إبر رامان المبعثرة على السطح تستجيب للأكسدة والاختزال لمراقبة استجابات العلاج بالإبر الصينية لدى الفئران التي تعاني من ضعف تحمل الجلوكوز

ملخص

تقدم هذه الدراسة الاستكشافية لنموذج الفئران إبرة دقيقة نشطة بتقنية تشتت رامان السطحي الحساس للتكسيد والاختزال (SERS) للتدخل في الوخز بالإبر وتتبع مؤشرات SERS المرتبطة بالقدرة التأكسدية المحلية وإمكانية الأكسدة في الفئران ذات تحمل الجلوكوز الضعيف.

الملخص

يرتبط ضعف تحمل الجلوكوز (IGT) باضطراب توازن الأكسدة والاختزاز وزيادة الإجهاد التأكسدي، لكن التتبع الديناميكي داخل الجسم للتغيرات المرتبطة بالأكسدة والاختزاز أثناء التدخل في الوخز يظل تحديا تقنيا. طورت هذه الدراسة نظام إبر دقيقة نشط لتشتت رامان السطحي الحساس للأكسدة والاختزاز (SERS) لتدخل الوخز بالإبر في نفس الوقت وتتبع مؤشرات SERS المرتبطة بقدرة الأكسدة (OC) وإمكانية الأكسدة (RP) في الفئران المصابة ب IGT. تم إعداد مجسات SERS الحساسة للأكسدة والاختزال من خلال تحويل أقداف الذهب النانوية (GNS) إلى وظيفة مع p-phenylenediamine (p-PDA) لاستجابة OC والأنثراكوينون لاستجابة RP على التوالي. تم تحميل المجسات في أخديدين محفورين على إبر الوخز بالإبر لبناء إبر دقيقة نشطة في SERS. تم استخدام ذكور من جرذان سبراج-داولي الخالية من مسببات الأمراض المحددة في هذه الدراسة الاستكشافية. خدم ثلاثة فئران كضابطين طبيعيين، وتم إطعام 20 فأرا نظاما غذائيا عالي الدهون وأعطوا ستربتوزوتوسين (STZ) لتحفيز IGT. بعد الفحص، تم تقسيم 18 فأرا مؤهلا ل IGT إلى مجموعتين ذات نظام غذائي عالي الدهون ونظامية طبيعية، مع 9 فئران لكل مجموعة غذائية. تم تقسيم كل مجموعة غذائية إلى مجموعات فرعية لتواء نقاط الوخز بالإبر، ولف موقع الوخز بالإبر غير المعالج، وإدخال مباشر بنقطة الوخز بالإبر، مع 3 فئران لكل مجموعة فرعية. تم إجراء الوخز مرتين يوميا لمدة 7 أيام متتالية، وتم تسجيل مستويات السكر في الدم الصائم (FPG)، وسكر الدم بعد تناول الطعام لمدة ساعتين (2hPG)، ومؤشرات SERS المرتبطة بالأوكسيتي والRP. أظهرت النتائج أن الوخز عند نقاط الوخز بالإبر مع الالتواء كان مرتبطا بقيم FPG و2hPG أقل وتغير مؤشرات SERS المرتبطة ب OC وRP في نموذج IGT للفئران. نظرا لأن منحنيات المعايرة الخارجية، أو اختبارات الإجهاد التأكسدي الكيميائي المستقل المستقلة، أو اختبارات التجسس والاستطلاع، أو اختبارات التوافق الحيوي لم تدرج، يجب تفسير نسب SERS كمؤشرات بصرية مرتبطة بالأكسدة والاختزاز النسبية بدلا من تركيزات كيميائية حيوية مطلقة أو قيم مطلقة للأكسدة والجهد الاختزالية. تدعم هذه النتائج جدوى استخدام الإبر الدقيقة النشطة في SERS كمنصة استكشافية قبل سريرية لدمج تدخل الوخز بالإبر مع تتبع SERS بنسبة موضعية محلية في فئران IGT.

المقدمة

ضعف تحمل الجلوكوز (IGT)، وهو انخفاض في قدرة الجسم على تحمل الجلوكوز، يمثل مرحلة انتقالية بين مستوى السكر الطبيعي في الدم وجلوكوز الدم^{السكري 1}. لذا، فإن IGT هو إشارة تحذير مبكرة رئيسية ومرحلة قابلة للعكس في تطور مرض السكري من النوع^الثاني الثاني. تظهر البيانات السريرية أن حوالي 30٪ من السكان المصابين بمرض IGT سيتقدمون إلى السكري من النوع الثاني خلال 5–10 سنوات³؛ ومع ذلك، مع التدخل في الوقت المناسب، يمكن تقليل هذه النسبة إلى أقل من 10٪⁴.

IGT هو عملية ديناميكية ومعقدة، والبيئة المستمرة ذات الجلوكوز العالي هي محفز رئيسي لاضطرابات الأيض التأكسدي⁵. عندما يكون الجسم في حالة طويلة من فرط سكر الدم، تعمل سلسلة التنفس الميتوكوندرية بشكل غير طبيعي، ويرتفع معدل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بنسبة 30–50٪، مما يعزز القوة التأكسدية مباشرة في الجسم⁶؛ في الوقت نفسه، تثبط مستويات السكر العالية نشاط الإنزيمات الرئيسية مثل الجلوتاثيون ريدوكتاز، مما يمنع نظام مضادات الأكسدة من إزالة أنواع الأكسجين التفاعلية الزائدة في الوقت المناسب، مما يزيد من اضطراب توازن الأكسدة والاختزال بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك، يصاحب IGT تغيرات مرضية، بما في ذلك مقاومة الأنسولين وضعف طفيف في وظيفة خلايا β، مما يؤدي إلى مجموعة من الاستجابات البيولوجية والكيميائية الحيوية ^7,8. مع تطور حالة الأكسدة والاختزال، تزيد هذه التغيرات من تعطل أيض الجلوكوز وتزيد من خطر مضاعفات السكري، بما في ذلك اعتلال الشبكية، واعتلال الكلى،^{وأمراض القلب} والأوعية الدموية^. لذلك، يجب أن تحسن مراقبة القدرة التأكسدية (OC) وإمكانية الأكسدة (RP) لدى الأفراد أو النماذج الحيوانية المصابة ب IGT فهمنا للآليات الكامنة وراء تطور IGT وتوجيه تصميم استراتيجيات علاجية مستهدفة.

للوخز بالإبر تاريخ يزيد عن 3000 عام وأظهر فعالية سريرية جيدة في علاج العديد من الأمراض¹¹. علاوة على ذلك، أظهرت العديد من الدراسات التجريبية على الحيوانات أن الوخز بالإبر له تأثيرات مفيدة في تنظيم حالات الإجهاد التأكسدي في النماذج الحيوانية من خلال تعزيز نظام الإنزيمات المضادة للأكسدة وتقليل تأكسدة الدهون¹². وباعتباره ممارسة طبية صينية تقليدية، أظهر الوخز بالإبر فوائد كبيرة في علاج السكري ومرض التهاب الرحم العضلي (IGT). تم الإبلاغ عن أن نقاط الوخز بالإبر غوانيون (CV4) وسانينجياو (SP6) تنشط مسار SIRT1/PGC-1α في العضلات العظمية، مما يخفف من مقاومة الأنسولين لدى فئران السمنة والسكري¹³. علاوة على ذلك، تقوم نقاط الوخز بالإبر في تيانشو (ST25) بتعديل نشاط الخلايا العصبية المثبطة للجلوكوز الموجودة في المنطقة الجانبية تحت المهاد وتساهم في تنظيم استقلاب الجليكوليبيد^. ومع ذلك، ركزت معظم الدراسات حول آليات الوخز بالإبر داخل الأوعية الدموية بشكل أساسي على الأنظمة العصبية المعدلة والمناعية والجهاز الهضمي، حيث قد يؤثر الوخز بالإبر على استقلابية الجلوكوز من خلال تعديل الوظيفة الذاتية أو ينظم بشكل غير مباشر مستويات الجلوكوز في الدم من خلال تعزيز توازن الفلورا المعوية^15,16. الآلية المحددة لتأثير الوخز بالإبر في علاج IGT وتأثيراته على الإجهاد التأكسدي افتقرت إلى التحقيق العميق ودعم البيانات التجريبية.

يوفر تشتت رامان المعزز على السطح (SERS) حساسية وخصوصية عالية، مما يتيح اكتشاف مجموعة واسعة من المحللات. أظهرت مجسات SERS النانوية المبنية على ألياف البصريات^{النانوية 17}، وأغشية الكيتوزان¹⁸، والدراسات السابقة أن إبر الوخز¹⁹ يمكن استخدامها للكشف عن العلامات الحيوية والناقلات العصبية وغيرها من جوانب الكيمياء الحيوية الخلوية في الجسم الحي. تمثل إبر الوخز بالإبر على وجه الخصوص أدوات واعدة لاختبار الأنسجة العميقة، حيث تتيح المراقبة الواقعية طفيفة التوغل تليها التحليل خارج الجسم الحي. الوخز بالإبر، كطريقة علاجية راسخة، له مجموعة واسعة جدا من التطبيقات السريرية. أظهرت الدراسات الحديثة أن الألياف البصرية المدعومة ب SERS، وضمادات الجروح، وأجهزة الإبر الدقيقة يمكن أن تدعم التتبع الميداني أو طفيف التوغل للإشارات المرتبطة بالأكسدة والاختزاز في بيئات ذات صلة بيولوجية ^20,21. بالتوازي، ظهرت إبر الوخز بالإبر النشطة بنظام SERS وأنظمة الإبر الدقيقة ذات الصلة كحاملات واعدة لدمج قدرة الاستشعار مع تدخل الأنسجة¹⁹، مما أدى إلى إبر دقيقة نشطة في SERS بقدرات استجابة حية وقدرات كشف SERS في المختبر.

تبني هذه الدراسة على استراتيجية الإبرة الدقيقة النشطة في SERS التي تم الإبلاغ عنها سابقا لاكتشاف الإشارات المرتبطة بسعة الأكسدة وإمكانية الأكسدة في نماذج الإجهاد الناتج عن الجلوكوز. ومع ذلك، يختلف العمل الحالي عن الدراسة السابقة في السياق البيولوجي والغرض التجريبي. على وجه التحديد، تطبق هذه الدراسة منصة الإبر الدقيقة النشطة بنظام SERS على نموذج الفئران لضعف تحمل الجلوكوز وتدمج تتبع SERS النسبي المحلي مع التدخل بالإبر الصينية. تقارن الدراسة الحالية أيضا نقاط الوخز بالإبر مع المواقع غير المجاورة للوخز بالإبر، وتقيم مختلف التلاعبات بالإبر، وتراقب مؤشرات SERS المرتبطة بالأكسدة والاختزال خلال فترة تدخل مدتها 7 أيام. مقارنة بالألياف البصرية المعتمدة على SERS التي تم الإبلاغ عنها سابقا، وضمادات الجروح، والإبر الدقيقة النشطة في SERS المصممة أساسا للكشف الكيميائي الحيوي في موقع واحد أو وظيفة واحدة، توفر المنصة الحالية تقدمين. أولا، يتم دمج المجسات المستجيبة ل OC وRP في أخدودين مستقلين محفورين على إبرة إبر واحدة، مما يتيح مراقبة معلمات الأكسدة الاختزاز المكملة في نفس الوقت. ثانيا، تعمل إبرة الوخز بالإبر ليس فقط كحامل لمسبار SERS بل أيضا كجهاز علاجي، مما يسمح بإجراء مراقبة الأكسدة والاختزاز أثناء التدخل في الوخز بالإبر بدلا من العلاج. كما هو موضح في الشكل 1، بعد إدخال الإبر الدقيقة في الأنسجة، تتكون جروح صغيرة، وتتفاعل المجسات في الأخاديان مع الأنسجة، مما يمكنها من اكتشاف مستويات OC وRP في الجسم الحي. كان هدف الدراسة استخدام هذه الإبر الدقيقة النشطة في SERS لفحص التغيرات في الأوكسيد وRP لدى الفئران المصابة ب IGT وتحديد تأثيرات الوخز بالإبر مع نقاط الوخز بالإبر في هذه الحيوانات، مما يحصل على رؤى قيمة حول آلية تأثير الوخز بالإبر في علاج IGT والعلاقة بين حالات التأكسد والاختزاز وحالات ارتفاع السكر غير الطبيعية.

البروتوكول

الحيوانات ونماذج IGT

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في معهد أبحاث جامعة جنوب شرق سوتشو (رقم الموافقة) SEU-IACUC-20250318007) وتم تنفيذها وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم الحصول على الفئران وإيواؤها في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) عند درجة حرارة 25 درجة مئوية مع دورة ضوء 12 ساعة و12 ساعة ظلام. بالنسبة للإجراءات التي تتطلب تخدير، تم تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران الذي يرسل في الأكسجين عبر غرفة تحفيز ويتم الحفاظ عليه باستخدام مخروط أنف. تم استخدام الإيزوفلوران بنسبة 3٪ للتحفيز و1٪ للصيانة، مع تعديل التركيز حسب معدل التنفس والاستجابة الإجرائية.

تم تأكيد عمق التخدير المناسب قبل الوخز أو الحقن بسبب فقدان رد فعل التصحيح وعدم الاستجابة لقرص إصبع القدم. خلال التخدير، تم مراقبة نمط التنفس، وضعية الجسم، والتعافي، ووضع الحيوانات على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. كانت الحيوانات تؤوي 2 في كل قفص مع وصول مجاني للطعام والماء ما لم يكن هناك حاجة للصيام لاختبار الجلوكوز. بعد الوصول، تم تأقلم الفئران لمدة أسبوع قبل إدخال النموذج. تمت مراقبة رفاهية الحيوان يوميا، بما في ذلك النشاط العام، والتجميل، وتناول الطعام، ووزن الجسم، وحالة موقع الحقن، والتعافي بعد التخدير. في نهاية الدراسة، تم إعدام الفئران وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد. تم تنفيذ القتل الرحيم عن طريق استنشاق CO₂ تدريجيا، تلاه تأكيد الوفاة باستخدام طريقة خلع عنق الرحم. الحيوانات التي استوفت معايير النهاية الإنسانية، بما في ذلك فقدان الوزن الشديد، وعدم الحركة المستمر، والتنفس غير الطبيعي، وعدم القدرة على الأكل أو الشرب، أو الضيق الشديد، تم إعدامها فورا بدلا من الحفاظ عليها حتى النقطة النهائية المجدولة. تم استخدام ذكور من فئران سبراج-داولي الخالية من الممرضات المحددة ووزنها 200 ± 20 جراما في هذه الدراسة. بعد أسبوع واحد من التكيف، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى مجموعتين: تم إطعام الجرذان الثلاثة في المجموعة الطبيعية بطعام طبيعي، بينما تم إطعام الجرذان ال20 في المجموعة النموذجية بطعام عالي الدهون (50٪ طعام قاعدي + 10٪ شحم + 25٪ سكروز + 15٪ مسحوق صفار) لمدة 3 أسابيع. تلقت الحيوانات في مجموعة النموذج حقنا داخل الصفاق بمقدار 20 ملغ/كجم من محلول STZ بنسبة 2٪ (مذاب بمقدار 0.1 مول/لتر، وحموضة 4.4 سيترات مخازلة) لمدة 12 ساعة، بعد 12 ساعة من الصيام دون تقييد الماء. تلقى الأشخاص في المجموعة الطبيعية حقنة داخل الصفاق من الجرعة المقابلة من محلول السترات بعد إطعامهم الطعام الطبيعي. تم إجراء اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (IPGTT) بعد أسبوع واحد. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

تم قياس سكر الدم الصائم (FPG) بجمع الدم من طرف ذيل الفئران في كل مجموعة بعد 12 ساعة من الصيام دون تقييد الماء، وتم تسجيل سكر الدم بعد تناول الطعام لمدة ساعتين (2hPG) بعد حقن ديكستروز 20٪ من الجهد داخل الصفاق 2 جرام/كغ. في المجموعة الطبيعية، كان نطاق FPG بين 5.1–6.6 mmol/L، ونطاق 2hPG للجلوكوز بين 7.3–9.4 mmol/L، مقارنة بFPG ≤7.0 mmol/L ونطاق 2hPG بين 10–16 mmol/L في مجموعة النموذج. من بين 20 فأرا تم تعيينهم لتحفيز نموذج IGT، استوفى 18 فأرا معايير IGT المحددة مسبقا بعد اختبار IPGTT وتم تضمينهم في تجربة التدخل اللاحقة. تم استبعاد فأرين لأن قيم FPG أو 2hPG الخاصة بهما كانت خارج نطاق IGT المحدد مسبقا. تم تقسيم الفئران الثمانية عشر المؤهلة عشوائيا إلى مجموعة غذائية عالية الدهون ومجموعة نظامية طبيعية، مع وجود 9 فئران لكل مجموعة. تم تقسيم كل مجموعة غذائية إلى ثلاث مجموعات فرعية: التواء نقاط الوخز بالإبر، ولف مواقع الوخز بالإبر غير المعتادة، والإدخال المباشر بنقاط الوخز بالإبر، مع وجود ثلاثة فئران في كل مجموعة فرعية. كانت هذه دراسة استكشافية لتطوير طريقة تهدف إلى تقييم جدوى دمج تدخل الوخز بالإبر مع تتبع النسبة المعتمد على SERS في نموذج جرذان IGT قبل السريري. لم يتم إجراء أي حساب رسمي للقوة الإحصائية. تم اختيار حجم المجموعة الفرعية المكونة من ثلاثة فئران بناء على الجدوى، والدراسات الأولية للإبر الدقيقة SERS، ومبدأ تقليل الحيوانات. تم تعيين الفئران عشوائيا من قبل المجرب؛ لم يتم تنفيذ إخفاء التخصيص الرسمي وتعميمه.

تم فحص بروتوكولات علاج الوخز بالإبر بالإشارة إلى إرشادات الممارسة السريرية المبنية على الأدلة للطب الصيني التقليدي، وجدوى التجارب الحيوانية²². كانت نقاط الوخز المختارة تشونغوان (RN12/CV12)، شويفن (RN9/CV9)، يينجياو (RN7/CV7)، تيانشو الثنائي (ST25)، شويداو الثنائي (ST28)، وزوسانلي الثنائي (ST36). تم العثور على RN12 وRN9 وRN7 على الخط الأوسط الأمامي وتم التعامل معها كنقاط منتصف فردية، بينما عولجت ST25 وST28 وST36 بشكل ثنائي الجانب. استندت أزواج نقاط الوخز بالإبر إلى تلك المستخدمة في العلاج السريري ل IGT²³. استند التكيف إلى الأدبيات^24،25، باستخدام الطريقة الثنائية. بالنسبة للفئران، تم تحديد نقاط الوخز وفقا للمعالم التشريحية والتحويل النسبي من مواقع نقاط الإبر البشرية القياسية. تم تحديد نقاط الريشة الطبيعية/القلب القلبي البطني على طول الخط الأوسط الأمامي باستخدام النتوء التدريجي، والسرة، والارتباط الداخلي كعلامات تشريحية. تم تمييز ST25 على الجانب الثنائي على مستوى السرة، وST28 على جانبين في منطقة أسفل البطن على نفس المسافة الجانبية من الخط الأوسط الأمامي. تم تحديد ST36 على الطرف الخلفي الجانبي الأمامي في منطقة الظنبوب الأمامية، الجانبية للحدبة الظنبوبية. تم تمييز مواقع المقارنة غير الإبرية المجاورة على بعد 5 مم من نقاط الوخز المقابلة وخارج خط الزوال المعترف به، مع تجنب الأوعية الظاهرة، والندب، ومواقع الثقب السابقة. قبل الوخز، كانت الفئران تخدر بالأيزوفلوران وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد وتوضع في وضعية الاستلقاء على وسادة التدفئة. تم حلق وتعقيم جلد البطن والطرف الخلفي فوق كل موقع مستهدف بنسبة 75٪ إيثانول. تم إدخال إبر دقيقة نشطة في SERS تقريبا بشكل عمودي على الجلد بعمق يقارب 10 ملم. بالنسبة لمجموعات التواء نقاط الوخز بالإبر، تم إدخال إبر دقيقة نشطة في SERS في نقاط الوخز المختارة وتم تدويرها بلطف في الاتجاهين خلال فترة الاحتفاظ التي تبلغ 20 دقيقة. بالنسبة للمجموعات غير الموضعية للوخز بالإبر، تم إجراء نفس الإجراء في مواقع المقارنة غير الإبرية المجاورة بحجم 5 مم. بالنسبة لمجموعات الإدخال المباشر، تم إدخال إبر دقيقة نشطة في SERS في نقاط الوخز وتم الاحتفاظ بها لمدة 20 دقيقة دون التواء. جميع إجراءات الوخز تم تنفيذها من قبل نفس المشغل المدرب لتقليل التفاوت بين المشغلين.

تم إجراء الإبر مرتين يوميا، في الساعة 10:00 و15:00، لمدة 7 أيام متتالية. قبل كل إجراء يومي، كان يتم قياس FPG بعد 8 ساعات من الصيام دون تقييد للماء. بعد كل يوم من إجراءات الإخزاء، تم تسجيل ردود OC وRP. في اليوم السابع، بعد العلاج بالإبر الصينية، تم إجراء اختبار IPGTT وتم تسجيل قيم 2hPG.

التحذيرات

الستربتوزوتوسين خطير ويجب التعامل معه كمادة كيميائية سامة. حضر محلول الستربتوزوتوسين في غطاء بخار كيميائي أو خزانة أمان حيوي معتمدة، مع ارتداء معطف مختبر وقفازات نيتريل ونظارات واقية وقناع. يجب التعامل مع الحقن والإبر والمدلال والمديل والمراوح والأقفاص والنفايات الحيوانية الملوثة بالستريبتوزوتوسين، وذلك وفقا لإجراءات النفايات البيولوجية والكيميائية الخطرة المؤسسية. يجب التخلص من الإبر والحقن المستخدمة فورا في حاويات حادة مقاومة للثقب دون الحاجة لإعادة الغطاء.

تصنيع الإبر الدقيقة النشطة في SERS للكشف عن OC وRP

تم تجهيز إبر الوخز بالإبر كما تم الإبلاغ سابقا^{في 26}. تم تصنيع الإبر الدقيقة النشطة في SERS باستخدام نفس نوع إبر الوخز بالإبر التجارية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (0.25 مم × 26 مم) طوال الدراسة. تم إدخال الإبر تقريبا بشكل عمودي على الجلد بعمق 10 مم. بالنسبة لمجموعات الالتفاف، تم تطبيق الدوران اليدوي ثنائي الاتجاه بلطف وثبات لمدة 20 دقيقة خلال فترة التثبيت بواسطة نفس المشغل المدرب. لم يكن التلاعب يتم التحكم فيه بواسطة الأداة؛ لذلك، لم يتم قياس تردد الدوران والسعة بدقة. وقد تم الاعتراف بهذا القيد في النقاش.

في البداية، تم نقع الإبر في محلول PMMA بنسبة 20٪ (بدون زجاج) في MMA، ثم تجفيفها في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة يوم واحد. بعد ذلك، تم صنع انبعاجين متوازيين بحجم موحد وشكل وعمق متشابهان في طبقة الحماية من PMMA (بمسافة 5 مم) باستخدام شفرة سكين حرفية صغيرة تم تنظيفها بالإيثانول؛ ثم تم غمر الإبر في حمض الكبريتيك بعمق 0.5 متر ليعمل كإلكتروليت لمدة 10 ثوان لتخضع للحفر الكيميائي الكهربائي بجهد 12 فولت، مما يولد أخاديدين شبه دائريين في مواقع التقطيع. ثالثا، بعد الشطف ثلاث مرات، تم غمر الإبر في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة في محلول إيثانول يحتوي على 0.1 مول L⁻¹ MPTES و0.3 مول L⁻¹ APTES، مما منح وظيفة الكبريتيريل للأسطح المحددة. رابعا، تم إزالة الطلاء عن طريق غمس الإبرة في MMA. تم إعداد إبر دقيقة مستجابية لإمكانات الاختزاز مع SERS بناء على طريقة²⁷ المبلغ عنها سابقا. تم امتصاص ركيزة SERS على أحد الأخاديد المحفورة في كل إبرة وخز بالإبر، وبعد ذلك تم غمر الإبر الدقيقة النشطة في محلول p-PDA مائي بتركيز 1 × ^10-4 مول/لتر لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مما أدى إلى إبر دقيقة مستجابة للأكسدة ونشطة في SERS. تم تصنيع ركائز SERS المبنية على قشور نانوية ذهبية كما ذكر^{سابقا 28}. في العمل الحالي، كانت هذه الإبر الصغيرة تقطر في الأخدود الآخر لكل إبرة وخز بالإبر، والتي تركت لتجف طبيعيا. وقد أدى ذلك إلى استخدام إبر دقيقة نشطة في SERS مع استجابة OC وRP.

تقييم خارج الجسم الحي لتفاعل OC واستجابة RP للإبر الدقيقة النشطة في SERS

تم تقييم استجابات مسبارات OC وRP عن طريق إدخال الإبر الدقيقة النشطة ل SERS في نسيج خارج الجسم الحي . للتحقق من استجابة مسبار OC للتغيرات التأكسدية، تم تسجيل أطياف SERS ل p-PDA قبل وبعد الأكسدة. كما تم الحصول على أطياف مجسات SERS المؤكسدة من خلال محلول NaBH₄ مختزل بقوة ومحلول HAuCl₄ مؤكسد بقوة. تم تقييم انتقائية مسبار OC باستخدام عوامل مختزلة، منها 1 × ^10-4 M FeSO₄، و1 × ^10-4 M Na₂SO₄، و1 × ^10-4 M حمض الأسكوربيك، وعوامل مؤكسدة، بما في ذلك 1 × ^10-4 M CuSO₄، 1 × ^10-4 M H₂O₂، 1 × ^10-4 M FeCl₃, وواحد × ^10-4 M HAuCl₄. تم تجهيز جميع المحاليل في 20 مللي مولار PBS (pH 7.4)، وتم حضن المجسات مع كل محلول لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تقييم متانة الإبر الدقيقة النشطة في SERS من خلال تسجيل استجابات OC قبل وبعد التفاعل مع 1 × ^10-4 مول/لتر FeCl₃ في درجة حرارة الغرفة. تم استخدام هذه الاختبارات خارج الجسم الحي والاختبارات القائمة على الحلول لتأكيد استجابة المجس تحت ظروف مضبوطة. ومع ذلك، فهي لا تعيد إنتاج تعقيد البيئة الدقيقة للأنسجة في الجسم الحي ، حيث قد تؤثر التغيرات المحلية في الرقم الهيدروجيني، وامتصاص البروتين، ومكونات المصفوفة خارج الخلية، ومواد بيولوجية أخرى على إشارات SERS. لذلك، تم تفسير قراءات OC وRP في الجسم الحي ، كمؤشرات SERS مرتبطة بالأكسدة والاختزالية النسبية بدلا من قياسات كيميائية حيوية مستقلة عن المصفوفة.

كشف الإصابة بالإبر الزجاجية وRP في مواقع الوخز بالإبر وغير الوخز

لتقييم أداء مجسات OC وRP في نقاط الوخز بالإبر وغير الوخز بالإبر، تم إدخال الإبر الدقيقة النشطة ل SERS في الفئران السليمة عند نقاط الوخز ST36 وRN12، وعلى عمق 5 مم لكل من هذه النقاط، على عمق يقارب 10 مم، لنفس المدة الزمنية.

تأثيرات الالتفاف الإبرة على اكتشاف OC وRP

لتقييم استجابة مجسات OC وRP تحت تقنيات الإبر المختلفة، تم إدخال إبر دقيقة نشطة ل SERS في نقاط الوخز ST36 وRN12 و5 مم بجوار هذه النقاط في الفئران السليمة بعمق حوالي 10 مم. عند كل نقطة وخز بالإبر، كانت إبرة واحدة ملتفة، بينما الإبرة المجاورة للنقطة لم تكن ملتوية، والعكس صحيح (إبرة مجاورة لنقطة الوخز بالإبر كانت ملتوية، بينما نظيرتها عند نقطة الوخز لم تكن ملتوية). تم جمع إشارات SERS من المجسات في نفس وقت الإدخال لكل إبرة.

تغيرات في ال OC وRP لدى الفئران المصابة ب IGT فيما يتعلق بنقاط الوخز بالإبر، ولف الإبر، والظروف الغذائية

لتقييم تأثيرات نقاط الوخز بالإبر، ولف الإبر، والظروف الغذائية على الجرذان المصابة ب IGT على الجرذان ذات النظام الغذائي عالي الدهون بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات (A1، A2، وA3؛ ثلاثة فئران في كل مجموعة)، وكذلك في مجموعة النظام الغذائي الطبيعي (المجموعات B1، B2، وB3؛ ثلاثة فئران في كل مجموعة). بالنسبة للفئران في المجموعتين A1 وB1، تم إدخال إبر دقيقة نشطة في SERS في نقاط الوخز بالإبر بعد التخدير ولفها لمدة 20 دقيقة؛ تم تنفيذ نفس الإجراء للفئران في المجموعتين A2 وB2، باستثناء أن الإبر الدقيقة تم إدخالها على بعد 5 مم بجوار نقاط الوخز بالإبر. بالنسبة للفئران في A3 وB3، تم إدخال الإبر الدقيقة النشطة في SERS في نقاط الوخز بالإبر للفئران دون التواء؛ تركت الإبر في مكانها لمدة 20 دقيقة. تم إجراء الإبر مرتين يوميا، في الساعة 10:00 و15:00، لمدة 7 أيام. قبل كل إجراءات يومية، كان يستخدم جهاز قياس الجلوكوز لتسجيل قيم FPG لكل مجموعة من الفئران (بعد الصيام دون تقييد للماء لمدة 8 ساعات). بعد كل يوم من الوخز، تم قياس وتسجيل استجابات OC وRP. في اليوم السابع، بعد الوخز بالإبر، تم إجراء اختبار IPGTT على كل مجموعة من الفئران، وتم تسجيل قيم 2hPG.

التوصيف والقياس

تم فحص شكل الإبر الدقيقة النشطة في SERS باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تم الحصول على أطياف SERS عند 25 درجة مئوية، باستخدام مطياف رامان مهيأ بهدف عمل بعيد المدى 50× (NA: 0.5) وليزر 785 نانومتر. لجميع القياسات، كان وقت الاستحواذ 10 ثوان، وتم تشغيل نظام رامان بإعداد ليزري اسمي يبلغ 600 ميكروواط تحت نفس التكوين البصري. لم يتم قياس طاقة الليزر الفعلية التي ترسل على سطح النسيج بشكل مباشر في هذه الدراسة. لذلك، تم استخدام أطياف SERS للمقارنات النسبية بين المجموعات تحت بيئات اكتساب متطابقة، ولم يتم التوصل إلى استنتاجات بشأن السلامة الضوئية المطلقة للأنسجة. تم حساب نسب شدة مسبارين SERS باستخدام الطريقة التالية: تم تعيين نسبة قيم الشدة عند 1450 سم⁻¹ إلى 1500 سم⁻¹ كمؤشر للOC (I₁₄₅₀ سم⁻¹/I₁₅₀₀ سم⁻¹)، بعد طرح الشدة عند 1700 سم⁻¹ (كخلفية) من كل من القمتين. على التوالي، كما في التقارير السابقة ¹⁷؛ وباستخدام I₁₆₀₆ سم⁻¹/₁₆₆₆ سم⁻¹ كمؤشر على RP، تم طرح شدة 1700 سم^⁲ (كخلفية) من كل من القمتين على التوالي. تم تحليل القيم المحسوبة I₁₄₅₀ سم⁻¹/I₁₅₀₀ سم⁻¹ وI₁₆₀₆ سم−1/I₁₆₆₆ سم⁻¹ كمؤشرات نسبية مشتقة من SERS للاستجابات المرتبطة ب OC وRP على التوالي. تم استخدام هذه النسب لمقارنة التغيرات بين المجموعات ونقاط الزمنية تحت إعدادات اكتساب متطابقة.

لم يتم تحديد منحنى معايرة خارجي في هذه الدراسة لتحويل هذه النسب إلى تركيزات مطلقة من الأنواع المؤكسدة أو قيم التوكد الاختزالي الكهربائي المطلق. تم تسجيل كل طيف مرتين في خمس نقاط مختلفة على مسبار SERS في ثلاث عينات مكررة. تم استخدام Origin لمعالجة البيانات وإنتاج الخرائط. لتقليل التغيرات المرتبطة بالاكتساب، تم تطبيق نفس طول موجة الليزر، والهدف، وزمن الاكتساب، وضبط طاقة الليزر، وسير عمل المعالجة الطيفية على جميع المجموعات. لم يتم قياس التأثيرات الحرارية الضوئية أو الكيميائية الضوئية المحتملة الناتجة عن الإشعاع بالليزر بشكل مستقل وتم الاعتراف بها كقيد. تعرض البيانات الإحصائية كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). يتم تحديد حجم العينة والاختبار الإحصائي المستخدم لكل تجربة أو لوحة أرقام في الأسطورة المطابقة للأشكال المحددة. في تجارب التحقق من المجس خارج الجسم الحي ، تم استخدام مسبار SERS أو الإبرة الدقيقة المحضرة بشكل مستقل كوحدة تحليل. في تحليلات جلوكوز الدم داخل الجسم الحي ، استخدم الفأر كوحدة تحليل بيولوجي. تم التعامل مع الأطياف التي جمعت من نقاط متعددة على نفس المسبار كقياسات فنية وتم قياسها قبل التحليل على مستوى المجموعة. تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام برنامج SPSS. تم إجراء مقارنات بين المجموعات باستخدام الاختبارات الإحصائية المشار إليها في أساطير الشكل المقابل. تم تفسير قياسات سكر الدم الصائم المتسلسل ومؤشر SERS خلال فترة التدخل التي استمرت 7 أيام كاتجاهات طولية استكشافية بسبب صغر حجم المجموعة الفرعية، ولم يتم تطبيق نموذج رسمي للقياسات المتكررة أو التأثيرات المختلطة. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها p < 0.05. *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001.

النتائج

تصنيع الإبر الدقيقة النشطة في SERS للكشف عن OC وRP

لتحديد التغيرات في OC وRP، تم تصنيع إبر دقيقة نشطة في SERS تحتوي على المجسات المقابلة. أكدت صور SEM التمثيلية البنية ذات الأخدود المزدوج للإبر الدقيقة النشطة في SERS. يظهر الشكل 2A جسم إبرة الوخز بالإبر مع أخديدين محفورين، ويظهر الشكل 2B أخدودا محملا ب GNS، ويظهر الشكل 2C رؤية موسعة ل GNS موزعة داخل الأخدود. أكدت هذه الصور أن الأخاديد المحفورة يمكن أن تكون مواقع تحميل محلية لمجسات SERS المستجيبة ل OC وRP. تم استخدام نسبة شدة الذروة I₁₄₅₀ سم⁻¹/₁₅₀₀ سم⁻¹ لتمثيل درجة أكسدة p-PDA. يعرض الشكل 3A أطياف SERS ل p-PDA قبل وبعد التفاعل مع 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃، بينما يعرض الشكل 3B أطياف لمسبار الأكسدة والاختزال في 1 × 10⁻³ M NaBH4 و1 × 10-4 M HAuCl₄ المحاليل المائية. تم التعبير عن استجابة RP المجس كنسبة شدة قصوى (I₁₆₀₆ ^سم-1/₁₆₆₆ ^سم-1)، والتي انخفضت مع زيادة RP.

لتقييم انتقائية المسبار المستجيب للسعة التأكسدية، تم قياس نسبة I₁₄₅₀ سم⁻¹/I₁₅₀₀ ^سم-1 بعد التعرض لعوامل مختزلة ومؤكسدة مختلفة. تم إجراء قياسات مستقلة مع n = 3 لكل مجموعة، واستخدم مسبار SERS أو الإبرة المجهزة بشكل مستقل كوحدة تحليل (الشكل 3C). مقارنة بمجموعة CK (اختبار كروسكال–واليس تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدن)، لم تغير العوامل المختزلة FeSO₄ وNa₂SO₄ بشكل ملحوظ نسبة I₁₄₅₀ سم⁻¹/I₁₅₀₀ سم⁻¹ (p > 0.05). كما أنتج حمض الأسكوربيك (AA، p < 0.001) نسبة أعلى في حالة الاختبار الحالية، رغم أنه تم تضمينه كعامل مختزل. لذلك، تم تفسير استجابة AA بحذر كاستجابة طيفية خاصة بالمجس في هذا الاختبار القائم على المحلول، وليس كدليل على سلوك مؤكسد. على النقيض من ذلك، زادت الكواشف المؤكسدة أو المرتبطة بالأكسدة النسبة بدرجات متفاوتة. تم زيادة النسبة بعد التعرض ل CuSO₄ (p < 0.0001)، H₂O₂ (p < 0.0001)، FeCl₃ (p < 0.0001) وHAuCl₄ (p < 0.0001). لتقييم استقرار مسبار OC عند درجة حرارة الغرفة، تم الحصول على أطياف SERS على فواصل ساعة على مدى فترة 6 ساعات قبل تفاعل المسبار مع 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ (الشكل 3D)، وتم حساب نسب I₁₄₅₀ سم⁻¹/I₁₅₀₀ سم⁻¹ المقابلة. بعد امتصاص المجسات، بقيت القيمة الابتدائية مستقرة تقريبا عند 0.20 ± 0.02، كما حدث مع تفاعل FeCl₃ عند حوالي 0.9 ± 0.10، خلال فترة 6 ساعات. تشير هذه النتائج إلى أن p-PDA على GNS مستقر في الهواء.

استجابات OC وRP عند الوخز بالإبر ونقاط غير الوخز بالإبر

أظهرت الدراسات^{السابقة 29} أن مسبار OC يحقق أقصى استجابة له بعد 10 دقائق من الإدخال. توضح الأشكال 4A و B استجابة الإبر الدقيقة النشطة في SERS لدى الفئران السليمة الموضوعة في نقاط الوخز ST36 وRN12، وكذلك تلك الموضوعة على بعد 5 مم بجوار النقاط، لمدة 10 دقائق. في هذه التجارب، كان n = 3 فئران لكل مجموعة، وتم التعامل مع الأطياف المجمعة من نقاط متعددة على نفس المسبار كنسخ تقنية وتم قياسها قبل التحليل على مستوى المجموعة. استجابت الإبر الدقيقة النشطة في SERS بفعالية للتغيرات في OC وRP في الجسم، دون فرق كبير في OC وRP في مجموعة نقاط الوخز بالإبر مقارنة بمجموعة نقاط الوخز بالإبر (اختبار t عينات مستقلة، p > 0.05).

لتحديد تأثيرات التواء الإبر على OC وRP المحليين في الجسم الحي، تم إدخال إبر دقيقة نشطة في SERS في فئران سليمة عند نقاط الوخز ST36 وRN12، وعلى بعد 5 مم من هذه النقاط، إلى عمق 10 مم. خلال مناورة الالتواء على كل نقطة وخز بالإبر، تم فك الالتواء الإبرة المجاورة للنقطة، والعكس صحيح، وتم تسجيل تغييرات في قيم OC وRP عند نقطة الثقب (الأشكال 4C–F). لم تكن هناك تغييرات ذات دلالة إحصائية في التأثير الداخلي وRP حسب ما إذا كان الالتواء قد تم في نقاط الوخز بالإبر أو غير الوخز بالإبر في الفئران الأصحاء، كما لم يكن هناك أي تأثير للالتواء عند نقطة مجاورة (p > 0.05).

التغيرات في OC وRP لدى الفئران المصابة ب IGT مرتبطة بالعلاج بالإبر الصينية، ولف الإبر، والظروف الغذائية

لتأكيد نجاح إنشاء نموذج الفئران ل IGT، تم تسجيل قيم FPG و2hPG باستخدام اختبار IPGTT في فئران النموذج والجرذان الضابطة على التوالي. شملت مجموعة الضابطة n = 3 فئران، وشملت مجموعة النموذج n = 18 فأرا استوفوا المعايير المحددة مسبقا لضعف تحمل الجلوكوز. أظهرت فئران النموذج مستوى أعلى من مستوى السكر في الدم الصائم مقارنة بالفئران الضابطة (6.92 ملليمول/لتر مقابل 5.54 ملليمول/لتر؛ اختبار مان–ويتني U، الرقم < 0.01) وارتفاع نسبة السكر في الدم بعد التحضير ساعتين مقارنة بالفئران الضابطة (11.52 ملليمول/لتر مقابل 7.92 ملليمول/لتر؛ اختبار مان–ويتني U، الصفحة < 0.001) (الشكل 5)، يشير إلى نجاح استحث IGT في الحيوانات النموذجية.

للتحقق من تأثيرات مزيج نقاط الوخز بالإبر، والتواء الإبر، والظروف الغذائية على فئران IGT، تم اختيار مجموعة نموذجية من أزواج نقاط الوخز بالإبر. ثم تم تقسيم 18 فئرا نموذجيا مؤهلا إلى مجموعتين ذات نظام غذائي عالي الدهون ونظام غذائي طبيعي، حيث كان عدد n = 9 فئران لكل مجموعة غذائية. تم تقسيم كل مجموعة غذائية إلى ثلاث مجموعات فرعية للتدخل: التواء نقاط الوخز بالإبر، ولف موقع الوخز بالإبر غير المعتاد، والإدخال المباشر بنقطة الوخز بالإبر، مع n = 3 فئران لكل مجموعة فرعية. تم تسجيل قيم FPG قبل كل يوم من الإبر (الأشكال 6A–C)، وتم قياس قيم 2hPG (الشكل 6D) بعد 7 أيام من الإبر بواسطة اختبار IPGTT في كل مجموعة. في هذه المجموعة الاستكشافية، لم يلاحظ فرق واضح في FPG أو 2hPG بين مجموعات نموذج النظام الغذائي عالي الدهون والنظام الغذائي الطبيعي بعد الوخز عند نقاط الوخز بالإبر. أشارت المقارنات بين الوخز بنقطة الوخز بالإبر والوخز غير في موقع الوخز الإبر إلى أن التواء نقاط الوخز بالإبر مرتبط بانخفاض قيم جلوكوز الدم في ظل الظروف التجريبية الحالية (اختبارات t عينات مستقلة، p < 0.05). نظرا لأن حجم المجموعة الفرعية كان صغيرا ولم يكن بالإمكان فصل النظام الغذائي وموقع نقاط الوخز والتلاعب بالالتواء بشكل كامل إحصائيا، فقد فسرت هذه النتائج كملاحظات أولية لنماذج حيوانية.

تمت مراقبة التغيرات في مؤشرات SERS المرتبطة بسعة الأكسدة والتقليل من جهد الأكسدة خلال أسبوع واحد من التدخل بالإبر الصينية في فئران IGT. لهذه التحليلات، تم تضمين n = 3 فئران لكل مجموعة فرعية، وتم التعامل مع كل جرذ كوحدة تحليل بيولوجي. في فئران النظام الغذائي عالي الدهون، انخفض مؤشر SERS المرتبط بالقدرة التأكسدية مع مرور الوقت في مجموعتي التواء نقاط الوخز بالإبر والإدخال المباشر لنقاط الوخز بالإبر، بينما ظل أعلى نسبيا في مجموعة التواء مواقع الوخز غير المتعلقة بالإبر الصينية (الشكل 7A). ارتفع مؤشر SERS المرتبط بإمكانية الأكسدة مع مرور الوقت في مجموعتي التواء نقاط الوخز بالإبر والإدخال المباشر لنقاط الوخز بالإبر، في حين أظهرت مجموعة التواء مواقع الوخز بالإبر زيادة أضعف نسبيا (الشكل 7B). لوحظت اتجاهات مماثلة في فئران IGT ذات النظام الغذائي الطبيعي. انخفض مؤشر SERS المرتبط بالسعة المؤكسدة مع مرور الوقت في مجموعتي التواء نقاط الوخز بالإبر والإدخال المباشر في نقطة الوخز بالإبر، مع تغير أصغر في مجموعة التواء موقع الوخز بالإبر غير الوخز بالإبر (الشكل 7C). ارتفع مؤشر SERS المرتبط بالإكسلاد مع الاختزاز مع مرور الوقت في مجموعتي التواء نقاط الوخز بالإبر والإدخال المباشر لنقطة الوخز الصينية، بينما بقيت مجموعة التواء غير المموقع بالإبر أقل نسبيا (الشكل 7D).

ولمقارنة الظروف الغذائية تحت نفس التلاعب بالإبر الصينية، تمت مقارنة المجموعات الفرعية التي تتوى نقاط الوخز بالإبر من مجموعتي النظام الغذائي عالي الدهون والنظام الغذائي الطبيعي. في هذه المقارنة، انخفض مؤشر SERS المرتبط بسعة الأكسدة مع مرور الوقت في كلا الحالتين الغذائيتين، مع لوحظ انخفاض أكبر في مجموعة التواء نقاط الوخز بالإبر في النظام الغذائي الطبيعي بحلول اليوم السابع (الشكل 7E). ارتفع مؤشر SERS المرتبط بالأكسدة مع إمكانية الاختزاز مع مرور الوقت في كلا الحالتين الغذائيتين، مع قيمة أعلى في اليوم السابع في المجموعة الفرعية التي تعقد نقاط التواء الوخز بالإبر في النظام الغذائي الطبيعي (الشكل 7F). تشير هذه النتائج إلى أن التواء نقاط الوخز بالإبر وتطبيع النظام الغذائي كان مرتبطا بتغيرات في مؤشرات SERS المرتبطة بالأكسدة المحلية في فئران IGT. نظرا لأن كل مجموعة فرعية احتوت على ثلاثة فئران فقط ولم تجر اختبارات مستقلة للضغط التأكسدي الكيميائي الحيوي، يجب تفسير هذه النتائج كملاحظات استكشافية لنماذج حيوانية بدلا من الأدلة الكيميائية الحيوية الحاسمة على تحسن الإجهاد التأكسدي.

توفر البيانات:

تم تنظيم ورفع جميع البيانات الخام العددية المستخدمة في توليد الأشكال والتحليل الإحصائي، بما في ذلك قياسات سكر الدم، وقيم النسبة المشتقة من SERS، وبيانات المصدر للوحات الأرقام الكمية، كجدول تكميلي 1. بالنسبة لتجارب المراقبة المستمرة التي تولدها الأداة التحليلية مباشرة، يتم تضمين القيم المصدرة والمخرجات المولدة من الجهاز الممثلة المستخدمة لتقييم أداء المجس في الملف التكميلي 1.

الشكل 1: سير العمل المنهجي لتدخل الوخز بالإبر وتتبع SERS بنسبة النسبة المحلية باستخدام إبرة دقيقة نشطة ذات أخدود مزدوج. يوضح المخطط إدخال الإبرة الدقيقة ذات الأخدود النشطة في SERS في نقطة الوخز بالإبر أو موقع غير الوخز بالإبر المجاور، يليه اكتساب رامان الطيفي. أنشأ المؤلفون هذا الشكل باستخدام برنامج WPS، ولا يتطلب الأمر ترخيص حقوق نشر. الاختصارات: SERS = تشتت رامان المعزز على السطح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: صور SEM تمثيلية للإبر الدقيقة النشطة في SERS. (أ) جسم إبرة الوخز بالإبر يحتوي على أخدودين؛ شريط السلم = 200 ميكرومتر؛ التكبير = 77×. (ب) أخدود مدمج مع GNS؛ شريط السلم = 20 ميكرومتر; التكبير = 1000×. (ج) صورة مكبرة للأخدود في B؛ شريط السلم = 2 ميكرومتر؛ التكبير = 30,000×. الاختصارات: SEM = المجهر الإلكتروني الماسح؛ GNS = أسقف نانوية ذهبية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: توصيف مجسات SERS المستجيبة ل OC وRP. (أ) أطياف تطبيع p-PDA قبل وبعد التفاعل مع FeCl₃. (ب) أطياف SERS المطبعة لمجسات RP في حلول NaBH₄ و HAuCl₄ على التوالي. (C) I₁₄₅₀ سم⁻¹/I₁₅₀₀ ^سم-1 لمجسات OC في محاليل مؤكسدة ومختزلة مختلفة. n=3 قياسات مجسات مستقلة لكل مجموعة. اختبار كروسكال–واليس تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدن مقابل مجموعة CK. تعرض البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). (د) تقييم استقرار المجس المستجيب للOC لمدة ست ساعات قبل وبعد رد الفعل مع FeCl₃. الاختصارات: SERS = تشتت رامان المعزز على السطح؛ CK = فحص التحكم; p-PDA = p-فينيل نيديامين؛ AA = حمض الأسكوربيك. p < 0.001، ****p < 0.0001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: مؤشرات SERS المرتبطة ب OC وRP مقاسة بطرق إبر مختلفة في مواقع الوخز بالإبر وغير الوخز في الفئران السليمة. (أ) مؤشر SERS المرتبط بالأوكسيتي بعد الإدخال المباشر في نقاط الوخز بالإبر والمواقع غير المجاورة غير الوخز بالإبر. (ب) مؤشر SERS المرتبط ب RP بعد الإدخال المباشر في نقاط الوخز بالإبر والمواقع غير المجاورة للوخز بالإبر. (ج) مؤشر SERS المرتبط بالأوكسيسيد بعد الإدخال المباشر في مواقع غير الوخز بالإبر والتواء الإبر عند نقاط الوخز بالإبر. (د) مؤشر SERS المرتبط ب RP بعد الإدخال المباشر في مواقع غير الوخز بالإبر والتواء الإبر عند نقاط الوخز بالإبر. (ه) مؤشر SERS المرتبط بالأوكسيكيد بعد الإدخال المباشر عند نقاط الوخز بالإبر والتواء الإبر في المواقع غير المجاورة للوخز بالإبر. (و) مؤشر SERS المرتبط ب RP بعد الإدخال المباشر عند نقاط الوخز بالإبر والتواء الإبر في المواقع غير المجاورة للوخز بالإبر. تم حساب OC ك I₁₄₅₀ ^سم-1/I₁₅₀₀ ^سم-1، وRP كI₁₆₀₆ ^سم-1/_{1666 سم-1}. n=3 لكل مجموعة. تعرض البيانات كمتوسط ± متوسط المتوسط المتوسط (SEM). لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين المقارنات الزوجية. الاختصارات: OC = القدرة التأكسدية؛ RP = جهد الأكسدة والاختزال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: قيم FPG و2hPG وفقا لاختبار IPGTT في فئران النموذج والتحكم (CK). تم قياس FPG و2hPG للتحقق من تأسيس نموذج الفئران الضعيف في تحمل الجلوكوز. n = 3 فئران في مجموعة التحكم وn = 18 فأرا في مجموعة النموذج. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة اختبار مان–ويتني U، وتعرض النتائج كمتوسط ± SEM. **p < 0.01، ***p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: قيم FPG و2hPG لفئران IGT أثناء إجراءات الوخز بالإبر. (A) قيم FPG للمجموعة التي تتلقى الوخز بالإبر مع التواء الإبر عند نقاط الوخز بالإبر وإدخال الإبر مباشرة عند نقاط الوخز (n = 3 لكل مجموعة). (B) قيم FPG للمجموعة التي تتلقى الإبر مع التواء عند نقاط الوخز بالإبر ونقاط غير الوخز بالإبر (n = 3 لكل مجموعة). (ج) قيم FPG للنظام الغذائي عالي الدهون والنظام الغذائي الطبيعي (n = 3 لكل مجموعة). (د) اليوم السابع قيم 2hPG في فئران النظام الغذائي عالي الدهون والنظام الغذائي الطبيعي تحت ظروف التواء نقاط الوخز بالإبر، ولف مواقع الوخز بالإبر غير الوخزية، والإدخال المباشر لنقاط الوخز بالإبر. (n = 3 لكل مجموعة). تعرض النتائج كمتوسط ± SEM. تم تحليل المقارنات الزوجية المخطط لها في اللوحة D باستخدام اختبار t للطالب ذو الذيلين غير المقوون. *p < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: التغيرات في OC وRP للفئران في كل مجموعة خلال أسبوع واحد من العلاج بالإبر. (أ) التغيرات في الألياف الصبغية في فئران IGT عالية الدهون. (ب) التغيرات في RP في فئران IGT عالية الدهون. (ج) تغيرات في الصبغة الصبغية في فئران IGT في النظام الغذائي العادي. (د) تغيرات في RP في فئران IGT في النظام الغذائي الطبيعي. (ه) مقارنة مؤشر SERS المرتبط ب OC بين حالات النظام الغذائي عالي الدهون والنظام الغذائي الطبيعي ضمن مجموعة التواء نقاط الوخز بالإبر؛ (و) مقارنة مؤشر SERS المرتبطة ب RP بين حالات النظام الغذائي عالي الدهون والنظام الغذائي الطبيعي ضمن مجموعة التواء نقاط الوخز بالإبر. n = 3 فئران لكل مجموعة فرعية. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM. تم تفسير القياسات التسلسلية كاتجاهات طولية استكشافية. الاختصارات: OC = القدرة التأكسدية؛ RP = جهد الأكسدة والاختزال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف الإضافي 1: مخرجات ممثلة من الأدوات لتقييم استجابة المجس. يحتوي هذا الملف على مخرجات مراقبة مستمرة ممثلة يتم توليدها مباشرة بواسطة الجهاز التحليلي وتستخدم لتقييم أداء استجابة المجس. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: جدول البيانات الخام للتحليلات الكمية. يحتوي هذا الملف على بيانات المصدر العددية المستخدمة في توليد الأشكال والتحليل الإحصائي، بما في ذلك قياسات جلوكوز الدم، وقيم النسبة المشتقة من SERS، وبيانات لوحات الأشكال الكمية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يمثل ضعف تحمل الجلوكوز مرحلة انتقالية قابلة للعكس قبل السكري من النوع الثاني، ويرتبط ارتباطا وثيقا باختلال الأيض، ومقاومة الأنسولين، واضطراب التنظيم المرتبط بالإجهاد التأكسدي. يمكن لتدخل نمط الحياة والاستراتيجيات العلاجية المبكرة الأخرى تقليل خطر التقدم الناتج عن ضعف تحمل الجلوكوز إلى السكري، لكن الأدوات لمراقبة الاستجابات الكيميائية الحيوية المحلية ديناميكيا أثناء التدخل لا تزال محدودة³⁰. تم الإبلاغ عن تأثير الوخز بالإبر الصينية على استقلاب الجلوكوز والمسارات المرتبطة بالإجهاد التأكسدي في الدراسات التجريبية والسريرية. ومع ذلك، تعتمد معظم الدراسات الميكانيكية للوخز بالإبر على قياسات الدم أو الأنسجة في النقطة النهائية، وتسمح الطرق القليلة نسبيا بتتبع استجابات محلية مرتبطة بالأكسدة والاختزاز بشكل طفيف التوغل أثناء التدخل في الوخز بالإبر. أكدت التجارب السريرية السابقة لعلاجات IGT أن خطر الإصابة بالسكري يمكن تقليله بشكل كبير من خلال تدخلات نمط الحياة، بما في ذلك تعديلات غذائية، وتقليل كتلة الجسم، وزيادة النشاط البدني³¹. لقد ثبت أن العلاج بالإبر الصينية فعال في تحسين مؤشرات أيض الجلوكوز وخفض الصيام و2hPG. لذلك، قد يوفر توضيح العلاقة بين الوخز بالإبر الصينية، والأكسدة والاختزال، وIGT طرقا لعكس IGT أو التدخل في تقدمه، مما يقلل من حدوث السكري، بالإضافة إلى توفير رؤية لأمراض IGT والآليات الكامنة وراء تطوره.

تقترح الدراسة الحالية منصة ميكرونيبرية نشطة مع تشتت السطح مع رامان ذات الأخدود المزدوج الحساسة للأكسدة والاختزال لتعزيز السطح، لدمج تدخل الوخز بالإبر مع تتبع SERS النسبي المحلي في نموذج فئران لضعف تحمل الجلوكوز. في هذا النظام، تم استخدام أخدودين محفورين على إبرة الوخز بالإبر لحمل مجسات تستجيب لسعة الأكسدة وقادرة على الاختزاز لجهد الأكسدة. سمح هذا التصميم لإبرة الوخز بالإبر بالعمل ليس فقط كأداة تدخل، بل أيضا كناقل استشعار للقراءات البصرية المرتبطة بالأكسدة والاختزاز المحلية نسبيا. أظهرت النتائج أن الوخز عند نقاط الوخز بالإبر مع الالتواء كان مرتبطا بانخفاض مستويات السكر في الدم الصائم وقيم 2hPG، ومع تغيرات في مؤشرات SERS المرتبطة بسعة الأكسدة ومؤشرات التوكد الاختزالي في الفئران ذات التحمل الضعيف للجلوكوز. تدعم هذه النتائج جدوى استخدام الإبر الدقيقة النشطة في SERS لاستكشاف الاستجابات المحلية المرتبطة بالأكسدة أثناء التدخل في الوخز الصيني. بشكل عام، تشير النتائج إلى أن الوخز عند نقاط الوخز بالإبر مع الالتواء كان مرتبطا بانخفاض قيم FPG و2hPG وتغيرات في مؤشرات SERS المرتبطة ب OC وRP لدى فئران IGT. تدعم هذه النتائج جدوى استخدام الإبر الدقيقة النشطة في SERS لمتابعة الاستجابات البصرية المحلية المرتبطة بالأكسدة والاختزاز أثناء التدخل في العلاج بالإبر الصينية. ومع ذلك، ونظرا لعدم إجراء اختبارات الإجهاد التأكسدي الكيميائية الحيوية، وتحليل التسرب المجس، واختبارات التوافق الحيوي للأنسجة، فلا ينبغي تفسير التغيرات الملحوظة في مؤشر SERS كدليل كيميائي حيوي قاطع على تحسن الإجهاد التأكسدي.

يمكن استخدام عدة طرق بديلة لمزيد من التحقيق في نفس الفرضية. يمكن استخدام اختبارات الإجهاد التأكسدي الكيميائي الحيوي القياسية، بما في ذلك قياسات أنواع الأكسجين التفاعلية، والمالونديالديهايد، وإنزيم الأكسجين الفائق، والكاتالاز، وغلوتاثيون بيروكسيديز، ونسب الجلوتاثيون/الجلوتاثيون ثنائي الكبريتيد، للتحقق مما إذا كانت التغيرات في مؤشرات SERS المشتقة من SERS تتوافق مع مؤشرات الإجهاد التأكسدي التقليدية^32,33. قد توفر مجسات الأكسدة الاختزال الكهروكيميائية، وأجهزة استشعار الأكسدة والاختزاز المعتمدة على الفلورة، واختبارات التلميع الكيميائي، والغسيل الميكروي يتبعه التحليل الكيميائي الحيوي، والتحقق الكيميائي المناعي أو النسجي القائم على الأنسجة معلومات تكميلية. إن دمج استشعار الإبر الدقيقة النشطة في SERS مع هذه الأساليب المستقلة سيساعد في تحديد ما إذا كانت التغيرات البصرية المرصودة تعكس تغييرات كيميائية حيوية محددة في الأكسدة أو استجابات أنسجة محلية أوسع للخز والحالة الأيضية³⁴.

تمتد التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة إلى ما هو أبعد من نموذج تحمل الجلوكوز الضعيف الحالي. نظرا لأن اختلال الأكسدة والاختزاز مرتبط بأمراض الأيض، وإصابة الأنسجة، والالتهابات، وإصلاح الجروح، قد توفر الإبر الدقيقة النشطة في SERS أداة مفيدة قبل السريرية لمراقبة الاستجابات المحلية المرتبطة بالأكسدة والاختزال في نماذج السكري، ودراسات شفاء الجروح، ونماذج الأمراض الالتهابية، وغيرها من بيئات التدخل طفيفة التوغل³⁵. في أبحاث الوخز بالإبر، قد تكون المنصة مفيدة لمقارنة نقاط الوخز بالإبر، ومواقع الوخز بالإبر، والتلاعب المختلف بالإبر، وجداول التدخل المختلفة. ومع ذلك، تظل هذه التطبيقات استكشافية وتتطلب المزيد من التحقق التقني والبيولوجي.

يجب ملاحظة عدة قيود. أولا، تم حساب قراءات OC وRP كمؤشرات نسبية مشتقة من SERS ولم تتم معايرتها مع تركيزات الأنواع المؤكسدة القياسية أو قيم التوكد الاختزالي الكهروكيميائي المطلق. لذلك، يجب تفسير النتائج الحالية كاستجابات بصرية مرتبطة بالأكسدة الاختزالية تحت ظروف اكتساب متطابقة بدلا من قياسات كيميائية حيوية مطلقة. ثانيا، قد تدخل البيئة الدقيقة للنسيج البيولوجي مصادر إضافية لتغير الإشارة، بما في ذلك تغيرات الرقم الهيدروجيني المحلي، وامتصاص البروتين، ومكونات المصفوفة خارج الخلية، وتأثيرات مصفوفة أخرى. لم يتم تقييم هذه العوامل بالكامل في الأوساط التي تحتوي على المصل أو تحاكي الأنسجة. ثالثا، لم يتم قياس طاقة الليزر الفعلية التي ترسل إلى سطح النسيج وتغير درجة الحرارة المحلي أثناء اكتساب رامان بشكل مباشر؛ لذلك، لا يمكن استبعاد التأثيرات الحرارية الضوئية أو الكيميائية الضوئية المحتملة تماما. رابعا، لم يتم تقييم قابلية تكرار هندسة الأخدود وتحميل المجسات على مستوى الدفعات من خلال تصوير SEM متعدد الإبر أو تحليل كفاءة التحميل. وأخيرا، لم تجر اختبارات التحقق الكيميائي المستقل من الميدان، وتحليل الغسل بالمجسات، واختبارات التوافق الحيوي المحلية. يجب أن تحدد الدراسات المستقبلية منحنيات معايرة في المصفوفات ذات الصلة بيولوجيا، وتربط مؤشرات SERS باختبارات الإجهاد التأكسدي والأكسدة الاختزالية القياسية، وقياس كمية التسرب المجس، وتقييم توافق الأنسجة المحلية بعد الإدخال المتكرر، والتحقق من صحة الجهاز في مجموعات حيوانية أكبر. قد توفر الإبر الدقيقة النشطة ب SERS منصة مفيدة لدمج تدخل الوخز بالإبر مع تتبع SERS بنسبة نسبية لمؤشرات الأكسدة المحلية المرتبطة بالأكسدة في نموذج جرذان IGT قبل السريري. تتطلب الدراسات الإضافية للمعايرة، والتحقق الكيميائي الحيوي، وتقييم الترشيح بالمجسات، ودراسات التوافق الحيوي قبل المطالبة بالمراقبة الكمية المطلقة أو التطبيق الانتقالي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	شركة تيانجين هيونز للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%)	شركة تيانجين هيونز للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	M742544
حمض الأسكوربيك	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	CFAD310554
مقياس نسبة السكر في الدم	شركة Cofoe للتكنولوجيا الطبية المحدودة	Cofoe A03
شرائط اختبار نسبة السكر في الدم	شركة Cofoe للتكنولوجيا الطبية المحدودة	Cofoe-A03-C
كبريتات النحاس (CuSO4)	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	PHR1477
إيثيل الكحول (≥99.7%)	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	XW00641752
كبريتات الحديدوز (FeSO4)	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	XW01772078701
الجلوكوز (Glu)	شركة تيانجين هيونز للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	D9434
بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	P-17-0500
كلوريد الحديد (FeCl3)	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	CP81015228
الميثيل ميثاكريليت (MMA)	شركة شانغهاي ألدين للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	M109626
مكروسكوب رامان	Renishaw	InVia Raman Microscope
الفينيلين ثنائي الأمين (p-PDA)	شركة شانغهاي TCI للتنمية الصناعية الكيميائية المحدودة	P128784
بولي ميثيل ميثاكريليت (PMMA)	شركة تيانجين هيونز للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	P742581
مجهر إلكتروني ماسح	Zeiss	ULTRA Plus
بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4)	شركة شانغهاي أداما بيتا للكواشف المحدودة	S432207
سلفات الصوديوم (Na2SO4)	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة	S572396
إبر الوخز بالإبر من الفولاذ المقاوم للصدأ	شركة سوتشو تيانكسي لصناعة أدوات الوخز بالإبر المحدودة	X-20-03
برنامج التحليل الإحصائي	شركة International Business Machines Corporation	الإصدار 2021
الستربتوزوتوسين (STZ)	شركة شانغهاي ألدين للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	S408311
حمض التترا كلورو الذهبي (HAuCl4)	شركة تيانجين هيونز للتكنولوجيا الحيوية والكيميائية المحدودة	A124024
برنامج SPSS	شركة International Business Machines Corporation, Armonk, ولاية نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية	الإصدار 26.0
الجرذان	شركة Jiangsu Qinglongshan للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	ذكور Sprague-Dawley خالية من مسببات الأمراض المحددة
العلاقة الأساسية	Anuokang Biotech.	SY10001
الشحم	MCE	HY-W127601
سكروز	MCE	HY-B1779
مسحوق صفار البيض	MCE	HY-B2235B
حمض الستريك أحادي الهيدرات	Sigma-Aldrich	C1909
سيترات ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدرات	Sigma-Aldrich	S4641
محلول السيترات العازل	beyotime	P0086
محلول فوسفات عازل	beyotime	ST448-1L
الأيزوفلورين	Bioss	D54468
نظام التخدير بالأيزوفلورين للحيوانات الصغيرة	RWD Life Science	R500
غرفة التخدير وقناع الأنف	RWD Life Science	R500compatible accessories
وسادة التدفئة	شركة شانغهاي Yuyan للعلوم الحيوية	Y69020
إيثانول 75%	Boyu Bio.	YB60401
غرفة التخدير بغاز CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	شركة Beijing Kingsoft Office Software	WPS365