مقالة منهجية

بروتوكول مُحسَّن لنموذج تضيق الصمام الأبهري المستحث بسلك توجيه في الفئران

120 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72218

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول نموذجاً مُحسَّناً لتضيق الصمام الأبهري المستحث بسلك توجيه في الفئران من سلالة C57BL/6. تتيح منصة دعم وعائية مطبوعة ثلاثية الأبعاد ومصممة خصيصاً التحكم الدقيق في النزيف، مما أدى إلى تحقيق نسبة بقاء بلغت 95% خلال 24 ساعة (19/20) ونسبة نجاح إجمالية للنموذج بلغت 90% عند الأسبوع الرابع (18/20).

الملخص

يعد تضيق الصمام الأبهر (AVS) مرضاً قلبياً وعائياً رئيسياً يزداد انتشاره بين السكان المسنين، ومع ذلك فإن ندرة أنسجة الصمامات المصابة تحد بشكل كبير من الدراسات الميكانيكية وتطوير العلاجات. يضع هذا البروتوكول ويحسن نموذجاً قابلاً للتكرار من الفئران المصابة بتضيق الصمام الأبهر عبر تطوير طريقة إصابة الصمام المستحثة بسلك التوجيه الخاص بـ Honda من خلال التحكم في النزيف. تخضع ذكور وإناث الفئران من سلالة C57BL/6 لإصابة في الصمام الأبهر مستحثة بسلك توجيه؛ وقد تم تحسين هذا الإجراء باستخدام منصة دعم وعائية مخصصة مطبوعة ثلاثية الأبعاد تحقق تحكماً دقيقاً في النزيف أثناء إدخال وسحب سلك التوجيه. وتشمل مقاييس النتائج معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 24 h، والتقييم بالموجات فوق الصوتية للقلب (echocardiographic assessment) عند الأسبوع الرابع، والتحقق النسيجي المرضي. يحقق البروتوكول المحسن معدل بقاء بنسبة 95% لمدة 24 h (19 من أصل 20 حيواناً)؛ ومن بين الناجين، حقق 94.7% (18 من أصل 19) معيار النجاح الديناميكي الدموي المحدد مسبقاً عند الأسبوع الرابع، مما أدى إلى معدل نجاح إجمالي للنموذج بنسبة 90% (18 من أصل 20 حيواناً)، وهو ما تم تأكيده عبر تخطيط صدى القلب والتحليل النسيجي. يوفر هذا النموذج الموحد منصة موثوقة وقابلة للتكرار لاستقصاء آليات تنكس الصمام وتقييم التدخلات العلاجية المرشحة.

المقدمة

لا يزال مرض صمامات القلب يشكل عبئاً صحياً كبيراً في كل من الدول المتقدمة والنامية، مع ارتفاع معدلات الانتشار بالتوازي مع شيخوخة السكان1. ورغم أن عملية زراعة الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVI) قد أحدثت تحولاً في علاج تضيق الصمام الأبهري الشديد2,3، إلا أن الآليات الخلوية والجزيئية التي تؤدي إلى تنكس الصمام لا تزال غير مفهومة بشكل كامل، ولا يوجد علاج دوائي معتمد لإبطاء تطور المرض أو عكس مساره4,5. وتتمثل إحدى العقبات الرئيسية في أبحاث أمراض الصمامات في محدودية توفر الأنسجة المصابة للفحص6,7؛ حيث يصعب الحصول على عينات من الصمام الأبهري البشري بكميات كافية، كما أن النماذج الحيوانية التي تحاكي التغيرات المرضية في الصمام بدقة كانت نادرة بالمثل8. وقد دفعت هذه الفجوة إلى بذل جهود مستمرة لتطوير نماذج حيوانية تعيد إنتاج الميزات الهيموديناميكية والنسيجية لتضيق الصمام الأبهري (AVS).

تتطلب النهج الغذائية التقليدية، مثل التغذية عالية الدهون لفترات طويلة في فئران ApoE⁻/⁻، فترة تتراوح بين 20 و24 أسبوعاً، وتؤدي إلى معدلات نجاح منخفضة، حيث تطور أقلية فقط من الحيوانات نمطاً ظاهرياً تضيقياً محدداً9,10,11,12. وقد عالج نموذج إصابة الصمام الناتج عن سلك التوجيه الذي وصفه Honda وزملاؤه العديد من هذه القصور من خلال إحداث إصابة ميكانيكية في شرفات الصمام عبر الوصول إلى الشريان السباتي13. وتتضمن التقنية الأصلية تشريح الشريان السباتي، وتمرير سلك التوجيه عكسياً إلى الصمام الأبهر، وكشط الشرفات بشكل متكرر، وتدوير السلك؛ مما ينتج عنه تغيرات هيموديناميكية سريعة خلال أيام ونمط ظاهري تضيقي مستقر بحلول الأسبوع الرابع13,14,15,16. وبسبب سرعتها ومباشرتها النسبية، تم اعتماد طريقة Honda على نطاق واسع في أبحاث الصمامات الحديثة. ومع ذلك، لا تزال هناك عدة فجوات مهمة؛ حيث لم يتم توثيق التفاصيل الإجرائية الكاملة بشكل وافٍ في المراجع العلمية، وتفتقر العملية إلى التوحيد القياسي بين المختبرات، كما لم يتم التطرق بشكل منهجي إلى دور السيطرة على النزيف، وهو محدد رئيسي للمراضة في الفترة المحيطة بالجراحة في هذا النموذج. وتؤدي هذه التناقضات إلى تقليل قابلية إعادة إنتاج النتائج وتحد من إمكانية التطبيق السريري.

لقد افترض الباحثون أن التحسين المنهجي للسيطرة على النزيف يمكن أن يحسن بشكل ملموس من معدلات البقاء على قيد الحياة في الفترة المحيطة بالجراحة ومن موثوقية النموذج. يقدم هذا البروتوكول نهجاً مُنقحاً وموحداً يعتمد على طريقة Honda من خلال إدخال منصة دعم وعائية مصممة خصيصاً ومطبوعة بتقنية ثلاثية الأبعاد. يتيح هذا الجهاز إمكانية ضبط الشد الطولي على الشريان السباتي، مما يوفر إرقاءً مؤقتاً كاملاً أثناء إدخال سلك التوجيه وسحبه دون سحق الوعاء الدموي. ومن خلال هذا النهج، يحقق البروتوكول المُحسَّن معدل بقاء بنسبة 95% لمدة 24 h (19 من أصل 20 حيواناً)؛ ومن بين الناجين، حققت نسبة 94.7% (18 من أصل 19) معايير النجاح الديناميكي الدموي المحددة مسبقاً عند مرور 4 أسابيع، مما أدى إلى معدل نجاح إجمالي للنموذج بنسبة 90% (18 من أصل 20 حيواناً). كما تم توفير توثيق إجرائي خطوة بخطوة لتسهيل إعادة إنتاج التجربة في المختبرات المختلفة.

البروتوكول

ملاحظة: تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة في هذا البروتوكول وفقاً لدليل الرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية، وقد تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في مستشفى غرب الصين (بروتوكول رقم 20240311055). تم استخدام ذكور الفئران من سلالة C57BL/6 (بعمر 8–10 أسابيع؛ وبوزن 22–25 g تقريباً) وإناث الفئران من سلالة C57BL/6 (بعمر 8–10 أسابيع؛ وبوزن 18–20 g تقريباً) طوال فترة الدراسة. جميع المواد والكواشف والأدوات والبرامج والأجهزة المخصصة المستخدمة في هذا البروتوكول، بما في ذلك منصة دعم الأوعية الدموية المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمخصصة، مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير قبل العملية والشق الجراحي

  1. خدر الفأر باستخدام الإيزوفلوران (3% للحث، و1.5–2% للمحافظة) المبخر في أكسجين 100%. تحقق من عمق التخدير الكافي من خلال التأكد من غياب منعكسات سحب القدم (قرص إصبع القدم).
    تنبيه: الإيزوفلوران مخدر متطاير. استخدمه مع نظام سحب نشط أو في منطقة جيدة التهوية، وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، واتبع إجراءات السلامة المؤسسية.
  2. ضع مرهم العين في كلتا العينين. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري على منصة جراحية منظمة الحرارة ومثبتة عند 37 °C.
  3. جهز الحقل الجراحي بإزالة الشعر من المنطقة الرقبية الأمامية باستخدام كريم كيميائي لإزالة الشعر.
  4. طهر الجلد بثلاث دورات متبادلة من بوفيدون-أيودين (أو كلورهيكسيدين) وكحول 70% (أو محلول ملحي معقم دافئ)، مع الإنهاء بالمطهر.
  5. قم بحقن ليدوكائين 0.5% تحت الجلد على طول خط الشق المخطط له لتسكين الألم الموضعي الاستباقي.
  6. ثم قم بإجراء شق جلدي طولي في الخط المتوسط (حوالي 1.0–1.5 cm) في الجزء الأمامي من الرقبة، بحيث يكون موقعه إلى يمين الخط المتوسط للرغامي قليلاً، باستخدام مقصات دقيقة.
    تنبيه: قد تسبب المقصات الدقيقة والإبر والأسلاك الموجهة والأدوات الحادة الأخرى إصابات. تعامل معها بحذر وتخلص من الأدوات الحادة المستخدمة في حاويات الأدوات الحادة المعتمدة.

2. عزل الوعاء الدموي ووضع الغرز

  1. باستخدام مجهر ستيريو جراحي، يتم كشف الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) عن طريق التشريح غير الحاد عبر طبقات اللفافة والعضلات التي تعلوه. افصل الشريان السباتي المشترك الأيمن بعناية عن العصب المبهم المجاور والأنسجة الضامة المحيطة، مع الحرص على تجنب التهيج الميكانيكي للعصب المبهم.
    ملاحظة: حافظ على رطوبة الغدد اللعابية والأنسجة المكشوفة باستخدام محلول ملحي معقم دافئ طوال فترة الإجراء لمنع الجفاف.
  2. قم بربط الطرف القاصي للشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) بشكل دائم باستخدام خيط حريري 6-0 مربوط بعقدة محكمة غير قابلة للانزلاق.
  3. ضع عقدة انزلاقية رخوة من خيط حريري 6-0 حول الجزء الداني من الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA)، مع تركها غير مشدودة لاستخدامها لاحقاً أثناء إدخال السلك الموجه.

3. تطبيق المنصة وبضع الشريان

ملاحظة: قبل الجراحة، قم بتعقيم المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين (EtO)، متبوعاً بتهوية كافية، وقم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية المعدنية عن طريق autoclave.

تحذير: أكسيد الإيثيلين مادة سامة وقابلة للاشتعال ومسرطنة. استخدم التعقيم بـ EtO فقط في المرافق المعتمدة، مع السماح بتهوية كافية، واتباع إجراءات المؤسسة الخاصة بالتخلص من النفايات.

  1. أدخل منصة دعم الأوعية الدموية المطبوعة ثلاثية الأبعاد بعناية أسفل الجزء المعزول من الشريان السباتي الأصيل الأيمن (RCCA)، مع وضع القمة التي على شكل حرف V مقلوب مباشرة تحت الوعاء الدموي.
  2. اضبط المنصة ببطء لزيادة الشد الطولي على الـ RCCA عن طريق تعشيق الغرز الموضوعة مسبقاً في الحزوز الجانبية الأعلى تدريجياً.
    ملاحظة: تم تصميم القمة التي على شكل حرف V مقلوب بزاوية 120° لتتلاءم مع انحناء الوعاء الدموي دون سحق الجدار. توقف عن زيادة الشد عند النقطة التي لا يصبح فيها النبض الشرياني مدركاً بصرياً. تضمن هذه النهاية البصرية الحرجة تحقيق إرقاء مؤقت دون إلحاق إصابة مفرطة بالوعاء الدموي.
  3. أجرِ شقاً شريانياً مستعرضاً صغيراً (حوالي نصف محيط الوعاء) في جزء الـ RCCA المثبت باستخدام مقصات دقيقة. يجب أن يحدث نزيف ضئيل أو لا يحدث نزيف على الإطلاق إذا تم ضبط الشد بشكل صحيح.

4. إدخال سلك التوجيه وإصابة الصمام

  1. تحت الرؤية المجهرية، أدخل السلك الدليل (بقطر 0.014 inch / 0.36 mm) في التجويف الشرياني عبر الشق الشرياني المستعرض في اتجاه تراجعي نحو جذر الأبهر.
    ملاحظة: هذا القطر هو المعياري في نماذج إصابات السلك الدليل المنشورة ويقارب قطر تجويف الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) في الفئران (~0.4–0.5 mm)، مما يعطي نسبة سلك دليل إلى وعاء تبلغ حوالي 0.7–0.9.
    تنبيه: يمكن للسلك الدليل أن يثقب الأوعية أو الأنسجة المحيطة. قم بدفعه ببطء تحت الرؤية المجهرية وتخلص من الأسلاك الدليلة المستخدمة كأدوات حادة أو نفايات جراحية ملوثة.
  2. أحكم ربط العقدة المنزلقة القريبة الموضوعة مسبقاً حول كل من الوعاء والسلك الدليل لتحقيق إرقاء تام في موقع الإدخال. وبمجرد تأمين العقدة المنزلقة، قم بإزالة المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد بعناية من أسفل الوعاء.
    ملاحظة: إذا حدث نزيف غير متوقع أثناء الإدخال، أو إذا تسبب قطر السلك الدليل في احتكاك مفرط، قم بإعادة وضع المنصة مؤقتاً للمساعدة في الإرقاء، أو قلل شد المنصة قليلاً للسماح بتوسع تجويف الوعاء قبل إعادة محاولة الإدخال.
  3. ادفع السلك الدليل بعناية في اتجاه تراجعي عبر RCCA، مروراً بقوس الأبهر، ونحو الصمام الأبهري. وتحت توجيه تخطيط صدى القلب في الوقت الفعلي، تأكد من أن طرف السلك الدليل قد عبر الصمام الأبهري ودخل البطين الأيسر.
  4. مع إحكام ربط العقدة المنزلقة القريبة تماماً للحفاظ على الإرقاء، قم بإجراء إصابة الصمام الميكانيكية عن طريق تنفيذ 100 حركة دفع وسحب (ذهاباً وإياباً) عبر الصمام الأبهري، تليها 100 حركة دورانية للسلك الدليل مقابل وريقات الصمام.
    ملاحظة: تم تحديد 100 حركة دفع وسحب و100 حركة دورانية من خلال تحسينات داخلية مكثفة باعتبارها الأعداد التي تحقق أفضل توازن بين وقت الإجراء والحث الموثوق لتضيق ذو دلالة ديناميكية دموية.

5. سحب سلك التوجيه وإغلاق الجرح

  1. بعد الانتهاء من إحداث إصابة الصمام، اسحب سلك التوجيه ببطء من الوعاء الدموي.
  2. قم على الفور بتحويل العقدة المنزلقة القريبة إلى عقدة دائمة غير منزلقة لربط الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) القريب ومنع أي نزيف بعد الإجراء.
  3. أغلق شق الجلد باستخدام غرز نايلون 5-0 متقطعة أو مشابك جراحية للجروح.
  4. لا تعطِ الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDs) بعد العملية. ولا تعطِ المضادات الحيوية في الفترة المحيطة بالجراحة، حيث يتم إجراء العملية في ظروف معقمة.
  5. انقل الحيوان إلى قفص تعافي نظيف ودافئ، وراقبه باستمرار حتى يستعيد القدرة الكاملة على الحركة.

6. التقييم بالموجات فوق الصوتية للقلب للديناميكا الدموية عبر الصمام

  1. إجراء تقييمات تخطيط صدى القلب لجميع الفئران الناجية بعد 4 أسابيع من الجراحة لتقييم شدة تضيق الصمام الأبهري.
  2. تحفيز التخدير بوضع الحيوان في غرفة تحريض تحتوي على 3% isoflurane في 100% أكسجين. التأكد من عمق التخدير عبر التحقق من فقدان منعكسات سحب القدم. إزالة الشعر من الجدار الأمامي للصدر باستخدام كريم كيميائي لإزالة الشعر. وضع مرهم عيني على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
  3. نقل الفأر المخدر إلى منصة تصوير منظمة الحرارة في وضع الاستلقاء الظهري.
  4. تثبيت القوائم بأقطاب تخطيط كهربائية القلب (ECG) السطحية للمراقبة المستمرة لمعدل ضربات القلب. معايرة تركيز isoflurane (عادةً 1.0–1.5%) للحفاظ على معدل ضربات قلب فسيولوجي مستقر يتراوح بين 450–550 beats per min.
  5. تنظيف الجدار الأمامي للصدر ووضع طبقة سخية من هلام الاقتران الصوتي المسخن مسبقاً.
  6. اكتساب صور وضع B-mode
    1. باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية Vevo 3100 مع محول طاقة MX550D (40 MHz)، اضغط على تحكم B-Mode لبدء التصوير الحي ثنائي الأبعاد.
    2. وضع محول الطاقة في الموضع الجانبي بجانب القص للحصول على عرض المحور الطولي بجانب القص للبطين الأيسر، والصمام الأبهري، والشريان الأبهري الصاعد. تحسين العمق، والعرض، وكسب 2D gain.
  7. اكتساب وضع M-mode وقياس البطين الأيسر
    1. من عرض المحور الطولي بجانب القص، اضغط على تحكم M-Mode. وضع خط أخذ العينات عبر البطين الأيسر عند مستوى العضلات الحليمية.
    2. الضغط على Start لبدء الاكتساب. بمجرد الحصول على تتبع مستقر يغطي ثلاث دورات قلبية على الأقل، اضغط على Save.
    3. في برنامج Vevo LAB، استخدم أداة LV Trace لتتبع شغاف القلب عند نهاية الانبساط ونهاية الانقباض، وتسجيل الأبعاد الداخلية للبطين الأيسر، وسماكة الجدار الأمامي والخلفي (LVAWd, LVPWd)، وكتلة البطين الأيسر.
  8. إعادة وضع وتوجيه محول الطاقة لاكتساب عرض مخصص للقوس الأبهري.
    ​ملاحظة: يعد الحصول على هذا العرض المحدد للقوس الأبهري أمراً ضرورياً لقياسات السرعة عبر الصمام بدقة، حيث يضمن المحاذاة المثلى لحزمة الموجات فوق الصوتية مع اتجاه تدفق الدم عبر الصمام الأبهري.
  9. تقييم Doppler الملون
    1. من عرض القوس الأبهري، اضغط على تحكم Color. وضع مربع اللون فوق الصمام الأبهري والجزء القريب من الشريان الأبهري الصاعد.
    2. ضبط مقياس اللون والكسب بحيث يظهر النفاث الانقباضي بوضوح دون حدوث تداخل (aliasing). اضغط على Start، ثم Save.
  10. قياس سرعة Doppler ذو الموجة النبضية
    1. الضغط على تحكم PW Doppler. وضع بوابة حجم العينة عند أضيق نقطة في النفاث (vena contracta)، وتطبيق تصحيح الزاوية (<60°).
    2. الضغط على Start لبدء التتبع الطيفي؛ وبمجرد تسجيل ثلاث دورات قلبية على الأقل، اضغط على Save. في برنامج Vevo LAB، قم بقياس ذروة السرعة عبر الصمام باستخدام أداة Peak Velocity، مع حساب المتوسط لثلاث دورات على الأقل.

7. المعالجة النسيجية وتلوين جذر الأبهر

  1. بعد التقييم باستخدام تخطيط صدى القلب، تأكد من التخدير العميق من خلال التحقق من الغياب التام لمنعكس سحب القدم. قم بإجراء الخلع الرقبي كطريقة ثانوية للقتل الرحيم، وفقاً لإرشادات الجمعية الأمريكية للطب البيطري (AVMA) لقتل الحيوانات رحيماً (طبعة 2020) والبروتوكولات المعتمدة مؤسسياً.
    تنبيه: تعتبر جيف الحيوانات، والأنسجة المستأصلة، والمواد الملوثة بالدم نفايات بيولوجية/حيوانية. تخلص منها وفقاً للوائح السلامة البيولوجية ومرافق الحيوانات المؤسسية.
  2. قم بإجراء عملية بضع الصدر باستخدام مقص جراحي مجهري لكشف القلب.
  3. أدخل إبرة تروية في قمة البطين الأيسر وقم بشطف الدورة الدموية الجهازية بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم وبارد. ويُستدل على نجاح التروية من خلال شحوب لون الكبد والرئتين.
  4. استأصل القلب السليم واغمره في بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 24 h لضمان التثبيت الكامل.
    تنبيه: البارافورمالدهيد مادة سامة ومخرشة. تعامل مع PFA بتركيز 4% داخل خزانة استنشاق كيميائية مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وتخلص من نفايات PFA كنفايات كيميائية خطرة.
  5. انقل النسيج المثبت إلى جهاز معالجة الأنسجة الآلي لإجراء التجفيف المتسلسل من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول، يليه الترويق باستخدام الزيلين والتسلل بشمع البارافين عند 65 °C.
    تنبيه: الزيلين مادة قابلة للاشتعال وسامة، والبارافين الساخن قد يسبب حروقاً. تعامل مع الزيلين في خزانة استنشاق أو جهاز معالجة معتمد، وتخلص من النفايات التي تحتوي على الزيلين كنفايات كيميائية خطرة.
  6. قم بطمر القلوب المعالجة في قوالب البارافين.
    ملاحظة: يعد التوجيه الصحيح للقلب عند الطمر أمراً بالغ الأهمية. ضع القلب بحيث يسمح بأخذ مقاطع عرضية عبر جذر الأبهر عند مستوى شرفات الصمامات الثلاث.
  7. باستخدام الميكروتوم الدوار، قم بقطع مقاطع عرضية متسلسلة بسمك 4–5 µm عبر مستوى الصمام الأبهري، مع ضمان شمول الشرفات الثلاث جميعاً. ثبت المقاطع على شرائح زجاجية واحفظها في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بإجراء صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) على شرائح مختارة لتقييم مورفولوجيا الأنسجة، وإعادة التشكيل الهيكلي، وسمك شرفات الصمامات.
  9. قم بإجراء صبغ Von Kossa على المقاطع المتسلسلة المجاورة للكشف عن التكلسات خللية التغذية وقياسها كمياً، والتي تظهر على شكل ترسبات معدنية بنية داكنة إلى سوداء داخل شرفات الصمامات.

8. الإجراء الجراحي وهمي

ملاحظة: يصف هذا القسم إجراء التحكم الشبيه (Sham control). تخضع الفئران في مجموعة التحكم الشبيه لنفس عمليات التخدير، وتجهيز الجلد، وكشف الوعاء الدموي، وبضع الشريان، وإدخال السلك الموجه تراجعياً كما في مجموعة إصابة السلك الأبهري (AWI)؛ يتم دفع السلك الموجه إلى المستوى فوق الصمامي ولكن لا يتم تمريره عبر الصمام الأبهري، ولا يتم إجراء أي إصابة ميكانيكية للصمام.

  1. قم بتخدير الفأر وتحضير المجال الجراحي كما هو موضح في الخطوات من 1.1. إلى 1.5.
  2. تحت الرؤية بالمجهر الاستريو، قم بكشف الشريان السباتي الأصلي الأيمن (RCCA) عن طريق التشريح الكليل كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  3. قم بربط الطرف القاصي من الـ RCCA بشكل دائم باستخدام خيط جراحي حريري 6-0، وضع عقدة منزلقة رخوة في الجهة الدانية (كما في الخطوتين 2.2–2.3).
  4. قم بإجراء شق شرياني مستعرض وأدخل سلك التوجيه كما هو موضح في الخطوات من 3.1 إلى 4.2.
  5. قم بدفع سلك التوجيه في اتجاه تراجعي وصولاً إلى المستوى فوق الصمامي للأبهر الصاعد تحت توجيه تخطيط صدى القلب، مع التأكد من أن طرف سلك التوجيه لا يعبر الصمام الأبهري.
    ملاحظة: لا تقم بحركات دفع-سحب أو حركات تدويرية مسببة لإصابة الصمام الموضحة في الخطوة 4.4. اسحب سلك التوجيه وقم فوراً بربط الـ RCCA في الجهة الدانية كما هو موضح في الخطوتين 5.1–5.2.
  6. أغلق شق الجلد باستخدام غرز نايلون 5-0 متقطعة أو مشابك الجروح.
    ملاحظة: كما هو الحال في مجموعة AWI، يتم توفير التسكين أثناء الجراحة عن طريق تسريب الليدوكائين الموضعي (الخطوة 1.5). انقل الحيوان إلى قفص تعافٍ مدفأ وراقبه حتى يستعيد القدرة على الحركة بالكامل.
  7. أخضع فئران مجموعة Sham لمراقبة ما بعد الجراحة، وتقييم تخطيط صدى القلب في الأسبوع الرابع، ومعالجة نسيجية مطابقة لما تم تطبيقه على مجموعة AWI.

9. التحليل الإحصائي وتصميم الدراسة

  1. خضع 20 فأراً (10 ذكور، 10 إناث) لإجراء AWI، بينما خضع 6 فئران من سلالة C57BL/6 (3 ذكور، 3 إناث) لإجراء Sham على مدار الدراسة.
  2. قياس ذروة السرعة عبر الصمام (المعيار الذي يحدد نجاح النموذج) في جميع الحيوانات الناجية (19 AWI، و6 Sham).
  3. تحليل المؤشرات التفصيلية لتخطيط صدى القلب والأنسجة في مجموعة فرعية محددة مسبقاً ومتوازنة من حيث الجنس مكونة من 6 فئران AWI (3 ذكور، 3 إناث).
  4. التأكد من أن جميع قياسات تخطيط صدى القلب والأنسجة قد أجراها باحثون لا يعرفون توزيع المجموعات (blinded).
  5. تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار Shapiro-Wilk قبل إجراء الاختبارات البارامترية. مقارنة مجموعتين مستقلتين (AWI مقابل Sham) باستخدام اختبار t-test للطلاب غير المقترن ثنائي الذيل.
  6. تحليل وعرض بيانات البقاء على قيد الحياة باستخدام طريقة Kaplan-Meier.
  7. إجراء جميع التحاليل باستخدام برنامج GraphPad Prism. تقديم البيانات كمتوسط ± SEM، مع اعتبار القيمة p < 0.05 دالة إحصائياً.

النتائج

تطوير منصة مطبوعة ثلاثية الأبعاد للسيطرة على النزيف

لمعالجة النزيف في الفترة المحيطة بالجراحة — وهو المصدر الرئيسي للمراضة والوفيات في نموذج تضيق الصمام الأبهري التقليدي المستحث بسلك التوجيه — تم تصميم منصة دعم وعائية مطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1تم تصنيع المنصة عن طريق الطباعة بالتجسيم الضوئي (SLA) باستخدام راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً (متوافق مع معايير USP Class VI / ISO 1093)، وبسماكة هيكلية تبلغ 1.07 مم. وبعد الطباعة، غُسلت القطع في كحول الإيزوبروبيل لإزالة الراتنج غير المتصلب، ثم خضعت للمعالجة اللاحقة تحت الأشعة فوق البنفسجية. وقد تم توفير ملف التصميم الكامل (.stp) لتمكين إعادة إنتاج المنصة على أنظمة SLA القياسية. وتتميز المنصة بسطح قمي على شكل حرف V مقلوب بزاوية رأس تبلغ 120° (الشكل 1-أ-ب)، والذي يتوافق مع انحناء الشريان السباتي الأصلي الأيمن المعزول دون التسبب في ضغط مفرط على الجدار. ثلمات جانبية متعددة متدرجة (الشكل 1ج–D) تتيح هذه الطريقة للمشغل تعشيق الغرز الموضوعة مسبقاً وتطبيق شد طولي قابل للتعديل على الوعاء الدموي. يتم زيادة الشد تدريجياً حتى يتوقف ظهور النبض الشرياني، وهي نقطة نهاية بصرية تشير إلى تحقيق إرقاء مؤقت كافٍ. يوفر هذا النهج مجالاً جراحياً مستقراً لإجراء بضع الشريان وإدخال السلك الدليل، مع تجنب حدوث إصابة سحق مفرطة في جدار الوعاء الدموي.

التأكيد أثناء العملية الجراحية على وضعية السلك الموجه

تم التحقق من الوضع الصحيح لسلك التوجيه على مرحلتين خلال الإجراء. أولاً، تحت الرؤية المباشرة بالمجهر الستيريوسكوبي، لوحظ دخول سلك التوجيه إلى لمعة RCCA عبر بضع الشريان المستعرض في اتجاه تراجعي (الشكل 2A). ثانياً، أكد التصوير بالموجات فوق الصوتية للقلب في الوقت الفعلي أن طرف سلك التوجيه قد اجتاز الصمام الأبهر ودخل البطين الأيسر. حدد التصوير بالنمط B سلك التوجيه كأثر خطي عالي الصدى يعبر مستوى الصمام الأبهر (الشكل 2B). وأظهر تصوير الدوبلر الملون تدفقاً مضطرباً موضعياً عند مستوى الصمام الأبهر، مما قدم تأكيداً إضافياً على وضع سلك التوجيه عبر وريقات الصمام (الشكل 2C؛ الفيديو التكميلي 1).

البقاء على قيد الحياة في الفترة المحيطة بالجراحة ومعدل نجاح النموذج

أدى دمج المنصة القابلة لضبط الشد في سير العمل الجراحي إلى تحقيق معدلات بقاء مبكرة مرتفعة. وأظهر تحليل كابلان-ماير (Kaplan-Meier) أن معدل البقاء بلغ 95% بعد 24 ساعة من الجراحة (19 من أصل 20 فأراً؛ الشكل 3A). وكشف فحص ما بعد الوفاة للحيوان الوحيد الذي لم ينجُ عن عدم وجود دليل على حدوث نزيف حاد، أو تلف هيكلي، أو نقص تروية قلبية، مما يشير إلى أن الوفاة كانت تعزى إلى مضاعفات مرتبطة بالتخدير وليس إلى الصدمة الجراحية. تم تقييم نجاح النموذج بعد 4 أسابيع باستخدام معيار محدد مسبقاً: وهو تجاوز ذروة سرعة التدفق عبر الصمام 2,0 mm/s، إلى جانب النتائج النسيجية الداعمة. ومن بين الحيوانات الـ 19 الناجية، استوفى 18 منها (94.7%) هذا الحد، مما حقق معدل نجاح إجمالي للنموذج بنسبة 90% عبر المجموعة الكلية (18 من أصل 20 فأراً؛ الشكل 3B). وكانت النتائج قابلة للمقارنة بين الجنسين: حيث بلغ معدل البقاء بعد 24 ساعة 9 من 10 في الذكور، و10 من 10 في الإناث، وبلغ معدل نجاح النموذج بعد 4 أسابيع 9 من 10 (90%) في كلا الجنسين؛ وكانت حالة الوفاة الوحيدة في الفترة المحيطة بالجراحة لذكر (مرتبطة بالتخدير)، وكان الفشل الوحيد في النموذج لأنثى ناجية.

التأكيد بالتصوير المقطعي للصدى لتضيق الصمام الأورطي

أكد تخطيط صدى القلب عبر الصدر بعد 4 أسابيع من الجراحة وجود تغيرات ديناميكية دموية تتفق مع تضيق الأبهر الشديد في مجموعة AWI. تم عرض قيم تخطيط صدى القلب الكمية كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)؛ وتم تحليل معاملات وظيفة وإعادة تشكيل البطين الأيسر في 6 فئران من مجموعة Sham و6 فئران من مجموعة AWI، بينما قيست ذروة السرعة عبر الصمام في جميع فئران AWI الناجية ومجموعة التحكم Sham (العدد = 19 AWI، العدد = 6 Sham). كان الكسر القذفي للبطين الأيسر أقل قليلاً في مجموعة AWI مقارنة بمجموعة التحكم Sham بعد 4 أسابيع (56.21 ± 1.15% مقابل 61.57 ± 2.12%؛ p = 0.0503؛ الشكل 3C)، وهو فرق لم يصل إلى الدلالة الإحصائية. أظهرت تسجيلات دوپلر بالموجات النبضية زيادة ملحوظة في سرعة النفاث عبر الصمام في مجموعة AWI، حيث وصلت إلى 2740.89 ± 104.10 mm/s، مقارنة بـ 98.00 ± 126.24 mm/s في مجموعة التحكم Sham (الشكل 3D). وأكد التحليل الكمي وجود ارتفاع ذو دلالة إحصائية عالية في ذروة سرعة النفاث عبر الصمام في مجموعة AWI بالنسبة لمجموعة التحكم Sham (p < 0.01؛ الشكل 3E). وتماشياً مع المرحلة المبكرة من التكيف مع فرط الحمل الضغطي، أظهرت مجموعة AWI إعادة تشكيل مركزية للبطين الأيسر: حيث زاد سمك الجدار الأمامي الانبساطي بشكل ملحوظ (LVAWd 1.14 ± 0.02 مقابل 0.96 ± 0.03 mm؛ p = 0.016؛ الشكل 3F)، بينما كان سمك الجدار الخلفي الانبساطي وكتلة البطين الأيسر أعلى ولكن لم يصلا إلى الدلالة الإحصائية (LVPWd 1.01 ± 0.12 مقابل 0.76 ± 0.02 mm، p = 0.0650، الشكل 3G؛ كتلة LV 124.51 ± 10.63 مقابل 104.47 ± 2.45 mg، p = 0.0961، الشكل 3H).

التحقق النسيجي المرضي من إعادة تشكيل الصمام والتكلس

أكد الفحص النسيجي لجذور الشريان الأبهر النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق تخطيط صدى القلب. عُرِضت القيم النسيجية الكمية كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، وحُللت في 6 فئران من مجموعة Sham و6 فئران من مجموعة AWI. وأظهر صبغ H&E في مجموعة AWI تضخماً ملحوظاً في الشرفات واختلالاً في التنظيم الهيكلي، وهي سمات كانت غائبة في ضوابط مجموعة Sham (الشكل 3I). وأكد القياس المورفومتري الكمي وجود زيادة معنوية في متوسط سمك شرفة الصمام في مجموعة AWI مقارنة بمجموعة Sham (p < 0.01؛ الشكل 3J). كما أظهر صبغ Von Kossa تكلسات ضمورية واسعة النطاق داخل شرفات الصمام المتضخمة في مجموعة AWI، والتي حُدِّدت على شكل رواسب معدنية يتراوح لونها بين البني الداكن والأسود. بينما أظهرت ضوابط مجموعة Sham ترسبات معدنية ضئيلة (الشكل 3K). وكشف تحليل الصور الكمي عن زيادة معنوية في إجمالي مساحة التكلس (µm2) في مجموعة AWI بالنسبة لضوابط مجموعة Sham (p < 0.01؛ الشكل 3L).

مخططات للمكونات الميكانيكية؛ أقسام مُصنفة من A إلى D توضح مواصفات التصميم.
الشكل 1تصميم منصة دعم الأوعية الدموية المطبوعة ثلاثية الأبعاد كما تظهر في أربعة مناظير. (A(منظر مائل أمامي أيسر).B(منظور مائل من الخلف جهة اليمين).كربون( منظر جانبي للملف الشخصي للهندسة الطولية العامة للمنصة. (دمنظر مائل يسلط الضوء على منطقة القمة ذات الشكل V المقلوب. تسميات المكونات: 10، جسم المنصة؛ 120، الأذرع الجانبية؛ 121، الحزوز الجانبية المتدرجة؛ 130، الطرف التشغيلي؛ 140، قمة الإدخال ذات الشكل V المقلوب؛ 150، سطح الدعم الملامس للوعاء؛ 160، منحدر الانتقال بين الحزوز المتجاورة؛ 190، الشريان السباتي الأصلي الأيمن (RCCA). صُنعت المنصة من راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً (السماكة الهيكلية: 1.07 مم). تم إنشاء الرسم الهيكلي ثلاثي الأبعاد بواسطة المؤلفين من ملف تصميم CAD الأصلي (.stp) لمنصة دعم الأوعية الدموية باستخدام FreeCAD، وهو برنامج مجاني ومفتوح المصدر للتصور والنمذجة بواسطة التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD). لم يتم اقتباس أي منشورات لجهات خارجية أو رسومات محمية بحقوق الطبع والنشر. ملف تصميم CAD الأصلي متاح كملف تكميلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التجهيز الجراحي مع إدخال القسطرة؛ صور بالموجات فوق الصوتية لتدفق الدم وتصور الأوعية الدموية.
الشكل 2التأكيد أثناء الجراحة وعن طريق تخطيط صدى القلب لوضع سلك التوجيه. (Aصورة فوتوغرافية أثناء الجراحة تظهر الإدخال الرجوعي لسلك التوجيه (السهم) عبر بضع الشريان المستعرض إلى تجويف الشريان السباتي العام الأيمن (RCCA) تحت الرؤية المباشرة بالمجهر الستيريوسكوبي.Bصورة بالموجات فوق الصوتية للقلب في نمط B تُظهر سلك التوجيه (الذي يظهر كأثر خطي عالي الصدى؛ السهم) وهو يعبر الصمام الأبهر ويدخل البطين الأيسر.سيصورة تخطيط صدى القلب بتكنيك دوپلر الملون توضح تدفقاً مضطرباً موضعياً عند مستوى الصمام الأبهر، مما يؤكد وضع سلك التوجيه عبر وريقات الصمام. يظهر التصوير بالوقت الحقيقي باستخدام دوپلر الملون للتدفق عبر الصمام أثناء وضع سلك التوجيه في الفيديو التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل البقاء، رسم بياني للمقارنة، سرعة النفاث عبر الصمامي، تخطيط صدى القلب، نتائج علم الأنسجة.
الشكل 3: نتائج البقاء على قيد الحياة، والديناميكا الدموية، وإعادة تشكيل البطين، والنتائج النسيجية المرضية لنموذج إصابة الشريان الأبهر بالسلك (AWI) المُحسّن. (A) منحنى كابلان-ماير لبقاء الفئران المصابة بـ AWI على قيد الحياة خلال 24 ساعة (العدد = 20). (Bنموذج النجاح (باللون الأحمر) مقابل الفشل (باللون الأسود) في مجموعة AWI عند الأسبوع الرابع (العدد = 20)؛ عُرِّف النجاح بأنه ذروة السرعة عبر الصمام > ٢٠ ملم/ثانية. (كربونالكسر القذفي (EF؛ p = 0.0503). (د) مخططات صدى القلب بنمط دوپلر ذو الموجة النبضية (PW) ممثلة لفأر من مجموعة الشام (يساراً) وفأر من مجموعة احتشاء الجدار الأمامي AWI (يميناً). (هـ(ذروة السرعة عبر الصمام (العدد = 19 AWI، العدد = 6 Sham؛ p < 0.0001). (فسماكة الجدار الأمامي للبطين الأيسر أثناء الانبساط (LVAWd؛ p = 0.0016). (ج) سمك الجدار الخلفي للبطين الأيسر في نهاية الانبساط (LVPWd؛ p = 0.0650). (هـ(كتلة البطين الأيسر)p = 0.0961). (I(مقاطع ممثلة لجذر الأبهر مصبغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (Sham، يسار؛ AWI، يمين). (ج(سمك وريقة الصمام الأورطي)p < 0.0001). (كـ) مقاطع ممثلة لجذر الأبهر مصبغة بطريقة Von Kossa (المجموعة الضابطة "Sham" على اليسار؛ ومجموعة الإصابة بجدار الأبهر "AWI" على اليمين). (لـإجمالي مساحة ترسب الكالسيوم (µm2; p < 0.01). أشرطة المقياس = 500 µmبالنسبة لجميع الرسوم البيانية العمودية الكمية، تمثل الأعمدة القيم المتوسطة وتمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). وقد أُجريت المقارنات الكمية بين مجموعتي Sham وAWI في الأجزاء C وE-H وJ وL باستخدام اختبار t للطلاب (Student’s t-test) غير المقترن ثنائي الذيل. البيانات الكمية مستمدة من مجموعتي Sham وAWI (العدد = 6 لكل مجموعة)، باستثناء ذروة السرعة عبر الصمام في الجزء E، والتي قيست في جميع فئران AWI الناجية ومجموعات Sham الضابطة (العدد = 19 لـ AWI، والعدد = 6 لـ Sham). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو التكميلي 1: التصوير بالموجات فوق الصوتية للقلب باستخدام دوبلر الملون لتصور تدفق الدم عبر الصمام أثناء وضع السلك المرشد. يوضح الفيديو تصويراً ملوناً بدوبلر في الوقت الفعلي عند مستوى الصمام الأورطي أثناء إجراء عملية AWI، مما يظهر تدفقاً مضطرباً موضعياً ناتجاً عن وضع سلك التوجيه عبر شرفات الصمام. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول وصفاً تفصيلياً لنموذج حيواني مستقر وآمن للتضيق الأبهري. وتتمثل إحدى ميزات هذا النهج في وجود منصة مساعدة تسهل إدخال سلك التوجيه في الشريان السباتي المشترك. يتم تصنيع هذه المنصة باستخدام الطباعة بالتصوير الحجري المجسم (SLA) من راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياً (بسمك هيكلي 1.07 mm)، وتتضمن سطحاً قميّاً على شكل حرف V مقلوب بزاوية رأس تبلغ 120°؛ وملف التصميم الكامل متاح مجاناً كملف .stp تكميلي. يضمن هذا الجهاز دخول سلك التوجيه بسلاسة، ويتحكم بشكل موضوعي في فقدان الدم أثناء الجراحة، وبذلك يحمي بقاء الفئران في النموذج على المديين القصير والطويل. ومنذ الوصف الأصلي، تم تحسين وتوصيف النموذج المستحث بسلك التوجيه بشكل أكبر، بما في ذلك متغيرات ذات درجات شدة متفاوتة تعاير كثافة الإصابة لإنتاج تضيق يتراوح من الخفيف إلى الشديد17، وتقارير حديثة توثق مضاعفاته أثناء الجراحة18؛ ويعتمد البروتوكول الحالي على هذه المجموعة من الأعمال من خلال المعالجة المنهجية للنزيف أثناء الجراحة.

تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة لنجاح تحفيز النموذج وتستحق اهتماماً خاصاً. أولاً، يجب معايرة درجة الشد الطولي المطبق عبر المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد بدقة: إذ ينبغي زيادة الشد فقط حتى يصبح نبض الشريان غير محسوس بصرياً. ويؤدي الشد غير الكافي إلى استمرار النزيف أثناء عملية شق الشريان، بينما يؤدي الشد المفرط إلى خطر تلف البطانة الداخلية وتمزق الوعاء الدموي. ثانياً، يجب إحكام ربط العقدة الانزلاقية القريبة حول كل من الوعاء الدموي وسلك التوجيه قبل إزالة المنصة؛ حيث يعد إزالة المنصة مبكراً مع عدم إحكام ربط العقدة الانزلاقية السبب الأكثر شيوعاً للنزيف أثناء الإجراء. ثالثاً، يعد التأكيد من دخول سلك التوجيه إلى البطين الأيسر تحت توجيه تخطيط صدى القلب أمراً ضرورياً. فبدون خطوة التحقق هذه، لا يمكن للمشغل التأكد من وضع سلك التوجيه بشكل صحيح عند الصمام الأبهري، وسيؤدي الإصابة غير المكتملة إلى فشل النموذج.

يمكن توقع العديد من المضاعفات الشائعة والتعامل معها. في حالة حدوث نزيف أثناء إدخال السلك الموجه، يجب إعادة وضع المنصة أسفل الوعاء الدموي لإعادة تحقيق الإرقاء المؤقت قبل المتابعة. وفي الحيوانات التي تمتلك شرايين سباتية ذات عيار أصغر، يمكن تقليل شد المنصة قليلاً لتوسيع لمعة الوعاء الدموي لاستيعاب السلك الموجه. لهذا النموذج عدة قيود يجب مراعاتها عند تفسير النتائج؛ إذ تسبب إصابة السلك الميكانيكية إصابة صمامية ميكانيكية والتهابية حادة، وهو ما يختلف عن العملية التنكسية المزمنة المدفوعة بالدهون التي تميز تضيق الصمام الأبهري التكلسي لدى البشر17,19,20,21. وبناءً على ذلك، فإن السمات النسيجية — رغم أنها تعيد إنتاج تثخن الشرفات والتكلس الضموري — قد لا تحاكي بشكل كامل جميع الأحداث الجزيئية للمرض البشري. تم تطوير البروتوكول والتحقق من صحته في كل من ذكور وإناث فئران C57BL/6 التي تتراوح أعمارها بين 8 و10 أسابيع؛ ومع ذلك، فإن قابليته للتطبيق على سلالات أخرى أو حيوانات مسنة تتطلب تحققا مستقلاً. قد تؤدي الاختلافات المرتبطة بالجنس في قطر الشريان السباتي وتشريح القلب إلى تعديل درجة الصعوبة الجراحية والنتائج الديناميكية الدموية؛ لذا يُشجع الباحثون على تسجيل الجنس كمتغير بيولوجي في التحليلات اللاحقة22. بالإضافة إلى ذلك، فإن الربط الدائم للشريان السباتي المشترك الأيمن هو جزء متأصل من الإجراء، ورغم أن دائرة ويليس توفر تروية دماغية جانبية في الفئران، ولم تُلاحظ أي قصورات عصبية واضحة، إلا أنه لا يمكن استبعاد حدوث تأثيرات معرفية أو وعائية دماغية طفيفة. لم يتم إجراء تخطيط صدى القلب الأساسي (قبل الإجراء)؛ حيث كانت مجموعة المحاكاة المتزامنة بمثابة الضابط لوظيفة الصمام الطبيعية، ويُنصح بإجراء مسح أساسي حيثما كان ذلك ممكناً لتمكين المقارنة داخل الحيوان الواحد وفحص التشوهات العفوية النادرة في الصمام الأبهري التي تم الإبلاغ عنها في فئران C57BL/6 (حوالي 0.3% في السلالات غير المعدلة). لم يتم تقييم القصور الأبهري بشكل منهجي في هذه الدراسة؛ لذا فإن تكرار القصور الأبهري الناجم عن الإصابة وعلاقته بشدة التضيق يستوجبان تقييماً مخصصاً وسيتم تناولهما في أعمال مستقبلية.

يجب أيضاً مراعاة العيوب المحتملة لهذه المنصة؛ فقد يتسبب الجهاز في تهيج ميكانيكي للبنى المجاورة، بما في ذلك العصب المبهم الذي يمتد بمحاذاة الشريان السباتي. ويتم تقليل هذا الخطر بفضل الحواف المستديرة وغير الحادة للمنصة، وقمتها التي تتوافق مع الوعاء الدموي بزاوية 120°، وقصر فترة تطبيقها، ولم تُلاحظ في هذه الدراسة أي اضطرابات تنفسية أو مضاعفات ظاهرة أخرى تعزى إلى الجهاز. وبالمقارنة مع النهج البديلة المعتمدة، يوفر هذا البروتوكول المُحسَّن عدة مزايا عملية؛ إذ تتطلب النماذج الغذائية في الفئران من سلالة ApoE⁻/⁻ تغذية عالية الدهون لمدة 20-24 أسبوعاً وتؤدي إلى أنماط تضيق متغيرة، حيث تفشل العديد من الحيوانات في تطوير مرض ذو دلالة هيموديناميكية. أما البروتوكول الحالي فينتج نمط تضيق متسق خلال 4 أسابيع، بمعدل نجاح إجمالي قدره 90% (18 من أصل 20 حيواناً). وبالمقارنة مع طريقة سلك توجيه Honda الأصلية، فإن التقدم الرئيسي لهذا البروتوكول يكمن في التحكم المنهجي في النزيف المحيط بالعملية الجراحية عبر المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

تم التعرف على حدوث نزيف أثناء إدخال السلك الموجه كمضاعفة ناتجة عن التقنية الأصلية، إلا أنه لم يتم التعامل مع هذه المشكلة بشكل كافٍ. وفي الخبرة الاسترجاعية للمختبر ذاته مع الإجراء التقليدي (ما قبل استخدام المنصة) (أكثر من 400 حالة)، حدث نزيف حاد أثناء العملية في ما يقرب من 40% من الحالات، مع وصول نسبة الوفيات بعد النزيف إلى ~60% ونسبة بقاء على قيد الحياة لمدة 24 h بلغت ~75%، حيث كان النزيف — وبشكل أساسي في موقع الوصول إلى الشريان السباتي — مسؤولاً عن جميع الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة تقريباً. وهذا يتفق مع ما توصل إليه Qian et al.، الذين حددوا نزيف موقع ثقب الشريان السباتي كسبب رئيسي للوفاة في الفترة المحيطة بالجراحة في هذا النموذج. ومن خلال التحكم في فقدان الدم، رفعت المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد نسبة البقاء على قيد الحياة لمدة 24 ساعة إلى 95%، مع عدم ملاحظة أي حالات وفاة تعزى إلى النزيف في المجموعة الحالية. وبما أن النزيف لم يعد هو مصدر القلق المحدّد، يمكن تغيير شدة الإصابة الميكانيكية لإنتاج درجات متفاوتة من شدة التضيق. ولهذه القابلية للضبط أهمية مباشرة في التطبيقات الانتقالية: فبالنسبة للعلاجات المرشحة ذات التأثيرات المتواضعة، قد يكون من الضروري إحداث إصابة أساسية أكثر شدة للكشف عن الفروق المرتبطة بالعلاج والتي قد تتواري في حال استخدام نموذج أقل شدة.

يعتبر هذا النموذج مناسباً للغاية لعدة فئات من الدراسات اللاحقة. ونظراً لأن النمط الظاهري للتضيق يتطور ضمن إطار زمني محدد وقابل للتكرار، فإنه يمكن أن يعمل كمنصة للتقييم قبل السريري للعلاجات الدوائية المرشحة التي تهدف إلى إبطاء تكلس الصمام أو تليفه23. كما يتوافق النموذج مع النهج الجينية: حيث يمكن تطبيق البروتوكول على الفئران المعدلة وراثياً أو الفئران التي تم تعطيل جيناتها (knockout) من خلفية C57BL/6 لتحليل مساهمة مسارات إشارات محددة في تطور مرض الصمام. بالإضافة إلى ذلك، توفر نقطة النهاية عند الأسبوع الرابع نافذة عملية للمراقبة التسلسلية بالصدى القلبي لتطور المرض أو الاستجابة للعلاج. ويمكن مشاركة ملفات تصميم المنصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد بحرية كملف .stp تكميلي، ومن المتوقع أن يؤدي توحيد هذا الجهاز عبر المختبرات إلى تحسين إمكانية التكرار بين المواقع المختلفة.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عن عدم وجود أي مصالح مالية متضاربة أو تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا للأمراض المزمنة غير المعدية (2026ZD0554300)؛ والمؤسسة الوطنية الطبيعية للعلوم في الصين (U23A20395, 82170375, 82500455)؛ ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة سيتشوان (2026NSFSC0552)؛ وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية؛ ومشاريع العلوم والتكنولوجيا في منطقة التبت ذات الحكم الذاتي، الصين (XZ202501ZY0120)؛ ومشروع "1.3·5" في مستشفى غرب الصين، جامعة سيتشوان (ZYGD23021, 23HXFH009). ويشكر المؤلفون Qipu Feng (مركز التجارب الحيوانية، مستشفى غرب الصين، جامعة سيتشوان) على المساعدة في التصوير بالموجات فوق الصوتية للحيوانات الصغيرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
منصة دعم وعائية مطبوعة ثلاثية الأبعادمصنعة خصيصاًN/Aمنصة دعم وعائية مصنعة خصيصاً ومطبوعة ثلاثية الأبعاد؛ تم توفير ملف CAD تكميلي بتنسيق .stp.
بارافورمالدهيد 4%ServicebioG1101-3MLتثبيت الأنسجة
خيط جراحي نايلون 5-0Jinhuan MedicalF503إغلاق الجلد باستخدام غرز متقطعة
خيط جراحي حريري 6-0Jinhuan MedicalRC411ربط دائم للشريان السباتي الأصلي الأيمن (RCCA) القاصي وعقدة انزلاقية دانية
هلام اقتران صوتي (مسخن مسبقاً)KepplerKL-250تخطيط صدى القلب
راتنج بوليمر ضوئي متوافق حيوياًFormlabsRS-F2-BMCL-01مادة طباعة SLA مستخدمة لتصنيع منصة الدعم الوعائية المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمصنعة خصيصاً.
فئران C57BL/6 (8–10 أسابيع؛ الذكور 22–25 g، الإناث 18–20 g)GemPharmatechC57BL/6استُخدم كلا الجنسين طوال الدراسة؛ أُويت تحت ظروف قياسية
غاز أكسيد الإيثيلينمرفق التعقيم المؤسسيN/Aتعقيم منصة الدعم الوعائية المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمصنعة خصيصاً.
FreeCADFreeCAD Project Association1.1.1تصور CAD وتوليد الرسم الهيكلي ثلاثي الأبعاد من ملف .stp.
GraphPad PrismGraphPad Software9.0التحليل الإحصائي والرسم البياني
سلك توجيه، بقطر 0.014-inchBoston ScientificH749393071900إحداث إصابة ميكانيكية في الصمام الأورطي
طقم صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)BeyotimeC0105Sدراسة مورفولوجيا وسماكة الشرفات
إيزوفلورانRWD Life ScienceR510-22-23% للتحريض؛ 1.5–2% للحفاظ على التخدير في 100% O2
ليدوكائينShijiazhuang Pharmaceutical GroupH14024045تسلل موضعي استباقي في موقع الشق (0.5%، الخطوة 1.5)
مقصات جراحة مجهريةRWD Life ScienceF11022-11شق الجلد، بضع الشريان، بضع الصدر
محول MX550D (40 MHz)FUJIFILM VisualSonicsMX550Dتخطيط صدى القلب
كريم نير (Nair) لإزالة الشعرNair255 gلإزالة الشعر من المنطقة العنقية الأمامية وجدار الصدر
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)ServicebioG4202-100MLالتروية
ميكروتوم دوارLeica BiosystemsRM2125 RTSتقطيع تسلسلي عند 4–5 µm
مجهر استريو (جراحي)OlympusSZX7عزل الأوعية والجراحة المجهرية
نظام الموجات فوق الصوتية عالي الدقة Vevo 3100FUJIFILM VisualSonicsVevo 3100تخطيط صدى القلب
طقم صبغ فون كوسا (Von Kossa)ServicebioG1043-20MLالكشف عن التكلس الضموري
زايلينNanjing Chemical Reagent Co., Ltd.C0430530209تصفية الأنسجة أثناء المعالجة بالبارافين.

المراجع

  1. Otto CM, Newby DE, Hillis GS. Calcific aortic stenosis: a review. JAMA. 2024;332(23):2014–2026.
  2. Vincent F, et al. Transcatheter aortic valve replacement in bicuspid aortic valve stenosis. Circulation. 2021;143(10):1043–1061.
  3. Kraler S, et al. Calcific aortic valve disease: from molecular and cellular mechanisms to medical therapy. Eur Heart J. 2021;43(7):683–697.
  4. Blaser MC, Bäck M, Lüscher TF, Aikawa E. Calcific aortic stenosis: omics-based target discovery and therapy development. Eur Heart J. 2025;46(7):620–634.
  5. Lindman BR, et al. Calcific aortic stenosis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2(1):16006.
  6. Yu Chen H, et al. Dyslipidemia, inflammation, calcification, and adiposity in aortic stenosis: a genome-wide study. Eur Heart J. 2023;44(21):1927–1939.
  7. Peeters FECM, et al. Calcific aortic valve stenosis: hard disease in the heart: a biomolecular approach towards diagnosis and treatment. Eur Heart J. 2018;39(28):2618–2624.
  8. Cai D, Saint L, Markley J, Chen SY. Novel humanized aortic valve calcification model. Circ Res. 2025;136(12):1632–1635.
  9. Rattazzi M, et al. Calcification of advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteries of ApoE-deficient mice: potential role of chondrocyte-like cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(7):1420–1425.
  10. Aikawa E, et al. Arterial and aortic valve calcification is abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 2009;119(13):1785–1794.
  11. Hjortnaes J, et al. Arterial and aortic valve calcification inversely correlates with osteoporotic bone remodeling: a role for inflammation. Eur Heart J. 2010;31(16):1975–1984.
  12. Aikawa E, et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 2007;116(24):2841–2850.
  13. Honda S, et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(2):270-278. doi:10.1161/ATVBAHA.113.302610.
  14. Zhu Z, et al. Models for calcific aortic valve disease in vivo and in vitro. Cell Regen. 2024;13:6.
  15. Zhong G, et al. Activation of Piezo1 promotes osteogenic differentiation of aortic valve interstitial cells through YAP-dependent glutaminolysis. Sci Adv. 2023;9(22):eadg0478.
  16. Li S, et al. Targeted inhibition of PTPN22 is a novel approach to alleviate osteogenic responses in aortic valve interstitial cells and aortic valve lesions in mice. BMC Med. 2023;21(1):252.
  17. Niepmann ST, et al. The graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics the human functional and morphological disease phenotype. Clin Res Cardiol. 2019;108(8):847–856.
  18. Qian N, et al. A novel mouse model of calcific aortic valve stenosis. Anim Models Exp Med. 2024;7(4):523–532.
  19. Iqbal F, et al. Sortilin enhances fibrosis and calcification in aortic valve disease by inducing interstitial cell heterogeneity. Eur Heart J. 2023;44(10):885–898.
  20. Billig H, et al. Aortic valve stenosis and osteoporosis: insights from a mouse model. BMC Cardiovasc Disord. 2025;25(1):562.
  21. Artiach G, et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids reduce aortic valve disease via the resolvin E1-ChemR23 axis. Circulation. 2020;142(8):776–789.
  22. Clayton JA, Collins FS. NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 2014;509(7500):282–283.
  23. Li B, et al. IGF1-mediated mesenchymal-endothelial transition as a potential regulatory target in calcific aortic valve disease. BMC Med. 2025;23(1):600.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.