تم شراء أربعين ذكرا بالغا من نوع سبريغ-داولي (SD) الخالي من الممرضات الخاصة (SPF)، بوزن 240–280 جرام، من مختبر بكين فيتال ريفر للتكنولوجيا [رقم الرخصة: SCXK (Jing) 2021-0011]. تم إيواء جميع الفئران في مركز الحيوانات المختبرية بجامعة بكين للطب الصيني تحت ظروف مضبوطة، مع درجة حرارة الغرفة 23°م ± 1°م، ورطوبة نسبية 50٪ ± 5٪، ودورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة، مع وصول مجاني للطعام والماء. تم تأقلم الفئران لمدة 5 أيام، وخلال ذلك تم إجراء تدريب التكيف على جهاز المشي في نفس الوقت. كانت الحيوانات تخضع للتكيف على جهاز المشي مرة واحدة يوميا بسرعة 10 م/دقيقة لمدة 15 دقيقة في كل جلسة دون تحفيز كهربائي لتقليل ضغط التعامل.
استنادا إلى دراستنا السابقة، فإن معدل نجاح تحفيز PSS عبر طريقة انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) هو حوالي 60٪15. باستخدام جدول أرقام عشوائي، تم اختيار 9 فئران عشوائيا مسبقا كمجموعة تعمل بالوهم؛ أما الجرذان ال 31 المتبقي فقد استخدمت كنماذج تأسيسية. بعد النمذجة الناجحة، تم تقسيم هذه الفئران عشوائيا إلى مجموعة النموذج ومجموعة MSSA. في النهاية، تم تضمين تسعة فئران في كل مجموعة. أجريت هذه التجربة وفقا لمبادئ 3R لرفاهية الحيوانات في المختبر، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة بكين للطب الصيني (BUCM 20250915-008).
تأسيس نموذج
تم تأسيس نموذج MCAO في الفئران باستخدام تقنية تعديل للخيط داخل اللومين. تم تخدير الفئران بنسبة 3٪ من إيزوفلوران للتحفيز، وتم الحفاظ على التخدير مع توصيل 1.5٪ من الإيزوفلوران بالأكسجين بمعدل تدفق ثابت 1 لتر/دقيقة طوال فترة العملية. تم إجراء شق في منتصف خط عنق الرحم، تلاه تشريح غير حاد لكشف الشريان السباتي المشترك الأيمن (CCA)، والشريان السباتي الخارجي (ECA)، والشريان السباتي الداخلي (ICA). تم إدخال خيط أحادي النايلون (قطره 0.36 ± 0.02 مم) في ال ICA عبر ECA وتقدمت حوالي 18–20 مم إلى مصدر الشريان الدماغي الأوسط (MCA) لتحقيق انسداد الشريان. تم ربط الأوعية الدموية وإغلاق الشق. ثم وضعت الفئران على وسادة تدفئة حتى تتعافى من التخدير. خضعت الفئران في مجموعة العمليات الوهمية لتعرض نفس الجراحات لاختبار CCA وICA وECA دون إدخال الخيط داخل الجهاز.
بعد الجراحة، تلقت جميع فئران MCAO رعاية موحدة بعد العملية. تم الحفاظ على الحيوانات على وسادة تدفئة بدرجة حرارة 37°C خلال أول 12 ساعة لمنع انخفاض حرارة الجسم. تم تنظيف الشقوق الجراحية يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية، وتم إعطاء الأمبيسيلين (100 ملغ/كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق للوقاية من العدوى، وتم توفير طعام مخفف للحفاظ على تغذية كافية. تمت مراقبة النشاط العام، وتناول الطعام، وحالة الجرح، ووظيفة الطرف الحركية يوميا من اليوم الأول حتى العاشر بعد العملية.
تم تقييم العجز العصبي من قبل باحثين تم تعميهم لتوزيع المجموعات باستخدام درجة العجز العصبي زيا لونغا، وتم تقييم قوة العضلات باستخدام مقياس آشورث المعدل (MAS). أجريت التقييمات قبل يوم واحد من الجراحة (اليوم −1)، وفي يوم الجراحة قبل MCAO (اليوم 0)، وفي الأيام بعد العملية 1، 3، 5، 7، و10. اعتبرت الفئران التي حصلت على درجات زيا لونغا وMAS ≥1 في اليوم الثالث بعد العملية قد أسست نموذجا ناجحا لنظام PSS.
علاج MSSA
بدأت التدخلات في اليوم الثالث بعد العملية. كان موقع تحفيز الوخز بالإبر في فروة الرأس هو خط التصلب المتعدد 6 (الخط المائل الجداري الصدغي الأمامي). وفقا للمعيار الوطني للتلاعب المعياري بالإبر الصينية في فروة الرأس (GB/T 21709.2-2021)، يمتد خط MS 6 من GV 21 (تشياندينغ) إلى GB 6 (شوانلي).
تم إدخال إبر الوخز بالإبر المعقمة ذات الاستخدام الواحد (0.25 × 13 مم) تحت الغاليا أبونوريوتيكا عند GV 21 بزاوية مائلة تقارب 15° بالنسبة لسطح فروة الرأس، وتقدمت نحو الحزام 6 على طول الخط المائل الجداري الصدغي الأمامي إلى عمق يقارب 10 مم. تم تطبيق التلاعب السريع بالدوران (200 دورة/دقيقة) بشكل متواصل لمدة دقيقة واحدة. بعد 15 دقيقة من الاحتفاظ بالإبرة، يتكرر نفس التلاعب الدوراني مرة واحدة، مما أدى إلى إجمالي وقت احتباس الإبرة 30 دقيقة. خلال فترة احتباس الإبر بالكامل، خضعت الفئران لتمارين المشي في نفس الوقت بسرعة ثابتة تبلغ 10 م/دقيقة.
لم تتلق الفئران في مجموعات النماذج الوهمية العلاج بالإبر الصينية أو التمارين على جهاز المشي. للتحكم في التعامل غير المحدد وضغط التقييد، تم التعامل معها بلطف وتقييدها في حوامل التخزين غير الضاغطة لمدة 30 دقيقة يوميا، متوافقة مع إجمالي مدة التدخل اليومية لمجموعة MSSA.
التقييمات السلوكية
نتيجة زيا لونغا للعجز العصبي:
تم تقييم العجز العصبي لدى الفئران باستخدام نظام التسجيل زيا لونغا16. تم تطبيق المعايير التالية: درجة 0 تشير إلى عدم وجود ضعف عصبي وحركة طبيعية غير مقيدة؛ تشير درجة 1 إلى امتداد غير كامل للطرف الأمامي أو الخلفي المقابل للجانب المصاب؛ أشار التقييم 2 إلى الدوران نحو الجانب المقابل أثناء الحركة؛ أما النتيجة 3 فأشارت إلى السقوط على الجانب المقابل أثناء المشي؛ ودرجة 4 أشارت إلى فقدان الوعي مع غياب الحركة التلقائية.
MAS لزيادة قوة العضلات:
تم تقييم قوة العضلات باستخدام MAS17. تم تعريف المعايير كما يلي: الدرجة 0، عدم زيادة في توتر العضلات؛ الدرجة الأولى، زيادة طفيفة في توتر العضلات، مع التقاط مؤقت أو مقاومة قليلة في نهاية الانثناء والتمدد السلبي؛ الدرجة 1+، زيادة ملحوظة في توتر العضلات، مع توقف مؤقت في منتصف نطاق الحركة ومقاومة مستمرة خلال النصف الثاني من الحركة؛ الدرجة الثانية، زيادة واضحة في قوة العضلات، مع مقاومة واضحة في معظم نطاق الحركة، رغم أن الطرف ظل قابلا للحركة بسهولة؛ الدرجة 3، زيادة كبيرة في توتر العضلات جعلت الثني والتمدد السلبي صعبا؛ والدرجة الرابعة، الحركة السلبية محدودة بسبب صلابة المفاصل. تم منح الصف 1+ درجة 2، مما أعطى درجة MAS قصوى 5 نقاط في هذه الدراسة10.
تصوير الأعصاب T2WI لقياس حجم الاحتماء الدماغي
تم الحصول على جميع فحوصات T2WI باستخدام ماسح الرنين المغناطيسي PharmaScan الذي يعمل ببرنامج ParaVision 360 (الإصدار 3.5). تم تطبيق تسلسل نبضات التيربو السريع المرجح بوزن T2 مع تعزيز الاسترخاء (T2_TurboRARE، ويسمى أيضا صدى الدوران السريع [FSE]) على فئران MCAO لقياس حجم الالتهاب الدماغي. تم تكوين معلمات التصوير كما يلي: زمن التكرار (TR) = 3000.0 مللي ثانية، زمن الصدى (TE) = 33.0 مللي ثانية، مجال الرؤية (FOV) = 35.00 × 35.00 مم2، حجم المصفوفة = 250 × 250، سمك الشريحة = 0.80 مم، عدد الشرائح = 35، عدد الإثارة (NEX) = 3.0، وزاوية الانقلاب (FA) = 180.0°. تم تحديد مناطق الاحتشاء الدماغي يدويا على أساس شريحة بشريحة في برنامج ITK-SNAP (الإصدار 4.4.0) بواسطة باحث واحد أعمى عن التعيين الجماعي باستخدام تغيرات شدة الإشارة والخصائص الشكلية المتوافقة مع الاحتشاء الإقفاري. ثم كان يتم حساب حجم الالتهاب الدماغي تلقائيا بواسطة البرنامج.
تصوير أعصاب DTI لتقييم سلامة البنية الدقيقة للمادة البيضاء
تم جمع بيانات الرنين المغناطيسي باستخدام ماسح الرنين المغناطيسي PharmaScan بقوة 7.0 T PharmaScan. تم تحفيز التخدير بإيزوفلوران 3٪ في الهواء المضغوط (0.4–0.6 لتر/دقيقة) وحافظ عليه بنسبة 1٪ من الأيزوفلوران طوال فترة اكتساب DTI. تم الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية باستخدام حمام ماء متحكم فيه حراريا طوال عملية التصوير.
خلال فحص الرنين المغناطيسي، تم تطبيق تسلسل تحديد المواقع بثلاثة مستويات أولا لوضع دماغ الجرذ داخل المغناطيس. تم تنفيذ DTI باستخدام تسلسل تصوير صدى محور واحد الطلقة مع القياس الصدى مع المعايير التالية: TR/TE = 3000/27 مللي ثانية، المصفوفة = 90 × 75، مجال الرؤية = 20 × 15 مم2، سمك الشريحة = 0.7 مم، 30 اتجاه تدرج انتشار، وقيم b 0 و1000 ث/مم2. لتحليل DTI، تم رسم مناطق ذات اهتمام في الكبسولة الخارجية على شرائح الدماغ بطول 1.3 مم خلف البريغما. تم إعادة بناء الخرائط البارامترية للتباين الجزئي (FA)، والانتشار المتوسط (MD)، والانتشارية المحورية (AD)، والانتشار الشعاعي (RD) باستخدام برنامج ParaVision 360. تعبر البيانات كنسبة نصف الكرة المصاب إلى نصف الكرة السليم المقابل.
صبغة LFB لتقييم إصابة الميالين وإعادة الميالين
تم إجراء تلوين LFB لتقييم الضرر الهيكلي للمحاور العصبية المائلينية في الكبسولة الخارجية. تم قياس إصابة المايلين، التي تتميز بتجعيد الميالين والهب، من خلال قياس الكثافة البصرية المتكاملة (IOD) لألياف الميالين المصبوغة ب LFB داخل ROI في الكبسولة الخارجية باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 6.0؛ عتبة الرمادي، 35–225). استنادا إلى أطلس الدماغ الفراغي18، تم تحليل ثلاثة مقاطع تاجية لكل حيوان عند البريغما +1.0 مم، −1.3 مم، و−1.6 مم، والتي تتوافق مع الأجزاء الأمامية والوسطى والخلفية الوسطى من الكبسولة الخارجية. تم حساب متوسط يوم التوزيع عبر الأقسام الثلاثة ليمثل كل حيوان (n = 4 لكل مجموعة). تم تطبيع قيم اللواء الصناعي من نفس الجانب إلى الجانب المقابل والتعبير عنها بنسبةمئوية 19.
تسجيلات كهربائية فيزيولوجية لتقييم قابلية الإثارة الانعكاسية للعمود الفقري
تم تسجيل منعكس H أحادي المشبك الشوكي باستخدام نظام تجربة وظيفي بيولوجي. تم تخدير الفئران بشكل خفيف ب α-كلورالوز (50 ملغ/كجم، داخل الصفاق) للحفاظ على قابلية الإثارة الانعكاسية للعمود الفقري أثناء التسجيلات الكهربائية. تم كشف العصب الوركي الأيسر عن طريق تشريح غير حاد ووضع على أقطاب خطافية ثنائية القطب للتحفيز الكهربائي. تم تطبيق محلول فيتامينات دهني بشكل متقطع على العصب المكشوف للحفاظ على ترطيب الأنسجة وصلاحية الأعصاب. تم إدخال زوج من أقطاب التسجيل المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في العضلات بين العظام للكف الخلفي الأيسر، ووضع قطب أرضي في الذيل. تم استدعاء منعكس H باستخدام محفز نبض أحادي القطب ثنائي القطب بمدة نبضة تبلغ 100 ميكروثانية. تم تحديد عتبة H-Reflex وعتبة الحركة (MT) باستخدام تحفيز كهربائي تدريجي، مع زيادة التيار بخطوات 0.05 مللي أمبير إلى أقصى شدة 3.0 مللي أمبير لتجنب إصابة الأعصاب الطرفية غير القابلة للعكس.
باستخدام نفس شدة التحفيز التي استثارت أقصى منعكس H (H max)، تم إرسال محفزات نبضية بترددات مختلفة (0.3، 5، و10 هرتز) للحصول على سعات H-Reflex عند ترددات تحفيز مختلفة. تم تطبيق تحفيز نبضي متكرر عند 0.3 هرتز للتحقق من أن سعة موجة M بقيت ضمن 95٪ من قيمتها الأولية؛ وإلا، يتم التخلص من مجموعة البيانات. تم حساب انخفاض التردد المعتمد على انعكاس H (FDD) كنسبة نسبة موجة H/موجة M (نسبة H/M) عند 5 هرتز و10 هرتز مقارنة ب 0.3 هرتز، مع استخدام نسبة H/M عند 0.3 هرتز كمرجع أساسي10.
تحليل البيانات
أجريت تحليلات إحصائية باستخدام برنامج SPSS (الإصدار 20.0). تعرض البيانات المستمرة كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لمقارنة نتائج التصوير التقليدية والمتغيرات الكمية الأخرى بين المجموعات. عندما تم تحقيق تجانس التباين، أجريت اختبارات بونفيروني بعد الاختبار؛ وإلا، فقد تم تطبيق اختبار دانيت T3. تم تحليل البيانات السلوكية باستخدام تحليل النوفاع الفاتح ثنائي الاتجاه مع مجموعة التجارب ونقطة زمنية بعد العملية كعوامل ثابتة. تم استخدام تحليل الارتباط بتقنية سبيرمان لتقييم الارتباطات بين متغيرات الدراسة. تم اعتبار قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.