مقالة منهجية

استهداف Cas9 لإجراء تجارب الإنقاذ في خلايا HEK293 المعطلة جينياً والمحولة بشكل مستقر

93 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72172

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

في هذه المقالة

ملخص

يعمل هذا البروتوكول على التخلص من بروتين Cas9 بعد تحرير الجينوم لتسهيل إجراء تجارب إنقاذ قوية في خطوط الخلايا المعطلة جينياً والمحولة بشكل مستقر.

الملخص

لقد أحدثت تقنية تحرير الجينات CRISPR-Cas9 ثورة في البيولوجيا الجزيئية. وغالبًا ما تُستخدم هذه التقنية لحذف جين يشفر بروتينًا مستهدفًا، حيث يوفر النمط الظاهري الناتج رؤية قيمة حول وظيفة هذا البروتين. ويمكن تأكيد الأهمية الوظيفية للبروتين المستهدف عن طريق إعادة إدخال البروتين لاستعادة الوظيفة المفقودة (الإنقاذ). ويتم تحقيق ذلك عادةً عن طريق إدخال cDNA المشفر للبروتين في وضع trans باستخدام ناقل تعبير. ومع ذلك، في الخطوط الخلوية المعطلة (knockout) التي تعبر عن نظام CRISPR-Cas9 بشكل مستقر، قد يتم قطع بلازميد التعبير الذي تم إدخاله حديثًا بواسطة Cas9. يوفر البروتوكول المقدم هنا استراتيجية لتجاوز هذا العائق المحتمل في تجارب الإنقاذ. وقد تم توضيح هذا النهج باستخدام خلايا HEK293 التي تم فيها تعطيل الجين المشفر لبروتين السقالة E3 ubiquitin ligase المسمى CUL4B بواسطة CRISPR-Cas9. وأدى نقل الحمض النووي الريبوزي الموجه (gRNA) الذي يستهدف جين Cas9 المدمج إلى هذه الخلايا إلى فقدان بروتين Cas9 القابل للكشف. وقد مكّن استئصال Cas9 من استعادة تعبير ووظيفة CUL4B بعد إدخال بلازميد تعبير CUL4B. تقدم هذه النتائج إثباتًا للمفهوم حول نهج قابل للتطبيق على نطاق واسع لدراسة وظيفة البروتين من خلال تجارب الإنقاذ.

المقدمة

تعد تقنية CRISPR-Cas9 أداة قوية لتحرير الجينوم، مشتقة من نظام مناعي تكيفي طبيعي تستخدمه بدائيات النوى للدفاع ضد عدوى العاثيات (bacteriophage). وبفضل تكلفتها المنخفضة، ومعدل نجاحها العالي، وسهولة استخدامها، تفوقت تقنية CRISPR-Cas9 على أدوات تحرير الجينوم الأخرى، مثل نوكلياز أصابع الزنك (ZFNs) ونوكليازات المستجيبات الشبيهة بمنشط النسخ (TALENs)، في إجراء التعديلات الجينية الدقيقة، لا سيما في المزارع الخلوية. يتكون هذا النظام المكون من جزأين من نوكلياز Cas9 وحمض نووي ريبوزي موجه (gRNA). ومن خلال اقتران قواعد واتسون-كريك، يقوم gRNA بتوجيه Cas9 إلى هدف جينومي مجاور لتتابع PAM (protospacer adjacent motif). ويعمل تتابع PAM كموقع تعرف حيوي يسمح بنشاط النوكلياز. وفي ذلك الموقع، يقوم Cas9 بإحداث كسر مزدوج السلاسل (DSB). وفي حال غياب قالب إصلاح متماثل، تقوم الخلية بإصلاح هذا الكسر عبر آلية الربط النهائي غير المتماثل (NHEJ). ويمكن أن تؤدي آلية الإصلاح هذه إلى حدوث إدراجات أو حذوفات (indels)، مما يؤدي إلى طفرات إزاحة الإطار وتعطيل وظيفي للجين المستهدف. وبناءً على ذلك، يتم تحقيق تعطيل الجين المستهدف عن طريق إدخال Cas9 مع gRNA مُهندس. يتكون تتابع gRNA من 20 نيوكليوتيد مكمل لموقع جينومي مجاور مباشرة لتتابع PAM. ويكشف الفقدان الوظيفي الناتج للجين المستهدف عن الأدوار المحددة لذلك الجين في العمليات الخلوية1.

تتضمن تجربة الإنقاذ، أو مقايسة التكامل، استعادة البروتين المفقود لإثبات عكس النمط الظاهري الملحوظ. يعمل هذا النهج كضابط دقيق لاستبعاد التأثيرات التجريبية غير المقصودة، مثل تلك الناتجة عن عمليات حذف CRISPR-Cas9 "خارج الهدف". الطريقة الأكثر شيوعاً لإعادة إدخال البروتين المستهدف هي من خلال ترصيف أو نقل ناقل تعبير خارجي. ومع ذلك، فإن هذا الحمض النووي المُدخل يكون عرضة لنفس استهداف CRISPR-Cas9 الذي تعرض له الموقع الداخلي. وتزداد هذه المخاطرة بشكل خاص في الخطوط الخلوية المنقولة مستقراً، حيث يقترن التعبير التأسيسي لـ Cas9 بالانتخاب الحيوي باستخدام المضادات الحيوية لضمان الحصول على مجموعة متجانسة ومتسقة من الخلايا المعطلة جينياً؛ وهي استراتيجية مطلوبة غالباً في الخطوط الخلوية التي يصعب ترصيفها أو نقلها، مثل تلك المشتقة من السلالات المناعية أو المكونة للدم أو العصبية.

تتمثل إحدى الطرق للالتفاف على استهداف الناقل في إدخال mRNA خارجي يشفر البروتين المطلوب، وبذلك يتم تجاوز القطع بوساطة Cas9 والحاجة إلى النسخ النووي. ومع ذلك، وبالمقارنة مع الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA)، فإن mRNA الاصطناعي أكثر تكلفة في الإنتاج، وأقل استقراراً بطبيعته، وينتج تعبيراً عابراً للغاية. علاوة على ذلك، فإنه يتطلب تعديلات كيميائية محددة لتجنب تحفيز الاستجابات المناعية الفطرية في العصارة الخلوية2.

لتجنب استهداف معقد Cas9/gRNA لبلازميدات التعبير، يمكن استخدام هندسة القواعد المترادفة (wobble base engineering) للتسلسل المشفر. ومن خلال استغلال تكرارية الشفرة الوراثية، يمكن إدخال طفرات مترادفة لإزالة تسلسل PAM المطلوب و/أو تعطيل تكامل gRNA دون تغيير تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين المشفر. ومع ذلك، فإن استخدام الطفرات المترادفة لا يخلو من المخاطر؛ حيث يمكن أن تؤدي هذه التعديلات إلى استخدام كودونات غير مثالية، مما قد يعطل حركية الترجمة ويؤدي إلى سوء طي البروتين، أو تقليل استقرار mRNA، أو إحداث تغييرات ضارة في البنية الثانوية لـ RNA3,4. وبالرغم من أنها أقل شيوعاً، تشمل العواقب المحتملة الأخرى إدخال إشارات تعدد الأدينيلات الخفية، وتعطيل أنماط التنظيم ما بعد النسخي، وزيادة كثافة CpG5,6. علاوة على ذلك، قد تؤدي التسلسلات المهندسة عن غير قصد إلى تحفيز استجابات الإجهاد الخلوي إذا تداخلت بنية mRNA الناتجة مع تقدم الريبوسوم7,8.

بالإضافة إلى التحديات المرتبطة باستخدام mRNA الاصطناعي أو هندسة القاعدة المتذبذبة (wobble-base engineering)، فإن التعبير التأسيسي لبروتين Cas9 بعد عملية التحرير يُدخل العديد من المتغيرات المربكة في المقايسات اللاحقة. ونظرًا لأن خصوصية Cas9 قد لا تكون مثالية، فإن التعبير المستمر يزيد من احتمالية القطع خارج الهدف (off-target cleavage)، مما يؤدي إلى التراكم التدريجي لطفرات غير مقصودة بمرور الوقت9,10,11. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي المراقبة الجينومية المزمنة وكسور الشريط المزدوج (DSBs) المتكررة إلى تحفيز استجابة مستمرة لتلف الحمض النووي، مما يدفع الخلايا في النهاية نحو توقف الدورة الخلوية، أو الشيخوخة الخلوية، أو الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)12,13. كما يفرض هذا الإنتاج التأسيسي عبئاً أيضياً، مما يعزز الانجراف النسيلي (clonal drift) الذي تتفوق فيه الخلايا ذات التعبير المنخفض على الخلايا ذات التعبير المرتفع، مما ينتج عنه مستويات غير متسقة من الجين المنقول عبر الممرات الخلوية المتتالية. وأخيراً، وباعتباره بروتيناً بدائياً كبيراً، قد يحفز Cas9 الإجهاد عبر إشارات المناعة الفطرية أو ينهك آلية التوازن البروتيني (proteostasis) للمضيف، مما يؤدي إلى تحفيز استجابة البروتين غير المطوي (unfolded protein response)14,15,16.

للتخفيف من هذه المضاعفات، تم تطوير العديد من استراتيجيات تثبيط Cas9 العابر، بما في ذلك بروتينات Anti-CRISPR (Acrs) المشتقة من العاثيات17,18، والمثبطات ذات الجزيئات الصغيرة أو الأنظمة المندمجة مع الديغرون مثل PROTACs19,20، وآليات التحكم بالتعديل الضوئي الوراثي19,21. ومع ذلك، فإن هذه النهج تفرض عقبات عملية تحد من فائدتها في فحوصات الإنقاذ. تعمل بروتينات Acrs على التثبيط من خلال المحاكاة الجزيئية، وبالتالي تتطلب تحسيناً قياسياً (stoichiometric optimization) لتحقيق الدقة. كما قد تؤدي Acrs إلى تفاقم نفس الإجهادات المناعية والبروتينية المرتبطة بفرط تعبير Cas9. ويؤدي التعديل الكيميائي إلى تعقيدات في الحركية الدوائية، وسمية خلوية محتملة، و"تأثيرات الخطاف" المرتبطة بـ PROTACs حيث تمنع تركيزات الليجاند المفرطة، بشكل متناقض، تكوين المعقد الثلاثي المنتج22. أما منصات التعديل الضوئي الوراثي فهي محدودة بسبب السمية الضوئية الخلوية والحاجة إلى أجهزة متخصصة للحفاظ على توصيل الضوء بشكل ثابت19,21. والأهم من ذلك، أنه نظرًا لأن هذه الطرق توفر تثبيطاً مؤقتاً أو عكسياً فقط، فإنها غالباً ما تكون غير كافية للتطبيقات التي يتم فيها التعبير عن Cas9 بشكل بنيوي.

في المقابل، توفر أنظمة CRISPR ذاتية التعطيل حلاً دائمًا من خلال تعطيل الجين المنقول Cas9 بشكل ذاتي ودائم فور إتمام تحرير الجين المستهدف بنجاح. ومن خلال القضاء على نشاط النوكلياز المتبقي، يحمي هذا النهج ناقلات الإنقاذ اللاحقة بشكل دائم من الانقسام، بينما يقلل في الوقت ذاته من إجهاد التوازن البروتيني طويل الأمد والانجراف الجينومي خارج الهدف. وعلى الرغم من إمكانية إيصال الـ gRNAs ذاتية التوجيه عبر عمليات عفن مؤقتة للبروتينات النووية الريبوزية أو عمليات عفن تعتمد على الدهون23,24، إلا أن هذه الطرق عرضة للتخفيف والتباين العشوائي، مما يؤدي إلى ظهور مجتمع "فسيفسائي" تفلت فيه بعض الخلايا من التعطيل25,26,27.

للتغلب على هذه القيود، يستخدم البروتوكول الموصوف هنا نظام توصيل فيروسي lentiviral لإيقاف نشاط Cas9 ذاتياً، مما يوفر مزايا عملية متميزة لتعديل الخطوط الخلوية المستقرة. يضمن التوصيل الفيروسي lentiviral الوراثة المرتبطة لـ transgene الخاص بـ Cas9 والمنظم الموجه ذاتياً له، مما يمنع بفعالية "هروب التخفيف" (dilution escape) المعتاد في المجموعات الخلوية سريعة الانقسام. علاوة على ذلك، تسمح السعة الاستيعابية الموسعة لناقلات lentiviral بالتعبير المشترك لعلامات الاختيار لضمان الحصول على مجموعة متجانسة محذوف منها Cas9، بينما يسهل نطاق التأثر الواسع (tropism)، الذي يمنحه التنميط الكاذب VSV-G، عملية التوصيل عالية الكفاءة إلى أنواع الخلايا التي يصعب ترانسفكشنها25,28,29.

كعرض لإثبات المفهوم لهذه الطريقة، يوضح هذا البروتوكول عملية التعطيل الذاتي لـ Cas9 لتسهيل الإنقاذ المظهري لبروتين السقالة E3 ubiquitin ligase المسمى CUL4B في خلايا HEK293 التي تم تعطيل جين CUL4B فيها30.

البروتوكول

استخدمت هذه الدراسة خطوط خلايا بشرية خالدة ومعتمدة (HEK293 وHEK293FT)، ولم تتضمن مشاركين بشريين، أو أنسجة بشرية أولية، أو تجارب على الحيوانات. وبناءً على ذلك، لم يتطلب الأمر الحصول على موافقة أخلاقية مؤسسية.

1. توليد بنية فيروسية بطيئة (lentiviral construct) خاصة بـ gRNA لـ Cas9-

  1. أدرج تسلسل gRNA الخاص بـ Cas9 (الجدول 1) في ناقل pLentiGuide-Puro lentiviral.
  2. استبدل جين المقاومة للمضاد الحيوي بجين يختلف عن علامة المقاومة المستخدمة لاختيار خط الخلايا CRISPR-Cas9 الذي تم تحويله بشكل مستقر.
  3. تحقق من نجاح عملية الإدراج ودقة التسلسل لكل من gRNA الخاص بـ Cas9 وجين المقاومة للمضاد الحيوي البديل عن طريق تسلسل سانجر (Sanger sequencing) باستخدام بادئات خاصة بالناقل.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استبدال جين المقاومة للبوروبوميسين (PuroR) بجين المقاومة للهيجروميسين B (HygroR) لإنشاء الناقل Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. وتشمل جينات المقاومة للمضادات الحيوية البديلة بلاستيسيدين S (BlastR)، و G418/Geneticin (NeoR)، وزيوسين (ZeoR).

2. إنتاج الفيروس البطيء (lentivirus) الذي يشفر RNA دليلًا محددًا لـ Cas9

  1. قم بزراعة 2.5 × 106  من خلايا HEK293FT في طبق زراعة أنسجة بقطر 10 سم ومعالج.
    ملاحظة: حافظ على الخلايا في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; high glucose) المدعم بـ 10% مصل جنين البقر (FBS) (ويشار إليه فيما يلي بـ cDMEM)، واحضنها عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO2. تُستخدم خلايا HEK293FT لأنها تنتج عيارات فيروسية لنتية أعلى من السلالات الخلوية الأخرى المشتقة من HEK29331.
  2. احضن الخلايا لمدة 12 ساعة حتى تصل إلى درجة تلاقي (confluence) لا تقل عن 60% قبل عملية ترانسفكشن (transfection).
    تنبيه: نفذ جميع الإجراءات التي تتضمن ناقلات فيروسية لنتية من الجيل الثالث وفق شروط المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL-2)، باستخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة وإجراءات إزالة التلوث المعتمدة (على سبيل المثال، كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية، وحاوية ثانوية، وإيثانول 70%)، كما وصفها Pauwels et al32.
  3. قم بتحضير خليط ترانسفكشن قياسي من فوسفات الكالسيوم (CaPhos). خفف 20 µg من إجمالي الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) في ماء معقم بدرجة البيولوجيا الجزيئية ليصل الحجم النهائي إلى 450 µL. أضف 50 µL من CaCl2 بتركيز 2.5 M، يليه 500 µL من محلول ملحي منظم بـ HEPES بتركيز 2× (HBS; pH 7.05)، للحصول على حجم نهائي قدره 1 mL في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.
    ملاحظة: استخدم حمضاً نووياً بلازميدياً متحققاً من تسلسله، ويكون في الغالب ملتفاً بشكل فائق (supercoiled)، ويلبي معايير الجودة التالية: A260/A280 = 1.8–2.0، وA260/A230 = 2.0–2.2، والاندوتوكسين <0.1 EU/µg. حضّر خليط الترانسفكشن باستخدام نسبة متساوية المولات تقريباً تتكون من 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro، و5.6 µg pLP1 (Gag/Pol)، و3.8 µg pLP2 (Rev)، و5.6 µg pLP/VSVG (بروتين سكرى لفيروس التهاب الفم الحويصلي).
  4. امزج محلول ترانسفكشن CaPhos جيداً عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة.
  5. أضف 1 mL من خليط ترانسفكشن CaPhos قطرة تلو الأخرى إلى مستنبت خلايا HEK293FT.
  6. قم بهز طبق المستنبت بلطف لتوزيع معقدات الترانسفكشن بشكل متساوٍ.
  7. احضن الخلايا لمدة 12 ساعة.
    ملاحظة: لا تتأثر عملية ترانسفكشن فوسفات الكالسيوم عموماً بالمضادات الحيوية القياسية المستخدمة في الصيانة33. ومع ذلك، يوصى باستخدام وسط خالٍ من المضادات الحيوية لطرق الترانسفكشن الأكثر حساسية، مثل الليبوفيكشن (lipofection)، لأن المضادات الحيوية متعددة الأنيونات يمكن أن تتداخل مع تكوين معقد الحمض النووي والليبيد34.
  8. قم بشفط وسط المستنبت والتخلص منه.
  9. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 mL من محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم 1× في درجة حرارة الغرفة.
  10. قم بشفط الـ PBS والتخلص منه.
  11. أضف 10 mL من وسط cDMEM الطازج في درجة حرارة الغرفة.
  12. أعد الخلايا إلى الحاضنة واترك الجسيمات الفيروسية اللنتية تتراكم في وسط المستنبت لمدة 36 ساعة.
    ملاحظة: تحت هذه الظروف، يُقدر أن السائل العلوي الفيروسي اللنتي غير المركز ينتج حوالي 1.0 × 106 وحدة تحول (TU)/mL بعد 48 ساعة، على الرغم من وجوب تحديد العيار الفعلي تجريبياً كما وصفه Kutner et al.35 أو Barde et al.36. خزن السائل العلوي الفيروسي اللنتي عند −80 °C لمدة تصل إلى سنتين. تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة، لأنها يمكن أن تقلل العيار الفيروسي بنسبة 55% تقريباً37,38,39,40.

3. حصاد الفيروسات البطيئة المشفرة لـ gRNA النوعي لـ Cas9 ونقلها إلى الخلايا المستهدفة

  1. استنبت 1.0 × 106 من الخلايا المستهدفة الملتصقة في طبق زراعة أنسجة معالج بقطر 10 cm.
  2. قم بتحضين الخلايا المستهدفة لمدة 12 h قبل عملية ترانسدكشن الفيروسات البطيئة (lentiviral transduction).
    ملاحظة: الخلايا المستهدفة هي خلايا HEK293 التي تعبّر باستقرار عن Streptococcus pyogenes Cas9، وgRNA يستهدف CUL4B (الجدول 1)، وجين مقاومة البوروميسين (PuroR). حافظ على الخلايا في وسط cDMEM يحتوي على 10 µg/mL من البوروميسين، وتحقق من تعطيل CUL4B عن طريق تحليل western blot قبل التثبيط الذاتي لـ Cas9. أجْرِ جميع التجارب اللاحقة باستخدام خلايا HEK293ΔCUL4B في ممرات مبكرة.
  3. احصد الوسط الذي يحتوي على الفيروسات البطيئة عن طريق نقل السائل الطافي بعناية من خلايا HEK293FT المنتجة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 mL، مع الحرص على عدم تعكير الطبقة الخلوية الأحادية.
    ملاحظة: تخلص من خلايا HEK293FT المنتجة وفقاً لإرشادات السلامة البيولوجية المعتمدة32.
  4. قم بمركزة السائل الطافي المجموع عند 1,000 × g لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة (RT) لترسيب أي خلايا HEK293FT منتجة متبقية.
  5. قم بشفط والتخلص من وسط الزراعة من خلايا HEK293ΔCUL4B التي تم استنباتها مسبقاً.
  6. انقل 7 mL من السائل الطافي الفيروسي المصفى إلى الطبق قطر 10 cm الذي يحتوي على خلايا HEK293ΔCUL4B. تجنب تحريك الراسب في قاع أنبوب المركزّة، واترك 1 mL على الأقل من السائل الطافي المتبقي لتقليل انتقال الخلايا المنتجة.
    ملاحظة: قم بترشيح السائل الطافي عبر مرشح 0.45 µm، إذا رغبت في ذلك، للقضاء بشكل أكبر على الخلايا المنتجة المتبقية. تخلص من السائل الطافي المتبقي وفقاً لإرشادات السلامة البيولوجية32. عند عيار تقديري يبلغ 1.0 × 106 TU/mL، من المتوقع أن يؤدي لقاح بحجم 7 mL إلى إنتاج تعدد عدوى (MOI) يتراوح بين 3.5 و5.541.
  7. قم بتحضين خلايا HEK293ΔCUL4B التي خضعت للترانسدكشن لمدة 24 h للسماح بتمام عملية الترانسدكشن والتكامل الفيروسي البطيء.
  8. قم بشفط والتخلص من السائل الطافي الفيروسي.
  9. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 mL من محلول 1× PBS المعقم في درجة حرارة الغرفة.
  10. قم بشفط والتخلص من محلول PBS.
  11. أضف 10 mL من وسط cDMEM الطازج في درجة حرارة الغرفة.
  12. أعد الخلايا إلى الحاضنة واستنبتها لمدة أربعة أيام للسماح بتعبير الجين المنقول وتعطيل Cas9.
    ملاحظة: إذا كان ناقل Cas9 gRNA الفيروسي البطيء لا يشفر مراسلاً فلورياً، فقم بعمل ترانسدكشن لمزرعة مراقبة موازية باستخدام ناقل فيروسي بطيء تم إنتاجه بشكل مشابه ويعبّر عن مراسل فلوري. استخدم مزرعة المراقبة لتقدير كفاءة الترانسدكشن وتوقيت استنفاد الجين المستهدف عن طريق المجهر الفلوري النوعي أو قياس التدفق الخلوي الكمي. في هذه الدراسة، تم اكتشاف تعبير GFP بسهولة بواسطة المجهر الفلوري بعد أربعة أيام من الترانسدكشن.

4. الاختيار بالمضادات الحيوية للمتحولات التي تحمل gRNA الخاص بـ Cas9

ملاحظة: بعد أربعة أيام من عملية التنبيغ، يجب أن تكون الخلايا المستهدفة قد وصلت إلى حالة الالتحام أو اقتربت منها، مما يستدعي نقلها إلى وعاء زراعة أكبر. يتم إجراء نقل الخلايا بالتزامن مع بدء عملية الانتقاء بالمضادات الحيوية.

  1. اشفط وسط الزرع من خلايا HEK293ΔCUL4B وتخلص منه.
  2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 mL من المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات (PBS) المعقم بتركيز 1× في درجة حرارة الغرفة.
  3. اشفط محلول PBS وتخلص منه.
  4. أضف 2 mL من محلول trypsin-EDTA المعقم في درجة حرارة الغرفة إلى طبق الزرع.
  5. حضن الخلايا لمدة 5 min لتعزيز عملية الانفصال.
  6. أضف 8 mL من وسط cDMEM في درجة حرارة الغرفة لمعادلة تأثير الـ trypsin.
  7. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 mL.
  8. قم بتجانس معلق الخلايا عن طريق السحب والضخ (Trituration) من 15 إلى 20 مرة لتفكيك التجمعات الخلوية تماماً.
  9. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 × g لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة.
  10. أثناء عملية الطرد المركزي للخلايا، جهز قارورة T150 معالجة لزراعة الأنسجة تحتوي على 20 mL من وسط cDMEM المكمل بـ 250 µg/mL من hygromycin B.
    ملاحظة: قد يختلف تركيز hygromycin B المطلوب للاختيار باختلاف أنواع الخلايا. قم بإجراء منحنى قتل (kill curve) باستخدام 50–500 µg/mL من hygromycin B لتحديد الحد الأدنى من التركيز المطلوب للقضاء على جميع الخلايا غير المنقولة خلال 7–10 days. إذا تم استخدام علامة مقاومة لمضاد حيوي بديل في ناقل Cas9 gRNA، فقم بإجراء منحنى قتل باستخدام 2–10 µg/mL من blasticidin S، أو 400–800 µg/mL من G418/Geneticin، أو 50–400 µg/mL من zeocin.
  11. اشفط السائل الطافي وتخلص منه دون تعكير كتلة الخلايا (cell pellet).
  12. أعد تعليق كتلة الخلايا في 10 mL من وسط cDMEM المكمل بـ 250 µg/mL من hygromycin B.
  13. انقل معلق الخلايا البالغ 10 mL إلى قارورة T150 المجهزة والتي تحتوي على 20 mL من وسط الاختيار.
  14. رج القارورة بلطف لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ.
  15. حضن الخلايا تحت ظروف الاختيار لمدة ثلاثة أيام.
  16. في اليوم الثالث من الاختيار، اشفط وسط الاختيار واستبدله بـ 30 mL من وسط cDMEM طازج مكمل بـ 250 µg/mL من hygromycin B.
    ملاحظة: يؤدي استبدال وسط الاختيار إلى إزالة الخلايا الميتة غير الملتصقة، وتعويض العناصر الغذائية، والحفاظ على نشاط المضاد الحيوي.
  17. استمر في التحضين حتى تصل الطبقة الأحادية من الخلايا الناجية إلى درجة تلاقي (confluence) تبلغ 90% تقريباً، وعادة ما يكون ذلك بعد أربعة أيام إضافية.

5. التحقق من إزالة Cas9 وin trans إنقاذ CUL4B

ملاحظة: بمجرد أن تصل الخلايا إلى حالة تلاقي تبلغ 90% تقريبًا، تحقق من استئصال Cas9 في التجارب الأولية، وقم فورًا بحفظ بقية الخلايا بالتبريد42. يقلل هذا النهج من تطوير آليات تعويضية ثانوية.

  1. استنبات خلايا HEK293 في ممرات مبكرةΔCUL4B خلايا تعبر بشكل مستقر عن RNA موجه (gRNA) يستهدف Cas9 (والتي سيشار إليها فيما يلي باسم HEK293ΔCUL4BΔcas9) في أربعة آبار من طبق زراعة أنسجة مكون من 6 آبار بكثافة 2.5 × 105 عدد الخلايا لكل بئر.
  2. استزراع خلايا HEK293ΔCUL4B الخلايا في أربعة آبار من طبق منفصل يحتوي على 6 آبار. يتم استزراع خلايا HEK293 الأصلية في بئر إضافي واحد على الأقل ليكون بمثابة مجموعة ضابطة.
    ملاحظة: استخدم HEK293ΔCUL4B ومزارع خلايا HEK293 الأصلية كعناصر تحكم للتعبير عن Cas9 وCUL4B، على التوالي.
  3. تُحضن جميع المزارع لمدة 12 ساعة للسماح بالالتصاق الكامل للخلايا والتكاثر النشط.
  4. قم بتحضير مخاليط ترنسفكشن (نقل جيني) بفوسفات الكالسيوم (CaPhos) تحتوي على 0، أو 0.5، أو 1.0، أو 2.0 µg من pCMV-FLAG-CUL4B. قم بضبط كل خليط ليصل إلى إجمالي ثابت من 10 µg الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) عن طريق إضافة ناقل pCMV فارغ.
  5. خفف كل مزيج من الحمض النووي (DNA) في ماء معقم بدرجة نقاوة مناسبة للبيولوجيا الجزيئية حتى يصل الحجم النهائي إلى 180 µLأضف 20 µL من 2.5 M CaCl22، ثم أضف 200 µL من 2× محلول ملحي منظم بـ HEPES (HBS؛ باهاء 7.05) للحصول على حجم نهائي قدره 400 µL في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: عند استخدام بلازميدات التعبير التي تعمل بواسطة محفزات قوية (مثل CMV)، قم بإجراء معايرة للحمض النووي DNA لتحقيق مستويات تعبير بروتيني قابلة للمقارنة بالتعبير الداخلي. استخدم حمضاً نووياً بلازميدياً (plasmid DNA) تم التحقق من تسلسله، ويكون في الغالب فائق الالتفاف (supercoiled)، وبقيم امتصاص A260/A280 تتراوح بين 1.8 و2.0، وقيم A260/A230 تتراوح بين 2.0 و2.2، ومستوى إندوتوكسين يبلغ <0.1 وحدة دولية/µg.
  6. امزج كل محلول ترانسفكشن (transfection) من الفوسفات الكالسيومي (CaPhos) جيداً عن طريق الماصة بلطف.
  7. أضف 200 µL من كل خليط ترانزفكشن قطرة تلو الأخرى في البئر المخصص الذي يحتوي على خلايا HEK293ΔCUL4BΔcas9 الخلايا. استبدل رؤوس الماصات بين العينات لمنع التلوث الخلطي.
  8. أضف المتبقي 200 µL من كل خليط ترنسفكشن (transfection) مطابق قطرة تلو الأخرى إلى البئر المحدد الذي يحتوي على خلايا HEK293ΔCUL4B خلايا.
  9. يُحضن المزارع التي تم نقل الجينات إليها لمدة 12 ساعة.
  10. قم بشفط الوسط الزرعي من كل بئر.
  11. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من المحلول المعقم بدرجة حرارة الغرفة 1× محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS).
  12. اشفط محلول PBS وتخلص منه.
  13. أضف 2 مل من وسط cDMEM الطازج بدرجة حرارة الغرفة إلى كل بئر.
  14. تُحضن المزارع لمدة 24 ساعة إضافية للسماح بتعبير CUL4B والاستجابات الوظيفية اللاحقة.
  15. احصد الخلايا باستخدام إجراءات التريبسين القياسية.
  16. انقل كل معلق خلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 مل.
  17. اغسل كل معلق خلوي مرة واحدة بـ 1× محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS).
  18. قم بعمل نبضات قصيرة للعينات بسرعة 14,000 دورة في الدقيقة. × ج في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا.
  19. اسحب السائل العلوي من محلول PBS وتخلص منه.
    تنبيه: βيعد مادة 2-mercaptoethanol مهيجاً متطايراً للجلد والجهاز التنفسي وله رائحة قوية. يجب التعامل مع المحاليل الأصلية (stock solutions) داخل غطاء دخان كيميائي معتمد مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات المقاومة للمواد الكيميائية، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة. تخلص من الرؤوس الملوثة والأنابيب والنفايات وفقاً لإرشادات المؤسسة الخاصة بالنفايات الخطرة.
  20. قم بتحليل كل كتلة خلوية مباشرة في 200 µL محلول منظم عينات لايملي (Laemmli sample buffer) مُدعّم بـ 5% (حجم/حجم) β-مركابتويثانول.
  21. قم بمسخ البروتينات عن طريق تسخين العينات عند 95 °C لمدة 15 دقيقة.
  22. حل 20-40 µg للبروتين الكلي لكل مسار عن طريق الفصل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد وبنظام دوديسيل كبريتات الصوديوم القياسي (SDS-PAGE).
  23. انقل البروتينات المفصولة إلى غشاء من بولي فينيليدين فلوريد (PVDF).
  24. قم بحجب الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول الحجب.
    ملاحظة: قم بتحضير محلول الحجب باستخدام إما حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5% (وزن/حجم) أو ألبومين المصل البقري (BSA) بنسبة 5% (وزن/حجم) مُذاباً في محلول غسيل قياسي (0.1% Tween 20 في إما 1× محلول ملحي منظم بـ Tris أو 1× محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS).
  25. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام محلول غسيل قياسي.
  26. قم بتحضين الغشاء مع أجسام مضادة أولية ضد CUL4B أو Cas9 أو WDR5 أو CDC6 أو α-TUBULIN لمدة 12 ساعة عند 4 °C مع الرجّ اللطيف.
    ملاحظة: خفف الأجسام المضادة الأولية بنسبة 1:1,000 في محلول غسيل قياسي.
  27. أزل محلول الجسم المضاد الأولي واغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام محلول غسيل قياسي.
  28. قم بحضن الغشاء مع الجسم المضاد الثانوي المناسب من نوع IgG المضاد للفئران أو المضاد للأرانب، والمقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP)، لمدة 12 ساعة عند 4 °C مع الرّج اللطيف.
    ملاحظة: يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية بنسبة 1:3,000 في محلول الحجب.
  29. أزل محلول الأجسام المضادة الثانوية، واغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام محلول غسيل قياسي.
  30. ضع ركيزة التألق الكيميائي المحسّنة (ECL) بشكل متجانس على الغشاء، ثم حضنه لمدة دقيقة واحدة.
  31. التقط إشارات التلألؤ الكيميائي باستخدام نظام تصوير رقمي.
    ملاحظة: يمكن تأكيد نجاح تعطيل الجين، إذا لزم الأمر، عن طريق تسلسل سانجر للمنطقة الجينومية المستهدفة بعد تضخيم الحمض النووي الجينومي المستخلص بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).43.

النتائج

لإنتاج خطوط خالية من Cas9 عن طريق التعطيل لغرض إعادة التشكيل التجريبي، تم إنتاج فيروس لنتي (lentivirus) يشفر لـ gRNA يستهدف Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) في خلايا HEK293FT باستخدام بلازميدات تعبئة قياسية (pLP1 وpLP2 وpLP/VSVG). جُمع السائل الطافي الفيروسي الناتج واستُخدم لنقل العدوى إلى الخلايا المستهدفة. وأكد البقاء على قيد الحياة أثناء الانتقاء باستخدامไฮغرومايسين ب (hygromycin B) نجاح نقل العدوى الفيروسي اللنتي، بينما تحقق تحليل لطخة ويسترن اللاحق من تعطيل Cas9 (الشكل 1).

تم الكشف بسهولة عن بروتين CUL4B في خلايا HEK293 الأصلية، بينما كان غائباً في خلايا HEK293ΔCUL4B وHEK293ΔCUL4BΔcas9 المنقولة بنواقل فارغة. وتماشياً مع فقدان CUL4B، أظهر كل من WDR5 وCDC6 الزيادات والنقص المتوقعين في تعبير الحالة المستقرة، على التوالي، مما يؤكد تعطيل وظيفة CUL4B. كما تم الكشف عن بروتين Cas9 في خلايا HEK293ΔCUL4B، بينما لم يكن قابلاً للكشف في خلايا HEK293 الأصلية وخلايا HEK293ΔCUL4BΔcas9 ، مما يؤكد نجاح استئصال Cas9. وكما كان متوقعاً، أدى نقل بلازميد تعبير CUL4B إلى خلايا HEK293ΔCUL4B إلى استعادة ضئيلة فقط لتعبير بروتين CUL4B. في المقابل، لوحظ تعبير قوي لـ CUL4B بعد نقل خلايا HEK293ΔCUL4BΔcas9، صاحب ذلك استعادة لتعبير البروتينات المصبة، كما يتضح من انخفاض مستويات WDR5 وزيادة مستويات CDC6. وتثبت هذه النتائج مجتمعة أن استئصال Cas9 يسمح باستعادة فعالة لتعبير ووظيفة CUL4B عن طريق منع شطر بلازميد الإنقاذ بواسطة Cas9 (الشكل 2).

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل التجريبي للاستئصال الاستراتيجي لـ Cas9 والتحقق من استعادة CUL4B. يوضح سير العمل هذا توليد خلايا CRISPR المعطلة والمستأصلة لـ Cas9 عن طريق التعداء المشترك لخلايا HEK293FT المنتجة بـ pLP1 وpLP2 وpLP/VSVG وبنية Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro عبر تعداء فوسفات الكالسيوم. يتم جمع المادة الطافية للفيروسات البطيئة الناتجة، وطردها مركزياً لتنقية خلايا الإنتاج المتبقية، واستخدامها لنقل الجينات إلى الخلايا المستهدفة. وبعد عملية الانتقاء، يتم تأكيد نجاح استئصال Cas9 عبر تحليل لطخة ويسترن لإنشاء خط خلايا معطل تماماً وجاهز لإعادة تشكيل CUL4B تجريبياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: استعادة تعبير ووظيفة CUL4B في خلايا HEK293 المعدلة بواسطة CRISPR-Cas9. (A) المخطط التجريبي لسير عمل عفن الخلايا (transfection). تم عفن خلايا HEK293ΔCUL4B   و HEK293ΔCUL4BΔcas9 إما بناقل فارغ أو بكميات متزايدة من pCMV-FLAG-CUL4B. تم حصاد الخلايا بعد 36 h من عفن الخلايا، وفُصلت بروتينات المستخلص بواسطة SDS-PAGE. (B) تحليل لطخة ويسترن (Western blot) لكفاءة الاستعادة والضوابط الوظيفية اللاحقة. تم تصوير البروتينات المحددة بواسطة لطخة ويسترن. عمل كل من WDR5 و CDC6 كضوابط لوظيفة CUL4B. وعملت α-TUBULIN كضابط لتحميل العينات. استُخدمت خلايا HEK293 الأصلية كضابط للتعبير الأساسي. اللطخات ممثلة لتجارب مكررة (n = 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجين المستهدفتسلسل gRNA (5'′→3′)PAM (5′→3′)موقع الهدفوصف الهدف
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAتجمع جزيئات الجليكوجين (AGG)Xq24 الإكسون 3المنطقة الطرفية النيتروجينية (N-terminal) لإطار القراءة المفتوح (ORF) لجين CUL4B البشري من أجل التعطيل الجيني عن طريق إزاحة الإطار (frame-shift knockout)
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAتجمع الجلوتينين (AGG)إطار القراءة المفتوح (hSpCas9)منطقة داخلية محفوظة من الجين المنقول Cas9 لتحفيز حدوث طفرات حذف وإدراج ذاتية التعطيل

الجدول 1: تسلسلات الحمض النووي الريبوزي الموجه لـ CRISPR-Cas9 ومواصفات الهدف الجينومي.

المناقشة

أتاح هذا البروتوكول استعادة قوية للتعبير عن البروتين المستهدف ووظيفته في خطوط الخلايا التي تم تعطيلها باستخدام CRISPR-Cas9، والتي تم فيها استئصال Cas9 بعد عملية التعديل. ومن الملاحظات البارزة في هذا العمل الدرجة الكبيرة التي يثبط بها التعبير التأسيسي لـ Cas9 التعبير عن الجين المنقول المدفوع بالبلازميد. وتكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على استعادة كل من البروتين المفقود والنمط الظاهري المرتبط به. كما تضع هذه الطريقة إطاراً للاستكشاف الظاهري لمجموعة واسعة من التعديلات البروتينية. فعلى سبيل المثال، قد يوفر إدخال متغير محاكي للفسفرة (مثل استبدال السيرين بحمض الأسبارتيك) رؤية قيمة حول دور ذلك التعديل ما بعد الترجمي دون التداخل الناتج عن وجود البروتين الأصلي.

وبناءً على ذلك، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع مع الخطوط الخلوية القياسية الملتصقة (مثل HeLa و A549) والمعلقة (مثل Jurkat و THP-1). ومع ذلك، قد يثبت أن إطار الاختيار المتسلسل هذا غير عملي للخلايا الأولية أو الخلايا غير المنقسمة (مثل الخلايا العصبية الأولية أو البلاعم). وفي هذه الأنظمة الحساسة، يؤدي التخلص السريع من الخلايا المجاورة غير المنقولة إلى إطلاق حطام سام للخلايا وإشارات إجهاد محفزة لموت الخلايا المبرمج في البيئة الدقيقة المشتركة، مما يؤدي إلى تسمم غير مباشر46,47. وبالمثل، قد يفشل هذا الإطار في الخطوط السرطانية متعددة الصيغ الصبغية وشديدة التكيف (مثل الورم الأرومي الدبقي U87 أو الورم الميلانيني A375) التي تميل إلى الهروب من الأنماط الظاهرية التي يتوسطها نظام CRISPR عبر إعادة ترتيب صبغية سريعة أو الاختيار السريع للمستنسخات المقاومة الموجودة مسبقاً48,49. وفي نهاية المطاف، تعتمد الملاءمة على قدرة الخط الخلوي على تحمل الحمل الأيضي للتعبير عن ناقلين مزدوجين، ومقاومة ضغوط الاختيار غير المباشرة هذه، والحفاظ على حركية نمو مستقرة طوال البروتوكول الذي يستغرق عدة أسابيع.

بينما يعمل هذا النهج كإثبات مفهوم متعدد الاستخدامات لمعظم الخطوط الخلوية، فإن تنفيذه يتطلب توازناً دقيقاً بين كفاءة التوصيل والسلامة الجينومية. وكما هو موضح، فإن استخدام التوصيل عبر الفيروسات البطيئة (lentiviral delivery) لـ gRNA الموجه ذاتياً يضمن الحصول على مجموعة متجانسة خالية من Cas9، خاصة في الخلايا التي يصعب ترانسفكشنها. ومع ذلك، يظل خطر الطفرات الإدخالية الناتجة عن التكامل شبه العشوائي مصدر قلق. ويمكن إدارة هذه المخاطر عن طريق تحسين تعدد العدوى (MOI). ففي الخطوط المتقبلة مثل HEK293، يحقق MOI يتراوح بين 1–5 تشبعاً عالياً مع تقليل الطفرات الناجمة عن التكامل والسمية الخلوية41. وفي المقابل، تتطلب الخلايا المناعية أو العصبية المستعصية عادةً MOIs تتراوح بين 10–50، وغالباً ما يستلزم ذلك استخدام معززات مثل polybrene و/أو التلقيح بالدوران (spinoculation) لتحقيق كفاءات مماثلة50,51,52,53,54,55.

يمتد هذا المقايضة التقنية إلى المفاضلة بين المجموعات المختارة أحادية النسيلة أو متعددة النسائل. إن خلايا HEK293ΔCUL4BΔcas9 التي تم إنتاجها هنا هي متعددة النسائل، وهو خيار يسرع الجداول الزمنية التجريبية من خلال تجاوز عملية التوسع التي تستغرق أسابيع والمطلوبة للاستنساخ الفرعي للخلية الواحدة. علاوة على ذلك، فإن المجمع متعدد النسائل يلتقط النمط الظاهري المتوسط للمزرعة، مما يوفر حماية فعالة ضد العيوب الناتجة عن النسيلة الواحدة أو مشكلات التكامل المحددة الموقع. وبينما تكون الخطوط أحادية النسيلة أكثر قدرة على تقديم نتائج متسقة نظرًا للتجانس الجيني، فإن النتائج المعروضة هنا تشير إلى أن الاختيار متعدد النسائل يعد بديلاً قابلاً للتطبيق وغالباً ما يكون أفضل عندما تكون الأولوية للسرعة وتمثيل المجتمع الخلوي.

قد يكون الاستقرار الزمني للنمط الظاهري الناتج متغيراً حرجاً أيضاً. في النظام المعروض هنا، تضاءل التأثير التنظيمي لـ CUL4B على WDR5 و CDC6 عبر الممرات المتتالية لخطوط الخلايا المعطلة جينياً، وهو ما ارتبط بزيادة تعويضية في تنظيم البروتين الموازي CUL4A (البيانات غير معروضة). وهذا يعكس نتائج Nakagawa وآخرون، الذين أظهروا أن CUL4A يمكنه استعادة وظيفة CUL4B جزئياً في الخلايا المستنفذة من CUL4B44. إن هذا التعويض الاستتبابي شائع في البيولوجيا الخلوية، خاصة عند استهداف بروتين يتميز بتماثل بنيوي عالٍ وتكرار وظيفي مع بروتينات خلوية أخرى.

للتعامل مع هذه الآليات التعويضية الثانوية، يمكن اتباع نهجين استراتيجيين متميزين، وذلك بناءً على الأهداف التجريبية وخط الخلايا المستخدم. بالنسبة للباحثين الذين يمنحون الأولوية للكفاءة أو يعملون مع خطوط خلوية عالية التكيف، فإن اعتماد جدول زمني تجريبي مكثف يعد أمرًا ضروريًا. تتضمن هذه الاستراتيجية التحقق الفوري من فقدان البروتين المستهدف، ويفضل أن يكون ذلك بمجرد وصول المزرعة إلى 90% من درجة الالتحام بعد عملية الاختيار، يليه مباشرةً استهداف Cas9 ذاتي التعطيل وإجراء المقايسات الوظيفية. ومن خلال اعتماد سير العمل المتسارع هذا، تزداد احتمالية رصد العواقب البيولوجية الأولية لعملية التعطيل الجيني (knockout) قبل أن تتوفر الآليات التوازنية الخلوية الوقت الكافي لزيادة تنظيم النظائر المتكررة أو التسبب في تشويش النمط الظاهري الناتج.

وبدلاً من ذلك، بالنسبة للدراسات التي تتطلب استقراراً طويل الأمد أو تجارب إنقاذ عالية الدقة، لا سيما في النماذج المقاومة للترانسفكشن (transfection-refractory) مثل الخلايا المناعية والعصبية، يوفر النظام المتحكم به بواسطة التتراسيكلين (Tet-On/Off) حلاً فعالاً56,57. ورغم أن تنفيذ هذا الإطار القابل للتحفيز يتطلب جولات إضافية من نقل الفيروسات البطيئة (lentiviral transduction) واستخدام علامات مقاومة لمضادات حيوية مختلفة، إلا أنه يوفر آلية لاستعادة البروتين المستهدف بشكل مستدام لاستقرار البيئة الخلوية قبل تحفيز أحداث "الفقد والإنقاذ" المؤقتة التي تتم بوساطة الدوكسيسيكلين57.

الإفصاحات

استخدم المؤلفون Google Gemini للمساعدة في تنقيح المصطلحات التقنية وتحرير المخطوطة. وقد استُخدم الذكاء الاصطناعي كأداة للتحسين اللغوي ولم يساهم في التركيب الأصلي للبيانات، أو وضع التصور الدراسي، أو الصياغة الأولية للنص. وقد راجع المؤلفون المخرجات وقاموا بتحريرها ويتحملون المسؤولية الكاملة عن محتوى المخطوطة النهائية. ويصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال صناديق التمويل الأولية المقدمة من كلية Le Moyne، ولجنة البحث والتطوير في كلية Le Moyne، ولجنة أبحاث الطلاب في كلية Le Moyne، وصندوق مركز Walter L. '66 و MaryAnne Poland اليسوعي للبحث والابتكار في التدريس، وقسم العلوم البيولوجية والبيئية في كلية Le Moyne. يقر المؤلفون باستخدام BioRender.com في إعداد الرسوم التوضيحية الرسومية. تم إنشاء الشكل 1 في BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3)، كما تم إنشاء اللوحة العلوية من الشكل 2 في BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة لـ Cas9Cell Signaling65832يوفر هذا الجسم المضاد أحادي النسيلة من الفأر كشفاً محدداً لـ S. pyogenes Cas9 في المستخلصات البشرية، مما يجعله مثالياً للتحقق من إزالة Cas9 بوساطة gRNA الموجه ذاتياً.
الأجسام المضادة لـ CDC6Cell Signaling3387يوفر هذا الجسم المضاد أحادي النسيلة من الأرنب كشفاً محدداً لـ CDC6 البشري، مما يجعله مثالياً لمراقبة التأثيرات الوظيفية اللاحقة لـ CUL4B.
الأجسام المضادة لـ CUL4BSigma-AldrichC9995يوفر هذا الجسم المضاد متعدد النسائل من الأرنب والمنقى بالألفة كشفاً محدداً لـ CUL4B البشري دون التفاعل المتصالب مع نظيره القريب CUL4A.
الجسم المضاد الثانوي anti-mouse IgG المترابط بـ HRPCell Signaling7076هذا الجسم المضاد لـ IgG الفأري من الحصان مرتبط بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) ومحسن للكشف الكيميائي المضيء عن الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة من الفأر.
الجسم المضاد الثانوي anti-rabbit IgG المترابط بـ HRPCell Signaling7074هذا الجسم المضاد لـ IgG الأرنبي من الماعز مرتبط بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) ومحسن للكشف الكيميائي المضيء عن الأجسام المضادة الأولية متعددة النسائل وأحادية النسيلة من الأرنب.
الأجسام المضادة لـ WDR5Cell Signaling13105يوفر هذا الجسم المضاد أحادي النسيلة من الأرنب كشفاً محدداً لـ WDR5 البشري، مما يجعله مثالياً لمراقبة التأثيرات الوظيفية اللاحقة لـ CUL4B.
الأجسام المضادة لـ α-TUBULINCell Signaling3873يستهدف هذا الجسم المضاد أحادي النسيلة من الفأر alpha-tubulin البشري، وهو مثالي كضابط تحميل موحد للتقييس في تحليل لطخة ويسترن.
طقم ترانسفكشن فوسفات الكالسيومThermoFisher ScientificK278001يوفر هذا الطقم كواشف ترانسفكشن عابرة فعالة ومحسنة للإنتاج القابل للتوسع وفعال التكلفة لنواقل الفيروسات البطيئة في خلايا HEK293FT المنتجة الملتصقة.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation custom synthesisتسلسل cas9 gRNA: CGTGATCACCGACGAGTACA، تسلسل PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation custom synthesisتسلسل cas9 gRNA: CGTGATCACCGACGAGTACA، تسلسل PAM: AGG
وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium GibcoD5796هذا الوسط عالي الجلوكوز المكمل بـ L-glutamine وبيروفات الصوديوم محسن للحفاظ على النمو والحيوية والاستقرار الأيضي في خطوط الخلايا الثديية سريعة التكاثر (مثل HEK293FT)
مصل جنين البقري، ممتاز (مخمد حرارياً)Corning35-016-CVيوفر هذا المصل من الدرجة الممتازة والمخمد حرارياً عوامل نمو وهرمونات أساسية مع تقليل السمية الخلوية بوساطة المتممة لخطوط الخلايا الثديية.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573خط خلايا الكلية الجنينية البشرية الموصوف جيداً هذا قابل للترانسفكشن بدرجة عالية ويعمل كنموذج قياسي وقوي للتحقق من أنماط تعطيل الجينات وأطر استعادة البروتين.
خلايا HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007هذا المتغير سريع النمو وعالي القابلية للترانسفكشن من خط الكلية الجنينية البشرية يعبر بشكل مستقر عن مستضد SV40 large T، مما يجعله محسناً لزيادة عيارات الفيروسات أثناء إنتاج نواقل الفيروسات البطيئة.
Hygromycin BsigmaaldrichH7772يستخدم هذا المضاد الحيوي من نوع أمينونوكليوسيد كعامل اختيار في استنبات الخلايا الثديية لعزل المتحولات المستقرة التي تعبر عن علامة مقاومة الهيجروميسين.
بلازميد pCLIP-All-hCMV-Puro (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bتسلسل CUL4B gRNA: ATCAAACCCTACAAACTCCA، تسلسل PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/Aيستخدم بلازميد التعبير الثديي هذا محفز الفيروس المضخم للخلايا (CMV) لتوجيه التعبير التأسيسي لبروتين Cullin 4B المسمى بـ FLAG (CUL4B)، وهو هدية من Jianping Jin.
ناقل التعبير الثديي pCMV-M1Addgene23007ضابط ناقل تعبير فارغ (هدية من Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963يوجه ناقل النقل الفيروسي البطيء هذا تعبير محفز U6 البشري لـ gRNA قابل للتخصيص جنباً إلى جنب مع علامة مقاومة البيوروميسين الموجهة بمحفز EF-alpha لاستهداف CRISPR في الخلايا التي تعبر عن Cas9، وهو هدية من Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 ناقل فيروسي بطيء يشفر لـ GFP لتقييم كفاءة التحول (هدية من Kevin Janes)
PuromycinSigma-AldrichP8833يستخدم هذا المضاد الحيوي من نوع أمينونوكليوسيد كعامل اختيار في استنبات الخلايا الثديية لعزل المتحولات المستقرة التي تعبر عن علامة مقاومة البيوروميسين.
محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم (PBS)Corning21-040-CVيستخدم هذا المحلول الملحي المتوازن القياسي لغسل الطبقات الخلوية أحادية الطبقة لإزالة بقايا أوساط الاستنبات أو بروتينات المصل أو الإنزيمات بفعالية دون تعطيل الضغط الاسموزي أو حيوية الخلايا.
Trypsin EDTA 1XCorning25-051-CIيستخدم محلول التفكيك الإنزيمي القياسي هذا لفصل الخلايا الثديية الملتصقة من أوعية الاستنبات عن طريق شطر الروابط الببتيدية، بينما يقوم EDTA بمخلبة الكاتيونات ثنائية التكافؤ لتعطيل الالتصاق بين الخلايا.
مزيج تغليف الفيروسات البطيئة ViraPowerThermoFisher ScientificK497500يستخدم هذا المزيج المحسن من بلازميدات التغليف (pLP1 و pLP2 و pLP/VSVG) للترانسفكشن المشترك في الخلايا المنتجة لتسهيل تجميع عيارات عالية وإنتاج نواقل تعبير فيروسية بطيئة غير قادرة على التكرار.

المراجع

  1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Leonhardt C, et al. Single-cell mRNA transfection studies: Delivery, kinetics and statistics by numbers. Nanomedicine. 2014;10(4):679-688.
  3. Liu Y, Yang Q, Zhao F. Synonymous but not silent: The codon usage code for gene expression and protein folding. Annu Rev Biochem. 2021;90:375-401.
  4. Chamary JV, Hurst LD. Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals. Genome Biol. 2005;6(9):R75.
  5. Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. 2014;20(11):604-613.
  6. Bauer AP, et al. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):3891-3908.
  7. Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 2009;324(5924):255-258.
  8. Simms CL, Yan LL, Zaher HS. Ribosome collision is critical for quality control during no-go decay. Mol Cell. 2017;68(2):361-373.e5.
  9. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826.
  10. Babu K, et al. Bridge helix of Cas9 modulates target DNA cleavage and mismatch tolerance. Biochemistry. 2019;58(14):1905-1917.
  11. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31(9):827-832.
  12. Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med. 2018;24(7):939-946.
  13. Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med. 2018;24(7):927-930.
  14. Yang S, Li S, Li XJ. Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Rep. 2018;25(10):2653-2659.e3.
  15. Kafri M, Metzl-Raz E, Jona G, Barkai N. The cost of protein production. Cell Rep. 2016;14(1):22-31.
  16. Mehta A, Merkel OM. Immunogenicity of Cas9 protein. J Pharm Sci. 2020;109(1):62-67.
  17. Liu Q, Zhang H, Huang X. Anti-CRISPR proteins targeting the CRISPR-Cas system enrich the toolkit for genetic engineering. FEBS J. 2020;287(4):626-644.
  18. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csörgő B, Bondy-Denomy J. Anti-CRISPR protein applications: Natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nat Methods. 2020;17(5):471-479.
  19. Gangopadhyay SA, et al. Precision control of CRISPR-Cas9 using small molecules and light. Biochemistry. 2019;58(4):234-244.
  20. Pandit B, et al. Bio-orthogonal chemistry-based strategy to turn off CRISPR-Cas9 activity in solution and live cells. NAR Mol Med. 2026;3(1):ugag008. Available from: https://doi.org/10.1093/narmme/ugag008
  21. Bubeck F, et al. Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9. Nat Methods. 2018;15(11):924-927.
  22. Kostic M, Jones LH. Critical assessment of targeted protein degradation as a research tool and pharmacological modality. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(5):305-317.
  23. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019.
  24. Hendel A, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):985-989.
  25. Merienne N, et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Rep. 2017;20(12):2980-2991.
  26. Kelkar A, et al. Doxycycline-dependent self-inactivation of CRISPR-Cas9 to temporally regulate on- and off-target editing. Mol Ther. 2020;28(1):29-41.
  27. Dai Y, et al. Self-inactivating AAV-CRISPR at different ages enables sustained amelioration of Huntington's disease deficits in BAC226Q mice. Sci Adv. 2026;12(12):eaea8052.
  28. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11:783-784.
  29. Parr-Brownlie LC, et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 2015;8:14.
  30. Dobransky A, Root M, Hafner N, Marcum M, Sharifi HJ. CRL4-DCAF1 ubiquitin ligase-dependent functions of HIV viral protein R and viral protein X. Viruses. 2024;16(8)1313.
  31. Thermo Fisher Scientific. ViraPower Lentiviral Expression Systems User Guide. 2026. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/virapower_lentiviral_system_man.pdf
  32. Pauwels K, et al. State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr Gene Ther. 2009;9(6):459-474.
  33. Guo L, et al. Optimizing conditions for calcium phosphate-mediated transient transfection. Saudi J Biol Sci. 2017;24(3):622-629.
  34. Thermo Fisher Scientific. Cationic Lipid Transfection. 2026. Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/cationic-lipid-transfection.html
  35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. Available from: https://doi.org/10.1038/nprot.2009.22
  36. Barde I, Salmon P, Trono D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 2010;53(1):4.21.1-4.21.23. Available from: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142301.ns0421s53
  37. Kumru OS, et al. Physical characterization and stabilization of a lentiviral vector against adsorption and freeze-thaw. J Pharm Sci. 2018;107(11):2764-2774.
  38. American Type Culture Collection. Lentiviral Vector Reference Material Information Sheet. 2026. Available from: https://www.atcc.org/-/media/product-assets/documents/protocols/virology/lentiviral-vector-reference-material-information-sheet.pdf?rev=a934bd06c07f4969b0aafec16506cd44
  39. Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 2001;280(1):124-131.
  40. Kowolik CM, Yee JK. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 2002;5(6):762-769.
  41. Pichavant C, Tremblay JP. Generation of lentiviral vectors for use in skeletal muscle research. In: DiMario JX, editor. Myogenesis: Methods and Protocols. Humana Press; Totowa, NJ; 2012. p. 285-295.
  42. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat Protoc. 2008;3(12):1981-1989.
  43. Bauer DE, Canver MC, Orkin SH. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. J Vis Exp. 2015;(95):e52118.
  44. Nakagawa T, Xiong Y. X-linked mental retardation gene CUL4B targets ubiquitylation of H3K4 methyltransferase component WDR5 and regulates neuronal gene expression. Mol Cell. 2011;43(3):381-391.
  45. Zou Y, et al. CUL4B promotes replication licensing by up-regulating the CDK2-CDC6 cascade. J Cell Biol. 2013;200(6):743-756.
  46. Dachs GU, Hunt MA, Syddall S, Singleton DC, Patterson AV. Bystander or no bystander for gene-directed enzyme prodrug therapy. Molecules. 2009;14(11):4517-4545.
  47. Prise KM, O'Sullivan JM. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2009;9(5):351-360.
  48. Clark MJ, et al. U87MG decoded: The genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000832.
  49. Cormier JN, et al. Heterogeneous expression of melanoma-associated antigens and HLA-A2 in metastatic melanoma in vivo. Int J Cancer. 1998;75(4):517-524.
  50. Sigma-Aldrich. Successful Transduction Using Lentivirus. Darmstadt, Germany; 2023. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/successful-transduction-lentivirus
  51. Swainson L, Mongellaz C, Adjali O, Vicente R, Taylor N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol. 2008;415:301-320.
  52. Davis HE, Morgan JR, Yarmush ML. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 2002;97(2-3):159-172.
  53. Denning W, et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: Effect of sera and polycations. Mol Biotechnol. 2013;53(3):308-314.
  54. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 2000;74(21):10074-10080.
  55. Sano S, et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. 2019;(152):e59977.
  56. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(12):5547-5551.
  57. Gossen M, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268(5218):1766-1769.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

BiologyCRISPRCas9KnockoutLentivirusTransductionStableSelectionRescueRestorationTransgeneTransfectionPlasmid
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.