بروتوكول مُحسَّن لنموذج تضيق الصمام الأبهري المستحث بسلك توجيه في الفئران

Yaoyu Zhang; Jing Zhou; Yanjiani Xu; Shuang Liu; Fangyang Huang; Jialiang Zhang; Mao Chen

doi:10.3791/72218

مقالة منهجية

بروتوكول مُحسَّن لنموذج تضيق الصمام الأبهري المستحث بسلك توجيه في الفئران

DOI:

10.3791/72218

⸱

أغسطس 21, 2026

Yaoyu Zhang^*¹^,²^,³ , Jing Zhou^*¹^,²^,³ , Yanjiani Xu^*¹^,²^,³ , Shuang Liu¹^,²^,³ , Fangyang Huang¹^,²^,³ , Jialiang Zhang¹^,²^,³ , Mao Chen¹^,²^,³

¹Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, ²Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, ³Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول نموذجاً مُحسَّناً لتضيق الصمام الأبهري المستحث بسلك توجيه في الفئران من سلالة C57BL/6. تتيح منصة دعم وعائية مطبوعة ثلاثية الأبعاد ومصممة خصيصاً التحكم الدقيق في النزيف، مما أدى إلى تحقيق نسبة بقاء بلغت 95% خلال 24 ساعة (19/20) ونسبة نجاح إجمالية للنموذج بلغت 90% عند الأسبوع الرابع (18/20).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تضيق الصمام الأبهر (AVS) مرضاً قلبياً وعائياً رئيسياً يزداد انتشاره بين السكان المسنين، ومع ذلك فإن ندرة أنسجة الصمامات المصابة تحد بشكل كبير من الدراسات الميكانيكية وتطوير العلاجات. يضع هذا البروتوكول ويحسن نموذجاً قابلاً للتكرار من الفئران المصابة بتضيق الصمام الأبهر عبر تطوير طريقة إصابة الصمام المستحثة بسلك التوجيه الخاص بـ Honda من خلال التحكم في النزيف. تخضع ذكور وإناث الفئران من سلالة C57BL/6 لإصابة في الصمام الأبهر مستحثة بسلك توجيه؛ وقد تم تحسين هذا الإجراء باستخدام منصة دعم وعائية مخصصة مطبوعة ثلاثية الأبعاد تحقق تحكماً دقيقاً في النزيف أثناء إدخال وسحب سلك التوجيه. وتشمل مقاييس النتائج معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 24 h، والتقييم بالموجات فوق الصوتية للقلب (echocardiographic assessment) عند الأسبوع الرابع، والتحقق النسيجي المرضي. يحقق البروتوكول المحسن معدل بقاء بنسبة 95% لمدة 24 h (19 من أصل 20 حيواناً)؛ ومن بين الناجين، حقق 94.7% (18 من أصل 19) معيار النجاح الديناميكي الدموي المحدد مسبقاً عند الأسبوع الرابع، مما أدى إلى معدل نجاح إجمالي للنموذج بنسبة 90% (18 من أصل 20 حيواناً)، وهو ما تم تأكيده عبر تخطيط صدى القلب والتحليل النسيجي. يوفر هذا النموذج الموحد منصة موثوقة وقابلة للتكرار لاستقصاء آليات تنكس الصمام وتقييم التدخلات العلاجية المرشحة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال مرض صمامات القلب يشكل عبئاً صحياً كبيراً في كل من الدول المتقدمة والنامية، مع ارتفاع معدلات الانتشار بالتوازي مع شيخوخة السكان¹. ورغم أن عملية زراعة الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVI) قد أحدثت تحولاً في علاج تضيق الصمام الأبهري الشديد²^,³، إلا أن الآليات الخلوية والجزيئية التي تؤدي إلى تنكس الصمام لا تزال غير مفهومة بشكل كامل، ولا يوجد علاج دوائي معتمد لإبطاء تطور المرض أو عكس مساره⁴^,⁵. وتتمثل إحدى العقبات الرئيسية في أبحاث أمراض الصمامات في محدودية توفر الأنسجة المصابة للفحص⁶^,⁷؛ حيث يصعب الحصول على عينات من الصمام الأبهري البشري بكميات كافية، كما أن النماذج الحيوانية التي تحاكي التغيرات المرضية في الصمام بدقة كانت نادرة بالمثل⁸. وقد دفعت هذه الفجوة إلى بذل جهود مستمرة لتطوير نماذج حيوانية تعيد إنتاج الميزات الهيموديناميكية والنسيجية لتضيق الصمام الأبهري (AVS).

تتطلب النهج الغذائية التقليدية، مثل التغذية عالية الدهون لفترات طويلة في فئران ApoE⁻/⁻، فترة تتراوح بين 20 و24 أسبوعاً، وتؤدي إلى معدلات نجاح منخفضة، حيث تطور أقلية فقط من الحيوانات نمطاً ظاهرياً تضيقياً محدداً⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². وقد عالج نموذج إصابة الصمام الناتج عن سلك التوجيه الذي وصفه Honda وزملاؤه العديد من هذه القصور من خلال إحداث إصابة ميكانيكية في شرفات الصمام عبر الوصول إلى الشريان السباتي¹³. وتتضمن التقنية الأصلية تشريح الشريان السباتي، وتمرير سلك التوجيه عكسياً إلى الصمام الأبهر، وكشط الشرفات بشكل متكرر، وتدوير السلك؛ مما ينتج عنه تغيرات هيموديناميكية سريعة خلال أيام ونمط ظاهري تضيقي مستقر بحلول الأسبوع الرابع¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. وبسبب سرعتها ومباشرتها النسبية، تم اعتماد طريقة Honda على نطاق واسع في أبحاث الصمامات الحديثة. ومع ذلك، لا تزال هناك عدة فجوات مهمة؛ حيث لم يتم توثيق التفاصيل الإجرائية الكاملة بشكل وافٍ في المراجع العلمية، وتفتقر العملية إلى التوحيد القياسي بين المختبرات، كما لم يتم التطرق بشكل منهجي إلى دور السيطرة على النزيف، وهو محدد رئيسي للمراضة في الفترة المحيطة بالجراحة في هذا النموذج. وتؤدي هذه التناقضات إلى تقليل قابلية إعادة إنتاج النتائج وتحد من إمكانية التطبيق السريري.

لقد افترض الباحثون أن التحسين المنهجي للسيطرة على النزيف يمكن أن يحسن بشكل ملموس من معدلات البقاء على قيد الحياة في الفترة المحيطة بالجراحة ومن موثوقية النموذج. يقدم هذا البروتوكول نهجاً مُنقحاً وموحداً يعتمد على طريقة Honda من خلال إدخال منصة دعم وعائية مصممة خصيصاً ومطبوعة بتقنية ثلاثية الأبعاد. يتيح هذا الجهاز إمكانية ضبط الشد الطولي على الشريان السباتي، مما يوفر إرقاءً مؤقتاً كاملاً أثناء إدخال سلك التوجيه وسحبه دون سحق الوعاء الدموي. ومن خلال هذا النهج، يحقق البروتوكول المُحسَّن معدل بقاء بنسبة 95% لمدة 24 h (19 من أصل 20 حيواناً)؛ ومن بين الناجين، حققت نسبة 94.7% (18 من أصل 19) معايير النجاح الديناميكي الدموي المحددة مسبقاً عند مرور 4 أسابيع، مما أدى إلى معدل نجاح إجمالي للنموذج بنسبة 90% (18 من أصل 20 حيواناً). كما تم توفير توثيق إجرائي خطوة بخطوة لتسهيل إعادة إنتاج التجربة في المختبرات المختلفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة في هذا البروتوكول وفقاً لدليل الرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية، وقد تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في مستشفى غرب الصين (بروتوكول رقم 20240311055). تم استخدام ذكور الفئران من سلالة C57BL/6 (بعمر 8–10 أسابيع؛ وبوزن 22–25 g تقريباً) وإناث الفئران من سلالة C57BL/6 (بعمر 8–10 أسابيع؛ وبوزن 18–20 g تقريباً) طوال فترة الدراسة. جميع المواد والكواشف والأدوات والبرامج والأجهزة المخصصة المستخدمة في هذا البروتوكول، بما في ذلك منصة دعم الأوعية الدموية المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمخصصة، مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير قبل العملية والشق الجراحي

خدر الفأر باستخدام الإيزوفلوران (3% للحث، و1.5–2% للمحافظة) المبخر في أكسجين 100%. تحقق من عمق التخدير الكافي من خلال التأكد من غياب منعكسات سحب القدم (قرص إصبع القدم).
تنبيه: الإيزوفلوران مخدر متطاير. استخدمه مع نظام سحب نشط أو في منطقة جيدة التهوية، وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، واتبع إجراءات السلامة المؤسسية.
ضع مرهم العين في كلتا العينين. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري على منصة جراحية منظمة الحرارة ومثبتة عند 37 °C.
جهز الحقل الجراحي بإزالة الشعر من المنطقة الرقبية الأمامية باستخدام كريم كيميائي لإزالة الشعر.
طهر الجلد بثلاث دورات متبادلة من بوفيدون-أيودين (أو كلورهيكسيدين) وكحول 70% (أو محلول ملحي معقم دافئ)، مع الإنهاء بالمطهر.
قم بحقن ليدوكائين 0.5% تحت الجلد على طول خط الشق المخطط له لتسكين الألم الموضعي الاستباقي.
ثم قم بإجراء شق جلدي طولي في الخط المتوسط (حوالي 1.0–1.5 cm) في الجزء الأمامي من الرقبة، بحيث يكون موقعه إلى يمين الخط المتوسط للرغامي قليلاً، باستخدام مقصات دقيقة.
تنبيه: قد تسبب المقصات الدقيقة والإبر والأسلاك الموجهة والأدوات الحادة الأخرى إصابات. تعامل معها بحذر وتخلص من الأدوات الحادة المستخدمة في حاويات الأدوات الحادة المعتمدة.

2. عزل الوعاء الدموي ووضع الغرز

باستخدام مجهر ستيريو جراحي، يتم كشف الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) عن طريق التشريح غير الحاد عبر طبقات اللفافة والعضلات التي تعلوه. افصل الشريان السباتي المشترك الأيمن بعناية عن العصب المبهم المجاور والأنسجة الضامة المحيطة، مع الحرص على تجنب التهيج الميكانيكي للعصب المبهم.
ملاحظة: حافظ على رطوبة الغدد اللعابية والأنسجة المكشوفة باستخدام محلول ملحي معقم دافئ طوال فترة الإجراء لمنع الجفاف.
قم بربط الطرف القاصي للشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) بشكل دائم باستخدام خيط حريري 6-0 مربوط بعقدة محكمة غير قابلة للانزلاق.
ضع عقدة انزلاقية رخوة من خيط حريري 6-0 حول الجزء الداني من الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA)، مع تركها غير مشدودة لاستخدامها لاحقاً أثناء إدخال السلك الموجه.

3. تطبيق المنصة وبضع الشريان

ملاحظة: قبل الجراحة، قم بتعقيم المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين (EtO)، متبوعاً بتهوية كافية، وقم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية المعدنية عن طريق autoclave.

تحذير: أكسيد الإيثيلين مادة سامة وقابلة للاشتعال ومسرطنة. استخدم التعقيم بـ EtO فقط في المرافق المعتمدة، مع السماح بتهوية كافية، واتباع إجراءات المؤسسة الخاصة بالتخلص من النفايات.

أدخل منصة دعم الأوعية الدموية المطبوعة ثلاثية الأبعاد بعناية أسفل الجزء المعزول من الشريان السباتي الأصيل الأيمن (RCCA)، مع وضع القمة التي على شكل حرف V مقلوب مباشرة تحت الوعاء الدموي.
اضبط المنصة ببطء لزيادة الشد الطولي على الـ RCCA عن طريق تعشيق الغرز الموضوعة مسبقاً في الحزوز الجانبية الأعلى تدريجياً.
ملاحظة: تم تصميم القمة التي على شكل حرف V مقلوب بزاوية 120° لتتلاءم مع انحناء الوعاء الدموي دون سحق الجدار. توقف عن زيادة الشد عند النقطة التي لا يصبح فيها النبض الشرياني مدركاً بصرياً. تضمن هذه النهاية البصرية الحرجة تحقيق إرقاء مؤقت دون إلحاق إصابة مفرطة بالوعاء الدموي.
أجرِ شقاً شريانياً مستعرضاً صغيراً (حوالي نصف محيط الوعاء) في جزء الـ RCCA المثبت باستخدام مقصات دقيقة. يجب أن يحدث نزيف ضئيل أو لا يحدث نزيف على الإطلاق إذا تم ضبط الشد بشكل صحيح.

4. إدخال سلك التوجيه وإصابة الصمام

تحت الرؤية المجهرية، أدخل السلك الدليل (بقطر 0.014 inch / 0.36 mm) في التجويف الشرياني عبر الشق الشرياني المستعرض في اتجاه تراجعي نحو جذر الأبهر.
ملاحظة: هذا القطر هو المعياري في نماذج إصابات السلك الدليل المنشورة ويقارب قطر تجويف الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) في الفئران (~0.4–0.5 mm)، مما يعطي نسبة سلك دليل إلى وعاء تبلغ حوالي 0.7–0.9.
تنبيه: يمكن للسلك الدليل أن يثقب الأوعية أو الأنسجة المحيطة. قم بدفعه ببطء تحت الرؤية المجهرية وتخلص من الأسلاك الدليلة المستخدمة كأدوات حادة أو نفايات جراحية ملوثة.
أحكم ربط العقدة المنزلقة القريبة الموضوعة مسبقاً حول كل من الوعاء والسلك الدليل لتحقيق إرقاء تام في موقع الإدخال. وبمجرد تأمين العقدة المنزلقة، قم بإزالة المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد بعناية من أسفل الوعاء.
ملاحظة: إذا حدث نزيف غير متوقع أثناء الإدخال، أو إذا تسبب قطر السلك الدليل في احتكاك مفرط، قم بإعادة وضع المنصة مؤقتاً للمساعدة في الإرقاء، أو قلل شد المنصة قليلاً للسماح بتوسع تجويف الوعاء قبل إعادة محاولة الإدخال.
ادفع السلك الدليل بعناية في اتجاه تراجعي عبر RCCA، مروراً بقوس الأبهر، ونحو الصمام الأبهري. وتحت توجيه تخطيط صدى القلب في الوقت الفعلي، تأكد من أن طرف السلك الدليل قد عبر الصمام الأبهري ودخل البطين الأيسر.
مع إحكام ربط العقدة المنزلقة القريبة تماماً للحفاظ على الإرقاء، قم بإجراء إصابة الصمام الميكانيكية عن طريق تنفيذ 100 حركة دفع وسحب (ذهاباً وإياباً) عبر الصمام الأبهري، تليها 100 حركة دورانية للسلك الدليل مقابل وريقات الصمام.
ملاحظة: تم تحديد 100 حركة دفع وسحب و100 حركة دورانية من خلال تحسينات داخلية مكثفة باعتبارها الأعداد التي تحقق أفضل توازن بين وقت الإجراء والحث الموثوق لتضيق ذو دلالة ديناميكية دموية.

5. سحب سلك التوجيه وإغلاق الجرح

بعد الانتهاء من إحداث إصابة الصمام، اسحب سلك التوجيه ببطء من الوعاء الدموي.
قم على الفور بتحويل العقدة المنزلقة القريبة إلى عقدة دائمة غير منزلقة لربط الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) القريب ومنع أي نزيف بعد الإجراء.
أغلق شق الجلد باستخدام غرز نايلون 5-0 متقطعة أو مشابك جراحية للجروح.
لا تعطِ الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDs) بعد العملية. ولا تعطِ المضادات الحيوية في الفترة المحيطة بالجراحة، حيث يتم إجراء العملية في ظروف معقمة.
انقل الحيوان إلى قفص تعافي نظيف ودافئ، وراقبه باستمرار حتى يستعيد القدرة الكاملة على الحركة.

6. التقييم بالموجات فوق الصوتية للقلب للديناميكا الدموية عبر الصمام

إجراء تقييمات تخطيط صدى القلب لجميع الفئران الناجية بعد 4 أسابيع من الجراحة لتقييم شدة تضيق الصمام الأبهري.
تحفيز التخدير بوضع الحيوان في غرفة تحريض تحتوي على 3% isoflurane في 100% أكسجين. التأكد من عمق التخدير عبر التحقق من فقدان منعكسات سحب القدم. إزالة الشعر من الجدار الأمامي للصدر باستخدام كريم كيميائي لإزالة الشعر. وضع مرهم عيني على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
نقل الفأر المخدر إلى منصة تصوير منظمة الحرارة في وضع الاستلقاء الظهري.
تثبيت القوائم بأقطاب تخطيط كهربائية القلب (ECG) السطحية للمراقبة المستمرة لمعدل ضربات القلب. معايرة تركيز isoflurane (عادةً 1.0–1.5%) للحفاظ على معدل ضربات قلب فسيولوجي مستقر يتراوح بين 450–550 beats per min.
تنظيف الجدار الأمامي للصدر ووضع طبقة سخية من هلام الاقتران الصوتي المسخن مسبقاً.
اكتساب صور وضع B-mode
1. باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية Vevo 3100 مع محول طاقة MX550D (40 MHz)، اضغط على تحكم B-Mode لبدء التصوير الحي ثنائي الأبعاد.
2. وضع محول الطاقة في الموضع الجانبي بجانب القص للحصول على عرض المحور الطولي بجانب القص للبطين الأيسر، والصمام الأبهري، والشريان الأبهري الصاعد. تحسين العمق، والعرض، وكسب 2D gain.
اكتساب وضع M-mode وقياس البطين الأيسر
1. من عرض المحور الطولي بجانب القص، اضغط على تحكم M-Mode. وضع خط أخذ العينات عبر البطين الأيسر عند مستوى العضلات الحليمية.
2. الضغط على Start لبدء الاكتساب. بمجرد الحصول على تتبع مستقر يغطي ثلاث دورات قلبية على الأقل، اضغط على Save.
3. في برنامج Vevo LAB، استخدم أداة LV Trace لتتبع شغاف القلب عند نهاية الانبساط ونهاية الانقباض، وتسجيل الأبعاد الداخلية للبطين الأيسر، وسماكة الجدار الأمامي والخلفي (LVAWd, LVPWd)، وكتلة البطين الأيسر.
إعادة وضع وتوجيه محول الطاقة لاكتساب عرض مخصص للقوس الأبهري.
ملاحظة: يعد الحصول على هذا العرض المحدد للقوس الأبهري أمراً ضرورياً لقياسات السرعة عبر الصمام بدقة، حيث يضمن المحاذاة المثلى لحزمة الموجات فوق الصوتية مع اتجاه تدفق الدم عبر الصمام الأبهري.
تقييم Doppler الملون
1. من عرض القوس الأبهري، اضغط على تحكم Color. وضع مربع اللون فوق الصمام الأبهري والجزء القريب من الشريان الأبهري الصاعد.
2. ضبط مقياس اللون والكسب بحيث يظهر النفاث الانقباضي بوضوح دون حدوث تداخل (aliasing). اضغط على Start، ثم Save.
قياس سرعة Doppler ذو الموجة النبضية
1. الضغط على تحكم PW Doppler. وضع بوابة حجم العينة عند أضيق نقطة في النفاث (vena contracta)، وتطبيق تصحيح الزاوية (<60°).
2. الضغط على Start لبدء التتبع الطيفي؛ وبمجرد تسجيل ثلاث دورات قلبية على الأقل، اضغط على Save. في برنامج Vevo LAB، قم بقياس ذروة السرعة عبر الصمام باستخدام أداة Peak Velocity، مع حساب المتوسط لثلاث دورات على الأقل.

7. المعالجة النسيجية وتلوين جذر الأبهر

بعد التقييم باستخدام تخطيط صدى القلب، تأكد من التخدير العميق من خلال التحقق من الغياب التام لمنعكس سحب القدم. قم بإجراء الخلع الرقبي كطريقة ثانوية للقتل الرحيم، وفقاً لإرشادات الجمعية الأمريكية للطب البيطري (AVMA) لقتل الحيوانات رحيماً (طبعة 2020) والبروتوكولات المعتمدة مؤسسياً.
تنبيه: تعتبر جيف الحيوانات، والأنسجة المستأصلة، والمواد الملوثة بالدم نفايات بيولوجية/حيوانية. تخلص منها وفقاً للوائح السلامة البيولوجية ومرافق الحيوانات المؤسسية.
قم بإجراء عملية بضع الصدر باستخدام مقص جراحي مجهري لكشف القلب.
أدخل إبرة تروية في قمة البطين الأيسر وقم بشطف الدورة الدموية الجهازية بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم وبارد. ويُستدل على نجاح التروية من خلال شحوب لون الكبد والرئتين.
استأصل القلب السليم واغمره في بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 24 h لضمان التثبيت الكامل.
تنبيه: البارافورمالدهيد مادة سامة ومخرشة. تعامل مع PFA بتركيز 4% داخل خزانة استنشاق كيميائية مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وتخلص من نفايات PFA كنفايات كيميائية خطرة.
انقل النسيج المثبت إلى جهاز معالجة الأنسجة الآلي لإجراء التجفيف المتسلسل من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول، يليه الترويق باستخدام الزيلين والتسلل بشمع البارافين عند 65 °C.
تنبيه: الزيلين مادة قابلة للاشتعال وسامة، والبارافين الساخن قد يسبب حروقاً. تعامل مع الزيلين في خزانة استنشاق أو جهاز معالجة معتمد، وتخلص من النفايات التي تحتوي على الزيلين كنفايات كيميائية خطرة.
قم بطمر القلوب المعالجة في قوالب البارافين.
ملاحظة: يعد التوجيه الصحيح للقلب عند الطمر أمراً بالغ الأهمية. ضع القلب بحيث يسمح بأخذ مقاطع عرضية عبر جذر الأبهر عند مستوى شرفات الصمامات الثلاث.
باستخدام الميكروتوم الدوار، قم بقطع مقاطع عرضية متسلسلة بسمك 4–5 µm عبر مستوى الصمام الأبهري، مع ضمان شمول الشرفات الثلاث جميعاً. ثبت المقاطع على شرائح زجاجية واحفظها في درجة حرارة الغرفة.
قم بإجراء صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) على شرائح مختارة لتقييم مورفولوجيا الأنسجة، وإعادة التشكيل الهيكلي، وسمك شرفات الصمامات.
قم بإجراء صبغ Von Kossa على المقاطع المتسلسلة المجاورة للكشف عن التكلسات خللية التغذية وقياسها كمياً، والتي تظهر على شكل ترسبات معدنية بنية داكنة إلى سوداء داخل شرفات الصمامات.

8. الإجراء الجراحي وهمي

ملاحظة: يصف هذا القسم إجراء التحكم الشبيه (Sham control). تخضع الفئران في مجموعة التحكم الشبيه لنفس عمليات التخدير، وتجهيز الجلد، وكشف الوعاء الدموي، وبضع الشريان، وإدخال السلك الموجه تراجعياً كما في مجموعة إصابة السلك الأبهري (AWI)؛ يتم دفع السلك الموجه إلى المستوى فوق الصمامي ولكن لا يتم تمريره عبر الصمام الأبهري، ولا يتم إجراء أي إصابة ميكانيكية للصمام.

قم بتخدير الفأر وتحضير المجال الجراحي كما هو موضح في الخطوات من 1.1. إلى 1.5.
تحت الرؤية بالمجهر الاستريو، قم بكشف الشريان السباتي الأصلي الأيمن (RCCA) عن طريق التشريح الكليل كما هو موضح في الخطوة 2.1.
قم بربط الطرف القاصي من الـ RCCA بشكل دائم باستخدام خيط جراحي حريري 6-0، وضع عقدة منزلقة رخوة في الجهة الدانية (كما في الخطوتين 2.2–2.3).
قم بإجراء شق شرياني مستعرض وأدخل سلك التوجيه كما هو موضح في الخطوات من 3.1 إلى 4.2.
قم بدفع سلك التوجيه في اتجاه تراجعي وصولاً إلى المستوى فوق الصمامي للأبهر الصاعد تحت توجيه تخطيط صدى القلب، مع التأكد من أن طرف سلك التوجيه لا يعبر الصمام الأبهري.
ملاحظة: لا تقم بحركات دفع-سحب أو حركات تدويرية مسببة لإصابة الصمام الموضحة في الخطوة 4.4. اسحب سلك التوجيه وقم فوراً بربط الـ RCCA في الجهة الدانية كما هو موضح في الخطوتين 5.1–5.2.
أغلق شق الجلد باستخدام غرز نايلون 5-0 متقطعة أو مشابك الجروح.
ملاحظة: كما هو الحال في مجموعة AWI، يتم توفير التسكين أثناء الجراحة عن طريق تسريب الليدوكائين الموضعي (الخطوة 1.5). انقل الحيوان إلى قفص تعافٍ مدفأ وراقبه حتى يستعيد القدرة على الحركة بالكامل.
أخضع فئران مجموعة Sham لمراقبة ما بعد الجراحة، وتقييم تخطيط صدى القلب في الأسبوع الرابع، ومعالجة نسيجية مطابقة لما تم تطبيقه على مجموعة AWI.

9. التحليل الإحصائي وتصميم الدراسة

خضع 20 فأراً (10 ذكور، 10 إناث) لإجراء AWI، بينما خضع 6 فئران من سلالة C57BL/6 (3 ذكور، 3 إناث) لإجراء Sham على مدار الدراسة.
قياس ذروة السرعة عبر الصمام (المعيار الذي يحدد نجاح النموذج) في جميع الحيوانات الناجية (19 AWI، و6 Sham).
تحليل المؤشرات التفصيلية لتخطيط صدى القلب والأنسجة في مجموعة فرعية محددة مسبقاً ومتوازنة من حيث الجنس مكونة من 6 فئران AWI (3 ذكور، 3 إناث).
التأكد من أن جميع قياسات تخطيط صدى القلب والأنسجة قد أجراها باحثون لا يعرفون توزيع المجموعات (blinded).
تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار Shapiro-Wilk قبل إجراء الاختبارات البارامترية. مقارنة مجموعتين مستقلتين (AWI مقابل Sham) باستخدام اختبار t-test للطلاب غير المقترن ثنائي الذيل.
تحليل وعرض بيانات البقاء على قيد الحياة باستخدام طريقة Kaplan-Meier.
إجراء جميع التحاليل باستخدام برنامج GraphPad Prism. تقديم البيانات كمتوسط ± SEM، مع اعتبار القيمة p < 0.05 دالة إحصائياً.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير منصة مطبوعة ثلاثية الأبعاد للسيطرة على النزيف

لمعالجة النزيف في الفترة المحيطة بالجراحة—والذي يمثل المصدر الرئيسي للمراضة والوفيات في نموذج تضيق الصمام الأبهر (AVS) التقليدي المستحث بالسلك الدليل—تم تصميم منصة دعم وعائية مطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1صُنعت المنصة باستخدام الطباعة بالتصوير المجسم (SLA) من راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً (متوافق مع معيار USP Class VI / ISO 10993)، بسمك هيكلي قدره 1.07 مم. وبعد الطباعة، غُسلت القطع في كحول أيزوبروبيل لإزالة الراتنج غير المعالج، ثم عولجت لاحقاً تحت الأشعة فوق البنفسجية. تم توفير ملف التصميم الكامل (.stp) لتمكين إعادة إنتاج المنصة على أنظمة SLA القياسية. وتتميز المنصة بسطح قمي على شكل حرف V مقلوب بزاوية رأس تبلغ 120° (الشكل 1أ-B)، والتي تتوافق مع انحناء الشريان السباتي الأصلي الأيمن المعزول دون إحداث ضغط مفرط على الجدار. ومن ثمَّ، يتم عمل شقوق جانبية متعددة وخطوية (الشكل 1ج-D) يسمح ذلك للمشغّل بالتعامل مع الغرز الموضوعة مسبقاً وتطبيق شد طولي قابل للتعديل على الوعاء الدموي. ويتم زيادة الشد تدريجياً حتى يتوقف ظهور النبض الشرياني، وهي نقطة نهاية بصرية تشير إلى تحقيق إرقاء مؤقت كافٍ. يوفر هذا النهج مجالاً جراحياً مستقراً لإجراء بضع الشريان وإدخال السلك المرشد، مع تجنب حدوث إصابة سحق مفرطة لجدار الوعاء الدموي.

التأكيد أثناء الجراحة لموضع السلك المرشد

تم التحقق من الوضع الصحيح للسلك الموجه على مرحلتين خلال الإجراء. أولاً، تحت الرؤية المباشرة بالمجهر المجسم، لوحظ دخول السلك الموجه إلى تجويف الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) عبر فتحة الشريان المستعرض في اتجاه تراجعي (الشكل 2A). ثانياً، أكد التصوير بالموجات فوق الصوتية للقلب في الوقت الفعلي أن طرف السلك الموجه قد عبر الصمام الأبهري ودخل البطين الأيسر. وحدد التصوير بنمط B السلك الموجه كأثر خطي عالي الصدى يعبر مستوى الصمام الأبهري (الشكل 2B). كما أظهر تصوير دبلر الملون تدفقاً مضطرباً موضعياً عند مستوى الصمام الأبهري، مما قدم تأكيداً إضافياً على وضعية السلك الموجه عبر وريقات الصمام (الشكل 2C؛ الفيديو التكميلي 1).

البقاء على قيد الحياة في الفترة المحيطة بالجراحة ومعدل نجاح النموذج

أدى دمج المنصة القابلة لضبط الشد في سير العمل الجراحي إلى تحقيق معدلات بقاء مبكرة عالية. وأظهر تحليل كابلان-ماير معدل بقاء بلغ 95% بعد 24 ساعة من الجراحة (19 من أصل 20 فأراً؛ الشكل 3A). وكشف فحص ما بعد الوفاة للحيوان الوحيد الذي لم ينجُ عن عدم وجود دليل على حدوث نزيف حاد، أو تلف هيكلي، أو نقص تروية قلبية، مما يشير إلى أن الوفاة تعزى إلى مضاعفات مرتبطة بالتخدير وليس إلى الصدمات الجراحية. تم تقييم نجاح النموذج بعد 4 أسابيع باستخدام معيار محدد مسبقاً: وصول ذروة سرعة التدفق عبر الصمام إلى أكثر من 2,000 mm/s، بالإضافة إلى النتائج النسيجية الداعمة. ومن بين 19 حيواناً ناجياً، استوفى 18 (94.7%) هذا الحد، مما أدى إلى معدل نجاح إجمالي للنموذج بنسبة 90% عبر المجموعة الكاملة (18 من أصل 20 فأراً؛ الشكل 3B). وكانت النتائج قابلة للمقارنة بين الجنسين: حيث بلغت نسبة البقاء بعد 24 ساعة 9 من أصل 10 في الذكور، و10 من أصل 10 في الإناث، وبلغ معدل نجاح النموذج بعد 4 أسابيع 9 من أصل 10 (90%) في كلا الجنسين؛ وكانت حالة الوفاة الوحيدة في الفترة المحيطة بالجراحة لأنثى (مرتبطة بالتخدير)، وحالة فشل النموذج الوحيدة كانت لأنثى ناجية.

التأكيد بالموجات فوق الصوتية للقلب لتضيق الصمام الأبهري

أكد تخطيط صدى القلب عبر الصدر في الأسبوع الرابع بعد الجراحة حدوث تغيرات ديناميكية دموية تتماشى مع تضيق الصمام الأبهري الشديد في مجموعة AWI. عُرضت قيم تخطيط صدى القلب الكمية كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)؛ وحُللت معايير وظيفة وإعادة تشكيل البطين الأيسر في 6 فئران من مجموعة Sham و6 فئران من مجموعة AWI، بينما قيست ذروة السرعة عبر الصمام في جميع الفئران الناجية من مجموعة AWI ومجموعة التحكم Sham (العدد = 19 AWI، العدد = 6 Sham). كان الكسر القذفي للبطين الأيسر أقل قليلاً في مجموعة AWI مقارنة بمجموعة التحكم Sham في الأسبوع الرابع (56.21 ± 1.15% مقابل 61.57 ± 2.12%؛ p = 0.0503؛ الشكل 3C)، وهو فرق لم يصل إلى الدلالة الإحصائية. وأظهرت تسجيلات Doppler ذات الموجة النبضية زيادة ملحوظة في سرعة التدفق عبر الصمام في مجموعة AWI، حيث وصلت إلى 2740.89 ± 104.10 mm/s، مقارنة بـ 988.00 ± 126.24 mm/s في مجموعة التحكم Sham (الشكل 3D). وأكد التحليل الكمي وجود ارتفاع ذي دلالة إحصائية عالية في ذروة سرعة التدفق عبر الصمام في مجموعة AWI بالنسبة لمجموعة التحكم Sham (p < 0.0001؛ الشكل 3E). وتماشياً مع المرحلة المبكرة من التكيف مع فرط ضغط الدم، أظهرت مجموعة AWI إعادة تشكيل مركزية للبطين الأيسر: حيث زاد سمك الجدار الأمامي الانبساطي بشكل ملحوظ (LVAWd 1.14 ± 0.02 مقابل 0.96 ± 0.03 mm؛ p = 0.0016؛ الشكل 3F)، بينما كان سمك الجدار الخلفي الانبساطي وكتلة البطين الأيسر أعلى ولكن لم يصلا إلى الدلالة الإحصائية (LVPWd 1.01 ± 0.12 مقابل 0.76 ± 0.02 mm، p = 0.0650، الشكل 3G؛ كتلة LV 124.51 ± 10.63 مقابل 104.47 ± 2.45 mg، p = 0.0961، الشكل 3H).

التحقق النسيجي المرضي من إعادة تشكيل الصمام والتكلس

أكد الفحص النسيجي لجذور الشريان الأورطي النتائج التي تم الحصول عليها من تخطيط صدى القلب. عُرضت القيم النسيجية الكمية في صورة المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، وتم تحليلها في 6 فئران من مجموعة Sham و6 فئران من مجموعة AWI. كشف صبغ H&E في مجموعة AWI عن تسمك واضح في الشرفات واختلال في التنظيم البنيوي، وهي سمات كانت غائبة في ضوابط مجموعة Sham (الشكل 3I). وأكد القياس المورفومتري الكمي وجود زيادة معنوية في متوسط سمك شرفة الصمام في مجموعة AWI مقارنة بمجموعة Sham (p < 0.0001؛ الشكل 3J). كما أظهر صبغ فون كوسا (Von Kossa) تكلسًا خلليًا واسع النطاق داخل شرفات الصمامات المتسمكة في مجموعة AWI، والذي ظهر على شكل ترسبات معدنية تتراوح ألوانها بين البني الداكن والأسود. بينما أظهرت ضوابط مجموعة Sham ترسبات معدنية ضئيلة (الشكل 3K). وكشف تحليل الصور الكمي عن زيادة معنوية في إجمالي مساحة التكلس (µm²) في مجموعة AWI بالنسبة لضوابط مجموعة Sham (p < 0.0001؛ الشكل 3L).

figure-results-1
الشكل 1: تصميم منصة الدعم الوعائية المطبوعة ثلاثية الأبعاد موضحاً في أربعة مناظير. (A) منظور مائل أمامي-أيسر. (B) منظور مائل خلفي-أيمن. (C) منظور جانبي للمسقط الطولي العام للمنصة. (D) منظور بزاوية يبرز منطقة القمة ذات الشكل V المقلوب. تسميات المكونات: 110، جسم المنصة؛ 120، الأذرع الجانبية؛ 121، الحزوز الجانبية المدرجة؛ 130، الطرف التشغيلي؛ 140، قمة الإدخال ذات الشكل V المقلوب؛ 150، سطح الدعم الملامس للوعاء؛ 160، منحدر الانتقال بين الحزوز المتجاورة؛ 190، الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA). تم تصنيع المنصة من راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً (السُمك الهيكلي: 1.07 mm). أعد المؤلفون الرسم الهيكلي ثلاثي الأبعاد من ملف تصميم CAD الأصلي (.stp) لمنصة الدعم الوعائية باستخدام FreeCAD، وهو برنامج مجاني ومفتوح المصدر للتصور والنمذجة باستخدام CAD. لم يتم اقتباس أي منشورات من طرف ثالث أو رسومات محمية بحقوق الطبع والنشر. يتوفر ملف تصميم CAD الأصلي كملف تكميلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التأكيد الجراحي وعن طريق تخطيط صدى القلب لموضع السلك المرشد. (A) صورة جراحية تظهر الإدخال التراجعي للسلك المرشد (السهم) عبر بضع الشريان العرضي إلى تجويف الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) تحت الرؤية المباشرة بالمجهر الستيريوسكوبي. (B) صورة تخطيط صدى القلب بنمط B-mode تظهر السلك المرشد (الذي يظهر كأثر خطي عالي الصدى؛ السهم) وهو يعبر الصمام الأورطي ويدخل البطين الأيسر. (C) صورة تخطيط صدى القلب بدوبلر الملون تظهر تدفقاً مضطرباً موضعياً عند مستوى الصمام الأورطي، مما يؤكد وضع السلك المرشد عبر شرفات الصمام. تظهر رؤية تدفق الدم عبر الصمام بدوبلر الملون في الوقت الفعلي أثناء وضع السلك المرشد في الفيديو التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: نتائج البقاء على قيد الحياة، والديناميكا الدموية، وإعادة تشكيل البطين، والنتائج النسيجية المرضية لنموذج إصابة السلك الأبهرية (AWI) المُحسَّن. (A) منحنى كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة لمدة 24 h للفئران التي خضعت لـ AWI (العدد = 20). (B) نجاح النموذج (باللون الأحمر) مقابل الفشل (باللون الأسود) في مجموعة AWI بعد 4 أسابيع (العدد = 20)؛ عُرِّف النجاح بأن تكون ذروة السرعة عبر الصمام > 2,000 mm/s. (C) الكسر القذفي (EF; p = 0.0503). (D) صور تخطيط صدى القلب ممثلة بـ Doppler ذو موجة نبضية (PW) من فأر في مجموعة Sham (يسارًا) وفأر في مجموعة AWI (يمينًا). (E) ذروة السرعة عبر الصمام (العدد = 19 AWI، العدد = 6 Sham؛ p < 0.0001). (F) سُمك الجدار الأمامي للبطين الأيسر أثناء الانبساط (LVAWd; p = 0.0016). (G) سُمك الجدار الخلفي للبطين الأيسر أثناء الانبساط (LVPWd; p = 0.0650). (H) كتلة البطين الأيسر (p = 0.0961). (I) مقاطع ممثلة لجذر الأبهر مصبوغة بـ HE (مجموعة Sham يسارًا؛ ومجموعة AWI يمينًا). (J) سُمك وريقة الصمام الأبهري (p < 0.0001). (K) مقاطع ممثلة لجذر الأبهر مصبوغة بـ Von Kossa (مجموعة Sham يسارًا؛ ومجموعة AWI يمينًا). (L) إجمالي مساحة ترسب الكالسيوم (µm²; p < 0.0001). أشرطة المقياس = 500 µm. في جميع الرسوم البيانية العمودية الكمية، تمثل الأعمدة القيم المتوسطة وتمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). أُجريت المقارنات الكمية بين مجموعتي Sham وAWI في الأجزاء C و E–H و J و L باستخدام اختبار Student's t-test ثنائي الذيل غير المقترن. البيانات الكمية مأخوذة من مجموعتي Sham وAWI (العدد = 6 لكل مجموعة)، باستثناء ذروة السرعة عبر الصمام في الجزء E، والتي قيست في جميع فئران AWI الناجية وعينات Sham الضابطة (العدد = 19 AWI، العدد = 6 Sham). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو التكميلي 1: التصوير بالصدى القلبي باستخدام الدوبلر الملون لتدفق الدم عبر الصمام أثناء وضع سلك التوجيه. يوضح الفيديو التصوير الفوري بالدوبلر الملون عند مستوى الصمام الأبهري أثناء إجراء AWI، مما يظهر التدفق المضطرب الموضعي الناتج عن وضع سلك التوجيه عبر شرفات الصمام. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول وصفاً تفصيلياً لنموذج حيواني مستقر وآمن للتضيق الأبهري. وتتمثل إحدى ميزات هذا النهج في وجود منصة مساعدة تسهل إدخال سلك التوجيه في الشريان السباتي المشترك. يتم تصنيع هذه المنصة باستخدام الطباعة بالتصوير الحجري المجسم (SLA) من راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً (بسمك هيكلي 1.07 mm)، وتتضمن سطحاً قميّاً على شكل حرف V مقلوب بزاوية رأس تبلغ 120°؛ وملف التصميم الكامل متاح مجاناً كملف .stp تكميلي. يضمن هذا الجهاز دخول سلك التوجيه بسلاسة، ويتحكم بشكل موضوعي في فقدان الدم أثناء الجراحة، وبذلك يحمي بقاء الفئران في النموذج على المديين القصير والطويل. ومنذ الوصف الأصلي، تم تحسين وتوصيف النموذج المستحث بسلك التوجيه بشكل أكبر، بما في ذلك متغيرات ذات درجات شدة متفاوتة تعاير كثافة الإصابة لإنتاج تضيق يتراوح من الخفيف إلى الشديد¹⁷، وتقارير حديثة توثق مضاعفاته أثناء الجراحة¹⁸؛ ويعتمد البروتوكول الحالي على هذه المجموعة من الأعمال من خلال المعالجة المنهجية للنزيف أثناء الجراحة.

تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة لنجاح تحفيز النموذج وتستحق اهتماماً خاصاً. أولاً، يجب معايرة درجة الشد الطولي المطبق عبر المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد بدقة: إذ ينبغي زيادة الشد فقط حتى يصبح نبض الشريان غير محسوس بصرياً. ويؤدي الشد غير الكافي إلى استمرار النزيف أثناء عملية شق الشريان، بينما يؤدي الشد المفرط إلى خطر تلف البطانة الداخلية وتمزق الوعاء الدموي. ثانياً، يجب إحكام ربط العقدة الانزلاقية القريبة حول كل من الوعاء الدموي وسلك التوجيه قبل إزالة المنصة؛ حيث يعد إزالة المنصة مبكراً مع عدم إحكام ربط العقدة الانزلاقية السبب الأكثر شيوعاً للنزيف أثناء الإجراء. ثالثاً، يعد التأكيد من دخول سلك التوجيه إلى البطين الأيسر تحت توجيه تخطيط صدى القلب أمراً ضرورياً. فبدون خطوة التحقق هذه، لا يمكن للمشغل التأكد من وضع سلك التوجيه بشكل صحيح عند الصمام الأبهري، وسيؤدي الإصابة غير المكتملة إلى فشل النموذج.

يمكن توقع العديد من المضاعفات الشائعة والتعامل معها. في حالة حدوث نزيف أثناء إدخال السلك الموجه، يجب إعادة وضع المنصة أسفل الوعاء الدموي لإعادة تحقيق الإرقاء المؤقت قبل المتابعة. وفي الحيوانات التي تمتلك شرايين سباتية ذات عيار أصغر، يمكن تقليل شد المنصة قليلاً لتوسيع لمعة الوعاء الدموي لاستيعاب السلك الموجه. لهذا النموذج عدة قيود يجب مراعاتها عند تفسير النتائج؛ إذ تسبب إصابة السلك الميكانيكية إصابة صمامية ميكانيكية والتهابية حادة، وهو ما يختلف عن العملية التنكسية المزمنة المدفوعة بالدهون التي تميز تضيق الصمام الأبهري التكلسي لدى البشر¹⁷^,¹⁹^,²⁰^,²¹. وبناءً على ذلك، فإن السمات النسيجية — رغم أنها تعيد إنتاج تثخن الشرفات والتكلس الضموري — قد لا تحاكي بشكل كامل جميع الأحداث الجزيئية للمرض البشري. تم تطوير البروتوكول والتحقق من صحته في كل من ذكور وإناث فئران C57BL/6 التي تتراوح أعمارها بين 8 و10 أسابيع؛ ومع ذلك، فإن قابليته للتطبيق على سلالات أخرى أو حيوانات مسنة تتطلب تحققا مستقلاً. قد تؤدي الاختلافات المرتبطة بالجنس في قطر الشريان السباتي وتشريح القلب إلى تعديل درجة الصعوبة الجراحية والنتائج الديناميكية الدموية؛ لذا يُشجع الباحثون على تسجيل الجنس كمتغير بيولوجي في التحليلات اللاحقة²². بالإضافة إلى ذلك، فإن الربط الدائم للشريان السباتي المشترك الأيمن هو جزء متأصل من الإجراء، ورغم أن دائرة ويليس توفر تروية دماغية جانبية في الفئران، ولم تُلاحظ أي قصورات عصبية واضحة، إلا أنه لا يمكن استبعاد حدوث تأثيرات معرفية أو وعائية دماغية طفيفة. لم يتم إجراء تخطيط صدى القلب الأساسي (قبل الإجراء)؛ حيث كانت مجموعة المحاكاة المتزامنة بمثابة الضابط لوظيفة الصمام الطبيعية، ويُنصح بإجراء مسح أساسي حيثما كان ذلك ممكناً لتمكين المقارنة داخل الحيوان الواحد وفحص التشوهات العفوية النادرة في الصمام الأبهري التي تم الإبلاغ عنها في فئران C57BL/6 (حوالي 0.3% في السلالات غير المعدلة). لم يتم تقييم القصور الأبهري بشكل منهجي في هذه الدراسة؛ لذا فإن تكرار القصور الأبهري الناجم عن الإصابة وعلاقته بشدة التضيق يستوجبان تقييماً مخصصاً وسيتم تناولهما في أعمال مستقبلية.

يجب أيضاً مراعاة العيوب المحتملة لهذه المنصة؛ فقد يتسبب الجهاز في تهيج ميكانيكي للبنى المجاورة، بما في ذلك العصب المبهم الذي يمتد بمحاذاة الشريان السباتي. ويتم تقليل هذا الخطر بفضل الحواف المستديرة وغير الحادة للمنصة، وقمتها التي تتوافق مع الوعاء الدموي بزاوية 120°، وقصر فترة تطبيقها، ولم تُلاحظ في هذه الدراسة أي اضطرابات تنفسية أو مضاعفات ظاهرة أخرى تعزى إلى الجهاز. وبالمقارنة مع النهج البديلة المعتمدة، يوفر هذا البروتوكول المُحسَّن عدة مزايا عملية؛ إذ تتطلب النماذج الغذائية في الفئران من سلالة ApoE⁻/⁻ تغذية عالية الدهون لمدة 20-24 أسبوعاً وتؤدي إلى أنماط تضيق متغيرة، حيث تفشل العديد من الحيوانات في تطوير مرض ذو دلالة هيموديناميكية. أما البروتوكول الحالي فينتج نمط تضيق متسق خلال 4 أسابيع، بمعدل نجاح إجمالي قدره 90% (18 من أصل 20 حيواناً). وبالمقارنة مع طريقة سلك توجيه Honda الأصلية، فإن التقدم الرئيسي لهذا البروتوكول يكمن في التحكم المنهجي في النزيف المحيط بالعملية الجراحية عبر المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

تم التعرف على حدوث نزيف أثناء إدخال السلك الموجه كمضاعفة ناتجة عن التقنية الأصلية، إلا أنه لم يتم التعامل مع هذه المشكلة بشكل كافٍ. وفي الخبرة الاسترجاعية للمختبر ذاته مع الإجراء التقليدي (ما قبل استخدام المنصة) (أكثر من 400 حالة)، حدث نزيف حاد أثناء العملية في ما يقرب من 40% من الحالات، مع وصول نسبة الوفيات بعد النزيف إلى ~60% ونسبة بقاء على قيد الحياة لمدة 24 h بلغت ~75%، حيث كان النزيف — وبشكل أساسي في موقع الوصول إلى الشريان السباتي — مسؤولاً عن جميع الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة تقريباً. وهذا يتفق مع ما توصل إليه Qian et al.، الذين حددوا نزيف موقع ثقب الشريان السباتي كسبب رئيسي للوفاة في الفترة المحيطة بالجراحة في هذا النموذج. ومن خلال التحكم في فقدان الدم، رفعت المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد نسبة البقاء على قيد الحياة لمدة 24 ساعة إلى 95%، مع عدم ملاحظة أي حالات وفاة تعزى إلى النزيف في المجموعة الحالية. وبما أن النزيف لم يعد هو مصدر القلق المحدّد، يمكن تغيير شدة الإصابة الميكانيكية لإنتاج درجات متفاوتة من شدة التضيق. ولهذه القابلية للضبط أهمية مباشرة في التطبيقات الانتقالية: فبالنسبة للعلاجات المرشحة ذات التأثيرات المتواضعة، قد يكون من الضروري إحداث إصابة أساسية أكثر شدة للكشف عن الفروق المرتبطة بالعلاج والتي قد تتواري في حال استخدام نموذج أقل شدة.

يعتبر هذا النموذج مناسباً للغاية لعدة فئات من الدراسات اللاحقة. ونظراً لأن النمط الظاهري للتضيق يتطور ضمن إطار زمني محدد وقابل للتكرار، فإنه يمكن أن يعمل كمنصة للتقييم قبل السريري للعلاجات الدوائية المرشحة التي تهدف إلى إبطاء تكلس الصمام أو تليفه²³. كما يتوافق النموذج مع النهج الجينية: حيث يمكن تطبيق البروتوكول على الفئران المعدلة وراثياً أو الفئران التي تم تعطيل جيناتها (knockout) من خلفية C57BL/6 لتحليل مساهمة مسارات إشارات محددة في تطور مرض الصمام. بالإضافة إلى ذلك، توفر نقطة النهاية عند الأسبوع الرابع نافذة عملية للمراقبة التسلسلية بالصدى القلبي لتطور المرض أو الاستجابة للعلاج. ويمكن مشاركة ملفات تصميم المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد بحرية كملف .stp تكميلي، ومن المتوقع أن يؤدي توحيد هذا الجهاز عبر المختبرات إلى تحسين إمكانية التكرار بين المواقع المختلفة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن عدم وجود أي مصالح مالية متضاربة أو تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا للأمراض المزمنة غير المعدية (2026ZD0554300)؛ والمؤسسة الوطنية الطبيعية للعلوم في الصين (U23A20395, 82170375, 82500455)؛ ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة سيتشوان (2026NSFSC0552)؛ وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية؛ ومشاريع العلوم والتكنولوجيا في منطقة التبت ذات الحكم الذاتي، الصين (XZ202501ZY0120)؛ ومشروع "1.3·5" في مستشفى غرب الصين، جامعة سيتشوان (ZYGD23021, 23HXFH009). ويشكر المؤلفون Qipu Feng (مركز التجارب الحيوانية، مستشفى غرب الصين، جامعة سيتشوان) على المساعدة في التصوير بالموجات فوق الصوتية للحيوانات الصغيرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
منصة دعم وعائية مطبوعة ثلاثية الأبعاد	مصنعة خصيصاً	N/A	منصة دعم وعائية مصنعة خصيصاً ومطبوعة ثلاثية الأبعاد؛ تم توفير ملف CAD تكميلي بتنسيق .stp.
بارافورمالدهيد 4%	Servicebio	G1101-3ML	تثبيت الأنسجة
خيط جراحي نايلون 5-0	Jinhuan Medical	F503	إغلاق الجلد باستخدام غرز متقطعة
خيط جراحي حريري 6-0	Jinhuan Medical	RC411	ربط دائم للشريان السباتي الأصلي الأيمن (RCCA) القاصي وعقدة انزلاقية دانية
هلام اقتران صوتي (مسخن مسبقاً)	Keppler	KL-250	تخطيط صدى القلب
راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	مادة طباعة SLA مستخدمة لتصنيع منصة الدعم الوعائية المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمصنعة خصيصاً.
فئران C57BL/6 (8–10 أسابيع؛ الذكور 22–25 g، الإناث 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	استُخدم كلا الجنسين طوال الدراسة؛ أُويت تحت ظروف قياسية
غاز أكسيد الإيثيلين	مرفق التعقيم المؤسسي	N/A	تعقيم منصة الدعم الوعائية المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمصنعة خصيصاً.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	تصور CAD وتوليد الرسم الهيكلي ثلاثي الأبعاد من ملف .stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	التحليل الإحصائي والرسم البياني
سلك توجيه، بقطر 0.014-inch	Boston Scientific	H749393071900	إحداث إصابة ميكانيكية في الصمام الأورطي
طقم صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)	Beyotime	C0105S	دراسة مورفولوجيا وسماكة الشرفات
إيزوفلوران	RWD Life Science	R510-22-2	3% للتحريض؛ 1.5–2% للحفاظ على التخدير في 100% O₂
ليدوكائين	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	تسلل موضعي استباقي في موقع الشق (0.5%، الخطوة 1.5)
مقصات جراحة مجهرية	RWD Life Science	F11022-11	شق الجلد، بضع الشريان، بضع الصدر
محول MX550D (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	تخطيط صدى القلب
كريم نير (Nair) لإزالة الشعر	Nair	255 g	لإزالة الشعر من المنطقة العنقية الأمامية وجدار الصدر
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	التروية
ميكروتوم دوار	Leica Biosystems	RM2125 RTS	تقطيع تسلسلي عند 4–5 µm
مجهر استريو (جراحي)	Olympus	SZX7	عزل الأوعية والجراحة المجهرية
نظام الموجات فوق الصوتية عالي الدقة Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	تخطيط صدى القلب
طقم صبغ فون كوسا (Von Kossa)	Servicebio	G1043-20ML	الكشف عن التكلس الضموري
زايلين	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	تصفية الأنسجة أثناء المعالجة بالبارافين.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otto CM, Newby DE, Hillis GS. Calcific aortic stenosis: a review. JAMA. 2024;332(23):2014–2026.
Vincent F, et al. Transcatheter aortic valve replacement in bicuspid aortic valve stenosis. Circulation. 2021;143(10):1043–1061.
Kraler S, et al. Calcific aortic valve disease: from molecular and cellular mechanisms to medical therapy. Eur Heart J. 2021;43(7):683–697.
Blaser MC, Bäck M, Lüscher TF, Aikawa E. Calcific aortic stenosis: omics-based target discovery and therapy development. Eur Heart J. 2025;46(7):620–634.
Lindman BR, et al. Calcific aortic stenosis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2(1):16006.
Yu Chen H, et al. Dyslipidemia, inflammation, calcification, and adiposity in aortic stenosis: a genome-wide study. Eur Heart J. 2023;44(21):1927–1939.
Peeters FECM, et al. Calcific aortic valve stenosis: hard disease in the heart: a biomolecular approach towards diagnosis and treatment. Eur Heart J. 2018;39(28):2618–2624.
Cai D, Saint L, Markley J, Chen SY. Novel humanized aortic valve calcification model. Circ Res. 2025;136(12):1632–1635.
Rattazzi M, et al. Calcification of advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteries of ApoE-deficient mice: potential role of chondrocyte-like cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(7):1420–1425.
Aikawa E, et al. Arterial and aortic valve calcification is abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 2009;119(13):1785–1794.
Hjortnaes J, et al. Arterial and aortic valve calcification inversely correlates with osteoporotic bone remodeling: a role for inflammation. Eur Heart J. 2010;31(16):1975–1984.
Aikawa E, et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 2007;116(24):2841–2850.
Honda S, et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(2):270-278. doi:10.1161/ATVBAHA.113.302610.
Zhu Z, et al. Models for calcific aortic valve disease in vivo and in vitro. Cell Regen. 2024;13:6.
Zhong G, et al. Activation of Piezo1 promotes osteogenic differentiation of aortic valve interstitial cells through YAP-dependent glutaminolysis. Sci Adv. 2023;9(22):eadg0478.
Li S, et al. Targeted inhibition of PTPN22 is a novel approach to alleviate osteogenic responses in aortic valve interstitial cells and aortic valve lesions in mice. BMC Med. 2023;21(1):252.
Niepmann ST, et al. The graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics the human functional and morphological disease phenotype. Clin Res Cardiol. 2019;108(8):847–856.
Qian N, et al. A novel mouse model of calcific aortic valve stenosis. Anim Models Exp Med. 2024;7(4):523–532.
Iqbal F, et al. Sortilin enhances fibrosis and calcification in aortic valve disease by inducing interstitial cell heterogeneity. Eur Heart J. 2023;44(10):885–898.
Billig H, et al. Aortic valve stenosis and osteoporosis: insights from a mouse model. BMC Cardiovasc Disord. 2025;25(1):562.
Artiach G, et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids reduce aortic valve disease via the resolvin E1-ChemR23 axis. Circulation. 2020;142(8):776–789.
Clayton JA, Collins FS. NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 2014;509(7500):282–283.
Li B, et al. IGF1-mediated mesenchymal-endothelial transition as a potential regulatory target in calcific aortic valve disease. BMC Med. 2025;23(1):600.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

بروتوكول مُحسَّن لنموذج تضيق الصمام الأبهري المستحث بسلك توجيه في الفئران

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة