (The Cancer Genome Atlas). تم تقييم البيانات غير المقترنة للورم والأنسجة الطبيعية باستخدام اختبار Mann–Whitney U (A)، بينما تم تقييم البيانات المقترنة للورم والأنسجة الطبيعية باستخدام اختبار Wilcoxon signed-rank (B). وفُحصت الارتباطات مع البقاء الإجمالي، والبقاء الخاص بالمرض، والفترة الخالية من تطور المرض بواسطة انحدار كوكس للمخاطر النسبية أحادي المتغير (C–E). *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، و ****P < 0.0001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الارتباط بين تعبير LINC01871 وتسلل الخلايا المناعية
قمنا بعد ذلك بتوصيف التوزيع الخلوي لـ LINC01871 باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (single-cell RNA-sequencing) من عينات سرطان الثدي (GSE161529). وبعد إجراء مراقبة الجودة، وتصحيح تأثيرات الدفعات، والتجميع، وتوصيف أنواع الخلايا، شملت المجموعات المحددة الخلايا الظهارية، وخلايا T من نوع CD8⁺، وخلايا T، والبلعميات، والأرومات الليفية، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK)، والخلايا البائية (الشكل 6A). ومن بين هذه المجموعات، كان تعبير LINC01871 أكثر بروزاً في خلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية NK (الشكل 6B،C). وبناءً على ذلك، بحثنا بشكل أكبر في العلاقة بين LINC01871 والبيئة المجهرية المناعية باستخدام تقديرات التسلل القائمة على النسخ المتعدد (transcriptome). وقد أشار تحليل CIBERSORT إلى أن المجموعة ذات التعبير العالي لـ LINC01871 لديها نسب تقديرية أعلى لعدة مجموعات مناعية، بما في ذلك خلايا T من نوع CD8⁺، والخلايا القاتلة الطبيعية NK، والبلعميات M1، إلى جانب نسب تقديرية أقل لخلايا T التنظيمية (Tregs) والبلعميات M2 (الشكل 6D). وبالمثل، كانت درجات المناعة المشتقة من ESTIMATE أعلى في العينات ذات التعبير العالي لـ LINC01871 (الشكل 6E). كما أنتج التحليل بواسطة ssGSEA باستخدام جينات علامة الخلايا المناعية المبلغ عنها سابقاً أنماطاً متسقة بشكل عام (الشكل 6F). وأظهر توسيع هذا التحليل ليشمل أنواعاً مختلفة من السرطان وجود ارتباطات ذات دلالة إحصائية بين تعبير LINC01871 والوفرة التقديرية لمجموعات متعددة من الخلايا المناعية (الشكل 6G).

figure-results-6
الشكل 6. تحليلات التعبير أحادي الخلية والارتشاح المناعي لـ LINC01871. 
(A) تمثيل التقريب والإسقاط المتشعب الموحد (UMAP) للمجموعات الخلوية الموصوفة التي تم تحديدها من بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية. (B) مخطط سمات UMAP يوضح توزيع تعبير LINC01871 بين المجموعات الخلوية الموصوفة. (C) مخطط نقطي يعرض نسبة الخلايا التي تعبر عن LINC01871 ومتوسط التعبير المقاس لكل نوع من أنواع الخلايا. (D) النسب النسبية لـ 22 مجموعة من الخلايا المناعية في مجموعات التعبير المنخفض والعالي لـ LINC01871، والتي تم تقديرها بواسطة تحديد نوع الخلية من خلال تقدير المجموعات الفرعية النسبية لنواتج نسخ RNA (CIBERSORT). (E) درجات البيئة المجهرية السدوية والمناعية والورمية المشتقة باستخدام تقدير الخلايا السدوية والمناعية في أنسجة الأورام الخبيثة باستخدام بيانات التعبير (ESTIMATE). (F) الدرجات المرتبطة بالمناعة التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل إثراء مجموعة الجينات للعينة الواحدة (ssGSEA) في مجموعات التعبير المنخفض والعالي لـ LINC01871. (G) الارتباطات عبر أنواع السرطانات بين تعبير LINC01871 وارتشاح الخلايا المناعية المقدرة باستخدام ssGSEA. NK، الخلايا القاتلة الطبيعية؛ TME، البيئة المجهرية للورم. تعتمد اختصارات أنواع السرطان على تسميات أطلس جينوم السرطان (The Cancer Genome Atlas). تم تقييم الاختلافات بين مجموعات التعبير المنخفض والعالي لـ LINC01871 باستخدام اختبار مان-ويتني U (D–F). وتم تقييم الارتباطات عبر أنواع السرطانات بين تعبير LINC01871 وارتشاح الخلايا المناعية باستخدام تحليل ارتباط سبيرمان (G). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, و ****P < 0.0001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

توافر البيانات:
مجموعات البيانات التي تم تحليلها في هذه الدراسة متاحة للعموم من أطلس جينوم السرطان (TCGA؛ https://portal.gdc.cancer.gov) ومستودع التعبير الجيني (GEO؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). تشمل مجموعات البيانات المستخدمة مجموعة TCGA-BRCA وGSE161529 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). توفر الأشكال التكميلية 1-3 تحليلات معلوماتية حيوية وإنذارية إضافية. تسرد الجدول التكميلي 1 تتابعات البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR)، ويسرد الجدول التكميلي 2 الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في تحليل لطخة ويسترن. تتوفر نصوص R البرمجية المستخدمة في التحليلات المعلوماتية الحيوية والإحصائية في الملف التكميلي 1.

الشكل التكميلي 1. تحديد الجينات ذات التعبير المتباين ووحدات شبكة التعبير الجيني المشترك المرجحة المرتبطة بحساسية مثبطات CDK4/6 المتوقعة. 
(A,B) مخططات بركانية (Volcano plots) توضح الجينات ذات التعبير المتباين بين المجموعات المتوقع مقاومتها والمجموعات المتوقع حساسيتها لعقاري ribociclib (A) وpalbociclib (B). (C,D) مخططات شجرية عنقودية تم إنشاؤها بواسطة WGCNA توضح التجميع الجيني وتعيين الوحدات لـ ribociclib (C) وpalbociclib (D). تم تعريف الجينات ذات التعبير المتباين على أنها تلك التي تبلغ القيمة المطلقة للتغير اللوغاريتمي log2 fold change لها ≥0.5 وقيمة P المعدلة <0.05. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2. الأداء الإنذاري والتنبؤي لخمسة جزيئات lncRNAs مرشحة إضافية.
(A) تحليلات بقاء كابلان-ماير لخمسة جزيئات lncRNAs مرشحة إضافية تم تحديدها بواسطة انحدار LASSO. (B,C) تحليلات منحنى خصائص تشغيل المستقبل التي توضح الأداء التشخيصي لهذه الـ lncRNAs الخمسة للتنبؤ بالمقاومة تجاه ribociclib (B) وpalbociclib (C). التحليلات المقابلة لـ LINC01871 معروضة في الشكلين 1 و3. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3. التقييم الإنذاري لـ LINC01871 في سرطان الثدي.
(A) قيم التركيز المثبط النصفي الأقصى (IC50) المتوقعة لكل من ribociclib و palbociclib في مجموعات التعبير العالي والمنخفض لـ LINC01871 ضمن المجموعة الفرعية الموجبة لمستقبلات الهرمونات والسالبة لمستقبل عامل نمو البشرة البشري 2 (HR-positive/HER2-negative). (B) تحليلات ارتباط Spearman بين تعبير LINC01871 وقيم IC50 المتوقعة لكل من ribociclib و palbociclib في المجموعة الفرعية HR-positive/HER2-negative. (C) تحليل Kaplan–Meier للبقاء على قيد الحياة للفترة الخالية من تطور المرض (PFI) وفقاً لتعبير LINC01871. (D) تحليل Kaplan–Meier للبقاء على قيد الحياة للمرضى الذين تلقوا علاجاً إشعاعياً مصنفين حسب تعبير LINC01871. (E) مخطط نوغرام (Nomogram) يدمج تعبير LINC01871 والخصائص المرضية السريرية للتنبؤ بالبقاء الإجمالي على قيد الحياة في مجموعة TCGA-BRCA الإجمالية. (F) منحنيات المعايرة لتقييم التوافق بين احتمالات البقاء المتوقعة والملاحظة لمخطط النوغرام عند 1 و3 و5 سنوات. تم تحليل المقارنات في اللوحة A باستخدام اختبار Mann–Whitney U، وقُيمت الارتباطات في اللوحة B باستخدام تحليل ارتباط Spearman. IC50، التركيز المثبط النصفي الأقصى؛ PFI، الفترة الخالية من تطور المرض؛ HR، مستقبل الهرمونات؛ HER2، مستقبل عامل نمو البشرة البشري 2. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، و ****P < 0.0001؛ ns، غير دال إحصائياً. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1. تسلسلات البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR).
تسلسلات البادئات الأمامية والعكسية (5′→3′) المستخدمة لتحليل RT-qPCR لـ LINC01871 والجين المرجعي الداخلي GAPDH. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2. الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في تحليل لطخة ويسترن.
الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في تحليل لطخة ويسترن، بما في ذلك البروتين المستهدف أو خصوصية الجسم المضاد، والمورد، ورقم الكتالوج، والنوع المضيف، وتخفيف العمل، ومعرف مورد البحث (RRID). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1. نصوص R البرمجية المستخدمة في التحليلات المعلوماتية الحيوية والإحصائية.
يحتوي هذا الملف التكميلي على نصوص R البرمجية المستخدمة لإنشاء التحليلات المعلوماتية الحيوية والأشكال الموضحة في هذه الدراسة، بما في ذلك تحليل الترانسكريبتوم، وتحليل التعبير التفاضلي، وتحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA)، وانحدار مشغل التقلص والاختيار المطلق الأدنى (LASSO)، وتحليل البقاء، وتحليل خصائص تشغيل المستقبل (ROC)، وتحليل الإثراء الوظيفي، وتحليل الارتشاح المناعي، وتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (single-cell RNA sequencing)، وإنشاء الأشكال. وتتوافق النصوص البرمجية الفردية مع الأشكال الرئيسية والتكميلية الواردة في المخطوطة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

أدى الفهم المتوسع لبيولوجيا السرطان إلى تحديد أهداف علاجية جديدة، وترسيخ العلاجات الموجهة كمكون مهم في علاج السرطان.17ومع ذلك، لا يزال تطوير المقاومة العلاجية يحد من فعاليتها على المدى الطويل. وفي هذه الدراسة، أدى دمج تحليلات الأوميكس المتعددة مع مناهج التعلم الآلي إلى تحديد LINC01871 كمرشح مرتبط بالحساسية المتوقعة لعقاري ribociclib وpalbociclib. كما أظهرت التحليلات التجريبية أن الإفراط في تعبير LINC01871 أدى إلى زيادة الحساسية لكلا العاملين في المختبر، وثبط تكاثر خلايا سرطان الثدي في النماذج الخلوية ونماذج الطعوم الغريبة. وقد صاحبت هذه التأثيرات انخفاض في NF-κنشاط المسار B، مما يشير إلى وجود علاقة محتملة بين LINC01871 ومسار التأشير هذا. قد تكون هذه الملاحظات ذات صلة بالاستخدام المتزايد للمؤشرات الحيوية لتوجيه قرارات العلاج أثناء العلاج القائم على مثبطات CDK4/6. ومع ذلك، فإن الأدلة الداعمة لـ LINC01871 تختلف جوهرياً عن الأدلة المتاحة للنهج الراسخة الموجهة بالمؤشرات الحيوية. فعلى سبيل المثال، خضعت مراقبة الحمض النووي الورمي الدوار لطفرات ESR1 لتقييم استباقي كاستراتيجية لتكييف العلاج الهرموني. وفي المقابل، لا يزال LINC01871 بمثابة المؤشر الحيوي المرشح ولا ينبغي اعتبارها حتى الآن مناسبة لاتخاذ القرارات السريرية. ويكتسب هذا التمييز أهمية خاصة بما أن خيارات العلاج بعد تطور المرض أثناء العلاج القائم على مثبطات CDK4/6 في حالات سرطان الثدي النقيلي إيجابي مستقبلات الهرمونات (HR-positive) وسلبي مستقبل HER2 (HER2-negative) تشمل الآن مُحطِمات مستقبلات الإستروجين الانتقائية الفموية، ومثبطات مسار PI3K/AKT، والمقترنات بين الأجسام المضادة والأدوية.18,19في ظل هذا المشهد العلاجي المتطور، يمكن للمؤشرات الحيوية القادرة على تمييز الاختلافات في الحساسية لمثبطات CDK4/6 أن تساعد في تصنيف العلاج. ورغم أن نتائجنا تدعم وجود ارتباط بين LINC01871 والحساسية تجاه عقاري ribociclib وpalbociclib، إلا أن الأدلة الحالية مستمدة من تقديرات حاسوبية للحساسية الدوائية إلى جانب تجارب مخبرية. وبناءً على ذلك، ستكون هناك حاجة إلى دراسات أترابية استشرافية توثق التعرض لمثبطات CDK4/6 والنتائج السريرية لتحديد ما إذا كان لـ LINC01871 قيمة تنبؤية لدى المرضى.

لقد تم إثبات الفائدة العلاجية لمثبطات CDK4/6 في سرطان الثدي الموجب لمستقبلات الإستروجين و/أو مستقبلات البروجسترون في العديد من التجارب السريرية4,5,6. كما جذبت فائدتها المحتملة في سرطان الثدي ثلاثي السلبية اهتماماً بحثياً20,21. على سبيل المثال، وجد Yang وزملاؤه أن الاستهداف المتزامن لـ CDK4/6 وCDK7 ثبط تكاثر خلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية22. وقد حددت دراسات أخرى تغيرات جزيئية قد تعدل الاستجابة لتثبيط CDK4/6؛ حيث أفادت التقارير أن تثبيط GPX4 يزيد من الحساسية لعقار palbociclib في كل من سرطان الثدي الموجب لمستقبلات الإستروجين وسرطان الثدي ثلاثي السلبية23، بينما ارتبط C9orf142 بمقاومة مثبطات CDK4/6 في سرطان الثدي ثلاثي السلبية20. وعلى العكس من ذلك، أفادت التقارير أن تثبيط ACAA1 يعزز حساسية خلايا سرطان الثدي لمثبطات CDK4/624. لقد ركز معظم العمل الحالي حول المحددات الجزيئية للاستجابة لمثبطات CDK4/6 على الجينات المشفرة للبروتينات، مما جعل مساهمة lncRNAs أقل توصيفاً. وتوسع نتائجنا هذا المجال من خلال تحديد LINC01871 كحمض RNA غير مشفر محتمل مرتبط بالاستجابة لمثبطات CDK4/6. وقد ربطت اختبارات السمية الخلوية وتكوين المستعمرات، جنباً إلى جنب مع تقييم قياس التدفق الخلوي وتحليل البروتينات المرتبطة بدورة الخلية، بشكل ثابت بين الإفراط في تعبير LINC01871 وزيادة الحساسية لعقاري ribociclib وpalbociclib. كما دعمت اختبارات التكاثر المنفصلة ونموذج الطعم الغريب (xenograft model) بشكل أكبر وجود ارتباط تثبيطي بين الإفراط في تعبير LINC01871 ونمو سرطان الثدي.

لاستكشاف الآليات التي قد تكمن وراء هذه الملاحظات، قمنا بفحص الملفات الوظيفية للجينات ذات التعبير المتباين بين مجموعات LINC01871 المرتفعة والمنخفضة، والجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مشترك مع LINC01871. وقد ربط تحليلا GO وKEGG كلا المجموعتين الجينيتين بالعمليات المرتبطة بالمناعة ومسار إشارات NF-κB. وتعتبر هذه النتيجة ذات صلة بتنظيم الدورة الخلوية لأن التقارير السابقة أشارت إلى أن إشارات NF-κB تزيد من تعبير cyclin D، مما يسهل تقدم الدورة الخلوية25,26. كما أظهر Zhou وزملاؤه أن NF-κB يمكن أن يتفاعل مع محفز CDK6 ويحفز نسخ CDK627. وقد تم وصف التفاعل المتبادل بين NF-κB ومسار PI3K/AKT/mTOR أيضاً28، ويرتبط المسار الأخير بمقاومة مثبطات CDK4/611. ومعاً، توفر هذه الملاحظات مبرراً لفحص نشاط NF-κB في سياق LINC01871. وتماشياً مع نتائج الإثراء، أظهرت الخلايا التي تفرط في التعبير عن LINC01871 انخفاضاً في فسفرة P65. ومع ذلك، فإن هذه البيانات تثبت وجود ارتباط بدلاً من آلية تنظيمية مباشرة، ولا يزال من غير المحدد كيف يؤثر LINC01871 على إشارات NF-κB.

تمثل البيئة المجهرية المناعية مساهماً محتملاً آخر في الاستجابة لمثبطات CDK4/6. فعلى سبيل المثال، أفادت تقارير بأن خلايا γδ T تسهل المقاومة من خلال تأثيرات تتوسطها البلاعم CX3CR1⁺29. وقد لاحظ Luo وآخرون تسللاً أكبر لخلايا CD8⁺ T والخلايا القاتلة الطبيعية (NK-cell) في أورام المرضى الذين طوروا مقاومة لمثبطات CDK4/6 في نقاط زمنية لاحقة30. وأظهر تحليلنا للخلية الواحدة أن تعبير LINC01871 كان أكثر بروزاً في خلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية منه في الخلايا الظهارية. وربطت التحليلات التكميلية القائمة على النسخ (transcriptome) بين ارتفاع تعبير LINC01871 وزيادة التسلل التقديري لخلايا CD8⁺ T، وبلاعم M1، والخلايا القاتلة الطبيعية، وبين انخفاض التسلل التقديري لبلاعم M2 والخلايا التائية التنظيمية (Tregs). وقد ارتبطت خلايا CD8⁺ T وبلاعم M1 والخلايا القاتلة الطبيعية بالنشاط المناعي المضاد للأورام، بينما رُبطت بلاعم M2 بوظائف تعزز نمو الورم31,32,33,34. وبناءً على ذلك، تشير نتائجنا إلى أن ارتفاع تعبير LINC01871 قد يكون مرتبطاً ببيئة مجهرية ورمية أكثر نشاطاً مناعياً. ومع ذلك، يظل هذا التفسير أولياً لأن تقديرات الخلايا المناعية استُنتجت من ملفات النسخ ولم تُقَس بشكل مباشر، وستكون الدراسات الوظيفية ضرورية لتحديد ما إذا كان لـ LINC01871 دور في تشكيل البيئة المجهرية المناعية.

يجب الإقرار بعدة قيود عند تفسير هذه النتائج. أولاً، تم تحديد LINC01871 من خلال تحليل تكاملي للمؤشرات الحيوية المتعددة (multi-omics)، حيث استُنتجت الاستجابة للدواء حاسوبياً بدلاً من الحصول عليها من مرضى يتلقون مثبطات CDK4/6. وعلى الرغم من أن التجارب المباشرة في المختبر (in vitro) أظهرت حساسية أكبر تجاه عقاري palbociclib و ribociclib بعد الإفراط في التعبير عن LINC01871، إلا أن هذه النتائج لا تثبت قيمته التنبؤية لدى المرضى. لذا، ستكون هناك حاجة إلى مجموعات مستقلة من المرضى لديها بيانات موثقة عن التعرض لمثبطات CDK4/6 وبيانات الاستجابة السريرية لتقييم LINC01871 كعلامة حيوية تنبؤية. ثانياً، أُجري تحليل الاكتشاف في البداية على مجموعة TCGA-BRCA بأكملها، والتي تشمل أنواعاً فرعية غير متجانسة سريرياً من سرطان الثدي. كما لوحظ الارتباط بين LINC01871 والحساسية الدوائية المتوقعة ضمن المجموعة الفرعية الموجبة لـ HR والسالبة لـ HER2؛ ومع ذلك، يظل التأكيد في المجموعات التي عولجت سريرياً وكانت موجبة لـ HR وسالبة لـ HER2 أمراً ضرورياً. ثالثاً، اقتصرت تحليلات الاستجابة الدوائية لدينا على palbociclib و ribociclib لأن بيانات الاستجابة لـ abemaciclib المقابلة لم تكن متاحة في مجموعة بيانات GDSC2 المستخدمة في هذه الدراسة. وبناءً على ذلك، يظل من غير المعروف ما إذا كان الارتباط الملحوظ يمتد ليشمل abemaciclib. رابعاً، على الرغم من تأثيرات كبح الورم الملحوظة في التجارب القائمة على الخلايا والطعوم الغريبة (xenograft)، فإن الرابط الجزيئي بين LINC01871 ومسار تأشير NF-κB لم يتم إثباته بعد. فقد صاحب الإفراط في التعبير عن LINC01871 انخفاض في فسفرة P65، لكن الآلية المسؤولة عن هذا الارتباط تتطلب مزيداً من الاستقصاء. وبالمثل، فإن الملاحظات المتعلقة بالمناعة استُمدت أساساً من تحليلات حاسوبية قائمة على النسخ المتعددة (transcriptome)، ويجب تفسيرها كعلاقات ارتباطية وليس كدليل على أن LINC01871 ينظم مباشرة البيئة المناعية الدقيقة للورم. وأخيراً، تتضمن مقاومة مثبطات CDK4/6 عمليات بيولوجية متعددة، ومن غير المرجح أن يفسر LINC01871 التعقيد الكامل للاستجابة للعلاج. لذا، يجب أن تتضمن الأبحاث المستقبلية مجموعات محددة حسب النوع الفرعي، وتقييماً لـ abemaciclib، وتحققاً تجريبياً من الارتباطات المتعلقة بالمناعة، ودراسات ميكانيكية للعلاقة بين LINC01871 وتأشير NF-κB، وتقييماً سريرياً استشرافياً لتحديد ما إذا كان LINC01871 يتمتع بفائدة كعلامة حيوية تنبؤية.

الإفصاحات

تضارب المصالح:
يصرح المؤلفون بأنه لا توجد لديهم أي مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في مقاطعة فوجيان (منحة رقم 2022J011056). ويقر المؤلفون بفضل أطلس جينوم السرطان (TCGA) ومستودع تعبير الجينات الشامل (GEO) لتوفير مجموعات البيانات المتاحة للعموم والمستخدمة في هذه الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إبر محاقن 25 GBeyotimeFS802-30pcsإبر محاقن مخصصة للاستخدام مرة واحدة، تُستخدم لمبعد الفم والترخية المسبقة الاختيارية للرباط حول السني
محلول بارافورمالدهيد 4%SolarbioP1110محلول بارافورمالدهيد 4% يُستخدم لتثبيت العينات
إيثانول 75%Ouse Medical Devices StoreN/Aإيثانول 75% بدرجة طبية يُستخدم لتطهير الأسطح
فئران C57BL/6Charles River213فئران C57BL/6 ذكور بعمر 8 أسابيع تزن 22–29 g
كاربروفين (Carprofen)SolarbioC5350مسكن للآلام بعد الجراحة يُعطى عن طريق الحقن تحت الجلد بجرعة 5 mg/kg
كرات قطنيةOuning Medical DevicesN/Aكرات قطنية معقمة تُستخدم للتنظيف الفموي وإيقاف النزيف
برنامج CTAn v1.18.4.0+SkyScanN/Aبرنامج يُستخدم لتحليل صور μCT
برنامج DataViewer v1.5.6.2SkyScanN/Aبرنامج يُستخدم لعرض وتصدير صور μCT المعاد بناؤها
أغطية أصابعLeSu OfficeMEKU-1/2/3Bأغطية أصابع تُستخدم لحماية الإبهام أثناء الخلع
لوح رغويDongguan Lijianglong Industrial Co., Ltd.N/Aلوح رغوي يُستخدم كمنصة للجراحة والتثبيت
نظام غذائي هلاميReadyDietechJ10001نظام غذائي لما بعد الجراحة يُوضع في أرضية القفص لمدة 3 أيام عند استخدامه
برنامج GraphPad Prism v10.1.2GraphPadRRID: SCR_002798برنامج يُستخدم للتحليل الإحصائي وإنشاء الرسوم البيانية
مصباح رأسيBazhou Pengen Protective Equipment FactoryN/Aمصباح رأسي يُستخدم لإضاءة المجال الجراحي
وسادة تدفئةShijiazhuang Jianuan Electrical Appliances Co., Ltd.N/Aوسادة تدفئة يتم تسخينها مسبقاً إلى 38 °C تقريباً للتعافي بعد الجراحة
نموذج هيدروكسيباتيت محاكي (Hydroxyapatite phantom)QRMQRM-70127نموذج معايرة يُستخدم لتحويل قيم توهين الأشعة المقطعية (CT) إلى كثافة المعدن العظمي
جهاز تكبيرOlympus CorporationSZX10جهاز يُستخدم لفحص أطراف الملاقط المسننة ومقبس الخلع تحت التكبير
كمامةSenlun Medical Devices Specialty StoreN/Aكمامة جراحية
ماسح التصوير المقطعي المحوسب الدقيقBruker SkyScanSkyScan 1276ماسح μCT يُستخدم عند 80 kV و 500 μA وبدقة فوكسل 10 μm
برنامج Mimics Research v21.0MaterialiseRRID: SCR_015802برنامج يُستخدم لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد
بنتوباربيتال الصوديومSigma-AldrichP3761ملح بنتوباربيتال الصوديوم يُستخدم كمحلول تخدير بتركيز 1%
محلول ملحي منظم بالفوسفاتSolarbioP1010مسحوق محلول ملحي منظم بالفوسفات 0.01 M، بقيمة pH تتراوح بين 7.2–7.4
محلول بوفيدون أيودين المطهرBelkon Pharmacy Flagship StoreN/Aمحلول بوفيدون أيودين يُستخدم لتطهير البطن
أربطة مطاطيةFoshan Puli Rubber Products FactoryN/Aأربطة مطاطية تُستخدم لتجميع مبعد الفم
محلول ملحيThermo FisherBR0053Gأقراص ملحية تُستخدم لتحضير المحلول للتنظيف الفموي
نظام غذائي قياسي (chow diet)Jiangsu Xietong Pharmaceutical and Biotechnology Engineering Co., Ltd.XTC01WC-001علف قياسي يُستخدم للإيواء الروتيني ويتم تليينه للتغذية بعد الجراحة
معقم بخاريInstitutional facilityN/Aجهاز يُستخدم لتعقيم الملاقط المسننة والمحلول الملحي
مسحات قطنية معقمةKangbailai Medical Devices StoreN/Aمسحات قطنية معقمة مخصصة للاستخدام مرة واحدة
قفازات معقمةSenlun Medical Devices Specialty StoreN/Aقفازات لاتكس معقمة
قماش غير منسوج معقمShandong Xinhua Infection Control Supplies Hangzhou StoreN/Aقماش غير منسوج معقم يُستخدم لتغطية سطح العمل ووسادة التدفئة
غطاء رأس جراحي معقمSenlun Medical Devices Specialty StoreN/Aغطاء رأس جراحي معقم
ملابس جراحية تعقيمية (Scrubs)Senlun Medical Devices Specialty StoreN/Aملابس جراحية نظيفة يتم ارتداؤها أثناء الإجراء
شريط لاصقThermo Fisher15947شريط لاصق يُستخدم لتثبيت أطراف الفأر
ملاقط عيون مسننةBeyotimeFS229ملاقط عيون مسننة تُستخدم كملاقط أسنان
مرهم عيون بيطريDechra Veterinary Products143-16مرهم عيون يُوضع بعد التخدير لمنع جفاف القرنية

المراجع

  1. Bray F, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74(3):229-63.
  2. Xiong X, et al. Breast cancer: Pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  3. Ye F, et al. Advancements in clinical aspects of targeted therapy and immunotherapy in breast cancer. Mol Cancer. 2023;22(1):105.
  4. Johnston SRD, et al. Abemaciclib plus endocrine therapy for hormone receptor-positive, HER2-negative, node-positive, high-risk early breast cancer (monarchE): Results from a preplanned interim analysis of a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2023;24(1):77-90.
  5. Slamon D, et al. Ribociclib plus endocrine therapy in early breast cancer. N Engl J Med. 2024;390(12):1080-91.
  6. Finn RS, et al. The cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib in combination with letrozole versus letrozole alone as first-line treatment of oestrogen receptor-positive, HER2-negative, advanced breast cancer (PALOMA-1/TRIO-18): A randomised phase 2 study. Lancet Oncol. 2015;16(1):25-35.
  7. Morrison L, Loibl S, Turner NC. The CDK4/6 inhibitor revolution-a game-changing era for breast cancer treatment. Nat Rev Clin Oncol. 2024;21(2):89-105.
  8. Guo Z, et al. Cyclin-dependent kinase 4 and 6 inhibitors in breast cancer treatment. Oncogene. 2025;44(17):1135-52.
  9. Vora SR, et al. CDK4/6 inhibitors sensitize PIK3CA-mutant breast cancer to PI3K inhibitors. Cancer Cell. 2014;26(1):136-49.
  10. Foffano L, et al. Cyclin-dependent kinase 4 and 6 inhibitors (CDK4/6i): Mechanisms of resistance and where to find them. Breast. 2025;79:103863.
  11. Hao C, et al. PI3K/AKT/mTOR inhibitors for hormone receptor-positive advanced breast cancer. Cancer Treat Rev. 2025;132:102861.
  12. Bidard FC, et al. Switch to fulvestrant and palbociclib versus no switch in advanced breast cancer with rising ESR1 mutation during aromatase inhibitor and palbociclib therapy (PADA-1): A randomised, open-label, multicentre, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2022;23(11):1367-77.
  13. Bidard FC, et al. First-line camizestrant for emerging ESR1-mutated advanced breast cancer. N Engl J Med. 2025;393(6):569-80.
  14. Zhang D, et al. Cancer-associated fibroblasts promote tumor progression by lncRNA-mediated RUNX2/GDF10 signaling in oral squamous cell carcinoma. Mol Oncol. 2022;16(3):780-94.
  15. Chen F, et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nat Cell Biol. 2019;21(4):498-510.
  16. Chen X, et al. Estrogen-induced lncRNA LINC02568 promotes estrogen receptor-positive breast cancer development and drug resistance through both in trans and in cis mechanisms. Adv Sci (Weinh). 2023;10(25):e2206663.
  17. Huang R, Zhou PK. DNA damage repair: Historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):254.
  18. Güren AK, et al. Post-CDK4/6 inhibitor treatment landscape in metastatic hormone receptor-positive breast cancer: A narrative review. Expert Rev Anticancer Ther. 2026;26(4):425-35.
  19. Güren AK, et al. Efficacy and safety of sacituzumab govitecan in hormone receptor-positive metastatic breast cancer: A systematic review and meta-analysis. J Oncol Pharm Pract. 2026. doi:10.1177/10781552261462434.
  20. Liao L, et al. C9orf142 transcriptionally activates MTBP to drive progression and resistance to CDK4/6 inhibitors in triple-negative breast cancer. Clin Transl Med. 2023;13(11):e1480.
  21. Zhu X, et al. Efficacy and mechanism of the combination of PARP and CDK4/6 inhibitors in the treatment of triple-negative breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2021;40(1):122.
  22. Yang Y, et al. Dual inhibition of CDK4/6 and CDK7 suppresses triple-negative breast cancer progression via epigenetic modulation of SREBP1-regulated cholesterol metabolism. Adv Sci (Weinh). 2025;12(5):e2413103.
  23. Herrera-Abreu MT, et al. Inhibition of GPX4 enhances CDK4/6 inhibitor and endocrine therapy activity in breast cancer. Nat Commun. 2024;15(1):9550.
  24. Peng WT, et al. Inhibition of ACAA1 restrains proliferation and potentiates the response to CDK4/6 inhibitors in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 2023;83(10):1711-24.
  25. Joyce D, et al. NF-κB and cell-cycle regulation: The cyclin connection. Cytokine Growth Factor Rev. 2001;12(1):73-90.
  26. Iwanaga R, et al. Activation of the cyclin D2 and CDK6 genes through NF-κB is critical for cell-cycle progression induced by HTLV-I Tax. Oncogene. 2008;27(42):5635-42.
  27. Zhou B, et al. Bortezomib suppresses self-renewal and leukemogenesis of leukemia stem cells by NF-κB-dependent inhibition of CDK6 in MLL-rearranged myeloid leukemia. J Cell Mol Med. 2021;25(6):3124-35.
  28. Yu M, et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via the PI3K/AKT/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 2017;90:677-85.
  29. Petroni G, et al. IL-17A-secreting γδ T cells promote resistance to CDK4/CDK6 inhibitors in HR-positive/HER2-negative breast cancer via CX3CR1-positive macrophages. Nat Cancer. 2025;6(10):1656-75.
  30. Luo L, et al. Single-cell RNA sequencing identifies molecular biomarkers predicting late progression to CDK4/6 inhibition in patients with HR-positive/HER2-negative metastatic breast cancer. Mol Cancer. 2025;24(1):48.
  31. Komuro H, et al. Single-cell sequencing of CD8-positive tumor-infiltrating lymphocytes revealed the nature of exhausted T cells recognizing neoantigens and cancer/testis antigens in non-small cell lung cancer. J Immunother Cancer. 2023;11(8):e007180.
  32. Rafei H, et al. CREM is a regulatory checkpoint of CAR and IL-15 signalling in NK cells. Nature. 2025;643(8073):1076-86.
  33. Van Elsas MJ, et al. Immunotherapy-activated T cells recruit and skew late-stage activated M1-like macrophages that are critical for therapeutic efficacy. Cancer Cell. 2024;42(6):1032-50.e1010.
  34. Yang J, et al. STK11 coordinates IL-4 signaling with metabolic reprogramming to control M2 macrophage polarization and antitumor immunity. Sci Adv. 2025;11(39):eadx5495.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CDK4 6 NF Kappa B
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.