تدمج هذه الدراسة بين بيانات الترانسكريبتوميات العامة لالتهاب الرئة لدى الأطفال، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لرئة الفأر، وفحص المركبات المستخلصة من نبات Paeonia، والرسو الجزيئي، ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية، وذلك لتحديد الأهداف الالتهابية المرتبطة بالخلايا المتعادلة وتوقعات تفاعلات الكاتيكين من أجل التحقق منها مستقبلاً.
مقالة بحثية
تأثيرات الكاتيكين المستخلص من نبات Paeonia على الالتهاب المرتبط بالخلايا المتعادلة في الالتهاب الرئوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
غالباً ما يصاحب الالتهاب الرئوي لدى الأطفال استجابات التهابية مفرطة واختلال في التنظيم المناعي، مما قد يؤدي إلى نتائج سريرية شديدة. وقد أظهر الكاتيكين (Catechin) نشاطاً مضاداً للالتهابات في سياقات مرضية متعددة، إلا أن دوره وآلياته الجزيئية في الالتهاب الرئوي لا تزال غير واضحة. تم تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-sequencing) العامة من عينات التهاب رئوي لدى الأطفال (GSE261482) وبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية العامة لرئة الفئران من نموذج تجريبي للالتهاب الرئوي (GSE295484) باستخدام تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون، وتحليل التعبير التفاضلي، وتوصيف أنواع الخلايا، وتحليل إثراء مجموعة الجينات. كما تم تقييم التفاعلات بين الكاتيكين وبروتينات مختارة باستخدام الالتحام الجزيئي ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية. تم تحديد وحدة جينية رئيسية مرتبطة بسمات الالتهاب الرئوي، وفحص 18 جيناً مرشحاً، والتي كانت غنية بشكل أساسي في المسارات المرتبطة بالالتهاب والمناعة. وأظهر تحليل الخلايا المنفردة أن هذه الجينات كانت متركزة بشكل أساسي في الخلايا المتعادلة والبلعميات السنخية، مع زيادة في نسب الخلايا المتعادلة في الظروف الالتهابية. تم اختيار MMP9 وPYGL وGADD45A كجينات مرشحة. ودعمت محاكاة الالتحام والديناميكيات التفاعلات المتوقعة المستقرة بين الكاتيكين وهذه البروتينات المختارة. قد يكون الكاتيكين مرتبطاً بالمسارات الالتهابية المتعلقة بالالتهاب الرئوي من خلال تعديل المسارات المرتبطة بالخلايا المتعادلة والتفاعل مع البروتينات الرئيسية المرتبطة بالمناعة. توفر هذه الدراسة رؤية على مستوى الأنظمة لعمل الكاتيكين في الالتهاب الرئوي وتسلط الضوء على أهداف محتملة لمزيد من التحقق التجريبي.
المقدمة
يعد الالتهاب الرئوي مرضاً تنفسياً شائعاً وقد يكون خطيراً لدى الأطفال، وينتج بشكل أساسي عن عوامل معدية مثل Mycoplasma pneumoniae. وهو يمثل مكوناً رئيسياً من الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع، ويرتبط بمعدلات مراضة كبيرة بسبب الاستجابات الالتهابية المفرطة واختلال التنظيم المناعي1,2. وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن السيتوكينات الالتهابية، بما في ذلك عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) وإنترلوكين-6 (IL-6)، تلعب أدواراً حاسمة في تطور المرض من خلال تحفيز استقطاب الخلايا المناعية، وإصابة الأنسجة، والخلل الوظيفي الرئوي3. وعلى الرغم من التقدم في العلاج بمضادات الميكروبات، لا تزال الآليات الجزيئية التي تحرك الالتهاب في الالتهاب الرئوي لدى الأطفال غير مفهومة بشكل كامل4.
لقد استقطبت الفلافونيدات اهتماماً كبيراً نظراً لخصائصها المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة5. وقد أُفيد بأن الكاتيكين، وهو بوليفينول طبيعي يوجد بكثرة في الشاي والأغذية المشتقة من النباتات، يعمل على تخفيف الإجهاد التأكسدي والاستجابات الالتهابية في نماذج مرضية مختلفة6. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الكاتيكين يمكنه تثبيط شلالات إشارات الالتهاب، بما في ذلك مسارات MAPK وNF-κB، وتنظيم تعبير السيتوكينات، مما يؤدي إلى تخفيف الالتهاب والخلل الوظيفي الأيضي7. ومع ذلك، فإن معظم الدراسات الحالية تركز على الأمراض الأيضية أو أمراض القلب والأوعية الدموية، بينما لا يزال دور الكاتيكين في الأمراض الالتهابية التنفسية، وخاصة الالتهاب الرئوي، غير مدروس بما يكفي. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال الأهداف الجزيئية والآليات التي تكمن وراء الحماية التي يوفرها الكاتيكين في حالات الالتهاب الرئوي غير واضحة.
هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء الآليات الجزيئية المحتملة للكاتيكين في علاج الالتهاب الرئوي. واُفترض أن الكاتيكين يمكن أن يخفف من الاستجابات الالتهابية من خلال التفاعل مع البروتينات الرئيسية ومسارات الإشارات المشاركة في التنظيم المناعي. ولاختبار هذه الفرضية، تم دمج تحليلات علم الصيدلة الشبكي، والرسو الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، وتسلسل RNA أحادي الخلية لتحديد الجينات المرشحة بشكل منهجي وتقييم تفاعلاتها مع الكاتيكين. علاوة على ذلك، تم تحليل توزيع الخلايا المناعية وأنماط التعبير الجيني لاستكشاف دور الخلايا المتعادلة والبلاعم في تطور المرض.
أظهرت النتائج ارتباطاً تنبؤياً مستقراً بين الكاتيكين (catechin) وبروتينات مختارة، بما في ذلك PYGL وMMP9 وGADD45A، مع الحفاظ على الاستقرار الهيكلي طوال عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك، كشف تحليل الخلية الواحدة عن تغيرات ملحوظة في نسب الخلايا المناعية، ولا سيما الخلايا المتعادلة (neutrophils)، في ظل الظروف الالتهابية. وتشير هذه النتائج إلى أن الكاتيكين قد يكون مرتبطاً بآليات مضادة للالتهاب تشمل وظيفة الخلايا المناعية ومسارات نقل الإشارة الرئيسية. توفر هذه الدراسة رؤية شاملة على مستوى الأنظمة للآليات المحتملة المرتبطة بالكاتيكين في مرض الالتهاب الرئوي، وتدعم المزيد من التحقق من الكاتيكين كمركب مرشح لأبحاث الأمراض التنفسية الالتهابية.
البروتوكول
تضمنت هذه الدراسة تحليلاً ثانوياً لمجموعات بيانات مجهولة الهوية ومتاحة للعموم من قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus. ولم يتم استقطاب أو جمع أو توليد أي مشاركين بشريين جدد، أو تجارب حيوانية، أو عينات سريرية لهذه الدراسة. وكانت المسؤولية عن الموافقة الأخلاقية والموافقة المستنيرة لمجموعات البيانات الأصلية تقع على عاتق الدراسات الأصلية التي أنتجت تلك البيانات. وبناءً على ذلك، لم تكن هناك حاجة لموافقة إضافية من لجنة الأخلاقيات لهذا التحليل الثانوي الحالي.
جمع البيانات ومعالجتها الأولية
تم الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الشامل (RNA-seq) من مجموعة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO) ذات الرقم GSE2614828. اشتملت مصفوفة التعبير المستخدمة في هذه الدراسة على 177 عينة من الدم الكامل، بما في ذلك 139 عينة من الأطفال المصابين بالالتهاب الرئوي و38 عينة من مجموعة ضابطة سليمة. تضمنت البيانات الوصفية المتاحة الجنس، والتصنيف المسبب للمرض، وأنبوب الجمع، والدفعة، والحالة المرضية. تم تصنيف عينات الالتهاب الرئوي إلى بكتيرية مؤكدة (DB)، أو فيروسية مؤكدة (DV)، أو بكتيرية محتملة (PB)، أو فيروسية محتملة (PV)، أو غير معروفة (U) وفقاً لتصنيفات مجموعة البيانات الأصلية.
تم الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) من مجموعة بيانات GEO ذات الرقم GSE2954849، والتي اشتُقت من أنسجة رئة فئران C57BL/6 من النوع البري في نموذج تجريبي للالتهاب الرئوي. تضمنت مجموعة البيانات فئران حديثة الولادة (PND05) وفئران يافعة (PND12) تعرضت لهواء الغرفة، أو محلول PBS، أو بكتيريا E. coli، وجُمعت العينات بعد 48 h أو 96 h من عملية الشفط.
تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA)
لبناء شبكة التعبير المشترك، تمت تصفية مصفوفة التعبير أولاً لإزالة الجينات ذات التعبير المنخفض. بعد إزالة الجينات ذات التعبير المنخفض، تم تقييم التباين باستخدام الانحراف المطلق عن الوسيط (MAD). تم اختيار الـ 5,000 جين ذات أعلى قيم MAD لإجراء تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA) باستخدام برنامج R. تم تطبيق قوة عتبة لينة قدرها 15 لأنها استوفت معيار الطوبولوجيا الخالية من المقياس R2> 0.8. استُخدمت هذه العتبة لبناء مصفوفة التجاور الموزونة، والتي تم تحويلها لاحقاً إلى مصفوفة التداخل الطوبولوجي (TOM). بعد ذلك، تم اكتشاف الوحدات الجينية من شجرة التجميع الهرمي القائمة على مصفوفة TOM. ولتحديد الوحدات المرتبطة بالسمات المصاحبة للالتهاب الرئوي، تم حساب الجينات الذاتية للوحدات (module eigengenes) واختبار ارتباطها بحالة المرض ومسبباته.
تحليل التعبير التفاضلي
تمت مقارنة مجموعتي الالتهاب الرئوي والمجموعة الضابطة السليمة باستخدام حزمة limma في لغة R لتحديد الجينات ذات التعبير التفاضلي. وأُجري تصحيح للاختبارات المتعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg. وتم اعتبار الجينات جينات ذات تعبير تفاضلي فقط عند استيفاء كلا العتبتين: |log2 fold change| > 1 وقيمة p-value المعدلة < 0.05.
تحديد المركبات النشطة المشتقة من Paeonia والتنبؤ بالأهداف
من أجل تحديد المركبات ذات النشاط الحيوي في نبات الـ Paeonia وأهدافها البيولوجية المحتملة بشكل منهجي، تم تطبيق استراتيجية تكامل متعددة القواعد لضمان الموثوقية والشمولية، وذلك باتباع أطر عمل علم الصيدلة الشبكي المعتمدة. أولاً، تم استرجاع المركبات النشطة في Paeonia من قاعدة بيانات علم صيدلة نظم الطب الصيني التقليدي (TCMSP, https://tcmsp-e.com) وقواعد بيانات عامة أخرى، بما في ذلك ETCM والمصادر الأدبية. ثم فُرزت المركبات بناءً على المعايير الحركية الدوائية، بما في ذلك التوافر الحيوي الفموي (OB ≥ 30%) ومحاكاتية الدواء (DL ≥ 0.18)، لتحديد المكونات النشطة حيويًا المرشحة.
تم التنبؤ بالأهداف البروتينية المحتملة باستخدام نهج تكميلية قائمة على اللجينات. استُخدم موقع SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch) لتحديد الأهداف البشرية المرجحة من خلال مقارنة هياكل المركبات مع لجينات ذات نشاط معروف، واحتُفظ فقط بالتنبؤات ذات الاحتمالية ≥ 0.1. ولتوسيع نطاق تغطية الأهداف، استُخدم أيضاً نهج مجموعة التشابه (SEA, http://sea.bkslab.org) للفحص عن الارتباطات المحتملة خارج الهدف عبر العائلات البروتينية، بما في ذلك التفاعلات التي لم ترصدها تنبؤات الأهداف التقليدية. ولتكملة التنبؤ القائم على اللجينات بشكل أكبر، استُخدم خادم PharmMapper (http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/) لرسم الخرائط الفارماكوفورية العكسية مقابل قاعدة بيانات شاملة للبروتينات البشرية، واختيرت الأهداف ذات درجات الملاءمة المعيارية ≥ 0.7. بالإضافة إلى ذلك، جُمعت تفاعلات المركب والهدف التي تم التحقق منها تجريبياً من قواعد البيانات العامة، بما في ذلك DrugBank وBindingDB، لتحسين موثوقية تحديد الأهداف. بعد ذلك، تم توحيد جميع الأهداف المتوقعة إلى رموز جينية رسمية باستخدام قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org)، مع قصر الكائن الحي على "Homo sapiens." وحُذفت الإدخالات المكررة لضمان دقة البيانات. عُرِّفت مجموعة الأهداف المتكاملة على أنها اتحاد جميع الأهداف المتوقعة والمحققة لـ Paeonia، مما يمثل الأساس الجزيئي المحتمل لآثارها الفارماكولوجية. وبما أن الكاتيكين (catechin) قد حُدد كأحد المركبات النشطة المشتقة من Paeonia وله نشاط مضاد للالتهابات موثق جيداً، فقد اختير كمركب ممثل لعمليات الالتحام الجزيئي ومحاكاة الديناميكا الجزيئية اللاحقة.
تحليل الإثراء الوظيفي
تم تقييم الإثراء الوظيفي للعمليات البيولوجية وفقاً لأنطولوجيا الجينات (GO) ومسارات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) باستخدام حزمة clusterProfiler في لغة R. وقد تم الاحتفاظ بالمصطلحات المثرى عندما كان معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) < 0.05.
تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والتحليلات اللاحقة
تمت معالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (Single-cell RNA sequencing) باستخدام برنامج Seurat. واستُخدمت مصفوفة GSE295484 المعالجة في التحليلات اللاحقة، ولم يتم تطبيق أي تصفية إضافية على مستوى الخلايا بعد استيرادها. احتوت المصفوفة المعالجة على 90,883 خلية و 26,511 جيناً. استخدمت مخططات مراقبة الجودة عتبات مرجعية بلغت 200 و 8,000 جين مكتشف لكل خلية و 1.4% من القراءات الميتوكوندرية. خضعت البيانات للتطبيع (normalization) والقياس (scaling) وتحليل المكونات الرئيسية (PCA). بعد ذلك، تم إجراء تجميع للخلايا (Cell clustering)، واستُخدم تقريب وتوقيع المجموعات المتجانسة (UMAP) لتصور المجموعات الخلوية في فضاء منخفض الأبعاد. تم تعيين هويات الخلايا وفقاً لجينات العلامات المرجعية. وحُددت جينات العلامات باستخدام وظيفة FindAllMarkers مع ضبط المعاملات only.pos = TRUE و min.pct = 0.25 و logfc.threshold = 0.25.
لتقييم نشاط مجموعات الجينات المرشحة على مستوى الخلية الواحدة، تم إجراء تحليل AUCell باستخدام حزمة AUCell في لغة R. تم تسجيل درجات الخلايا وفقاً للتعبير عن بصمات جينية محددة مسبقاً، وجرى تصور أنماط الإثراء على مخططات UMAP. وبالنسبة لـ GSE295484، تم حساب نسب مجموعات الخلايا المناعية، بما في ذلك البلاعم السنخية والخلايا المتعادلة، عبر مجموعات هواء الغرفة، وPBS، وE. coli بعد 48 ساعة و96 ساعة من الشفط. تم تقييم الفروق بين المجموعات باستخدام اختبارات إحصائية غير معلمية. كما تم تحديد الجينات الواصمة للخلايا المتعادلة من مجموعة بيانات الخلية الواحدة ومقاطعتها مع الجينات المرشحة المحددة سابقاً للحصول على الجينات الرئيسية المرتبطة بالخلايا المتعادلة لإجراء مزيد من التحليل.
الرسو الجزيئي
أُجري الرسو الجزيئي باستخدام برنامج AutoDock Vina، مع تحضير المستقبل والربيطة باستخدام برنامج AutoDock Tools. تم الحصول على البنى البلورية للبروتينات المستهدفة من بنك بيانات البروتينات (PDB)، وشملت GADD45A (PDB ID: 2KG4)، وMMP9 (PDB ID: 6ESM)، وPYGL (PDB ID: 3DDS). عولجت بنى البروتينات قبل عملية الرسو عن طريق حذف جزيئات الماء والربيطات المبلورة بشكل مشترك. ثم أضيفت ذرات الهيدروجين القطبية، وعُينت شحنات Gasteiger.
تم الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد لمركب catechin من PubChem وتجهيزها باستخدام AutoDock Tools. بعد ذلك، استُخدم برنامج AutoDock Vina لإجراء عملية الالتحام (docking) لمركب catechin مع كل بروتين مستهدف، وذلك لتقييم ألفة الارتباط المتوقعة ونمط التفاعل. وكانت معلمات صندوق شبكة الالتحام (docking grid box) كما يلي: بالنسبة لـ GADD45A-catechin، فإن center_x = 0.131، وcenter_y = -0.002، وcenter_z = -0.018، وsize_x = 47.25، وsize_y = 47.25، وsize_z = 47.25؛ وبالنسبة لـ MMP9-catechin، فإن center_x = -0.434، وcenter_y = 43.036، وcenter_z = 14.868، وsize_x = 47.25، وsize_y = 47.25، وsize_z = 47.25؛ وبالنسبة لـ PYGL-catechin، فإن center_x = 88.408، وcenter_y = -80.795، وcenter_z = 105.959، وsize_x = 100.45، وsize_y = 100.45، وsize_z = 100.45.
محاكاة الديناميكا الجزيئية
تم استخدام حقل القوة AMBER14SB لمكونات البروتين. وجرى توليد بارامترات الربيطة باستخدام حقل القوة GAFF2 عبر برنامج sobtop_1.0 (dev3.1)، مع تعيين شحنات RESP. واستُخدم نموذج الماء TIP3P لإذابة كل معقد بروتين-ربيطة داخل صندوق محاكاة مكعب. وقد ساعدت إضافة أيونات Na⁺ وCl⁻ في معادلة النظام وتحقيق تركيز أيوني قدره 0.15 M. واستُخدمت طريقة particle mesh Ewald (PME) للتفاعلات الكهروستاتيكية بعيدة المدى مع حد قطع قدره 1 nm. كما طُبقت قيود الروابط باستخدام خوارزمية LINCS. وللقضاء على التنافرات الفراغية، أُجري تقليل الطاقة باستخدام طريقتي الانحدار الشديد والتدرج المترافق.
بعد عملية التوازن، أُجريت محاكاة الديناميكا الجزيئية (MD) الإنتاجية تحت ظروف NPT عند 310 K و1 bar، وبتحكم من منظم الحرارة Nosé–Hoover ومنظم الضغط Parrinello–Rahman. استمرت كل محاكاة لمدة 100 ns بخطوة زمنية قدرها 2 fs.
التحليل الإحصائي
أُجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج R. ونُفذت تحليلات الارتباط باستخدام طريقتي Pearson أو Spearman حسبما كان مناسباً. كما أُجريت مقارنات المجموعات باستخدام الاختبارات غير المعلمية، بما في ذلك اختبار Kruskal–Wallis. واعتُبرت القيمة p-value < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
النتائج
تحديد وحدة جينية رئيسية مرتبطة بالالتهاب الرئوي لدى الأطفال باستخدام تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA)
لتحديد الوحدات الجينية المرتبطة بالالتهاب الرئوي لدى الأطفال، تم إجراء تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك المرجح (WGCNA) على بيانات الترانسكريبتوم للدم الكامل المأخوذة من مرضى مصابين بالالتهاب الرئوي ومجموعات ضابطة سليمة. وكشف تحليل عنقود العينات عن عدم وجود قيم شاذة واضحة، مما يشير إلى جودة البيانات لإجراء التحليلات اللاحقة (الشكل 1أأظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) كذلك اتجاهاً واضحاً للانفصال بين مجموعتي الالتهاب الرئوي والمجموعة السليمة، مما يشير إلى وجود ملفات نسخية مميزة بين الحالتين (الشكل 1Bلبناء شبكة خالية من المقياس، تم ترتيب الجينات وفقاً للانحراف المطلق الوسيط، واختيار أعلى 5,000 جين لبناء الشبكة، كما حُددت قوة العتبة اللينة عند 15 بناءً على معيار مؤشر ملاءمة الطوبولوجيا الخالية من المقياس (R2 > 0.8) مع الحفاظ على متوسط اتصال منخفض نسبياً (الشكل 1ج). وباستخدام هذه العتبة، حدد التجميع الهرمي وحدات جينية متعددة ذات أنماط تعبير متميزة (الشكل 1Dكشف تحليل العلاقة بين الوحدات والسمات أن العديد من الوحدات كانت مرتبطة ارتباطاً وثيقاً بالأنماط الظاهرية السريرية. ومن الملاحظ أن الوحدة الزرقاء أظهرت ارتباطاً قوياً بكل من حالة المرض (الالتهاب الرئوي مقابل الأصحاء) والتصنيف المسبِّب للمرض، مما يشير إلى دورها المحتمل في تطور المرض واستجابة المضيف.الشكل 1E).
علاوة على ذلك، أظهر تحليل مخطط التشتت لعضوية الوحدة مقابل أهمية الجين داخل الوحدة الزرقاء ارتباطاً إيجابياً قوياً (cor = 0.6, p = 2.1e−35)، مما يشير إلى أن الجينات ذات الاتصال العالي داخل الوحدة كانت مرتبطة أيضاً بقوة بالسمة السريرية (الشكل 1F).
ارتباط الوحدة الزرقاء بمسببات الالتهاب الرئوي البكتيري
ولمزيد من الاستقصاء حول الاختلافات في التعبير الجيني عبر مسببات الالتهاب الرئوي المختلفة، أُجري تحليل WGCNA باستخدام تصنيفات سريرية متعددة، شملت مجموعات الضبط (C)، والحالات البكتيرية المؤكدة (DB)، والحالات الفيروسية المؤكدة (DV)، والحالات البكتيرية المحتملة (PB)، والحالات الفيروسية المحتملة (PV)، والمجموعات غير المعروفة (U). وكشف تحليل العلاقة بين الوحدة والسمة أن العديد من الوحدات أظهرت ارتباطات ذات دلالة إحصائية مع أنماط فرعية محددة من المسببات. ومن الجدير بالذكر أن الوحدة الزرقاء أظهرت أقوى ارتباط إيجابي مع مجموعة DB، مما يشير إلى احتمال مشاركتها في استجابات المضيف الخاصة بالعدوى البكتيرية (الشكل 2A).
أكد المخطط الشجري لتجمع الجينات وتعيين الوحدات المقابل تعزيز متانة بناء الوحدات والفصل الواضح بين تجمعات الجينات (الشكل 2B). وضمن الوحدة الزرقاء، أظهر تحليل عضوية الوحدة مقابل أهمية الجينات ارتباطاً إيجابياً ملحوظاً (cor = 0.41, p = 7.8e−14)، مما يشير إلى أن الجينات شديدة الاتصال داخل هذه الوحدة كانت مرتبطة أيضاً بقوة بالسمة المسببة للمرض (الشكل 2C).
بالإضافة إلى ذلك، كشفت مقارنة تعبير الجين الرئيسي للوحدة (module eigengene expression) عبر المجموعات المسببة للأمراض المختلفة عن وجود فروق ذات دلالة إحصائية في الوحدة الزرقاء (اختبار Kruskal–Wallis، p = 1.5e−13). وتحديداً، أظهرت الوحدة الزرقاء تعبيراً مرتفعاً في مجموعات الالتهاب الرئوي البكتيري، ولا سيما في المجموعة الفرعية DB، مقارنة بالفئات المسببة للأمراض الأخرى (الشكل 2D).
تحديد ثمانية عشر جيناً مرشحاً مرتبطاً بمركبات مشتقة من Paeonia ومرتبطاً بالالتهاب الرئوي لدى الأطفال عبر تحليل تكاملي
لتحديد الجينات المرشحة المرتبطة بالالتهاب الرئوي لدى الأطفال والأهداف المحتملة المرتبطة بـ Paeonia، أُجري أولاً تحليل للتعبير التفاضلي بين مرضى الالتهاب الرئوي والمجموعات الضابطة السليمة. وباستخدام هذه المعايير، تم تحديد 1,110 جيناً ذات تعبير تفاضلي (DEGs) بين عينات الالتهاب الرئوي والعينات الضابطة السليمة، شملت 524 جيناً مرتفع التعبير و586 جيناً منخفض التعبير. تتوفر الجينات الـ 524 ذات التعبير المرتفع في الجدول التكميلي S1 (انظر أيضاً الشكل 3A). ولتحديد الجينات الرئيسية بشكل أدق، تم تقاطع الجينات ذات التعبير التفاضلي المرتبطة بالالتهاب الرئوي مع الجينات المرتبطة بنمط DB الظاهري والأهداف المتوقعة لـ Paeonia. وأسفر هذا التحليل التكاملي عن 18 جيناً متقاطعاً، مما يشير إلى أدوارها المحتملة في تطور المرض والاستجابات المرتبطة بـ Paeonia (الشكل 3B).
تم بناء شبكة تفاعل بين المركبات والأهداف لتصور العلاقات بين المكونات النشطة في نبات Paeonia والجينات المرشحة المحددة، مما كشف عن اتصال واسع بين المركبات والأهداف (الجدول التكميلي S2 والشكل 3C). ولاستكشاف الوظائف البيولوجية لهذه الجينات الثمانية عشر، أُجريت تحليلات الإثراء الوظيفي. وقد ربط إثراء العمليات البيولوجية حسب تصنيف GO الجينات المرشحة بشكل أساسي بالوظائف المناعية والالتهابية، بما في ذلك تنظيم الاستجابة الالتهابية، والاستجابة للهرمونات الببتيدية، والتنظيم الإيجابي لاستقلاب أنواع الأكسجين التفاعلية، وتنظيم الإشارات التي يتوسطها الإنترفيرون من النوع الثاني (الشكل 3D). وأظهر تحليل KEGG كذلك أن الجينات كانت مثرية في المسارات المرتبطة بالالتهابات والمناعة، مثل مسارات إشارات IL-17 وNF-κB، بالإضافة إلى المسارات المرتبطة بالاستقلاب والغدد الصماء، بما في ذلك إشارات الجلوكاجون والاصطناع الحيوي للهرمونات الستيرويدية (الشكل 3D).
إثراء الجينات المرشحة في الخلايا المتعادلة والبلاعم السنخية في تحليل النسخ أحادي الخلية
لبحث التوزيع الخلوي للجينات المرشحة في سياق تجريبي لالتهاب رئوي، تم تحليل مجموعة بيانات scRNA-seq لرئة الفأر GSE295484. أُجري تحليل لمراقبة الجودة لتقييم موثوقية البيانات. وقد أشارت توزيعات أعداد الجينات المكتشفة، وتعدادات UMI، والنسب المئوية للجينات الميتوكوندرية والريبوسومية إلى جودة عالية إجمالاً لبيانات الخلية الواحدة في المصفوفة المعالجة (الشكل 4A). وأظهرت المخططات المبعثرة عتبات المرجع المستخدمة في تصور مراقبة الجودة للكشف عن الجينات والمحتوى الميتوكوندري (الشكل 4B).
بعد إجراء التطبيع وتقليل الأبعاد، تم تجميع الخلايا وتصورها باستخدام UMAP. تم تحديد مجموعات خلوية متمايزة، شملت الخلايا المتعادلة، والبالعات السنخية، والخلايا الوحيدة، والخلايا الظهارية، وأنواعاً أخرى من الخلايا المناعية والسدوية، مما يوضح التباين الخلوي في البيئة المجهرية للرئة أثناء الالتهاب الرئوي (الشكل 4C). ولتقييم نشاط الجينات المرشحة الـ 18 على مستوى الخلية الواحدة، تم إجراء تحليل AUCell. وأظهرت النتائج أن البصمة الجينية كانت مثرية بشكل أساسي في الخلايا المتعادلة والبالعات السنخية، كما أشارت درجات AUC الأعلى في هذه المجموعات الخلوية (الشكل 4D).
الجينات الالتهابية المرتبطة بأهداف المركبات المشتقة من Paeonia في نموذج التهاب رئوي بكتيري لدى الفئران
للمزيد من الاستقصاء حول ديناميكيات الخلايا المناعية في نموذج الالتهاب الرئوي التجريبي لدى الفئران، تم تحليل نسب البلاعم السنخية والخلايا المتعادلة في مجموعات هواء الغرفة، وPBS، وE. coli بعد 48 ساعة و96 ساعة من عملية الشفط. عند 48 ساعة، أظهرت البلاعم السنخية انخفاضاً ملحوظاً في ظل الإصابة بـ E. coli مقارنة بظروف الهواء وPBS، بينما أظهرت الخلايا المتعادلة زيادة جوهرية في نسبة الخلايا (الشكل 5A). ولوحظ اتجاه مماثل عند 96 ساعة، حيث ظلت نسب الخلايا المتعادلة مرتفعة استجابة لتحفيز E. coli، بينما أظهرت البلاعم السنخية مستويات منخفضة نسبياً. تشير هذه النتائج إلى توسع بارز في الخلايا المتعادلة أثناء العدوى البكتيرية. ولاستكشاف الخصائص الوظيفية للخلايا المتعادلة، تم تحديد جينات علامة الخلايا المتعادلة، وإجراء تحليل الإثراء الوظيفي. ربط إثراء KEGG جينات علامة الخلايا المتعادلة بإشارات التهابية، بما في ذلك مسارات TNF وMAPK ومستقبل الليكتين من النوع C (الشكل 5B). كما تركزت مصطلحات العملية البيولوجية GO في وظائف الاستجابة المناعية، مثل هجرة الكريات البيضاء، والالتصاق بين الخلايا الكريات البيضاء، والتنظيم الإيجابي لاستجابة الدفاع، والاستجابة للجزيئات ذات الأصل البكتيري (الشكل 5B). ولتحديد الجينات الرئيسية التي تربط نشاط الخلايا المتعادلة والالتهاب الرئوي وأهداف Paeonia، تم تقاطع جينات علامة الخلايا المتعادلة مع الجينات المرشحة الـ 18 التي تم تحديدها سابقاً. أسفر هذا التحليل عن ثلاثة جينات متداخلة: MMP9 وPYGL وGADD45A (الجدول التكميلي S3 والشكل 5C). وأخيراً، أظهر التصوير المرئي للتعبير الجيني أحادي الخلية أن هذه الجينات الثلاثة كانت تعبر بشكل سائد في مجموعات الخلايا المتعادلة (الشكل 5D)، مما يدعم بشكل أكبر أدوارها المحتملة في الاستجابات الالتهابية التي تتوسطها الخلايا المتعادلة.
ألفة الارتباط المتوقعة للكاتيكين مع بروتينات مختارة في الالتحام الجزيئي
لمزيد من التقييم للتفاعلات المحتملة بين الكاتيكين والبروتينات، أُجري تحليل للالتحام الجزيئي بين البروتينات المختارة (MMP9 وPYGL وGADD45A) والكاتيكين، وهو مركب نشط مستخلص من نبات Paeonia. تم الحصول على البنى البلورية لبروتينات GADD45A وMMP9 وPYGL من بنك بيانات البروتين (Protein Data Bank)، بينما تم استرجاع البنية ثلاثية الأبعاد للكاتيكين من قاعدة بيانات PubChem. وأشارت نتائج الالتحام إلى أن الكاتيكين يمكن أن يرتبط بمواقع في البروتينات الثلاثة المختارة، بطاقات ارتباط بلغت −6.3 kcal/mol لـ GADD45A، و−7.6 kcal/mol لـ MMP9، و−8.0 kcal/mol لـ PYGL (الشكل 6). ومن بين هذه البروتينات المختارة، أظهر الكاتيكين أقوى ألفة ارتباط متوقعة مع PYGL، يليه MMP9 ثم GADD45A، مما يشير إلى وجود تفاعل تفضيلي محتمل مع بروتين مرتبط بالتمثيل الغذائي.
على المستوى الجزيئي، شكل الكاتيكين (catechin) روابط هيدروجينية متعددة وتفاعلات كارهة للماء مع بقايا أحماض أمينية رئيسية في كل بروتين. ففي بروتين GADD45A، تفاعل الكاتيكين مع بقايا مثل GLN33 وTRP135. وفي بروتين MMP9، لوحظ وجود روابط هيدروجينية مستقرة مع بقايا تشمل GLN227 وTYR248 وHIS236. وبالمثل، شكل الكاتيكين في بروتين PYGL روابط هيدروجينية متعددة مع بقايا مثل LYS554 وASN631، مما ساهم في استقرار الارتباط. وبالإضافة إلى الروابط الهيدروجينية، كشف تحليل التفاعل عن وجود قوى فان دير فالس وتفاعلات متعلقة بـ π، مما يشير إلى نمط ارتباط متعدد الأنماط يعزز من استقرار معقدات الليجاند والبروتين المتوقعة. وتُشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الكاتيكين يمكن أن يشكل معقدات مستقرة متوقعة مع كل من MMP9 وPYGL وGADD45A. ومع ذلك، فإن الأهمية العلاجية لهذه التفاعلات تتطلب مزيداً من التحقق التجريبي.
التفاعلات المستقرة المتوقعة بين الكاتيكين وبروتينات مختارة
بناءً على وضعيات الالتحام التي تم الحصول عليها في الالتحام الجزيئي، أُجريت محاكاة للديناميكا الجزيئية لمدة 100 ns لتقييم استقرار معقدات الكاتيكين والبروتين بشكل أكبر. وأظهر تحليل RMSD أن جميع معقدات البروتين والرابط الثلاثة وصلت إلى حالة التوازن خلال فترة المحاكاة. ومن بينها، أظهر معقدا PYGL–catechin وMMP9–catechin تقلبات مستقرة نسبياً في RMSD، بينما أظهر معقد GADD45A–catechin تقلبات أعلى قليلاً ولكنها ظلت ضمن نطاق مقبول (الشكل 7A). وأشار تحليل Rg إلى أن جميع المعقدات حافظت على تماسك بنيوي مستقر طوال فترة المحاكاة، مع حد أدنى من التباين بمرور الوقت (الشكل 7B). وبالمثل، أظهر تحليل SASA مستويات تعرض مستقرة لجميع المعقدات، مما يدعم استقرارها البنيوي بشكل أكبر (الشكل 7C). وكشف تحليل الروابط الهيدروجينية عن تفاعلات مستمرة بين الكاتيكين والبروتينات المختارة؛ حيث حافظ معقد PYGL–catechin على عدد أكبر من الروابط الهيدروجينية بمرور الوقت مقارنة بـ MMP9 وGADD45A، مما يشير إلى تفاعلات ارتباط أقوى وأكثر استقراراً (الشكل 7D).
تم تقييم المرونة على مستوى الثمالات باستخدام RMSF. وأظهرت النتائج أن معظم الثمالات أظهرت تذبذباً منخفضاً، مع ظهور مرونة أعلى في مناطق قليلة فقط، مما يشير إلى أن ارتباط اللجين لم يؤدِ إلى عدم استقرار هيكلي كبير في البروتينات (الشكل 7E). وبشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن الكاتيكين يشكل معقدات متوقعة مستقرة مع MMP9 وPYGL وGADD45A، مع ملاحظة أقوى استقرار في التفاعل بين PYGL والكاتيكين. وتدعم هذه النتائج التفاعلات المتوقعة المستقرة بين الكاتيكين والبروتينات المختارة، مما يوفر دليلاً حوسبياً لمزيد من التحقق التجريبي.
توافر البيانات:
تم تحليل مجموعات بيانات متاحة للعامة في هذه الدراسة. تتوفر مجموعة بيانات bulk RNA-seq من قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO) تحت رقم الوصول GSE261482 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482)، وتتوفر مجموعة بيانات scRNA-seq لرئة الفئران تحت رقم الوصول GSE295484 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484). المخرجات المعالجة المستخدمة في المقال مقدمة كـ الجدول التكميلي S1، والجدول التكميلي S2، والجدول التكميلي S3.
الشكل 1. بناء تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA) وتحديد الوحدات المرتبطة بالمرض (A) تم إجراء تجميع العينات بناءً على ملفات التعبير الجيني، وتظهر تعليقات السمات المقابلة أسفل المخطط الشجري. (B) يوضح تحليل المكونات الرئيسية توزيع العينات على طول أول مكونين رئيسيين. (C) تم تقييم قوة العتبة اللينة باستخدام مؤشر ملاءمة الطوبولوجيا خالية المقياس ومتوسط الاتصال. (D) تم تجميع الجينات وفقاً للتداخل الطوبولوجي، ويشار إلى تعيينات الوحدات عن طريق اللون. (E) تظهر ارتباطات الجينات الذاتية للوحدات مع السمات السريرية على شكل خريطة حرارية. (F) تظهر العلاقة بين عضوية الوحدة وأهمية الجينات للجينات الموجودة في الوحدة الزرقاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. تحليل WGCNA بناءً على مسببات الالتهاب الرئوي. (A) تظهر ارتباطات الجين الذاتي للوحدات (Module eigengene correlations) لمجموعات المسببات، والتي تشمل المجموعة الضابطة، والبكتيرية المؤكدة، والفيروسية المؤكدة، والبكتيرية المحتملة، والفيروسية المحتملة، وغير المعروفة. (B) تم تعيين الوحدات الجينية من المخطط الشجري للتجميع القائم على التداخل الطوبولوجي. (C) تم رسم العضوية في الوحدة (Module membership) والأهمية الجينية للوحدة الزرقاء. (D) مقارنة تعبير الجين الذاتي للوحدة الزرقاء عبر مجموعات المسببات. الاختصارات: WGCNA = تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون؛ C = المجموعة الضابطة؛ DB = بكتيرية مؤكدة؛ DV = فيروسية مؤكدة؛ PB = بكتيرية محتملة؛ PV = فيروسية محتملة؛ U = غير معروفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. تحديد الجينات المرشحة وتحليلها وظيفياً. (A) مخطط بركاني (Volcano plot) يوضح الجينات ذات التعبير التفاضلي بين عينات الالتهاب الرئوي وعينات المجموعة الضابطة. (B) مخطط فن (Venn diagram) يوضح التداخل بين الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEGs) في الالتهاب الرئوي، والجينات المؤكدة المرتبطة بالبكتيريا، والجينات المستهدفة لـ Paeonia. (C) شبكة تفاعل المركب-الهدف بين المكونات النشطة لـ Paeonia والجينات المرشحة. (D) مخططات أعمدة توضح إثراء العمليات البيولوجية وفقاً لـ Gene Ontology (يساراً) وإثراء مسارات KEGG (يميناً) للجينات المتداخلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. تحليل ترانسكريبتومي للخلية الواحدة في الالتهاب الرئوي. (A) تلخص مخططات الكمان مقاييس مراقبة الجودة، بما في ذلك nCount_RNA، وnFeature_RNA، والنسبة المئوية للجينات الميتوكوندرية، والنسبة المئوية للجينات الريبوسومية. (B) مخططات تشتت تظهر العلاقات بين تعدادات UMI، والجينات المكتشفة لكل خلية، والنسبة المئوية للجينات الميتوكوندرية. (C) تصور UMAP لعناقيد الخلايا المصنفة حسب أنواع الخلايا. (D) مخطط UMAP يظهر درجات AUCell لبصمة الجين المرشح عبر الخلايا المفردة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5. ديناميكيات الخلايا المتعادلة وتحديد الجينات الرئيسية. (A) مخططات صندوقية توضح نسب الخلايا للبالعات السنخية والخلايا المتعادلة تحت ظروف مختلفة (الهواء، وPBS، وE. coli) عند 48 ساعة و96 ساعة. (B) مخططات شريطية توضح إثراء مسار KEGG (يساراً) وإثراء العملية البيولوجية GO (يميناً) للجينات الواصمة للخلايا المتعادلة. (C) مخطط فين يوضح التداخل بين الجينات الواصمة للخلايا المتعادلة والأهداف المشتركة للالتهاب الرئوي البكتيري وPaeonia. (D) مخططات UMAP توضح أنماط تعبير MMP9، وPYGL، وGADD45A عبر المجموعات الخلوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6. الالتحام الجزيئي للكاتيكين مع بروتينات مختارة. تراكيب ثلاثية الأبعاد لمعقدات البروتين-الربيطة تظهر ارتباط الكاتيكين بـ GADD45A (في الأعلى)، وMMP9 (في الوسط)، وPYGL (في الأسفل). وتوضح اللوحات المكبرة مناطق الارتباط والتماسات مع بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية. بينما تعرض المخططات ثنائية الأبعاد الروابط الهيدروجينية والتفاعلات الأخرى بين الكاتيكين والبروتينات المختارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7. محاكاة الديناميكا الجزيئية لمعقدات البروتين والرابط. (A) جذر متوسط مربع الانحراف للمعقدات أثناء المحاكاة. (B) تغيرات نصف قطر الدوران بمرور الوقت. (C) مساحة السطح المتاحة للمذيب أثناء المحاكاة. (D) أعداد الروابط الهيدروجينية بين catechin والبروتينات المستهدفة بمرور الوقت. (E) جذر متوسط مربع التقلب لبقايا البروتين في كل معقد. الاختصارات: RMSD = جذر متوسط مربع الانحراف؛ Rg = نصف قطر الدوران؛ SASA = مساحة السطح المتاحة للمذيب؛ RMSF = جذر متوسط مربع التقلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول التكميلي S1. الجينات ذات التعبير التفاضلي المرتفع في عينات الالتهاب الرئوي لدى الأطفال مقارنة بعينات المجموعة الضابطة السليمة، بما في ذلك رموز الجينات، وتغيرات log2 fold، وقيم P-values، وقيم P-values المعدلة، وإحصائيات limma ذات الصلة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S2. جدول تفاعلات المركبات والأهداف لنبات Paeonia المستخدم في تحليل الشبكة، بما في ذلك معرفات المركبات، وأسماء المركبات، والجينات المستهدفة المرتبطة بها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S3. جدول جينات العلامات للخلايا المفردة من GSE295484، بما في ذلك قيم P، ومتوسط تغيرات الطي اللوغاريتمية log2، ونسب التعبير، وقيم P المعدلة، وتوصيفات العناقيد الخلوية، ورموز الجينات. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
يُعد الالتهاب الرئوي سبباً رئيسياً للإصابة والوفاة عالمياً بين الرضع والأطفال الصغار، مما يشكل عبئاً كبيراً على الصحة العامة1. وتتسم إمراضية الالتهاب الرئوي لدى الأطفال بالتعقيد، حيث تشتمل على عمليات متعددة ومترابطة، بما في ذلك الاستجابات الالتهابية المفرطة، والإجهاد التأكسدي، واختلال تنظيم المسارات المناعية والأيضية2,10,11. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن التنشيط غير المنضبط لخلايا المناعة الفطرية، ولا سيما الخلايا المتعادلة والبلاعم، يساهم في إصابة أنسجة الرئة من خلال إطلاق السيتوكينات المحفزة للالتهابات، والإنزيمات المحللة للبروتين، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)12. وعلى الرغم من التقدم في العلاجات المضادة للميكروبات والعلاجات الداعمة، لا تزال الاستراتيجيات الفعالة التي تستهدف هذه الآليات الجزيئية الكامنة محدودة. لذا، فإن تحديد عوامل علاجية جديدة يمكنها تعديل الالتهاب واستعادة التوازن المناعي يكتسب أهمية كبيرة.
جذبت المركبات الكيميائية النباتية، وخاصة الكاتيكينات، اهتماماً متزايداً نظراً لخصائصها الموثقة جيداً كمضادات للالتهابات ومضادات للأكسدة ومعدلات مناعية13,14,15. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية الدقيقة التي يمارس من خلالها الكاتيكين تأثيراته الوقائية في حالات الالتهاب الرئوي غير واضحة إلى حد كبير. استكشفت هذه الدراسة بشكل منهجي الآليات المحتملة المرتبطة بالكاتيكين في الالتهاب الرئوي لدى الأطفال باستخدام نهج تكاملي يجمع بين تحليل الترانسكريبتوم، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، والرسو الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية.
تماشياً مع الفرضية الأولية، أظهرت النتائج أن الوحدة الزرقاء التي تم تحديدها بواسطة WGCNA كانت مرتبطة بشكل كبير بكل من حالة المرض وتصنيف المسببات، مما يشير إلى أن هذه الوحدة تمثل برنامجاً نسخياً أساسياً مشاركاً في الالتهاب الرئوي لدى الأطفال. وكشف المزيد من التكامل بين تحليل التعبير التفاضلي وتنبؤ أهداف Paeonia عن وجود 18 جيناً متداخلة، كانت مُثرية في المسارات المرتبطة بالمناعة، بما في ذلك الاستجابة الالتهابية، واستقلاب أنواع الأكسجين التفاعلية، وتأشير الإنترفيرون من النوع الثاني16,17. وتدعم هذه النتائج بشكل أكبر فكرة أن الاستجابات المناعية المختلة والإجهاد التأكسدي هما المحركان المركزيان لتطور المرض.
كشف تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (Single-cell RNA sequencing) بشكل أكبر أن مجموعة الجينات المرشحة كانت غنية بشكل سائد في الخلايا المتعادلة والبلاعم السنخية، مما يسلط الضوء على الدور المركزي لخلايا المناعة الفطرية في تطور الالتهاب الرئوي. وقد زادت نسب الخلايا المتعادلة بشكل ملحوظ تحت تحفيز E. coli، خاصة عند 48 h و 96 h، مما يشير إلى تنشيط مستمر أثناء الالتهاب الحاد، وهو ما يتوافق مع دورها المزدوج في التخلص من المسببات المرضية وإتلاف الأنسجة عبر الوسائط الالتهابية وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)18. وحدد تحليل إضافي ثلاثة جينات رئيسية—MMP9 و PYGL و GADD45A—كروابط محتملة بين الاستجابات المناعية، والتنظيم الأيضي، والإجهاد الخلوي. وبينما يشارك MMP9 في إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية والارتشاح الالتهابي19، وينظم GADD45A الاستجابات الإجهادية والمناعية، يشير PYGL إلى دور لإعادة البرمجة الأيضية في التنشيط المناعي20,21. واقترحت محاكاة الالتحام الجزيئي والديناميكا الجزيئية ارتباطاً مستقراً متوقعاً للكاتيكين بهذه البروتينات المختارة، مدعوماً بطاقات ارتباط مواتية وملفات مستقرة لـ RMSD و Rg و SASA، إلى جانب روابط هيدروجينية مستمرة وقيم RMSF منخفضة. تشير هذه النتائج إلى أن الكاتيكين قد يكون مرتبطاً بهذه الأهداف الالتهابية والأيضية، ولكن التأثيرات التنظيمية المباشرة تتطلب مزيداً من التحقق التجريبي22.
بالإضافة إلى آثاره المضادة للالتهابات، قد يلعب الكاتيكين أدواراً وقائية من خلال تنظيم الإجهاد التأكسدي والتوازن الأيضي. ويشير إثراء المسارات المرتبطة بـ ROS إلى أن الكاتيكين قد يخفف من الضرر التأكسدي عن طريق تعزيز القدرة المضادة للأكسدة، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة حول الخصائص المضادة للأكسدة للكاتيكينات. علاوة على ذلك، فإن مشاركة الإنزيمات الأيضية مثل PYGL تسلط الضوء على دور محتمل للكاتيكين في تنظيم الأيض المناعي، وهو مفهوم ناشئ في الأمراض الالتهابية.
يجب الإقرار بعدة قيود في هذه الدراسة. أولاً، استندت هذه الدراسة بشكل أساسي إلى مجموعات بيانات ترانسكريبتومية متاحة للعموم وتحليلات حاسوبية، ولم يتم التحقق من الآليات المتوقعة تجريبياً بعد. وعلى الرغم من أن محاكاة الالتحام الجزيئي والديناميكا الجزيئية أشارت إلى وجود تفاعلات مستقرة بين الكاتيكين (catechin) والبروتينات المستهدفة المرشحة، فإن هذه النتائج لا تثبت التثبيط الوظيفي أو التنشيط أو الفعالية العلاجية. لذا، هناك حاجة إلى إجراء المزيد من المقاييس الكيميائية الحيوية، والتجارب الخلوية، والدراسات الحيوية (in vivo) للتحقق من التأثيرات التنظيمية للكاتيكين على MMP9 وPYGL وGADD45A وتحديد أهميته العلاجية في حالات الالتهاب الرئوي. ثانياً، كانت المعلومات السريرية المتاحة لمجموعة بيانات الالتهاب الرئوي لدى الأطفال محدودة؛ حيث وفرت مجموعة البيانات GSE261482 بيانات ترانسكريبتومية للدم الكامل من مرضى الالتهاب الرئوي من الأطفال ومجموعات ضابطة سليمة، إلى جانب بيانات وصفية تشمل الجنس، والتصنيف المسبب للمرض، وأنبوب الجمع، والدفعة، وحالة المرض.
ومع ذلك، لم تكن المتغيرات السريرية التفصيلية، بما في ذلك العمر الفردي، وشدة الالتهاب الرئوي، وحالة العلاج عند أخذ العينات، ومعلومات أخرى عن مسار المرض، متاحة بالكامل في بيانات GEO الوصفية المستخدمة في هذه الدراسة. وبناءً على ذلك، تعذر إجراء المزيد من التحليلات الطبقية وفقاً للشدة السريرية، أو مرحلة العلاج، أو الفئات العمرية الفرعية. ثالثاً، تم اشتقاق مجموعات بيانات bulk RNA-seq وsingle-cell RNA-seq من سياقات بيولوجية مختلفة؛ حيث تم توليد GSE261482 من عينات دم كاملة لمرضى من الأطفال، بينما تم توليد GSE295484 من أنسجة رئوية لفئران C57BL/6 من النوع البري في نموذج تجريبي للالتهاب الرئوي. لذا، يجب تفسير نتائج الخلية الواحدة على أنها أدلة داعمة للسياق الخلوي لمجموعات الخلايا الالتهابية وتوزيع الجينات المرشحة، وليس كتحقق مباشر في حالات الالتهاب الرئوي لدى الأطفال البشر. بالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج الالتهاب الرئوي في الفئران المستحث بواسطة E. coli لا يمثل بشكل كامل المسببات غير المتجانسة للالتهاب الرئوي لدى الأطفال، بما في ذلك الأسباب البكتيرية، والفيروسية، والبكتيرية المحتملة، والفيروسية المحتملة، والأسباب غير المعروفة.
أخيراً، استند اختيار MMP9 وPYGL وGADD45A إلى الفحص المعلوماتي الحيوي التكاملي والأهمية البيولوجية المعروفة، ولكن لا تزال أدوارها الدقيقة في الالتهاب المرتبط بالخلايا المتعادلة والتنظيم بوساطة الكاتيكين بحاجة إلى تأكيد. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تستخدم مجموعات سريرية من الأطفال، ومجموعات بيانات الخلايا البشرية الفردية، ومقايسات وظيفية محددة الأهداف، ونماذج تجريبية للالتهاب الرئوي للتحقق من هذه النتائج وتوضيح الإمكانات الانتقالية للكاتيكين.
باختصار، تشير هذه الدراسة إلى أن الكاتيكين قد يكون مرتبطاً بالاستجابات الالتهابية المتعلقة بالخلايا المتعادلة وجينات مختارة تشارك في التنظيم المناعي، والإجهاد التأكسدي، والمسارات الأيضية في حالات الالتهاب الرئوي. ومن خلال تحليل تكاملي لتسلسل الحمض النووي الريبي الشامل (bulk RNA sequencing)، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (single-cell RNA sequencing)، والرسو الجزيئي، ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية، حددت هذه الدراسة وحدة جينية مرتبطة بالمرض، واختارت جينات MMP9 وPYGL وGADD45A لإجراء تحليلات الرسو والمحاكاة لمركب الكاتيكين. ويدعم إثراء الجينات المرشحة في الخلايا المتعادلة والبلعميات السنخية، إلى جانب التفاعلات المستقرة المتوقعة بين الكاتيكين والبروتينات المختارة، وجود آلية محتملة تستوجب المزيد من التحقق التجريبي. وبشكل عام، توفر هذه النتائج منظوراً على مستوى الأنظمة للآليات المحتملة المرتبطة بالكاتيكين في الالتهاب الرئوي، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات التجريبية والسريرية للتحقق من هذه الملاحظات وتوضيح أهميتها العلاجية.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حقل القوة AMBER14SB النوع: مجال القوة | حقل القوة البروتيني لمحاكاة الديناميكا الجزيئية | ||
| حزمة AUCell لبرنامج R النوع: حزمة R | تسجيل نشاط مجموعة الجينات على مستوى الخلية الواحدة | ||
| أدوات أوتودوك (AutoDock Tools) النوع: برنامج | تحضير المستقبل والربيطة | ||
| AutoDock Vina النوع: برنامج | الرسو الجزيئي | ||
| BindingDB النوع: قاعدة بيانات | BindingDB | تفاعلات المركب والهدف التي تم التحقق منها تجريبياً؛ لم يتم توفير رابط URL أو الإصدار في المخطوطة | |
| حزمة clusterProfiler للغة R النوع: حزمة R | تحليل إثراء GO وKEGG | ||
| DrugBank النوع: قاعدة بيانات | DrugBank | تفاعلات المركب والهدف المثبتة تجريبياً؛ لم يتم توفير رابط URL أو الإصدار في المخطوطة | |
| قاعدة بيانات ETCM النوع: قاعدة بيانات | التحليل المجهري الحاسوبي المعتمد على النسيج (ETCM) | فحص المركبات النشطة في نبات الفاوانيا (Paeonia)؛ لم يتم توفير رابط URL أو الإصدار في المخطوطة | |
| حقل القوة GAFF2 النوع: مجال القوة | حقل القوة لربيطة في محاكاة الديناميكا الجزيئية | ||
| GROMACS 2022 النوع: برنامج | GROMACS | محاكاة الديناميكا الجزيئية | |
| GSE261482 النوع: مجموعة بيانات عامة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي الشامل (bulk RNA-seq) | مستودع تعبير الجينات (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482 | بيانات تعبير الدم الكامل للمصابين بالالتهاب الرئوي لدى الأطفال والمجموعة الضابطة السليمة |
| GSE295484 النوع: مجموعة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) عامة | مستودع التعبير الجيني (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484 | بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية لرئة الفأر من نموذج تجريبي للالتهاب الرئوي |
| حزمة limma في لغة R النوع: حزمة R | تحليل التعبير التفاضلي | ||
| خادم PharmMapper النوع: قاعدة بيانات/أداة | PharmMapper | http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/ | رسم الخرائط الفارماكوفورية العكسي |
| بنك بيانات البروتين (PDB) النوع: قاعدة بيانات | بنك بيانات البروتين | البنى البروتينية لـ GADD45A (2KG4)، وMMP9 (6ESM)، وPYGL (3DDS) | |
| قاعدة بيانات PubChem النوع: قاعدة بيانات | PubChem | البنية ثلاثية الأبعاد للكاتيكين | |
| برنامج R النوع: برنامج | مشروع R | التحليلات الإحصائية | |
| حزمة Seurat في لغة R النوع: حزمة R | ضبط جودة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، والتطبيع، والتجميع، والتصور باستخدام خريطة الإسقاط الموحد غير الخطي (UMAP)، وتوصيف الخلايا | ||
| منهج تجميع التشابه (SEA) النوع: قاعدة بيانات/أداة | تحليل العناصر الطيفية (SEA) | http://sea.bkslab.org | التنبؤ بالتفاعلات المحتملة خارج الهدف |
| sobtop_1.0 (dev3.1) النوع: برنامج | توليد بارامترات الربيطة | ||
| SwissTargetPrediction النوع: قاعدة بيانات/أداة | SwissTargetPrediction | http://www.swisstargetprediction.ch | التنبؤ بالأهداف المركبة |
| نموذج المياه TIP3P النوع: نموذج المياه | إذابة معقدات البروتين والربيطة | ||
| قاعدة بيانات فارماكولوجيا النظم للطب الصيني التقليدي (TCMSP) النوع: قاعدة بيانات | قاعدة بيانات TCMSP | https://tcmsp-e.com | فحص المركبات النشطة في نبات الفاوانيا (Paeonia) |
| قاعدة بيانات UniProt النوع: قاعدة بيانات | UniProt | https://www.uniprot.org | توحيد رموز الجينات |
| حزمة WGCNA في لغة R النوع: حزمة R | تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون |
المراجع
- Chen L, Chen Y, Huang J, Zhang J. LncRNA LINC00707 serves as a sponge of miR-382-5p to alleviate lipopolysaccharide (LPS)-induced WI-38 cell injury through upregulating NKAP in infantile pneumonia. Autoimmunity. 2022;55(5):328-38.
- Li S et al. miRNA-302e attenuates inflammation in infantile pneumonia through the RelA/BRD4/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2019;44(1):47-56.
- Kennedy II DE et al. Contribution of Puma to inflammatory resolution during early pneumococcal pneumonia. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:886901.
- Wang C et al. Suppressing neutrophil itaconate production attenuates Mycoplasma pneumoniae pneumonia. PLoS Pathog. 2024;20(11):e1012614.
- Shen N et al. Plant flavonoids: classification, distribution, biosynthesis, and antioxidant activity. Food Chem. 2022;383:132531.
- Peng X, McClements DJ, Liu X, Liu F. EGCG-based nanoparticles: synthesis, properties, and applications. Crit Rev Food Sci Nutr. 2025;65(12):2177-98.
- Li T et al. Synergistic anti-inflammatory effects of quercetin and catechin via inhibiting activation of TLR4-MyD88-mediated NF-κB and MAPK signaling pathways. Phytother Res. 2019;33(3):756-67.
- Viz-Lasheras S et al. A diagnostic host-specific transcriptome response for Mycoplasma pneumoniae pneumonia to guide pediatric patient treatment. Nat Commun. 2025;16(1):673.
- Michki SN et al. Age-dependent immune responses and resident cell dynamics in young mice following pneumonia. iScience. 2026;29(1):114219.
- Jin M et al. Catechin-functionalized cationic lipopolymer based multicomponent nanomicelles for lung-targeting delivery. Adv Mater. 2024;36(17):e2302985.
- Shin-Ya M et al. Effects of tea, catechins and catechin derivatives on Omicron subvariants of SARS-CoV-2. Sci Rep. 2023;13(1):16577.
- Zheng Q, Li J, Yang L. Systematic investigation of catechin/cyclodextrin encapsulated polymeric nanospheres for the treatment and nursing care of pediatric pneumonia-causing human pathogens. Microb Pathog. 2025;205:107524.
- Zhang Y et al. Anti-inflammatory effect of chlorogenic acid in Klebsiella pneumoniae-induced pneumonia by inactivating the p38MAPK pathway. Int J Med Microbiol. 2023;313(2):151576.
- Gleeson K, Reynolds HY. Life-threatening pneumonia. Clin Chest Med. 1994;15(3):581-602.
- Ross SM. Resveratrol: the anti-inflammatory effects of a phytochemical compound on pneumonia, respiratory syncytial virus, and severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV-2). Holist Nurs Pract. 2023;37(2):110-2.
- Hu H et al. Hybrid biomimetic membrane coated particles-mediated bacterial ferroptosis for acute MRSA pneumonia. ACS Nano. 2023;17(12):11692-712.
- Dong L et al. A ROS-responsive nanoprodrug-engineered phage biotherapy for precision treatment of multidrug-resistant Gram-negative bacterial pneumonia. J Control Release. 2025;382:113708.
- Wiegman CH et al. Oxidative stress in ozone-induced chronic lung inflammation and emphysema: a facet of chronic obstructive pulmonary disease. Front Immunol. 2020;11:1957.
- Jiang T et al. Dual role of Baimao-Longdan-Congrong-Fang in inhibiting Staphylococcus aureus virulence factors and regulating TNF-α/TNFR1/NF-κB/MMP9 axis. Phytomedicine. 2025;139:156477.
- Zhang H et al. The attenuated Mycoplasma bovis strain promotes apoptosis of bovine macrophages by upregulation of CHOP expression. Front Microbiol. 2022;13:925209.
- Borella R et al. Metabolic reprograming shapes neutrophil functions in severe COVID-19. Eur J Immunol. 2022;52(3):484-502.
- Xu Y et al. Exosomal miR-155-5p drives widespread macrophage M1 polarization in hypervirulent Klebsiella pneumoniae-induced acute lung injury via the MSK1/p38-MAPK axis. Cell Mol Biol Lett. 2023;28(1):92.