مقالة منهجية

كشف المستضدات المناعية للخلايا داخل الورم في نموذج خلايا جذعية شبيهة بالورم الأرومي الدبقي ذات كفاءة مناعية باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية القائمة على الركيزة

70 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

تقدم الدراسة سير عمل مفصل وقابل للتكرار لتقنية الكيمياء النسيجية المناعية القائمة على الركيزة للكشف المتسق عن مستضدات فردية أو مزدوجة في مقاطع نسيجية ورمية مشتقة من الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي والمثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE). يدعم هذا البروتوكول تحديد مختلف المؤشرات المناعية والورمية مع معالجة التحديات التقنية، مع إمكانية استخدامه في نماذج أورام أخرى.

الملخص

يُعد الورم الأرومي الدبقي (GBM) أكثر الأورام الخبيثة الأولية في الدماغ شيوعاً وفتكاً، وتفتقر هذه الأورام إلى علاجات فعالة. ويتميز هذا الورم ببيئة مجهرية ورمية مثبطة للمناعة بشكل كبير، تساهم في ذلك جزئياً الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي (GSCs) المقاومة للعلاج. نصف هنا بروتوكولات قابلة للتكرار للكيمياء النسيجية المناعية (IHC) القائمة على الركيزة، بألوان مفردة ومزدوجة، للكشف عن المستضدات السطحية والداخل خلويّة المرتبطة بالخلايا المناعية المرتشحة للورم في مقاطع أورام الدماغ المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE). وقد تم اشتقاق أورام الدماغ من الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي في الفئران، والتي زُرعت في موقعها التشريحي في فئران ذات كفاءة مناعية. يستخدم سير عمل الكيمياء النسيجية المناعية أحادية اللون نظام كشف لوني يعتمد على بيروكسيداز الفجل (HRP) لتصوير مستضدات الخلايا المناعية الفردية، بينما يستخدم سير عمل الكيمياء النسيجية المناعية ثنائية اللون استراتيجية صبغ متسلسلة تعتمد على الفوسفاتاز القلوي (AP) للكشف المتزامن عن مستضدين للخلايا المناعية داخل المقطع النسيجي نفسه، بما في ذلك سير العمل الذي يستخدم أجساماً مضادة أولية من نفس الأصل المضيف. توفر هذه الطرق إطاراً عملياً وقابلاً للتكرار للتحليل اللوني للمستضدات المرتبطة بالخلايا المناعية المرتشحة للورم في أنسجة الورم الأرومي الدبقي، ويمكن تكييفها مع نماذج أورام أخرى قبل سريرية وربما مع عينات FFPE البشرية.

المقدمة

يُعد الورم الأرومي الدبقي (GBM) ورماً دماغياً خبيثاً أولياً عدوانياً، وشديد الغزو، وغير متجانس، ويرتبط بانخفاض معدلات بقاء المرضى على قيد الحياة رغم العلاجات القياسية الحالية1. وتتمثل السمة المميزة لهذا الورم في بيئته الدقيقة الورمية (TME) المثبطة للمناعة بشكل كبير، مما يساهم في مقاومة استراتيجيات العلاج المناعي2,3. وتعمل آليات متعددة على دفع عملية تثبيط المناعة في الورم الأرومي الدبقي، بما في ذلك تقليل ارتشاح الخلايا التائية المؤثرة وتحفيز خلل وظائف الخلايا التائية وإنهاكها4. بالإضافة إلى ذلك، تعمل الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي (GSCs)، وهي مجموعة فرعية من خلايا GBM، على تعزيز التهرب المناعي من خلال الحفاظ على بيئة دقيقة ورمية "باردة" مناعياً، تتميز بنشاط مناعي سام للخلايا محدود5. وتسلط هذه السمات الضوء على أهمية التوصيف الدقيق لمجموعات الخلايا المناعية المرتشحة إلى الورم وحالاتها الوظيفية في البيئة الدقيقة الورمية للورم الأرومي الدبقي.

لا يزال الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحد أكثر الطرق استخداماً لتقييم تسلل الخلايا المناعية داخل الأنسجة الورمية لأنها تحافظ على بنية النسيج مع السماح بتصور وتحديد موقع والتقييم شبه الكمي للمؤشرات الخلوية in situ6,7,8,9,10,11,12. وقد ساهمت الدراسات السابقة للكيمياء النسيجية المناعية والتنميط المناعي بشكل كبير في تعزيز فهمنا للمشهد المناعي لورم GBM وحددت مجموعات الخلايا المناعية المرتبطة بتطور الورم والاستجابة العلاجية12,13,14,15,16. وتعد الكيمياء النسيجية المناعية اللونية أحادية اللون مفيدة بشكل خاص للكشف عن المؤشرات المناعية الفردية في مقاطع الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE)12,13,15,17,18,19,20. وفي المقابل، تتيح الكيمياء النسيجية المناعية اللونية ثنائية اللون التصور المتزامن لمؤشرين داخل المقطع النسيجي نفسه، مما يسهل تقييم النمط الظاهري الخلوي أو حالة التكاثر أو التنشيط12,19,21.

على الرغم من هذه التطورات، لا تزال البروتوكولات العملية والموحدة للصبغ الكيميائي النسيجي المناعي (IHC) القائمة على الركيزة، والتي يمكن تطبيقها على نماذج GBM المشتقة من GSC في الكائنات ذات الكفاءة المناعية، محدودة. علاوة على ذلك، يظل الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي (IHC) أكثر تحديًا في أورام GBM مقارنة بالعديد من الأورام الصلبة الأخرى بسبب الارتشاح القليل وغير المتجانس للخلايا المناعية، والتباين الواسع داخل الورم، والبيئة الدقيقة للورم (TME) المعقدة والمثبطة للمناعة بشدة، مما يعقد التصوير الدقيق وتفسير المجموعات الخلوية المتعددة داخل المقطع النسيجي الواحد2,3,4. ويطرح الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي (IHC) المزدوج تحديات تقنية إضافية، لا سيما عندما يتم إنتاج كلا الأجسام المضادة الأولية في نفس الفصيلة المضيفة، مما يتطلب تحسينًا دقيقًا لتوافق الأجسام المضادة، واستراتيجية صبغ متسلسلة للكشف المتزامن عن مستضدين داخل المقطع النسيجي نفسه، واختيار ركيزة كيميائية لضمان تمييز واضح للمؤشرات تحت المجهر الضوئي.

نصف هنا بروتوكولات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية وثنائية اللون القائمة على الركيزة والقابلة للتكرار، والتي تنجح في الكشف عن مستضدات سطحية وداخل خلوية ممثلة للخلايا المناعية المرتشحة في الورم في نموذج GBM مشتق من 005 GSC في مكان الورم الأصلي لدى فأر يتمتع بكفاءة مناعية22,23,24. ويمكن أيضاً تكييف بروتوكولات الكيمياء النسيجية المناعية الملونة القائمة على الركيزة هذه مع نماذج أورام أخرى قبل سريرية، ومن المحتمل مع عينات الأورام البشرية المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE). وقد تم تثبيت أنسجة دماغ الفأر التي تم جمعها في فورمالين محيد المنظم بنسبة 10% طوال الليل (~12 h) قبل المعالجة الروتينية للأنسجة وتضمينها في البارافين، كما وصف سابقاً19. ثم تم تقطيع كتل FFPE (بثخانة 5 µm19) على شرائح زجاجية مجهرية موجبة الشحنة وحُفظت في درجة حرارة الغرفة حتى وقت الاستخدام. تستخدم الكيمياء النسيجية المناعية أحادية اللون نظام كشف ملون يعتمد على بيروكسيداز الفجل (HRP) مع استخدام 3,3′-diaminobenzidine (DAB) كركيزة لتوليد إشارة بنية لرؤية المستضدات الفردية تحت المجهر الضوئي. ويعد سير العمل هذا مناسباً للكشف عن كل من المستضدات المرتبطة بالغشاء والمستضدات داخل الخلوية في مقاطع أنسجة FFPE.

يتيح الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ثنائية اللون الكشف المتزامن عن مستضدين داخل المقطع النسيجي نفسه، ولكنها تتطلب تحسيناً إضافياً لضمان توافق الأجسام المضادة والفصل الواضح بين الإشارات اللونية. ويكون صبغ الكيمياء النسيجية المناعية ثنائي اللون بسيطاً نسبياً عندما يتم إنتاج الأجسام المضادة الأولية في أنواع مضيفة مختلفة، مما يسمح باستخدام أجسام مضادة ثانوية خاصة بكل نوع. ومع ذلك، يصبح الكشف المتزامن أكثر تحدياً من الناحية التقنية عندما تنشأ كلا الأجسام المضادة الأولية من النوع المضيف نفسه. ولمعالجة هذا التحدي، يعتمد سير عمل الكيمياء النسيجية المناعية ثنائي اللون الموصوف هنا استراتيجية صبغ لونية متسلسلة تعتمد على الفوسفاتاز القلوي (AP) باستخدام ركائز متميزة للسماح بالتمييز البصري الواضح بين إشارتي المستضدين تحت المجهر الضوئي.

تتضمن كلتا سيرتي العمل خطوتي إزالة البارافين من الأنسجة وإعادة التميؤ، واستعادة المستضد، والحجب، والصبغ، والتجفيف، والترويق، والتثبيت. ويعد تحضير الكواشف أمراً بالغ الأهمية لضمان جودة الصبغ وقابلية تكرار النتائج (راجع الملف التكميلي 1). وبالمثل، تعتبر التخفيفات المناسبة للأجسام المضادة الأولية ضرورية لنجاح بروتوكول الصبغ، ويتم ذلك مباشرة قبل الاستخدام في مصل حصان أو ماعز طبيعي بتركيز 2.5%، اعتماداً على الأنواع المضيفة للجسم المضاد الثانوي المقابل (راجع الجدول 1). كما تتوفر قائمة بالأجسام المضادة الثانوية المحددة للأنواع والمستخدمة في الصبغ أحادي اللون أو ثنائي اللون في الجدول 2. يستخدم الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية اللون كواشف ترويق وتثبيت تعتمد على الزيلين، بينما تتطلب الكيمياء النسيجية المناعية ثنائية اللون بدائل خالية من الزيلين (مثل Histo-Clear)، نظراً لأن الركيزة قابلة للذوبان جزئياً في الزيلين (راجع قائمة الركائز في الجدول 3).

البروتوكول

أُجري هذا البروتوكول وفقاً لجميع الإرشادات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة، بما في ذلك لجنة الرعاية المؤسسية واستخدام الحيوانات (IACUC) (أرقام بروتوكول IACUC: 2004N000067 و LA24-0045).

ملاحظة: تتضمن عدة خطوات في بروتوكولات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية وثنائية اللون كواشف قابلة للاشتعال، بما في ذلك الإيثانول وعوامل تصفية الأنسجة. وبناءً على ذلك، يجب إجراء العمليات التي تتضمن مواد كيميائية قابلة للاشتعال، بما في ذلك إزالة البرافين، وإعادة التميؤ، والتجفيف، والتصفية، والتثبيت، داخل خزانة استخلاص أبخرة كيميائية معتمدة مع اتباع ممارسات السلامة المختبرية المناسبة. كما يجب تحضير الكواشف القابلة للاشتعال وتخزينها في حاويات زجاجية ذات أغطية لولبية ومصنفة بشكل صحيح داخل خزائن تخزين المواد القابلة للاشتعال المخصصة، وفقًا لإرشادات السلامة المؤسسية. وقد تم تهيئة المواد وأحجام الكواشف لمعالجة دفعات تصل إلى 48 شريحة مجهرية (رفي تلوين، 24 شريحة لكل رف)، وإن كان من الممكن تعديل حجم سير العمل بسهولة وفقًا للاحتياجات التجريبية.

1. صبغ كيميائي نسيجي مناعي (IHC) أحادي اللون لمقاطع أورام الدماغ المثبتة بالفورمالين والمغموسة في البارافين (FFPE)

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي طريقة الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية اللون القائمة على الركيزة للكشف عن مستضدات سطحية وداخل خلوية ممثلة في مقاطع أورام الدماغ المثبتة بالفورمالين والمطمرة في البارافين (FFPE) المشتقة من نموذج 005 GSC في الموقع الأصلي.

  1. إزالة البارافين (20 دقيقة):
    1. ضع الشرائح في حامل شرائح من بولي أوكسي ميثيلين (POM) واغمر حامل الشرائح في حاويات الصبغ، أولاً في Xylene I ثم في Xylene II، لمدة 10 دقائق لكل منهما داخل خزانة أبخرة. تأكد من بقاء مقاطع الأنسجة مغمورة تماماً في الزيلين أثناء عملية إزالة البارافين.
      تنبيه: قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت خزانة أبخرة كيميائية مع استخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، ونظارات الواقية، وقناع الوجه، وقفازات اليدين. لا تسمح بجفاف المقاطع في هذه المرحلة أو في أي من الخطوات التالية، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الأنسجة وفقدان المقاطع. تُخزن محاليل الزيلين في حاويات زجاجية محكمة الإغلاق ويمكن إعادة استخدامها إذا كانت تبدو نظيفة.
  2. إعادة الترطيب التدريجي (15 دقيقة):
    1. أعد ترطيب المقاطع بالتتابع في إيثانول بتركيز 100% و90% و70% لمدة 5 دقائق لكل تركيز. لتحقيق ذلك، اغمر الشرائح في إيثانول 100% في حاوية الصبغ لمدة 5 دقائق (ثم أعد الإيثانول 100% إلى الزجاجة لإعادة استخدامه)، يليه إيثانول 90% لمدة 5 دقائق (ثم أعده إلى الزجاجة)، وأخيراً في إيثانول 70% لمدة 5 دقائق (ثم أعده إلى الزجاجة).
      تنبيه: قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت خزانة أبخرة كيميائية واستخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1. يمكن إعادة استخدام محاليل الإيثانول هذه عبر التجارب إذا خُزنت في حاويات زجاجية محكمة الإغلاق، بشرط أن تبدو نظيفة.
  3. شطف بالماء (5 دقائق):
    1. ضع الشرائح في ماء مقطر لمدة 5 دقائق، وبهذا تكتمل عملية إعادة الترطيب.
      ملاحظة: أثناء تنفيذ هذه الخطوة، قم بتحضير من 600 mL (لحامل شرائح واحد) إلى 800 mL (لحاملين من الشرائح) من محلول منظم لاسترجاع المستضد 1× (منظم سترات الصوديوم 10 mM) في دورق زجاجي سعة 2 L قابل للتسخين في الميكروويف، وفقاً للتعليمات المدرجة في الملف التكميلي 1.
  4. استرجاع المستضد (~20 دقيقة):
    1. غطِّ الدورق سعة 2 L الذي يحتوي على محلول منظم سترات الصوديوم 10 mM المحضر حديثاً بغشاء بلاستيكي لمنع التبخر المفرط أثناء التسخين المسبق والتسخين المطول في الميكروويف.
    2. اصنع ثقوباً قليلة في الغشاء البلاستيكي لمنع تطاير المحلول المنظم بسبب الضغط الزائد الناتج أثناء غلي مقاطع الأنسجة.
      ملاحظة: استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1.
    3. سخن مسبقاً محلول منظم سترات الصوديوم 10 mM لاسترجاع المستضد المحضر حديثاً لمدة 3 دقائق. ضع حامل الشرائح الذي يحتوي على مقاطع الأنسجة المعاد ترطيبها في محلول استرجاع المستضد المسخن مسبقاً.
    4. ثم سخن مقاطع الأنسجة في الميكروويف لمدة 15 دقيقة عند أعلى قدرة للميكروويف (على سبيل المثال، P10)، مع مراقبة الدورق بعناية لضمان بقاء المقاطع مغمورة وعدم جفافها بسبب التبخر.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن إجراء استرجاع المستضد في حوض صبغ بلاستيكي يوضع داخل جهاز طبخ بالبخار لمدة 15 دقيقة تقريباً، وهو ما يوفر طريقة تسخين ألطف تتطلب مراقبة أقل. وقد تم التحقق من كفاءة منظم سترات الصوديوم (10 mM، pH 6.0) واستخدامه كمحلول لاسترجاع المستضد لجميع الأجسام المضادة الأولية المدرجة في الجدول 1. وبناءً على الجسم المضاد الأولي وتوصيات الشركة المصنعة، قد يلزم استخدام منظمات أخرى، مثل EDTA أو Tris-EDTA، للأجسام المضادة التي لم يتم تقييمها في هذه الدراسة. 
  5. التبريد (10–20 دقيقة):
    1. أخرج الدورق من الميكروويف، وضعه على طاولة العمل، واتركه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ولتسريع التبريد، ضع الدورق في ماء صنبور مثلج لمدة ~10 دقائق.
      تنبيه: سيكون الدورق ساخناً جداً؛ استخدم قفازات مقاومة للحرارة أو ملاقط دورق للتعامل معه. استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1.
  6. الغسل بمحلول Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) (~10 دقائق):
    1. أخرج حامل الشرائح من الدورق واغمر الشرائح في محلول 1× DPBS في حاوية الصبغ.
    2. اشطف المقاطع مرتين في 1× DPBS لمدة 5 دقائق لكل مرة باستخدام عمليات غسل سكونية لطيفة لتجنب انفصال الأنسجة.
  7. الحاجز الكاره للماء (<1 دقيقة/شريحة):
    1. أثناء الغسل بـ DPBS (الخطوة 1.6)، أخرج كل شريحة بعناية وبشكل فردي، وامسح بلطف حول مقطع النسيج باستخدام مناديل خالية من الوبر (على سبيل المثال، Kim Wipes)، مع تجنب ملامسة النسيج نفسه.
    2. استخدم حاجزاً كارهاً للماء، مثل قلم peroxidase-anti-peroxidase (PAP)، لرسم حاجز طارد للسوائل حول كل مقطع نسيجي، ثم أعد الشريحة إلى محلول غسل DPBS في حاوية الصبغ. كرر هذه الخطوات لجميع الشرائح.
      ملاحظة: يمنع الحاجز الكاره للماء حول النسيج تسرب الكواشف بين المقاطع ويساعد في الاحتفاظ بالأجسام المضادة على النسيج.
  8. حجب البيروكسيداز الداخلي (5 دقائق):
    1. تخلص من 1× DPBS من حاوية الصبغ، ثم أضف محلول H₂O₂ بتركيز 3%، مع التأكد من غمر الشرائح أو مقاطع الأنسجة تماماً لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: قد يؤدي التحضين المطول في H₂O₂ 3% إلى تلف الأنسجة. يعد حجب نشاط البيروكسيداز الداخلي خطوة حاسمة لمنع ظهور خلفية ناتجة عن البيروكسيداز الداخلي أثناء تطوير اللون. استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1.
  9. غسل بـ DPBS (~12 دقيقة):
    1. تخلص من محلول H₂O₂ 3%، واشطف الشرائح مرة أخرى في 1× DPBS مرتين لمدة 5 دقائق لكل مرة.
    2. بعد الغسلة الثانية، أخرج الشرائح من حامل الشرائح، وضعها بشكل مسطح في غرفة ترطيب، وأضف الماء المقطر إلى حواف غرفة الترطيب.
    3. لا تترك المقاطع تجف، لذا انتقل فوراً إلى الحجب في الخطوة 1.10.
      ملاحظة: كل غرفة ترطيب مدرجة في جدول المواد تتسع لـ 30 شريحة.
  10. الحجب بالمصل (~70 دقيقة):
    1. أضف 50 µL من محلول bovine serum albumin (BSA) بتركيز 5% لكل مقطع وحضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إبقاء غطاء غرفة الترطيب مغلقاً لمنع تبخر المحلول الحاجب من مقاطع الأنسجة.
    2. بعد 30 دقيقة، انقر بلطف على الشرائح فوق مناديل خالية من الوبر موضوعة على طاولة العمل للتخلص من BSA.
    3. بعد ذلك، أضف مصل حصان أو ماعز طبيعي بتركيز 2.5% (قطرة واحدة لكل مقطع)، بحيث يطابق نوع الحيوان المضيف للجسم المضاد الثانوي، وحضن المقاطع لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة مع إغلاق غطاء غرفة الترطيب، ثم انقر بلطف على الشرائح فوق ورق امتصاص أو مناديل خالية من الوبر لإزالة المصل، وانتقل فوراً إلى الخطوة 1.11.
      ملاحظة: لا تترك المقاطع تجف. قم بتحضير الأجسام المضادة الأولية المخففة في المحلول الحاجب المناسب (انظر الجدول 1) قرب نهاية خطوة الحجب لتكون جاهزة للاستخدام في الخطوة 1.11 بمجرد اكتمال الحجب.
  11. التحضين مع الجسم المضاد الأولي (~16 ساعة):
    1. ضع ~50 µL من الأجسام المضادة الأولية، المخففة بشكل مثالي في المحلول الحاجب المناسب (انظر الجدول 1)، على مقاطع الأنسجة وحضنها طوال الليل (~16 ساعة) عند 4 °C في غرفة ترطيب.
      ملاحظة: تأكد من ملء المناطق المخصصة في غرفة الترطيب بالماء المقطر للحفاظ على رطوبة الغرفة طوال الليل. بالإضافة إلى ذلك، اتخذ الاحتياطات لضمان عدم ملء المناطق/الغرف المخصصة لشرائح الأنسجة بالماء المقطر، لأن ذلك قد يؤدي إلى غمر مقاطع الأنسجة بالماء.
  12. غسل بـ DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 دقيقة):
    1. ضع حامل شرائح في حاوية صبغ واملأها بمحلول الغسل (1× DPBS، 0.1% Tween 20).
    2. بعد التحضين طوال الليل، أخرج الشرائح من غرفة الترطيب، وتخلص من الأجسام المضادة الأولية عن طريق النقر بلطف على الشرائح فوق ورق امتصاص، ثم ضع الشرائح في حامل شرائح مغمور في محلول الغسل (1× DPBS، 0.1% Tween 20) في حاوية صبغ، وتخلص من محلول الغسل.
    3. ثم اشطف المقاطع في 1× DPBS (0.1% Tween 20) ثلاث مرات، لمدة 5 دقائق لكل مرة، ثم أخرج الشرائح من حامل الشرائح وضعها بشكل مسطح في غرفة الترطيب، وانتقل فوراً إلى الخطوة 1.13.
      ملاحظة: يمكن تمديد وقت كل غسلة إلى 10–15 دقيقة إذا لوحظ وجود تلوين خلفي عالٍ بعد تطوير اللون في الخطوة 1.15. يجب أن يكون الغسل لطيفاً وسكونياً (بدون هز أو رج) لمنع انفصال الأنسجة عن الشرائح.
  13. التحضين مع الجسم المضاد الثانوي (~32–35 دقيقة):
    1. أضف قطرة واحدة لكل مقطع من الجسم المضاد الثانوي المناسب والمقترن بـ HRP (anti-rabbit أو anti-rat IgG، حسب الاقتضاء؛ انظر الجدول 2) وحضن مقاطع الأنسجة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إبقاء غطاء غرفة الترطيب مغلقاً.
      ملاحظة: يمكن تخفيف الجسم المضاد الثانوي بنسبة 1:1 في PBS لتقليل الخلفية في الخطوة 1.15.
  14. غسل بـ DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 دقيقة):
    1. بعد التحضين مع الجسم المضاد الثانوي، أخرج الشرائح من غرفة الترطيب وانقر بلطف على الشرائح فوق ورق امتصاص للتخلص من الأجسام المضادة الثانوية.
    2. ثم ضع الشرائح في حامل شرائح مغمور في محلول الغسل (1× DPBS مع 0.1% Tween 20) داخل حاوية صبغ لغسلة سريعة، وتخلص من محلول الغسل.
    3. ثم اشطف مقاطع الأنسجة ثلاث مرات باستخدام 1× DPBS (0.1% Tween 20) لمدة 5 دقائق لكل مرة.
      1. قبل البدء في خطوة تطوير الكروموجين (أي الخطوة 1.15)، ضع حامل شرائح منفصلاً في حاوية صبغ مملوءة بالماء المقطر، وهي خطوة تحضيرية للخطوة 1.16 لإيقاف تفاعل الكروموجين.
      2. أثناء الغسلة الأخيرة، حضر محلول DAB العامل حديثاً (قطرة واحدة من الكروموجين لكل 1 mL من المادة الركيزة؛ انظر الملف التكميلي 1).
  15. تطوير الكروموجين (30 ثانية–5 دقائق):
    1. بعد الغسلة الثالثة في الخطوة 1.14، أخرج الشرائح من حامل الشرائح وضعها بشكل مسطح على طاولة العمل بخلفية بيضاء.
    2. ضع 50 µL من محلول DAB العامل على كل مقطع وراقب بصرياً ظهور اللون البني مقابل خلفية بيضاء أو تحت مجهر ضوئي.
      ملاحظة: استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1. يساعد استخدام ورق امتصاص أبيض في تصور تطور اللون البني خلال مرحلة كروموجين DAB. قد يستغرق تطوير اللون من 20–60 ثانية لبعض المؤشرات ومن 2–5 دقائق لغيرها (انظر التفاصيل في الخطوة 1.16).
  16. إيقاف التفاعل (1–2 دقيقة):
    1. بمجرد ظهور إشارة اللون البني المطلوبة في الخطوة 1.15، أوقف التفاعل فوراً عن طريق غمس الشريحة في حاوية من الماء المقطر المحضرة في الخطوة 1.14.3.1.
    2. اترك الشرائح تُشطف في الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة. تخلص من الماء المقطر، ثم انتقل إلى الخطوة 1.17 (التلوين المضاد).
      ملاحظة: يمكن للشرائح أن تبقى في الماء المقطر لمدة تصل إلى ساعة واحدة دون التأثير على التلوين. الوقت المطلوب لتطوير اللون هو الذي يحدد موعد بدء خطوة إيقاف التفاعل. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان هناك 2–3 مؤشرات (مثل CD3 أو CD4 أو CD8 أو غيرها) على نفس الشريحة (كما هو الحال في هذه الدراسة)، فقد تختلف أوقات التفاعل؛ على سبيل المثال، في النظام الموصوف هنا، يستغرق تطوير اللون عموماً حوالي 30 ثانية لخلايا CD8+، و1–3 دقائق لخلايا CD3+ أو CD4+، أو فترة أطول (3–5 دقائق) لخلايا Granzyme B+ و Ki67+. ونظراً للاختلافات في توقيت تطوير اللون، لا يمكن غمر الشريحة بأكملها في الماء المقطر لإيقاف التفاعل، بل يجب إيقاف كل تفاعل بشكل فردي لكل مقطع عن طريق إضافة 200–300 µL من الماء المقطر مباشرة على كل مقطع.
  17. التلوين المضاد (<1 دقيقة):
    1. لتعزيز التباين مع التلوين البني، أضف الهيماتوكسيلين المخفف (1:3 في ماء مقطر) إلى حاوية الصبغ، مع التأكد من بقاء الشرائح مغمورة في الهيماتوكسيلين المخفف لمدة ~10–20 ثانية.
      ملاحظة: إذا كانت خلفية DAB قوية، زد مدة التلوين المضاد (حتى دقيقة واحدة) أو استخدم الهيماتوكسيلين غير المخفف لفترة وجيزة.
  18. غسل بماء الصنبور (6 دقائق):
    1. تخلص من الهيماتوكسيلين من حاوية الصبغ وأعده إلى الزجاجة لإعادة استخدامه.
    2. اشطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم اشطفها في ماء صنبور جارٍ ببطء لمدة 5 دقائق، مع جعل المقاطع موجهة بعيداً عن التدفق المباشر للماء. تخلص من ماء الصنبور وانتقل إلى الخطوة 1.19.
      ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات المتبقية حتى التثبيت داخل خزانة أبخرة.
  19. إزالة الماء التدريجية (15–17 دقيقة):
    1. اغمر الشرائح في إيثانول 70% في حاوية الصبغ لمدة 5 دقائق (ثم أعد الإيثانول 70% إلى الزجاجة لإعادة استخدامه)، يليه إيثانول 90% لمدة 5 دقائق (ثم أعده إلى الزجاجة)، وأخيراً في إيثانول 100% لمدة 5 دقائق (ثم أعده إلى الزجاجة).
    2. انتقل إلى الخطوة 1.20.
      ملاحظة: نفذ هذه الخطوة في خزانة أبخرة كيميائية. يتم استخدام نفس محاليل الإيثانول من الخطوة 1.2 في خطوة إزالة الماء هذه ويمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا كانت تبدو نظيفة.
  20. التصفية (Clearing):
    1. استخدم نفس محاليل Xylene I و II المستخدمة في إزالة البارافين (الخطوة 1.1) لتنظيف مقاطع الأنسجة/الشرائح.
    2. أولاً، اغمر الشرائح في محلول Xylene I في حاوية الصبغ لمدة 10 دقائق (ثم أعد Xylene I إلى الزجاجة لإعادة استخدامه) ثم في محلول Xylene II لمدة 10 دقائق إضافية.
    3. احتفظ بالشرائح في Xylene II حتى يكتمل التثبيت (أي الخطوة 1.21).
      ملاحظة: لا تسمح أبداً بجفاف المقاطع خلال هذه الخطوة، لأن المقاطع الجافة تصبح هشّة؛ لذا، إذا لزم الأمر، يمكن أن تبقى المقاطع في Xylene II لفترة أطول من أجل التثبيت.
  21. التثبيت (Mounting):
    1. أخرج الشرائح واحدة تلو الأخرى من Xylene II وضعها بشكل مسطح في خزانة أبخرة كيميائية. ضع قطرة واحدة من وسط تثبيت قائم على الزيلين على غطاء شريحة (coverslip) بحجم مناسب، ثم ضع غطاء الشريحة على الشريحة، بحيث يكون وسط التثبيت مواجهاً لمقاطع الأنسجة.
    2. اضغط بلطف على غطاء الشريحة بإبهامك لتوزيع وسط التثبيت بالتساوي عبر المقاطع الثلاثة ولإزالة فقاعات الهواء.
      ملاحظة: يلزم غطاء شريحة مقاس 24 × 50 مم لتغطية ثلاثة مقاطع على شريحة واحدة؛ وغطاء مقاس 24 × 40 مم لمقطعين؛ وغطاء مقاس 24 × 24 مم لمقطع واحد. من المهم إكمال التثبيت خلال 30 ثانية لكل شريحة لأن وسط التثبيت يمكن أن يجف بسرعة بسبب تدفق الهواء المستمر في خزانة الأبخرة، مما يتسبب في تبخر Xylene II بسرعة من الشريحة ويجعل المقاطع هشّة.
  22. التجفيف بالهواء والفحص بالمجهر الضوئي:
    1. جفف الشرائح بالهواء في خزانة الأبخرة لمدة ساعتين على الأقل قبل التقييم والتصوير باستخدام المجهر الضوئي. وبمجرد جفافها، تُحفظ الشرائح المثبتة في صناديق الشرائح في درجة حرارة الغرفة لسنوات.

2. صبغ كيميائي نسيجي مناعي مزدوج اللون لمقاطع أورام الدماغ المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE)

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي سير عمل الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ثنائية اللون القائمة على الركيزة للكشف المتزامن عن مستضدين داخل نفس المقطع النسيجي لورم دماغي مثبت بالشمع البارافيني (FFPE). وبالمقارنة مع الكيمياء النسيجية المناعية أحادية اللون، فإن سير العمل ثنائي اللون يستغرق وقتاً أطول لأنه يتطلب دورات صبغ متسلسلة مع تحضين مستقل للأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك خطوات التحضين طوال الليل لكل جولة صبغ. ومع ذلك، فإن سير العمل الممتد هذا يتيح الكشف الموثوق والمتزامن عن المستضدات داخل نفس المقطع النسيجي مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة وضمان فصل واضح للإشارات اللونية تحت المجهر الضوئي.

  1. إزالة البارافين (20 دقيقة):
    1. اتبع عملية إزالة البارافين نفسها الموضحة أعلاه لـ IHC أحادي اللون في الخطوة 1.1 داخل غطاء أبخرة كيميائي، ولكن استخدم عوامل ترويق غير قائمة على الزيلين (على سبيل المثال، Histo-Clear I و Histo-Clear II بدلاً من الزيلين).
      تنبيه: استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1 ونفذ هذه الخطوة تحت غطاء أبخرة كيميائي. يُوصى باستخدام Histo-Clear لأن الكروموجين قابل للذوبان جزئياً في الزيلين، والمعالجة الخالية من الزيلين تساعد في الحفاظ على كثافة الصبغ خلال IHC ثنائي اللون. لا تسمح بجفاف المقاطع. يمكن إعادة استخدام محاليل الترويق هذه إذا خُزنت في حاويات زجاجية محكمة الإغلاق وكانت تبدو نظيفة.
  2. إعادة الترطيب التدريجي (15 دقيقة):
    1. نفس خطوات IHC أحادي اللون الموضحة في الخطوة 1.2. أعد ترطيب المقاطع بالتتابع مع خفض تدريجي في تركيز الإيثانول (100%، و90%، و70%) لمدة 5 دقائق في كل خطوة.
      ​ملاحظة: يتم استخدام مجموعة منفصلة من الإيثانول المتدرج الخالي من الزيلين هنا، حيث أن الإيثانول المتدرج المستخدم لـ IHC أحادي اللون في الخطوة 1.2 من المرجح أن يكون ملوثاً بـ Xylene II.
  3. شطف بالماء (5 دقائق):
    1. نفس خطوات IHC أحادي اللون في الخطوة 1.3؛ ضع الشرائح في ماء مقطر لمدة 5 دقائق لإتمام عملية إعادة الترطيب.
      ​ملاحظة: نفس الخطوة 1.3؛ قم بتحضير محلول استعادة المستضد خلال هذه الفترة البالغة 5 دقائق.
  4. استعادة المستضد (~20 دقيقة): اتبع إجراء استعادة المستضد نفسه الموضح لـ IHC أحادي اللون في الخطوة 1.4.
  5. التبريد (10-20 دقيقة): اتبع عملية التبريد نفسها الموصوفة لـ IHC أحادي اللون في الخطوة 1.5.
  6. غسيل بـ DPBS (10 دقائق): اتبع عملية غسل محلول استعادة المستضد كما هو موضح لـ IHC أحادي اللون في الخطوة 1.6.
  7. الحاجز الكاره للماء (<1 دقيقة/شريحة):
    1. أثناء الغسيل بـ DPBS في الخطوة 2.6، قم بعمل حاجز كاره للماء حول مقاطع الأنسجة باتباع نفس العملية/البروتوكول المتبع في الخطوة 1.7.
    2. استخدم قلم الحاجز الكاره للماء لرسم حاجز طارد للسوائل حول كل مقطع نسيجي، ثم أعد الشريحة إلى محلول غسيل DPBS في حاوية الصبغ. كرر هذه الخطوات لجميع الشرائح.
  8. حجب الفوسفاتاز القلوي (5 دقائق):
    1. بعد إتمام الحواجز الكارهة للماء على جميع مقاطع الأنسجة، أخرج الشرائح من حاوية الصبغ، وضعها بشكل مسطح في الغرفة المرطبة، وأضف قطرة واحدة من محلول حجب الفوسفاتاز القلوي الداخلي (على سبيل المثال، BLOXALL) لكل مقطع، واحضن المقاطع لمدة 5 دقائق. انتقل فوراً إلى الخطوة 2.9.
      ​ملاحظة: نظراً لاستخدام أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ AP في بروتوكول IHC ثنائي اللون، فمن الضروري حجب نشاط الفوسفاتاز القلوي الداخلي لتقليل إشارة الخلفية أثناء تطوير اللون الأحمر أو الأزرق. يُستخدم محلول حجب BLOXALL هنا لتثبيط الفوسفاتاز القلوي الداخلي. كما أنه يثبط البيروكسيداز الداخلي، لذا يمكن أيضاً استخدام محلول الحجب هذا في بروتوكول IHC أحادي اللون لحجب نشاط البيروكسيداز الداخلي، بدلاً من محلول H₂O₂ بتركيز 3%.
  9. غسيل بـ DPBS (10 دقائق):
    1. اشطف الشرائح في محلول 1× DPBS في حاوية الصبغ مرتين لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    2. بعد الغسلة الثانية، أخرج الشرائح من حاوية الصبغ، وضعها بشكل مسطح في الغرفة المرطبة، وأضف الماء المقطر إلى حواف الغرفة المرطبة.
      ملاحظة: لا تترك المقاطع تجف، لذا انتقل فوراً إلى حجب الارتباط غير النوعي بين المستضد والجسم المضاد في الخطوة 2.10.
  10. حجب المصل (~70 دقيقة):
    1. اتبع عملية حجب المصل نفسها كما في بروتوكول IHC أحادي اللون الموضح في الخطوة 1.10.
      1. أولاً، قم بالحجب باستخدام دارئ الحجب العالمي (5% BSA؛ 50 µL/مقطع) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم باستخدام مصل حصان طبيعي بتركيز 2.5% (قطرة واحدة/مقطع)، بما يتوافق مع فصيلة المضيف للجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب والمقترن بـ AP، لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة مع إغلاق غطاء الغرفة المرطبة.
      2. بعد هذه الفترة، ربت بلطف على الشرائح باستخدام ورق ماص للتخلص من المصل، وانتقل إلى الخطوة 2.11.
        ملاحظة: قم بتحضير الجسم المضاد الأولي I (انظر الجدول 1) خلال الدقيقة الأخيرة من خطوة الحجب، كما هو موضح في الخطوة 1.10.
  11. حضن الجسم المضاد الأولي I (~16 ساعة):
    1. اتبع عملية الحضن نفسها مع الجسم المضاد الأولي كما في الخطوة 1.11. على سبيل المثال، أضف ~50 µL من الجسم المضاد rabbit anti-CD3، المخفف بنسبة 1:100 في مصل حصان طبيعي بتركيز 2.5% (انظر الجدول 1)، إلى كل مقطع نسيجي.
    2. احضن العينات طوال الليل (~16 ساعة) عند 4 °C في غرفة مرطبة.
  12. غسيل بـ DPBS (0.1% Tween 20) (~18-20 دقيقة):
    1. اتبع إجراء الغسيل نفسه (3 خطوات غسيل، 5 دقائق لكل منها) كما هو موضح في بروتوكول IHC أحادي اللون في الخطوة 1.12.
    2. بعد الغسلة الثالثة، ضع الشرائح بشكل مسطح داخل الغرفة المرطبة. انتقل فوراً إلى الخطوة 2.13.
      ملاحظة: نفس ملاحظات الخطوة 1.12، على سبيل المثال، يمكن تمديد وقت كل غسلة إلى 10-15 دقيقة، ويجب أن يكون الغسيل لطيفاً وساكناً. لا تترك المقاطع تجف.
  13. حضن الجسم المضاد الثانوي I (~32-35 دقيقة):
    1. أضف قطرة واحدة لكل مقطع من الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب والمقترن بـ AP (انظر الجدول 2) واحضن المقاطع النسيجية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إغلاق غطاء الغرفة المرطبة.
      ملاحظة: يمكن تخفيف الجسم المضاد الثانوي بنسبة 1:1 في PBS لتقليل الخلفية في الخطوة 2.15.
  14. غسيل بـ DPBS (0.1% Tween 20) (~18-20 دقيقة):
    1. اتبع إجراء الغسيل نفسه باستخدام 1× DPBS/0.1% Tween 20، كما في الخطوة 1.14.
    2. ملاحظة: خلال خطوة الغسيل النهائية، قم بتحضير محلول العمل للركيزة حديثاً (5 mL، كما هو موصى به؛ انظر الجدول 3) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (انظر تحضير الكواشف في الملف التكميلي 1).
  15. تطوير اللون الأحمر (12-15 دقيقة):
    1. بعد إتمام الخطوة 2.14، ضع الشرائح بشكل مسطح على طاولة العمل بخلفية بيضاء، مثل ورق ماص أبيض، كما هو موضح في الخطوة 1.15.
    2. امزج محلول عمل الركيزة الأحمر المحضر حديثاً جيداً، ثم أضف 50 µL إلى كل مقطع نسيجي (تخلص من أي محلول متبقٍ).
    3. احضن المقاطع النسيجية في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر اللون الأحمر، مع الفحص الدوري كل 2-3 دقائق مقابل خلفية بيضاء أو تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظة: يختلف الوقت المطلوب لتطوير اللون الأحمر باختلاف الواسمات وقد يستغرق 20-30 دقيقة. ومع ذلك، بالنسبة لصبغ خلايا CD3+ في مقاطع أورام الدماغ 005 باستخدام نظام الكشف AP، يحدث تطوير اللون الأحمر عادةً خلال 12-15 دقيقة.
  16. شطف بالدارئ (5 دقائق):
    1. بمجرد ظهور إشارة اللون الأحمر المطلوبة في الخطوة 2.15، اشطف المقاطع في 1× DPBS/0.1% Tween 20 لمدة 5 دقائق في حاوية صبغ.
    2. خلال وقت الغسيل هذا، قم بتحضير الجسم المضاد الأولي II حديثاً في دارئ حجب مناسب (على سبيل المثال، الجسم المضاد rabbit anti-Ki67 المخفف بنسبة 1:100 في مصل حصان طبيعي بتركيز 2.5%؛ انظر الجدول 1).
      ملاحظة: على عكس الشطف بالماء المقطر المستخدم في IHC أحادي اللون (الخطوة 1.16)، يُستخدم DPBS/0.1% Tween 20 هنا ليس فقط لإيقاف التفاعل ولكن أيضاً لغسل الكروموجين الزائد بدقة والتحضير لدورة الصبغ الثانية.
  17. حضن الجسم المضاد الأولي II (~16 ساعة):
    1. انقل الشرائح إلى غرفة مرطبة وأضف ~50 µL من الجسم المضاد rabbit anti-Ki67 المحضر حديثاً إلى كل مقطع نسيجي. احضن العينات طوال الليل (~16 ساعة) عند 4 °C.
  18. غسيل بـ DPBS (0.1% Tween 20) (~18-20 دقيقة):
    1. اتبع نفس الإجراء المتبع في الخطوة 1.12.
    2. بعد الغسلة الثالثة، أخرج الشرائح من حاوية الصبغ وضعها بشكل مسطح في الغرفة المرطبة. انتقل فوراً إلى الخطوة 2.19.
  19. حضن الجسم المضاد الثانوي II (~32-35 دقيقة):
    1. اتبع نفس الإجراء المتبع في الخطوة 2.13. أضف قطرة واحدة لكل مقطع من IgG المضاد للأرانب والمقترن بـ AP (انظر الجدول 2) واحضن المقاطع النسيجية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إغلاق غطاء الغرفة المرطبة.
  20. غسيل بـ DPBS (0.1% Tween 20) (~18-20 دقيقة):
    1. اتبع إجراء الغسيل نفسه باستخدام 1× DPBS/0.1% Tween 20، كما في الخطوة 1.14.
      ملاحظة: خلال خطوة الغسيل النهائية، قم بتحضير محلول العمل للركيزة حديثاً (5 mL، كما هو موصى به؛ انظر الجدول 3) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (انظر تحضير الكواشف في الملف التكميلي 1).
  21. تطوير اللون الأزرق (10-12 دقيقة):
    1. بعد إتمام الخطوة 2.20، ضع الشرائح بشكل مسطح على طاولة العمل بخلفية بيضاء.
    2. امزج محلول عمل الركيزة الأزرق المحضر حديثاً جيداً، ثم أضف 50 µL إلى كل مقطع نسيجي (تخلص من أي محلول متبقٍ).
    3. احضن المقاطع النسيجية في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر اللون الأزرق، مع الفحص الدوري كل 2-3 دقائق مقابل خلفية بيضاء أو تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظة: مثلما هو الحال مع تطوير اللون الأحمر في الخطوة 2.15، يمكن أن يستغرق الوقت المطلوب لتطوير اللون الأزرق 20-30 دقيقة. ومع ذلك، بالنسبة لصبغ خلايا Ki67+ في مقاطع أورام الدماغ 005 باستخدام نظام الكشف AP، يتطور اللون الأزرق خلال 10-12 دقيقة.
  22. غسيل بالدارئ (5 دقائق):
    1. بمجرد ظهور إشارة اللون الأزرق المطلوبة في الخطوة 2.21، اغمر المقاطع في 1× DPBS/0.1% Tween 20 لمدة 5 دقائق في حاوية صبغ. تخلص من محلول الغسيل.
  23. شطف بالماء (دقيقة واحدة): اشطف المقاطع في ماء مقطر لمدة دقيقة واحدة. تخلص من الماء المقطر بعد الشطف.
  24. تجفيف تدريجي (15-17 دقيقة):
    1. اغمر الشرائح في إيثانول بتركيز 70% في حاوية الصبغ لمدة 5 دقائق (ثم أعد الإيثانول 70% إلى الزجاجة لإعادة استخدامه)، يليه إيثانول بتركيز 90% لمدة 5 دقائق (ثم أعده إلى الزجاجة)، وأخيراً في إيثانول بتركيز 100% لمدة 5 دقائق (ثم أعده إلى الزجاجة).
    2. كرر كل خطوة في غطاء الأبخرة. انتقل إلى الخطوة 2.25.
      ملاحظة: تُستخدم محاليل الإيثانول نفسها (الخالية من الزيلين) من الخطوة 2.2 في خطوة التجفيف هذه، ويمكن إعادة استخدامها عدة مرات إذا كانت تبدو نظيفة.
  25. ترويق غير قائم على الزيلين:
    1. استخدم نفس المحاليل الخالية من الزيلين (أي Histo-Clear) المستخدمة في الخطوة 2.1 لتنظيف مقاطع الأنسجة/الشرائح.
      1. أولاً، اغمر الشرائح في محلول ترويق I خالي من الزيلين في حاوية الصبغ لمدة 10 دقائق (ثم أعد المحلول I إلى الزجاجة لإعادة استخدامه) ثم في محلول ترويق II خالي من الزيلين لمدة 10 دقائق إضافية.
      2. احتفظ بالشرائح في محلول ترويق II خالي من الزيلين حتى اكتمال عملية التثبيت (أي الخطوة 2.26).
        ملاحظة: يمكن أن تظل المقاطع في محلول ترويق II خالي من الزيلين لفترة أطول، إذا لزم الأمر، لأجل التثبيت.
        تنبيه: استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1 ونفذ هذه الخطوة تحت غطاء أبخرة كيميائي.
  26. تثبيت غير قائم على الزيلين:
    1. أخرج الشرائح واحدة تلو الأخرى من محلول ترويق II الخالي من الزيلين وضعها بشكل مسطح في غطاء الأبخرة. ضع قطرة واحدة من وسط تثبيت غير قائم على الزيلين على غطاء شريحة بحجم مناسب، ثم ضع غطاء الشريحة على الشريحة، بحيث يكون وسط التثبيت مواجهاً لمقاطع الأنسجة.
    2. اضغط بلطف على غطاء الشريحة بإبهامك لنشر وسط التثبيت بالتساوي عبر جميع المقاطع الثلاثة ولإزالة فقاعات الهواء.
      ملاحظة: أتمم عملية التثبيت خلال 30 ثانية لكل شريحة، حيث أن وسط التثبيت يمكن أن يجف بسرعة. استخدم معدات الوقاية الشخصية كما في الخطوة 1.1 ونفذ هذه الخطوة تحت غطاء أبخرة كيميائي.
  27. التجفيف بالهواء والمجهر الضوئي: جفف الشرائح بالهواء في غطاء الأبخرة لمدة ساعتين على الأقل قبل التقييم والتصوير باستخدام المجهر الضوئي. بمجرد جفافها، يمكن تخزين الشرائح المثبتة في صناديق الشرائح في درجة حرارة الغرفة لسنوات.

النتائج

أنتجت تقنية IHC أحادية اللون باستخدام نظام الكشف اللوني القائم على HRP صبغاً واضحاً وقابلاً للتكرار في مقاطع أورام الدماغ FFPE 05. تظهر الصور الممثلة لصبغ المستضدات السطحية في الشكل 1، مما يثبت نجاح الكشف عن واسمات الخلايا التائية (CD3, CD4, CD8)، وواسمات البلاعم المرتبطة بالأورام (TAM) مثل (CD68, F4/80)، وجزيء نقطة التحقق المناعية PD-L1. وفي جميع الحالات، تم تصور الصبغ الإيجابي كإشارة لونية بنية مميزة باستخدام DAB ككاشف لوني، مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة وأقل قدر من الصبغ الخلفي، مما يشير إلى أن بروتوكول IHC أحادي اللون يتوافق مع مختلف المستضدات المرتبطة بالغشاء.

تم توضيح قابلية تطبيق بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادي اللون للكشف عن المستضدات داخل الخلوية في الشكل 2. وتظهر صور الصبغ التمثيلية نجاح الكشف عن المؤشرات داخل الخلوية الخاصة بالنسخ، والإشارات، والانتشار، والسمية الخلوية، والموت الخلوي المبرمج، بما في ذلك T-bet وFoxP3 وphosphorylated STAT1 (pSTAT1) وKi67 وgranzyme B وcleaved caspase-3. وبشكل مشابه لصبغ المستضدات السطحية، أدى الكشف عن المؤشرات داخل الخلوية إلى ظهور إشارات لونية بنية واضحة مع الحفاظ على بنية النسيج، مع حدوث حد أدنى من صبغ الخلفية غير النوعي (الشكل 2)، مما يثبت أن البروتوكول مناسب للكشف عن كل من المستضدات السطحية وداخل الخلوية.

تم استخدام بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ثنائي اللون بنجاح للكشف المتزامن عن مستضدين داخل المقطع النسيجي نفسه، وذلك بتوظيف استراتيجية كشف لونية متسلسلة تعتمد على الفوسفاتاز القلوي (AP). وكما هو موضح في الشكل 3، أدى الصبغ المزدوج لـ CD3 (باللون الأحمر)/Ki67 (باللون الأزرق) وpSTAT1 (باللون الأحمر)/CD68 (باللون الأزرق)، والتي تشير على التوالي إلى الخلايا التائية التكاثرية والبلعميات الشبيهة بـ M119، إلى إنتاج إشارات لونية متميزة بوضوح تحت المجهر الضوئي، مما أثبت فعالية الكشف المتزامن للمستضدين مع فصل لوني واضح باستخدام سير عمل الصبغ المتسلسل. ولإثبات تعدد استخدامات نهج الصبغ ثنائي اللون هذا، تم تطبيق البروتوكول نفسه بنجاح للكشف المشترك عن واسم عصبي (NeuN باللون الأحمر) والبروتين الفلوري الأخضر (GFP باللون الأزرق) في مقاطع من أورام دماغية مشتقة من أورام 05 GSC التي تعبر عن GFP (الشكل 4). ويرجح أن يشير التموضع المشترك لـ GFP وNeuN إلى أن خلايا 005 GSCs تتمايز إلى أنماط ظاهرة ناضجة تعبر عن الواسم العصبي NeuN21.

الصور في الشكل ١, الشكل 2، و الشكل 3 تمثل أربعة أورام مستقلة، مع مقطع واحد لكل ورم لجميع مستضدات الخلايا المناعية المصبوغة، باستثناء صورة F4/80 التي تمثل ورمين مستقلين، وصورة PD-L1 التي تمثل ثلاثة أورام مستقلة، مع وجود مقطعين لكل من F4/80 و PD-L1. الصورة في الشكل 4 يمثل مقطعاً واحداً من الورم. ونظراً لاستخدام بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية المزدوج (dual-IHC) لصبغ مستضدين بالتتابع (على سبيل المثال، CD3+ و Ki67+, أو CD68+ و pSTAT1+) في المقطع النسيجي نفسه عبر ورمين إلى أربعة أورام مستقلة، وتم التحقق من ذلك بشكل أكبر عن طريق الصبغ المشترك لـ GFP+ و NeuN+ الخلايا، وتدعم هذه النتائج إمكانية التطبيق القابل للتكرار لبروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية المزدوجة (dual-IHC). وبالمثل، تم تطبيق بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية المنفردة (single-IHC) بنجاح على 12 مستضداً مختلفاً للخلايا المناعية، مما يثبت قابليته للتطبيق على نطاق واسع في ظل ظروف الصبغ الموصوفة هنا.

تُظهر هذه النتائج التمثيلية مجتمعة أن بروتوكولات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية وثنائية اللون القائمة على الركيزة والموصوفة هنا، توفر طرقاً عملية وقابلة للتكرار للكشف عن مجموعة واسعة من المستضدات السطحية وداخل الخلوية في أنسجة GBM المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE).

الكيمياء النسيجية المناعية للمؤشرات المناعية CD3 وCD4 وCD8 وCD68 وF4/80 وPD-L1، وصور مجهرية.
الشكل 1: الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية اللون للمستضدات السطحية. صبغ كيميائي نسيجي مناعي أحادي اللون (بني) قائم على الركيزة للمستضدات السطحية للخلايا التائية المتسللة إلى الورم (CD3+، CD4+، وCD8+)، والبلعميات المرتبطة بالأورام (CD68+ و F4/80+)، وجزيء نقطة التفتيش المناعية PD-L1 (بروتيني الموت المبرمج الرابط 1)+) باستخدام نظام الكشف القائم على بيروكسيداز الفجل (HRP) في مقاطع من أورام أرومة دبقية (GBM) في الفئران مشتقة من خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية للأورام الأرومة الدبقية (GSC) (راجع التفاصيل في القسم 1 من البروتوكول). تُعرض صور تمثيلية للكيمياء النسيجية المناعية (تكبير 10× لـ CD3 وCD4 وCD8؛ وتكبير 20× لـ CD68 وF4/80 وPD-L1). تظهر الخلايا الموجبة مصبوغة باللون البني. شريط المقياس = 100 μμm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مؤشرات الكيمياء النسيجية المناعية T-bet و FoxP3 و p-STAT1 و Ki67 و GranB و CC3 في المقاطع النسيجية.
الشكل 2: الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية اللون للمستضدات داخل الخلوية. صبغ كيميائي نسيجي مناعي (IHC) أحادي اللون (بني) قائم على الركيزة لعامل النسخ داخل الخلوي (T-bet)+ و FoxP3+)، وإشارات (pSTAT1+)، وتكاثري (Ki67+)، وسامّة للخلايا (جرانزيم B+، وGranB)، وموت الخلايا المبرمج (caspase-3 المشطور+، و CC3) في مقاطع من أورام دماغية باستخدام نظام كشف يعتمد على بيروكسيداز الفجل (HRP) في مقاطع من أورام دماغية فئرانية مشتقة من خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية (GSC) للورم الأرومي الدبقي (GBM) (راجع التفاصيل في القسم 1 من البروتوكول). تُعرض صور ممثلة للكيمياء النسيجية المناعية (تكبير 10× لكل من FoxP3 وGranB وCC3؛ وتكبير 20× لكل من T-bet وpSTAT1 وKi67). صُبغت الخلايا الإيجابية باللون البني. أشرطة المقياس = 100 μμm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التحليل النسيجي، واسمات CD3/Ki67 وpSTAT1/CD68، صورة مجهرية، دراسة تكاثر الخلايا.
الشكل 3: كيمياء نسيجية مناعية (IHC) ثنائية اللون للخلايا اللمفاوية المتكاثرة المرتشحة إلى الورم (TILs) والبلعميات المرتبطة بالورم (TAMs) الشبيهة بالنمط M1. صبغ كيميائي نسيجي مناعي ثنائي اللون (أحمر/أزرق) لـ CD3 قائم على الركيزة+(أحمر)/Ki67+خلايا T التكاثرية المتسللة إلى الورم (باللون الأزرق) وpSTAT1+(أحمر)/CD68+(باللون الأزرق) البلاعم الشبيهة بالنوع M1 باستخدام نظام الكشف القائم على الفوسفاتاز القلوي (AP) في مقاطع من ورم أرومي دبقي لدى الفئران مشتقة من خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي (GSC) (راجع التفاصيل في القسم 2 من البروتوكول). تُعرض صور ممثلة للكيمياء النسيجية المناعية (تكبير 20×). في الصورة العلوية، يظهر CD3+ تُصبغ الخلايا باللون الأحمر، Ki67+ تظهر الخلايا مصبوغة باللون الأزرق، وتشير الأسهم السوداء إلى عدد قليل من الخلايا ذات التوضع المشترك. وبالمثل، في الصورة السفلية، يظهر pSTAT1+ الخلايا مصبوغة باللون الأحمر، CD68+ تظهر الخلايا مصبوغة باللون الأزرق، ويُشار إلى عدد قليل من الخلايا ذات التموضع المشترك بأسهم سوداء. مقاييس الرسم = 100 μμm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أنسجة مصبوغة بـ NeuN/GFP، ورم مقابل غير ورم، صورة مجهرية، تحليل التمايز الخلوي.
الشكل 4: الكيمياء النسيجية المناعية ثنائية اللون (IHC) للخلايا العصبية والبروتين الفلوري الأخضر الموجب (GFP)+الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية في الورم الأرومي الدبقي (GSCs). تلوين كيميائي نسيجي مناعي (IHC) ثنائي اللون (أحمر/أزرق) لبروتين NeuN يعتمد على الركيزة+(الأحمر)/GFP+(باللون الأزرق) باستخدام نظام الكشف القائم على الفوسفاتاز القلوي (AP) في مقاطع من أورام أرومة دبقية (GBM) لدى الفئران، والمشتقة من خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية للأورام الأرومية الدبقية (GSC) (راجع التفاصيل في القسم 2 من البروتوكول). تظهر صورة تمثيلية للكيمياء النسيجية المناعية (تكبير 20×). NeuN+ تُصبغ الخلايا (علامة عصبية) باللون الأحمر، وGFP+ تُصبغ الخلايا (التي تعبر عن 05 GSCs) باللون الأزرق، وتُشير الأسهم السوداء إلى عدد قليل من الخلايا ذات التموضع المشترك. شريط المقياس = 100 μμm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

جسم مضاد أولي ضدرقم الكتالوجالموردالتخفيف التشغيليمحلول التخفيف الموقي (Dilution Buffer)الأنواع المضيفةالثانوي المناسب 
CD3eab5690Abcam1:100مصل الخيلأرنبمضاد الغلوبولين المناعي G للأرنب
CD4 14-9766-80eBioscience1:200مصل الماعزجرذمضاد IgG للجرذان
CD68ab125212Abcam1:100مصل حصانأرنبمضاد IgG للأرنب
CD8a 14-0808-80eBioscience1:100مصل الماعزجرذمضاد IgG للجرذان
كاسباز-3 المشطور9661CST1:100مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
F4/80ab1101Abcam1:100مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرنب
FoxP3ab54501* Abcam1:450مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
البروتين الفلوري الأخضر (GFP)ab183734Abcam1:200مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
جرانزايم ب (Granzyme B)ab4059Abcam1:150مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
Ki67ab1667Abcam1:100مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
NeuN24307توقيت 표준 (CST)1:400مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
بروتين PD-L1ab205921Abcam1:400مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرانب
pSTAT19167توقيت الساحل القياسي1:100مصل الحصانأرنبمضاد IgG للأرنب
T-betab9109Abcam1:100مصل الحصانفأرمضاد IgG للفأر

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة الأولية. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة، جنبًا إلى جنب مع مصادرها، وتخفيفات العمل المُحسَّنة، ومحاليل التخفيف الموصى بها، والأنواع المضيفة، والأجسام المضادة الثانوية المناسبة لصبغ الكيمياء النسيجية المناعية أحادية وثنائية اللون.

الأجسام المضادة الثانوية المقترنةرقم الكتالوجالنوع المضيفالقطرة/المقطعالمورد
HRP anti-rat IgGMP-74-15ماعزقطرة واحدة (غير مخففة)Vector Laboratories
HRP anti-rabbit IgGMP-7401حصان
HRP anti-mouse IgGMP-7402-15حصان
AP anti-rat IgGMP-5404-15ماعز
AP anti-rabbit IgGMP-5401حصان

جدول 2: قائمة الأجسام المضادة الثانوية. كواشف الكشف الثانوية المحسنة لبروتوكولات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية وثنائية اللون، بما في ذلك المترافقات الإنزيمية (HRP أو AP)، والأنواع المضيفة، وحجم التطبيق الموصى به، ومعلومات المورد.

المادة الركيزةإنزيم الكشفتركيبة المحلول المنظمتركيبة الكاشفوقت الحضانةملاحظات
Vector Blueالفوسفاتاز القلوي10 ملي مولار Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني 8.2-8.5، 0.1% Tween 20قطرتان من (80 µL) الكاشف 1 + قطرتان (80 µL(الكاشف 2 + قطرتان (45 µL(الكاشف 3)٢٠-٣٠ دقيقةللتلوين الأزرق في الكيمياء النسيجية المناعية المزدوجة؛ قابل للذوبان جزئياً في الزايلين؛ يوصى باستخدام كواشف ووسائط تثبيت خالية من الزايلين
فيكتور ريد (Vector Red)الفوسفاتاز القلوي تريس-HCl بتركيز 10 ميلي مولار، pH 8.2–8.5، وتوين 20 بتركيز 0.1%قطرتان (80 µL) الكاشف 1 + قطرتان (80 µL) الكاشف 2 + قطرتان (80 µL( الكاشف 3 )٢٠–٣٠ دقيقةللتلوين المناعي الكيميائي النسيجي المزدوج باللون الأحمر
ديامينوبنزيدين (DAB) بيروكسيداز الفجل الحار محلول منظم للركازة مُوفر من قِبل الشركة المصنعةإضافة قطرة واحدة من المولد اللوني إلى 1 مل من ركيزة DABمتغير (راجع الخطوة 2.16)ينتج صبغة بنية؛ مادة مسرطنة، يجب التعامل معها وفقاً لإرشادات السلامة

جدول 3: قائمة الركائز الملونة. يلخص هذا الجدول الركائز الملونة المستخدمة في الكيمياء النسيجية المناعية أحادية وثنائية اللون، بما في ذلك إنزيمات الكشف المتوافقة، وطرق التحضير والتركيب، وأوقات الحضن، وتوصيات المناولة الحرجة لضمان التطوير الأمثل للإشارة الملونة.

الملف التكميلي 1: تحضير الكواشف والمحاليل المنظمة والركائز. يلخص هذا الملف طرق التحضير والتخزين واعتبارات التعامل الحرجة لجميع الكواشف، والمحاليل المنظمة، ومحاليل الحجب، والركائز الملونة المستخدمة في بروتوكولات الكيمياء النسيجية المناعية أحادية وثنائية اللون.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تصف هذه الدراسة سير عمل تفصيلي وقابل للتكرار للكيمياء النسيجية المناعية (IHC) المعتمدة على الركيزة والتلون اللوني للكشف أحادي وثنائي اللون عن المستضدات السطحية وداخل الخلوية في أنسجة أورام الدماغ المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE) المشتقة من نموذج خلايا جذعية سرطانية (GSC) في الموضع الأصلي. كان الهدف الأساسي من هذه الدراسة منهجياً، وهو وضع بروتوكول عملي وخطوات مفصلة للكشف اللوني الموثوق عن المستضدات في أنسجة الورم الأرومي الدبقي (GBM) لدى كائنات ذات كفاءة مناعية.

لا تزال طريقة الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) الملونة طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتقييم العلامات الخلوية في الأنسجة المصبوبة في البارافين والمثبتة بالفورمالدهيد (FFPE)، لأنها تحافظ على بنية النسيج مع السماح بالتحديد المكاني للمستضدات داخل البيئة الدقيقة للورم (TME)15,16. ويتطلب الصبغ الملون القابل للتكرار تحسيناً دقيقاً للعديد من المعايير التقنية، بما في ذلك استعادة المستضد، وظروف الحجب، وتركيز الأجسام المضادة، ووقت تطوير الملون، والتعامل مع الأنسجة أثناء الصبغ والتثبيت. ويمكن أن تؤدي الانحرافات البسيطة في هذه الخطوات إلى فقدان الأنسجة، أو ضعف شدة الإشارة، أو زيادة صبغ الخلفية، أو ضعف الحفاظ على المورفولوجيا. ويعالج هذا البروتوكول التحديات التقنية الشائعة من خلال تقديم إرشادات إجرائية مفصلة لتحسين اتساق الصبغ وقابلية تكراره.

باستخدام سير عمل IHC أحادي اللون، أظهر التلوين النموذجي نجاح الكشف عن نطاق واسع من المستضدات المرتبطة بالغشاء والمستضدات الموجودة داخل الخلايا، بما في ذلك علامات الخلايا التائية، والعلامات المرتبطة بالبلعميات، وجزيئات نقاط التفتيش المناعية، وبروتينات الإشارة، وعلامات التكاثر، والمستضدات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. وتبرهن هذه النتائج النموذجية على قابلية تطبيق هذا البروتوكول للكشف عن فئات متنوعة من المستضدات في أنسجة GBM المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البرافين (FFPE) باستخدام نظام كشف لوني قياسي يعتمد على HRP.

يتمثل التحدي التقني الشائع في تقنية الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ثنائية اللون في الكشف المتزامن عن مستضدين عندما يتم إنتاج كلا الجسمين المضادين الأوليين في نفس الفصيلة المضيفة، مما قد يؤدي إلى تعقيد توافق الأجسام المضادة وتمييز الإشارات. ولمعالجة ذلك، قمنا بإنشاء سير عمل لصبغ ثنائي اللون تتابعي يعتمد على الفوسفاتاز القلوي (AP)، باستخدام ركائز لونية متميزة تسمح بفصل بصري واضح لإشارات المستضدات تحت المجهر الضوئي.

أظهر الصبغ المشترك التمثيلي لـ CD3/Ki67 و pSTAT1/CD68 نجاح الكشف المتزامن عن المستضدات داخل المقطع النسيجي نفسه. ويدعم التطبيق الإضافي لمسار العمل هذا في الصبغ المشترك لـ NeuN/GFP تعدد استخدامات بروتوكول الصبغ المزدوج اللون المتسلسل بما يتجاوز تحليل المؤشرات المناعية. يمكن قياس الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي (IHC) مزدوج اللون عن طريق التقييم اليدوي أو تحليل الصور الرقمي. وتشمل المقاييس الشائعة عدد أو نسبة الخلايا ذات الإيجابية المفردة والمزدوجة، بالإضافة إلى توزيعها داخل الورم. وعند استخدام التحليل الرقمي، يُوصى بتوحيد العتبات واختيار المناطق لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.

للحصول على نتائج صبغ موثوقة باستخدام بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادي اللون، يجب تضمين ضابط سلبي يتم فيه حذف الجسم المضاد الأولي. يجب ألا ينتج هذا الضابط أي إشارة لونية أثناء تطوير الركيزة (الخطوة 1.15)، مما يؤكد خصوصية إجراء الصبغ. أما بالنسبة لبروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية ثنائي اللون، فيوصى بضوابط سلبية إضافية عن طريق حذف الجسم المضاد الأولي I (الخطوة 2.11)، أو الجسم المضاد الأولي II (الخطوة 2.17)، أو كلا الجسمين المضادين الأوليين. ونظراً لأن كلا الجسمين المضادين الأوليين ينشآن من نفس فصيلة المضيف، فإن هذه الضوابط تتحقق من أن الجسم المضاد الثانوي الثاني المضاد للأرانب (الخطوة 2.19) لا يكشف عن بقايا الجسم المضاد الأولي من دورة الصبغ الأولى، وتساعد في استبعاد أي انتقال أو إشارة لونية غير نوعية.

على الرغم من أن الصور التمثيلية المعروضة في هذا البروتوكول توضح نتائج صبغ مثالية، قد يواجه المستخدمون أحياناً نتائج دون المستوى المطلوب، بما في ذلك إشارة لونية ضعيفة أو غائبة، أو صبغ خلفية مفرط، أو صبغ غير متساوٍ عبر المقطع النسيجي، أو نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة. وعادةً ما ترتبط هذه النتائج باسترجاع غير كافٍ للمستضدات، أو تركيز غير مثالي للأجسام المضادة، أو حجب غير كافٍ، أو إفراط في تطوير الركيزة اللونية، أو جفاف الأنسجة أثناء إجراء الصبغ. يمكن عموماً التعرف على هذه المشكلات من خلال المقارنة مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة، وتصحيحها عن طريق تحسين ظروف استرجاع المستضدات، وتخفيف الأجسام المضادة، وخطوات الحجب، وإجراءات الغسل، وأوقات تحضين المادة اللونية كما هو موضح في جميع أنحاء البروتوكول.

يتمثل أحد محددات هذه الدراسة في أن قابلية تطبيق الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) أحادية أو ثنائية اللون قد تم إثباتها باستخدام مقاطع نسيجية ممثلة من نموذج ورمي واحد، بدلاً من تطبيقها بشكل منهجي عبر نماذج ورمية متعددة أو مراحل مختلفة من تطور الورم. ومع ذلك، فإن هذا المحدد لا يؤثر على الهدف الأساسي من هذه الدراسة، والذي كان يتمثل في إنشاء وتوثيق سير عمل منهجي قابل للتكرار للكيمياء النسيجية المناعية الكروموجينية أحادية وثنائية اللون القائمة على الركيزة. وبالمقارنة مع التألق المناعي، تتوافق الكيمياء النسيجية المناعية الكروموجينية مع مجهر الحقل المضيء الروتيني، وت حافظ بشكل أفضل على مورفولوجيا الأنسجة، وتكون أقل تأثراً بالتألق الذاتي للأنسجة. وعلى الرغم من تحسين هذا البروتوكول هنا لنموذج GBM مشتق من GSC في موقع تشريحي أصلي لدى كائنات ذات كفاءة مناعية، إلا أنه قد يكون قابلاً للتكيف مع نماذج أورام أخرى قبل سريرية، ومع إجراء تحسينات خاصة بكل وسم، يمكن تطبيقه على عينات الأورام البشرية المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البرافين (FFPE). كما أن التكامل مع منصات التشخيص الرقمي وتحليل الصور قد يوسع من فائدته في التحليلات شبه الكمية القائمة على الأنسجة.

الإفصاحات

يعد S.D.R. مخترعاً مشاركاً في براءات اختراع تتعلق بفيروسات الهربس البسيط الحالة للأورام، والتي تملكها وتديرها جامعة جورج تاون ومستشفى ماساتشوستس العام، وقد حصلت هذه البراءات على عوائد مادية من شركتي Amgen و Acti\Vec Inc.، كما عمل كمستشار وتلقى مكافآت مالية من شركات Replimune و Cellinta و Greenfire Bio، ومكافآت مالية وحصص ملكية من EG 427. ويصرح بقية المؤلفين بأن هذه المخطوطة أُعدت في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

تلقى D.S. دعمًا جزئيًا من صندوق كلية العلوم والتكنولوجيا في جامعة كارولاينا الشمالية الزراعية والتقنية الحكومية (NCA&T)، ومنحة زمالة أعضاء هيئة التدريس (GRADS-4C) في NCA&T، ومنحة من المعاهد الوطنية للصحة NIH (1R16NS147983-01). وبالمثل، تلقى S.D.R. دعمًا جزئيًا من كرسي توماس أ. باباس في العلوم العصبية، بينما تلقى R.H.N. دعمًا جزئيًا من منحة NIH (1R35GM153737). ونتوجه بالشكر للدكتور إندر فيرما والدكتور ياسوشي سودا لتوفير 005 GSCs.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زجاجات زجاجية سعة 2 L CorningCORN1395-2Lتُستخدم لتحضير وتخزين 10× DPBS، و1× DPBS، والماء المقطر، ومحلول سترات الصوديوم المنظم
كأس زجاجي Pyrex سعة 2 L Corning1000-2Lيُستخدم لاستعادة المستضدات بوساطة الميكروويف في محلول سترات الصوديوم المنظم (حجم التشغيل 600–800 mL)
مصل حصان طبيعي أو مصل ماعز طبيعي بتركيز 2.5%تأتي هذه المواد جاهزة مع الأجسام المضادة الثانوية من Vector Laboratories. تُستخدم للحجب النوعي حسب الفصيلة ولتخفيف الأجسام المضادة بناءً على الفصيلة المضيفة للجسم المضاد الثانوي (anti-rabbit أو anti-rat IgG) لتقليل الارتباط غير النوعي والتلوين الخلفي
بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30% (H2O2)Fisher ScientificBP2633500
زجاجات زجاجية سعة 500 mLVWR InternationalVWRU10754-818تُستخدم لتحضير وتخزين الكواشف القابلة للاشتعال لصبغة IHC أحادية اللون، والكواشف الخالية من الزايلين لصبغة IHC ثنائية اللون
ورق امتصاص للمختبر مع مناديل Kimwipesيُستخدم أثناء إجراءات التلوين لإزالة الأجسام المضادة الزائدة أو محلول الغسيل من مقاطع الأنسجة قبل عمليات التحضين اللاحقة، مما يقلل من انتقال الكواشف والتلوث الخلطي
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Cleaved caspase-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzyme BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP anti-rabbit IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP anti-rat IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
محلول الحجب BLOXALLVector LaboratoriesSP-6000-100يُستخدم بشكل أساسي في صبغة IHC ثنائية اللون لتثبيط نشاط البيروكسيداز والفوسفاتيز القلوي الداخليين
ألبومين المصل البقري (BSA)Bioworld22070007-2يُستخدم لتحضير محلول حجب عام بتركيز 5% لتقليل الارتباط غير النوعي
وسط تثبيت دائم Cytoseal 60 Electron Microscopy Sciences18006وسط تثبيت متوافق مع الزايلين يُستخدم لصبغة IHC أحادية اللون
ركيزة ومادة ملونة DABDAKOK346811-2تُستخدم للكشف اللوني أحادي اللون القائم على HRP. تُحضّر مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة قطرة واحدة من المادة الملونة إلى 1 mL من ركيزة DAB وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة’. يجب التخلص من محلول التشغيل غير المستخدم بعد التحضير. مادة DAB مادة مسرطنة محتملة ويجب التعامل معها وفقًا لإرشادات السلامة البيولوجية والكيميائية المؤسسية
ماء مقطريُستخدم لتحضير الكواشف، وعمليات الغسيل، وتحضير المحاليل المنظمة. يمكن استخدام مياه فائقة النقاء أو مياه Milli-Q أيضًا
DPBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات لـ Dulbecco)’ Corning55-031-PC
إيثانول، 200 proof Decon Labs2701
شرائح مجهرية Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15شرائح زجاجية مجهرية مشحونة إيجابياً لمقاطع الأنسجة
أغطية شرائح زجاجيةCorning or Milipore Sigmaيجب اختيار الأحجام المناسبة بناءً على عدد مقاطع الأنسجة في كل شريحة. تشمل الأحجام الشائعة: 24 mm × 24 mm (مقطع نسيجي واحد)، 24 mm × 40 mm (مقطعان نسيجيان)، 24 mm × 50 mm (ثلاثة مقاطع نسيجية)
HematoxylinFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Electron Microscopy Sciences64111-01عامل ترويق خالٍ من الزايلين يُستخدم لصبغة IHC ثنائية اللون. يتم تحضير زجاجتين سعة 500 mL تحملان الملصقات Histo-Clear I وHisto-Clear II
HRP anti-mouse IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP anti-rabbit IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP anti-rat IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
غرف ترطيب Stellar ScientificHS-120879لتحضين مقاطع الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية
قلم حاجز كاره للماء (PAP pen)Vector LaboratoriesH-4000يُستخدم لإنشاء حاجز طارد للماء حول مقاطع الأنسجة للاحتفاظ بالأجسام المضادة والكواشف أثناء التحضين ومنع التلوث الخلطي بين مقاطع الأنسجة المتعددة على الشريحة نفسها
مناديل KimwipesKimtech Science34155تُستخدم لإزالة الكواشف المتبقية ومحلول غسيل الأنسجة بلطف
محرك مغناطيسي IKAI-10001529لتحضير المحاليل المركزية من سترات الصوديوم وDPBS
فرن ميكروويفPanasonic (Model: NN-L931BF)SN: 6H61050036سعة 2.2 قدم مكعب. مطلوب لاستعادة المستضدات بوساطة الحرارة باستخدام كأس زجاجي سعة 2 L
مجهر Nikon الضوئي NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Cameras: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (color) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/W)
مقياس pH VWR International77619-152لضبط pH محلول استعادة المستضدات
غلاف بلاستيكيFisher Scientific01810يُستخدم لتغطية محلول استعادة المستضدات بشكل فضفاض أثناء التسخين بالميكروويف لتقليل التبخر ومنع جفاف الأنسجة
حوامل شرائح Polyoxymethylene (POM) MopecSP234متوافقة مع أوعية التلوين المذكورة أعلاه؛ كل حامل يتسع لما يصل إلى 24 شريحة مجهرية
ميزان دقيق Mettler Toledo30697420لوزن مسحوق سترات الصوديوم وDPBS
ثلاجةThermo ScientificTSG3005CAلتخزين الأجسام المضادة والكواشف الحساسة لدرجة الحرارة
صناديق تخزين الشرائحFisher Scientific22-267294
أوعية/أطباق تلوين MopecSP233يستوعب كل وعاء حامل تلوين واحد يتسع لـ 24 شريحة
قضبان تحريك Fisher Scientific14-512-128لتحضير المحاليل المركزية من سترات الصوديوم وDPBS
سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدرات Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
وسط تثبيت دائم VectaMount PT Vector LaboratoriesH-5600-60وسط تثبيت دائم خالٍ من الزايلين يُستخدم لصبغة IHC ثنائية اللون
طقم ركيزة الفوسفاتيز القلوي Vector Blue Vector LaboratoriesSK-5300يُستخدم لتطوير الإشارة اللونية الزرقاء أثناء صبغة IHC ثنائية اللون القائمة على AP. نظرًا لأن Vector Blue قابل للذوبان جزئيًا في الزايلين، يجب استخدام عوامل ترويق وأوساط تثبيت خالية من الزايلين في سير عمل التلوين ثنائي اللون
طقم ركيزة الفوسفاتيز القلوي Vector RedVector LaboratoriesSK-5100يُستخدم لتطوير الإشارة اللونية الحمراء أثناء صبغة IHC ثنائية اللون القائمة على AP
زايلين (1 L) StatLab8400-1يُستخدم كعامل لإزالة البارافين والترويق في صبغة IHC أحادية اللون. يتم تحضير زجاجتين سعة 500 mL تحملان الملصقات Xylene I وXylene II

المراجع

  1. Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
  2. Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
  3. Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
  4. Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
  5. He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
  6. Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
  7. Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
  8. Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
  9. Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
  10. Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
  11. Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
  12. Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
  13. Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
  14. Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
  15. Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
  16. Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
  17. Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
  18. Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
  19. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
  20. Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
  21. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
  22. Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
  23. Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
  24. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا الورم الأرومي الدبقي الجذعيةالبيئة المجهرية للورمبروتوكول الكيمياء النسيجية المناعيةالكشف الكروموجينيالكيمياء النسيجية المناعية ثنائية اللونورم دماغي مثبت بالفورمالين ومضمن في البارافينالخلايا المناعية المرتشحة للورمالزرع في الموضع الأصليصبغ الفوسفاتاز القلوي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.