تقدم هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصور يجمع بين جمع ومعالجة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية وفق معايير موحدة، ولوحة قياس التدفق الخلوي المكونة من سبعة مؤشرات، ومقايسة سيتوكينات متعددة تحليلية تشمل 13 مادة تحليلية، ومسار تحليل موحد.
مقالة بحثية
التصور المتكامل لتجنيد العدلات وتوصيف السيتوكينات الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُعد سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) مصفوفة أخذ العينات الأكثر وصولاً بشكل مباشر لدراسة التهاب المسالك الهوائية السفلية، ومع ذلك، تعتمد التحليلات التقليدية على قياس التدفق الخلوي بعلامة واحدة مقترناً بمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لكل مادة تحليل على حدة، وهو نهج يحد من كثافة المعلومات ويحجب الاقتران بين الخلايا والعوامل. تقدم هذه الدراسة سير عمل للتصور المتكامل يربط بين عمليات الجمع والمعالجة المسبقة الموحدة مع لوحة قياس التدفق الخلوي لسبع علامات للخلايا المتعادلة والخلايا الوحيدة، ومقايسة السيتوكين المتعددة لـ 13 مادة تحليل، ومسار تحليل موحد يعتمد على التقريب والإسقاط متعدد الطيات الموحد (UMAP)، والتجميع الميتافيزيقي FlowSOM، والتجميع الهرمي، وشبكات ارتباط سبيرمان، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA).
تم تطبيق سير العمل على مجموعة أترابية مستقبلية في مركز واحد شملت 112 بالغاً خضعوا لمنظار القصبات، ضمت 64 مريضاً مصاباً بعدوى رئوية مؤكدة ميكروبيولوجياً و48 من ضوابط غير المصابين بالعدوى. وكشفت قراءات الخلوية وقياس التدفق الخلوي عن تحول واضح في الملف السنخي من هيمنة الخلايا البلعمية إلى هيمنة الخلايا المتعادلة أثناء العدوى، حيث ارتفعت نسبة الخلايا المتعادلة من وسيط قدره 3.2% إلى 68.4%، وزاد التركيز المطلق للخلايا المتعادلة بنحو 50 ضعفاً. كما حدد التوصيف المتعدد استجابة سيتوكينية منسقة مكونة من ثلاث وحدات، حيث شهدت وحدات الكيموكين، والمحفزات للالتهاب، والتنظيمية جميعاً زيادة في التنظيم، وأظهر كل من CXCL8/IL-8 وIL-1β وIL-6 وCXCL1/GRO-α وG-CSF أقوى تمييز للمؤشرات الفردية ضمن مجموعة الدراسة (المساحة تحت المنحنى [AUC] من 0.89 إلى 0.94). وكشف التصور التكاملي باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، ومصفوفة الارتباط، والرسم البياني للشبكة عن محور مترابط بإحكام بين الخلايا المتعادلة والكيموكينات على مستوى المشاركين، حيث برز تعداد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) كمركز محوري للشبكة.
يعتمد سير العمل هذا فقط على المواد التي يتم الحصول عليها بشكل روتيني من غسيل القصبات والأسناخ (BAL) المشار إليه سريرياً، ولا يتطلب أي حجم إضافي من العينة، ويوفر إطاراً غنياً بالمعلومات لتحليل التهاب الممرات الهوائية في حالات العدوى التنفسية، وهو ما قد يكون قابلاً للتطبيق في مختبرات الرعاية الثالثية المجهزة بمنصات قياس التدفق الخلوي متعدد المعايير ومنصات المصفوفات الخرزية المتعددة، ويمتد ليشمل الدراسات الطولية، ودراسات الخلية الواحدة، ودراسات تقييم العلاج. وسيتطلب الاعتماد السريري الأوسع للمواد التحليلية الفردية كعلامات حيوية إجراء تحقق استشرافي في مجموعات مستقلة متعددة المراكز.
المقدمة
ما تزال الوفيات المعدية الناجمة عن عدوى الجهاز التنفسي السفلي سببًا رئيسيًا للوفيات العالمية، على الرغم من التقدم الذي تم إحرازه في استراتيجيات اللقاحات وطرق العلاج؛ ومع ذلك، يظل هذا الأمر صحيحًا بشكل خاص بين الأطفال وكبار السن1. وتعد الخلايا المتعادلة (Neutrophils) هي الخلايا الأساسية التي تم الإبلاغ عنها في المراحل المبكرة من الاستجابة المناعية الفطرية في الجهاز التنفسي المصاب، وهي عملية حيوية للقضاء على الممرض الغازي؛ ومع ذلك، فإن الالتهاب المتعادل غير المنضبط يؤدي إلى انهيار الحاجز الشعيري السنخي، وتلف الأنسجة التأكسدي، وتطور متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)2,3. كما تظهر الخلايا المتعادلة في الحيز الهوائي للرئة حركية تجنيد، وأنماط استبقاء، وسلوكًا تأثيريًا يختلف عن الأنسجة الأخرى، وتؤثر هذه الاختلافات على ما إذا كانت العدوى ستزول أو ستتطور إلى التهاب رئوي حاد4.
يُعد سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) مصدراً هاماً للمعلومات حول البيئة المجهرية للأسناخ الرئوية، ويقدم التمثيل الأقرب للمناعة السريرية في هذا الموقع5. ويلعب الكيموكين CXCL8 دوراً أساسياً في جذب الخلايا المتعادلة إلى الرئتين عبر مستقبلاته CXCR1 وCXCR2، وذلك جنباً إلى جنب مع كيموكينات أخرى، بما في ذلك CXCL1 وCXCL2 وCXCL56. وتعمل السيتوكينات IL-1β وIL-6 وTNF-α على تعزيز هذه العملية بشكل أكبر، بينما يعمل IL-10 كسيتوكين مضاد. وقد تبين أن مستوياتها في سائل BALF ترتبط بشدة عدوى الرئتين وتطور المضاعفات الرئوية الناتجة عن الالتهابات الرئوية البكتيرية والفيروسية وغير النمطية7، ويتم حالياً اعتماد ملفات المؤشرات الحيوية المتعددة لسائل BALF من أجل التشخيص المبكر والتمييز بين المسببات المرضية في عدوى الجهاز التنفسي السفلي8.
عادة ما تفشل اختبارات سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) الروتينية في الإحاطة الكاملة بالبيولوجيا الكامنة وراء الاختبار. يمكن تقدير تعداد الخلايا عن طريق التمييز اليدوي للخلايا في عينات التدوير المركزي (cytospin)، بينما تُقاس الوسائط القابلة للذوبان باستخدام مقاييس الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) الفردية وتُعرض في شكل مخطط أعمدة. يتم تقييم الكيموكينات والسيتوكينات وكل نوع من الخلايا بشكل منفصل، دون إنشاء ارتباط بين تدرج تركيز كيموكين معين والمجتمعات الخلوية التي يؤثر عليها في العينة. وغالبًا ما يتم إغفال الجمع بين وحدات السيتوكينات، وعلاقات الاستجابة للجرعة بين الكيموكينات والعدلات، والمجموعات الفرعية من المرضى التي تملك سمات التهابية خاصة بها في غياب التحليل متعدد المتغيرات9.
تجعل التطورات في مجال الحوسبة مثل هذا النهج الشمولي واقعياً بشكل تدريجي. إن الجمع بين قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (multiparameter flow cytometry) وقياس التدفق الخلوي الطيفي (spectral flow cytometry) مع منهجيات تقليل الأبعاد، مثل التضمين العشوائي للجيران الموزع t (t-SNE) أو التقريب والاسقاط المتعدد المتجانس (UMAP)، يسمح برسم خرائط للأنماط الظاهرية المناعية عالية الأبعاد في فضاء ثنائي الأبعاد، حيث أثبت UMAP قدرة أفضل على الاحتفاظ بالطوبولوجيا العامة وقابلية التكرار عند تطبيقه على بيانات قياس التدفق الخلوي10. وتساعد لوحات تحليل السيتوكينات متعددة العناصر، متبوعة بالتجميع الهرمي وشبكات الارتباط، في تحديد البصمات المرتبطة بشدة المرض والتي لا يمكن تمييزها باستخدام منهجيات السيتوكين الواحد11. ورغم التقدم في هذا المجال، لا يوجد حتى الآن سير عمل يجمع هذه الطرق معاً لدراسة تجنيد الخلايا المتعادلة وبصمات السيتوكينات من عينات سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) نفسها في حالات العدوى التنفسية. تصف هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصور المرئي للبحث في تجنيد الخلايا المتعادلة باستخدام علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات، يليه تحليل UMAP وتحليل بصمات السيتوكينات عبر المقايسة المناعية المتعددة، مع التجميع الهرمي ومصفوفات الارتباط وتحليل المكونات الرئيسية. وينتج عن سير العمل هذا تصور مرئي متكامل يشمل القراءات المناعية الخلوية والذائبة للمجاري التنفسية في رسم بياني واحد، وذلك باستخدام عينات BALF التي يتم الحصول عليها روتينياً أثناء تنظير القصبات المشار إليه سريرياً في حالات عدوى الجهاز التنفسي السفلي.
البروتوكول
مجتمع الدراسة والأخلاقيات
كانت هذه دراسة رصدية استباقية في مركز واحد، أُجريت في مستشفى تعليمي تخصصي في الفترة ما بين يناير 2026 وأبريل 2026. تمت الموافقة على البروتوكول بموجب رقم الموافقة 2026HL-038، وتم الحصول على موافقة مستنيرة مكتوبة من كل مشارك قبل البدء في أي إجراء من إجراءات الدراسة.
تم استقطاب البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و75 عامًا ممن خضعوا لعملية تنظير القصبات المرن التشخيصي مع غسيل القصبات والأسناخ (BAL) كجزء من الرعاية السريرية الروتينية بشكل تتابعي، وتم توزيعهم على مجموعة مصابة بالعدوى أو مجموعة ضابطة غير مصابة بناءً على تشخيصاتهم السريرية والميكروبيولوجية النهائية. يوضح الشكل 1 نظرة عامة على سير عمل التصوير المتكامل، بدءًا من استقطاب المرضى وصولاً إلى المخرجات المرئية المتكاملة.
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل التصوير المرئي المتكامل لتوصيف تجنيد الخلايا المتعادلة واستجابات السيتوكينات الالتهابية بناءً على سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF). تلخص المراحل الخمس، من اليسار إلى اليمين، التجنيد الاستباقي لمجموعات العدوى والمجموعات الضابطة باستخدام تنظير القصبات وغسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BAL)، والمعالجة الأولية لسائل BALF لتحويله إلى كريّة خلوية وجزء طافٍ، والقياسات المتوازية الخلوية (علم الخلايا بصبغة Wright–Giemsa وقياس التدفق الخلوي متعدد المعايير) والذائبة (المقايسة المناعية القائمة على الخرز بـ 13-plex)، ومسار التصوير المرئي الموحد (UMAP مع تجميع Meta-clustering باستخدام FlowSOM، والخريطة الحرارية الهرمية، وتحليل المكونات الرئيسية، وشبكة ارتباط Spearman)، والمخرج المرئي المتكامل. الاختصارات: BAL = غسيل القصبات والأسناخ الرئوية؛ BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية؛ UMAP = التقريب والإسقاط المتشعب الموحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
كانت معايير الاشتمال لمجموعة العدوى كما يلي: (1) المرضى الذين تم تشخيصهم إما بالالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع (CAP)، أو الالتهاب الرئوي المكتسب من المستشفى (HAP)، أو الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي (VAP) وفقًا لإرشادات جمعية الأمراض المعدية الأمريكية (IDSA) والجمعية الأمريكية للصدر (ATS)؛ (2) الكشف عن مسبب مرض واحد أو أكثر من خلال زراعة سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) بنسبة ≥104 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)/mL، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعدد للجهاز التنفسي، أو تسلسل الجيل التالي الميتاجينومي لسائل BALF، أو اختبارات مستضد/جسم مضاد محددة من عينات مأخوذة من الجهاز التنفسي والمصل المقترنة.
كانت معايير مجموعة الضبط كما يلي: (1) أسباب غير معدية لإجراء تنظير القصبات، وتتمثل في تقييم عقيدة رئوية غير محددة، أو نتائج شعاعية غير طبيعية لا تشير إلى وجود عدوى، أو الفحص للكشف عن السعال المزمن؛ (2) عدم وجود عدوى رئوية حادة، وهو ما أظهرته النتائج السلبية للاختبارات الميكروبيولوجية وغياب أي علامات للالتهاب أو العدوى الجهازية في وقت إجراء تنظير القصبات؛ و(3) عدم استخدام المضادات الحيوية خلال 30 يوماً قبل المشاركة. تم استقطاب أفراد مجموعة الضبط من المرضى الذين يخضعون لتنظير القصبات لحالات رئوية أخرى تستدعي ذلك سريرياً بدلاً من المتطوعين الأصحاء، وذلك ليعكس المجتمع الذي يتم منه الحصول روتينياً على غسيل القصبات والأسناخ (BAL) المستدعى سريرياً في مركز الدراسة.
تضمنت معايير الاستبعاد ما يلي: (1) الإصابة بورم خبيث و/أو الخضوع للعلاج الكيميائي السام للخلايا خلال الأشهر الستة السابقة؛ (2) إيجابية المصل لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV)؛ (3) زراعة أعضاء صلبة أو زراعة خلايا جذعية مكونة للدم؛ (4) العلاج المستمر بمثبطات المناعة الذي يتضمن جرعة يومية معادلة من البريدنيزون. > 0.3 ملغ/كغ لأكثر من 3 أسابيع؛ (5) الإناث الحوامل أو المرضعات؛ (6) وجود تاريخ مرضي لنزفية الدم (bleeding diathesis) أو أي موانع لإجراء تنظير القصبات المرن؛ (7) الإصابة المسبقة بمرض تنفسي مزمن شديد (الداء الرئوي الانسدادي المزمن [COPD] من المرحلة الثالثة أو الرابعة وفقاً للمبادرة العالمية للأمراض الرئوية الانسدادية المزمنة [GOLD]، أو التليف الرئوي مجهول السبب، أو الربو المستمر الشديد، أو توسع القصبات ذو الدلالة السريرية)؛ (8) السل النشط؛ (9) المشاركة في دراسة تداخلية أخرى خلال الثلاثين يوماً الماضية. أُجري غسيل قصبي أسناخي (BAL) أثناء عملية تنظير القصبات الأولى، وذلك خلال 72 ساعة من الدخول للمستشفى في حالات العدوى، وخلال 48 ساعة من التنبيب في المرضى الذين يعانون من عدوى ويخضعون للتنفس الاصطناعي.
ركزت حسابات حجم العينة على النتيجة الخلوية الأولية: عدد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) بين المجموعات. وبناءً على حجم التأثير المتوقع البالغ 0.6 SD بين المسالك الهوائية المصابة وغير المصابة، ومع مراعاة نسبة 15% كبديل للمنسحبين، كانت هناك حاجة إلى حجم عينة لا يقل عن 45 شخصاً لكل مجموعة لتحقيق قيمة α = 0.05 (ثنائية الذيل) مع قوة إحصائية تبلغ 80%. من بين 156 مرشحاً مؤهلاً، لم يستوفِ 27 شخصاً شروط الأهلية (18 فشلوا في تلبية معايير الاشتمال، ويرجع ذلك أساساً إلى عدم القدرة على تحديد العامل الممرض المسؤول عن مرضهم خلال الفترة المحددة أو عدم الموافقة على الإجراء نفسه؛ بينما خالف 9 أشخاص معايير الاستبعاد، ويرجع ذلك أساساً إلى وجود ورم خبيث نشط أو تاريخ من تناول العلاج الكيميائي، أو استخدام الكورتيكوستيرويدات المزمن، أو الإصابة بمرض رئوي مزمن شديد سابق، أو وجود نزعة نزفية). خضع المشاركون الـ 129 المتبقون لمنظار القصبات. لاحقاً، تم سحب 17 شخصاً من الدراسة (7 بسبب عدم كفاية كمية الـ BALF المستخلصة < 40%؛ و4 بسبب سحب الموافقة أثناء الاستشفاء؛ و6 بسبب إعادة تصنيف الأشخاص بعد التقييم الميكروبيولوجي النهائي - حيث شُخّص 4 مرشحين من مجموعة التحكم بإصابة خفية بناءً على نتائج المزرعة؛ ومرشحان من مجموعة الإصابة افتقرا إلى دليل على الإصابة بعد تحليل المزرعة). تألفت المجموعة النهائية من المشاركين في الدراسة من 112 مشاركاً: 64 مصاباً و48 غير مصاب.
جمع غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) ومعالجته مسبقاً
أجرى مشغلون مَهَرة عملية تنظير القصبات باستخدام البروتوكول المؤسسي القياسي، بما يتوافق مع التوصيات التقنية المنشورة لغسيل القصبات والأسناخ الرئوية12. استُخدم الليدوكائين موضعياً، وتلقى المرضى تخديراً وريدياً متوسطاً مع توفير أكسجين إضافي للحفاظ على تشبع الأكسجين (SpO₂) >92%. تم إدخال منظار القصبات المرن ووضعه في القطعة القصيبة الرئوية التي تظهر بها تشوهات إشعاعية. وفي الحالات التي كانت فيها التشوهات الإشعاعية منتشرة أو لا يمكن تحديد موقعها، تم اختيار الفص الأوسط الأيمن أو القطع اللسانية اليسرى. وبعد كل عملية غسيل، تم إجراء شفط يدوي لطيف بضغط سلبي < 100 mmHg. تم إعطاء ما مجموعه من ثلاث إلى خمس جرعات من المحلول الملحي المعقم عند 37 °C، وبكمية 20–40 mL لكل جرعة، وبحجم إجمالي يتراوح بين 100–150 mL. تم تقدير نسبة الاسترداد كحجم المسترد بالنسبة للحجم المغسول، واعتُبرت العينات التي بلغت نسبة استردادها ≥40% فقط صالحة للتحليل.
تم تجميع العينات التي تم جمعها من الغسلات الثانية واللاحقة لتقليل التلوث الشعبي والحصول على عينة غنية بالخلايا السنخية. حُفظ مجمع سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) على الثلج وتمت معالجته خلال ساعتين من عملية الجمع، مع مراعاة النتائج الحديثة بشأن التغيرات في التركيب الخلوي والعد التفريقي بعد التخزين الطويل وتدفئة عينات BALF البشرية13. بعد الترشيح باستخدام شبكة نايلون معقمة بحجم مسام 70 ميكرون لإزالة المخاط، والتي تمت عن طريق المرور الميكانيكي فقط دون إضافة عامل مذيب للمخاط أو مضاد للتكتل مثل dithiothreitol، حيث أظهرت الاختبارات الأولية أن ذلك كان كافيًا لإزالة تكتلات المخاط دون فقدان ملموس في سلامة الحاتمة السطحية لاحقًا، خضع السائل للطرد المركزي عند 400 × g لمدة 10 دقائق عند 4 °C. تم سكب السائل الطافي وتوزيعه في أنابيب تجميد ذات ارتباط بروتيني منخفض لتحليل السيتوكينات، وعُلقت الخلايا في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) مع 0.5% bovine serum albumin و2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)، مع الاحتفاظ بجزء منها لإجراء الفحص الخلوي والتدفق الخلوي. جُمّدت عينات السيتوكينات في النيتروجين السائل، وحُفظت عند –80 °C، ولم تخضع لأكثر من دورة تجميد وإذابة واحدة قبل الاستخدام.
علم خلايا العدلات والتقدير الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي
فيما يتعلق بالباثولوجيا الخلوية، تم وضع 100 µL من معلق خلايا سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) على شريحة زجاجية باستخدام جهاز طرد مركزي خلوي (انظر جدول المواد) عند 300 × g لمدة 5 min، ثم جُففت في الهواء وصُبغت بصبغة رايت-جيمزا (Wright-Giemsa). أجرى تقني في علم الدم عمليات العد التفريقي دون معرفة بالتاريخ الطبي للمريض، حيث قام بعد ما لا يقل عن 400 خلية لكل شريحة وحسب النسب المئوية للخلايا البلعمية، والخلايا اللمفاوية، والخلايا المتعادلة، والخلايا الحمضية. واعتُبرت النسب المئوية للخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) مقياس النتيجة الأساسي للباثولوجيا الخلوية، بناءً على الأدلة الحالية التي تشير إلى فائدتها في التمييز بين أمراض الرئة المعدية وغير المعدية لدى المرضى الذين يعانون من ارتشاح رئوي14.
استند بروتوكول التكميم باستخدام قياس التدفق الخلوي إلى عملية تحقق حديثة من بروتوكول تمايز الكريات البيضاء في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) رباعي الألوان15، وشمل علامات إضافية لتحديد الخلايا المتعادلة. وتحديداً، تم حجب حوالي 5 × 105 خلية معزولة من BALF باستخدام كاشف حجب مستقبلات Fc البشرية (راجع جدول المواد) لمدة 10 min عند 4 °C، ثم صُبغت لمدة 20 min عند 4 °C بأجسام مضادة ضد CD45 (clone HI30)، وCD66b (clone G10F5)، وCD15 (clone HI98)، وCD16 (clone 3G8)، وCD11b (clone ICRF44)، وCD14 (clone M5E2)، وHLA-DR (clone L243)، بالإضافة إلى صبغة حيوية قابلة للتثبيت (راجع جدول المواد). ولتحلل الكريات الحمراء، استُخدم محلول تجاري لتحلل الكريات الحمراء (راجع جدول المواد) لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة. وبعد تحلل الكريات الحمراء، غُسلت الخلايا مرتين باستخدام PBS مضاف إليه 2% من مصل العجل الجنيني وأعيد تعليقها في محلول تدفق منظم، ثم حُللت باستخدام مقياس تدفق خلوي متعدد الألوان (راجع جدول المواد). أُجري التعويض باستخدام حبيبات تعويض مصبوغة صبغة أحادية (راجع جدول المواد)، وتضمنت كل لوحة تحليل أنابيب خالية من صبغة واحدة (fluorescence-minus-one) وأنابيب غير مصبوغة.
تم الحصول على ما لا يقل عن 1 × 105 حدث CD45⁺ لكل عينة. تم تحديد الخلايا المفردة (Singlets) أولاً في مخطط FSC-A/FSC-H، تلتها الكريات البيضاء الحية (viability dye⁻) من نوع CD45⁺، وبعد ذلك تم استبعاد الخلايا الوحيدة والبلعمية من نوع CD14⁺HLA-DR⁺ لاختيار الخلايا الحبيبية CD66b⁺ ذات التشتت الجانبي العالي. ثم تم تعريف الخلايا المتعادلة ضمن مجموعة الخلايا الحبيبية على أنها أحداث CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. وقد رُسمت بوابة الخلايا الحبيبية الأولية CD66b⁺ بشكل واسع حول جميع أحداث التشتت الجانبي العالي بدلاً من قصرها على حدود CD15⁺CD16⁺CD11b⁺، وذلك لضمان بقاء الخلايا المتعادلة المنشطة من نوع CD16-dim وCD11b-high والأشكال الأخرى الأقل نضجاً من الخلايا الحبيبية ضمن العدد الإجمالي الآلي للخلايا المتعادلة؛ بينما طُبق تعريف CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ الأكثر صرامة فقط لتوصيف المجموعة الفرعية للخلايا المتعادلة الناضجة التي تم ذكرها بشكل منفصل في تحليلات التجميع اللاحقة. تم تقدير عدد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) بوحدة (cells/µL) بناءً على النسبة المئوية للخلايا المتعادلة والعدد الإجمالي للخلايا ذات النواة الذي تم تحديده باستخدام محلل دم آلي (انظر جدول المواد). وقد تمت أرشفة مصفوفات التعويض، واستراتيجية تحديد البوابات، وتقارير مراقبة الجودة لكل عينة، وظل المحللون غير مدركين لتوزيع المجموعات المشاركة طوال فترة الحصول على البيانات وتحليلها.
توصيف السيتوكينات الالتهابية المتعددة
تم إذابة رواسب السوائل الطافية لسائل غسيل القصبات الهوائية والمزمات (BALF) مرة واحدة على ثلج رطب، متبوعاً برج سريع بجهاز الفورتيكس، ثم الترويق عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جـ لمدة 5 دقائق عند 4 °C مباشرةً قبل إجراء المقايسة. تم قياس 13 من المواد التحليلية الموزعة على ثلاث فئات وظيفية باستخدام منصة مقايسة مناعية متعددة تعتمد على الخرزات مع لوحة خرزات مغناطيسية مخصصة (انظر جدول المواداشتملت مجموعة المحفزات الالتهابية على IL-1β وIL-6 وIL-17A وTNF-α؛ واشتملت مجموعة الكيموكينات على CXCL8/IL-8 وCXCL1/GRO-α وCXCL10/IP-10 وCCL2/MCP-1 وCCL3/MIP-1α؛ بينما اشتملت المجموعة التنظيمية على IL-10 وIFN-γ وIL-1RA وG-CSF. وقد استند اختيار المواد التحليلية إلى تلك التي تم الإبلاغ عنها بشكل أكثر شيوعاً كمعلومات قيمة في التحليلات المتعددة للسيتوكينات في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) أو في المصل في دراسات الالتهاب الرئوي أو العدوى التنفسية الشديدة.7,11تَم تحديد عامل التخفيف (1:2 في محلول منظم للمقايسة) من خلال تجربة استطلاعية أجريت على مجموعة فرعية ممثلة من كل من العينات المصابة وعينات المجموعات الضابطة لضمان أن >وقعت 90% من القياسات ضمن المنحنى القياسي.
تم تحديد منحنيات القياسية باستخدام تخفيفات تسلسلية من سبع نقاط للمعايير المؤشبة الخاصة بالشركة المصنعة، والتي جُهزت في مكررات على كل لوح، بما في ذلك بئر فارغ واحد لطرح الخلفية. وأُجري مطابقة المنحنى عبر انحدار لوجستي خماسي المعلمات (5PL) بواسطة برنامج الحصول على البيانات والتحليل المملوك للجهاز (راجع جدول المواد). وحُسب الحد الأدنى للتقدير الكمي (LLOQ) على أنه أصغر كمية من المعيار تعطي استعادة مطابقة عكسية تتراوح بين 80% و 120% ومعامل تباين (CV) داخل التشغيلة ≤ 20%. أما القيم التي كانت أقل من LLOQ فقد استُبدلت بالقيمة LLOQ/√2. كما تم تقسيم عينتين من مراقبة الجودة من سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) المجمعة، إحداهما من مريض مصاب ممثل والأخرى من شخص سليم، وإضافتهما إلى كل لوح لتتبع الأداء على المدى الطويل. واستندت معايير ضمان الجودة إلى توصيات أفضل الممارسات المستمدة من برنامج كفاءة مقايسة قائمة على الخرزات المتعددة في مواقع متعددة استمر لمدة 12 عاماً16، بما في ذلك متطلبات أن يكون CV داخل المقايسة ≤ 10% في الآبار المكررة، و CV بين الألواح ≤ 20% لمراقبة الجودة، وبحد أدنى لعدد الخرزات ≥ 50 لكل مادة تحليلية في البئر الواحد. وأُعيد تشغيل الألواح التي لم تستوفِ المعايير المذكورة أعلاه. أُجري التحليل في دفعة واحدة خلال أربعة أسابيع، باستخدام تشغيلة واحدة من الطقم، مع تداخل عشوائي لعينات الإصابة والعينات الضابطة.
مسار تحليل التصوير المرئي
تَم تحليل ملفات معيار قياس التدفق الخلوي (FCS) أولاً باستخدام برنامج تجاري لقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) لتعويض الإشارات وتحديد الخلايا المفردة الحية الموجبة لـ CD45⁺، ثم صُدِّرت لإجراء تحليل غير متحيز باستخدام برنامج R v4.4. وبالنسبة لكل عينة، تم أخذ عينة فرعية مكونة من 10,000 حدث موجب لـ CD45⁺ ودمجها، وتحويل شدة الإشارات باستخدام دالة arcsinh بمعامل مساعد قدره 150. كما أُجري تقليل الأبعاد وإسقاطات UMAP باستخدام حزمة uwot بضبط 15 أقرب جار ومسافة دنيا قدرها 0.1، بالتوازي مع تضمينات t-SNE باستخدام حزمة Rtsne بقيمة حيرة (perplexity) تبلغ 30.10تم تحديد مجموعات الأنماط الظاهرية باستخدام FlowSOM مع 100 عقدة لخريطة ذاتية التنظيم، ثم قُسمت لاحقاً إلى 12-15 مجموعة عبر التجميع الميتاوي (meta-clustering)، باستخدام منهج قائم على التحسين تم التحقق من صحته مؤخراً لبيانات قياس التدفق الخلوي عالية الأبعاد.17تم تعيين تسمية توضيحية لكل عنقود بناءً على متوسط تعبير مؤشرات السلالة والتنشيط، ثم تمت مراجعتها مقابل البوابات اليدوية.
لتحليل بيانات السيتوكينات المتعددة، تم أولاً تحويل القيم الخام باستخدام اللوغاريتم العشري log₁₀ ثم توحيدها بين المواد التحليلية عبر حساب الدرجة المعيارية (z-scoring) قبل إجراء التحليلات الإضافية. خضعت كل من المواد التحليلية والمرضى للتجميع الهرمي باستخدام المسافة الإقليدية ورابط Ward.D2؛ وعُرِضت النتائج في خريطة حرارية مجمعة حسب الصفوف والأعمدة. استُخدم هذا النهج للكشف عن وحدات السيتوكينات ذات التعبير المشترك وتصنيف المجموعات الفرعية من المرضى في المجموعات الالتهابية المتعددة9. تم إنشاء مصفوفات الارتباط لجميع المؤشرات الحيوية الخلوية والذائبة باستخدام ارتباطات سبيرمان الرتبية الزوجية. رُسمت الخرائط الحرارية لمصفوفات الارتباط إلى جانب شبكة تمثل فيها العقد المؤشرات الحيوية، وتشير الحواف إلى الارتباطات التي صمدت أمام تصحيح الاختبارات المتعددة باستخدام طريقة بنجاميني-هوشبرغ (BH). تم قياس عرض الحافة وفقاً لمقدار معامل الارتباط |ρ|، وأُدرجت الحواف فقط إذا كانت |ρ| ≥ 0.30 و p < 0.05 بعد التصحيح. أُجري تحليل المكونات الرئيسية (PCA) على المصفوفة الموحدة التي تحتوي على الخلايا والسيتوكينات باستخدام دالة prcomp() مع قياس تباين الوحدة. تم إسقاط المشاركين على أول مكونين رئيسيين مع تراكب مجموعات العدوى والمجموعات الضابطة. وضمن تقليل العينات والتوحيد المتسق لجميع التحليلات إمكانية المقارنة بين قراءات المؤشرات الحيوية الخلوية والذائبة في جميع التصورات البيانية.
التحليل الإحصائي
تم وصف المتغيرات المستمرة باستخدام الوسيط (المدى الربيعي، IQR) عندما كانت غير طبيعية وفقاً لاختبارات Shapiro–Wilk، وبالمتوسط (الانحراف المعياري، SD) في الحالات الأخرى. ووُصفت المتغيرات الفئوية باستخدام التكرارات والنسب. أُجريت المقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار Mann–Whitney U عندما كانت المتغيرات المستمرة ذات توزيعات غير طبيعية، واختبار Welch t عندما كانت المتغيرات المستمرة موزعة طبيعياً، واختبار مربع كاي (chi-squared)/اختبار فيشر الدقيق (Fisher's exact test) عندما كان ذلك مناسباً للمتغيرات الفئوية. كما تم تقييم الارتباطات بين المتغيرات المستمرة من خلال معامل ارتباط رتب سبيرمان (Spearman's rank correlation coefficient). ولمراعاة معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) في تحليلات السيتوكينات المتعددة والارتباطات، تم تعديل قيم p باستخدام طريقة Benjamini–Hochberg مع حد قطع q < 0.05. واعتُبرت قيمة p < 0.05 ذات اتجاهين دالة إحصائياً في جميع التحليلات الأولية. وحيثما أمكن، تم الاحتفاظ بالحالات التي تحتوي على بيانات مفقودة في متغيرات فردية وتحليلها عن طريق تحليل الحالات الكاملة للمتغير المتأثر، بينما أُجريت عمليات تعويض متعددة باستخدام المعادلات المتسلسلة (m = 20) لإجراء تحليلات الحساسية. وتم إنشاء منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) والمساحة المقابلة تحت المنحنى (AUC) لسيتوكينات فردية باستخدام حزمة pROC ضمن مجموعة الدراسة الكاملة؛ ولم يتم استخدام مجموعة تحقق خارجية منفصلة. وكررت تحليلات الحساسية المحددة مسبقاً مقارنات المجموعات الأولية بعد استبعاد المشاركين الذين تلقوا مضادات حيوية خلال 72 h قبل تنظير القصبات، وبعد تقسيم مجموعة العدوى حسب حالة التهوية الميكانيكية وبحسب النوع الفرعي للالتهاب الرئوي (المكتسب من المجتمع، أو المكتسب في المستشفى، أو المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي). أُجريت التحليلات باستخدام حزم rstatix و FlowSOM و uwot و ComplexHeatmap و igraph و pROC و mice في برنامج R v4.4. وأُنشئت الأشكال باستخدام برامج رسم بياني علمية تجارية (انظر جدول المواد).
النتائج
مجتمع الدراسة وخصائص العينة
ضمت مجموعة التحليل النهائية 112 شخصاً، منهم 64 شخصاً في مجموعة الإصابة و48 شخصاً في مجموعة الضبط غير المصابة. كانت الخصائص الديموغرافية الأساسية متشابهة بين المجموعتين، بينما كانت المؤشرات المختبرية المتعلقة بالإصابة أعلى في مجموعة الإصابة، كما هو موضح في الجدول 1. كانت الإصابات ناتجة بشكل أساسي عن بكتيريا سالبة الجرام، وكانت المسببات البكتيرية الرئيسية هي Klebsiella pneumoniae وPseudomonas aeruginosa وAcinetobacter baumannii. وشملت المسببات الأخرى Streptococcus pneumoniae وStaphylococcus aureus، وعوامل غير نمطية، وفيروسات، وإصابات مختلطة.
استوفت معدلات استعادة سائل غسيل القصيبات والأسناخ الرئوية (BALF) العتبة المحددة مسبقاً وهي ≥40% لجميع العينات المحتفظ بها، مع تسجيل معدلات أقل قليلاً في مجموعة العدوى مقارنة بمجموعة الضبط (الوسيط 48.3% مقابل 53.3%، p = 0.03)، وهو ما يتفق مع زيادة التهاب المجاري التنفسية والاحتقان المخاطي في المجاري التنفسية المصابة. ونظراً لأن الحجم المستعاد اختلف أيضاً بين المجموعتين (58 mL مقابل 64 mL، p = 0.04)، فقد تكون جميع تركيزات السيتوكينات المبلغ عنها عرضة لاختلاف طفيف في عامل التخفيف بين المجموعتين؛ وقد أدى تحليل حساسية محدد مسبقاً مقتصر على العينات التي بلغت نسبة استعادتها ≥50% (العدد = 42 في مجموعة العدوى، العدد = 34 في مجموعة الضبط) إلى إعادة إنتاج اتجاه وحجم كل مقارنة بين المجموعتين (أكبر تغيير في حجم التأثير < 8%)، مما يشير إلى أن انحياز التخفيف من غير المرجح أن يكون سبباً في الاختلافات الملحوظة. وكان الوقت بين الجمع والمعالجة 65 min لمجموعة العدوى و62 min لمجموعة الضبط، مما يجعله ضمن النافذة الزمنية المحددة بساعتين. وأشارت معايير ضبط الجودة (QC) على مستوى العينة إلى نتائج عالية الجودة. تم الحصول على التعدادات التفريقية للخلايا بناءً على عد ≥400 خلية في جميع العينات 112/112 (100%). كما استوفت عمليات استحواذ قياس التدفق الخلوي المعيار المحدد مسبقاً وهو ≥1 × 105 من أحداث CD45⁺ في جميع العينات 112/112 (100%)، بمتوسط حيوية للخلايا الحية بلغ 89.4% (IQR 85.6–92.8%). واستوفت جميع أطباق السيتوكينات المتعددة معايير ضبط الجودة بعد إعادة تشغيل واحدة. وبالنسبة لجميع التحاليل الـ 13، كان معامل التباين (CV) داخل المقايسة 4.7% (2.1–9.3%، جميعها <10%)، وكان معامل التباين بين الأطباق لعينات ضبط الجودة المجمعة 11.2% (6.8–18.4%، جميعها <20%)، وكان متوسط عدد الخرزات 78 حدثاً/تحليل/بئر (53–142، جميعها ≥ 50).
| متغير | عدوى (العدد = 64) | مجموعة الضبط (العدد = 48) | القيمة الاحتمالية (p value) |
| العمر، بالسنوات، الوسيط [المدى الربيعي] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| ذكر، ن (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| مؤشر كتلة الجسم، كجم/م²2، الوسيط [المدى الربيعي] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| تاريخ التدخين، العدد (%) | 0.52 | ||
| أبداً | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| السابق | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| الحالي | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| فرط ضغط الدم، ن (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| داء السكري، العدد (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| مرض الشرايين التاجية، العدد (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| مرض الكلى المزمن، العدد (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| دواعي إجراء تنظير القصبات، ن (%) | — | ||
| الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع | 35 (54.7) | — | |
| الالتهاب الرئوي المكتسب من المستشفيات | 19 (29.7) | — | |
| الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي | 10 (15.6) | — | |
| عقيدة رئوية غير محددة | — | 23 (47.9) | |
| شذوذ شعاعي مستمر | — | 15 (31.3) | |
| تقييم السعال المزمن | — | 10 (20.8) | |
| المسبب المرضي، العدد (%) | — | ||
| البكتيريا سالبة الجرام | 28 (43.8) | ||
| البكتيريا موجبة الجرام | 16 (25.0) | ||
| المسببات المرضية غير النموذجية | 7 (10.9) | ||
| الفيروسات التنفسية | 8 (12.5) | ||
| عدوى مختلطة | 5 (7.8) | ||
| التهوية الميكانيكية عند غسل القصبات والأسناخ (BAL)، العدد (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| التعرض للمضادات الحيوية خلال 72 ساعة قبل غسيل القصبات والأسناخ (BAL)، العدد (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| الحجم المحقون، مل، الوسيط [المدى الربيعي] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| الحجم المستعاد، مل، الوسيط [المدى الربيعي] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| معدل استعادة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية، %، الوسيط [المدى الربيعي] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| وقت المعالجة، دقيقة، الوسيط [المدى الربيعي] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| عدد كرات الدم البيضاء في الدم، × 10⁹/لتر، الوسيط [المدى الربيعي] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| العدلات في الدم، %، الوسيط [المدى الربيعي] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| البروتين المتفاعل-C، مجم/لتر، الوسيط [المدى الربيعي] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| بروكالسيتونين، نانوغرام/ملليلتر، الوسيط [المدى الربيعي] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
الجدول 1: الخصائص الديموغرافية والسريرية وخصائص معالجة سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) لمجموعة الدراسة. تتم مقارنة الخصائص الديموغرافية الأساسية، والأمراض المصاحبة، ودواعي إجراء تنظير القصبات، والمسببات المرضية، ومعايير الإجراءات، وقيم المختبر لدم الطرفين بين 64 مشاركاً في مجموعة العدوى و 48 مشاركاً في مجموعة التحكم غير المصابة بالعدوى. يتم تقديم المتغيرات المستمرة في شكل الوسيط [المدى الربيعي] وتتم مقارنتها باستخدام اختبار Mann–Whitney U ؛ أما المتغيرات الفئوية فتُقدم في شكل العدد والنسبة المئوية n (%) وتتم مقارنتها باستخدام اختبار مربع كاي (chi-squared test) أو اختبار فيشر الدقيق (Fisher's exact test) حيثما كان ذلك مناسباً. الاختصارات: BAL = غسيل القصبات والأسناخ؛ BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ؛ BMI = مؤشر كتلة الجسم؛ IQR = المدى الربيعي؛ WBC = تعداد خلايا الدم البيضاء.
تصوير تجنيد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF)
لوحظ تحول واضح في النسبة من مجموعة تهيمن عليها الخلايا البلعمية إلى مجموعة تهيمن عليها الخلايا المتعادلة بين الأشخاص المصابين، كما هو موضح في الشكل 2. صُبغت تحضيرات جهاز الطرد المركزي الخلوي باستخدام تقنية Wright–Giemsa، وأظهر التلوين تمييزاً واضحاً بين المجموعتين، حيث احتوت مجموعة الضبط على المزيد من البلعميات السنخية، وبعض الخلايا الليمفاوية، وقليل من الخلايا المتعادلة، بينما هيمنت الخلايا المتعادلة على المجموعة المصابة مع وجود بكتيريا داخل خلوية متكررة، ونوى متحللة، وتحببات سامة. استُخدمت التعدادات التفريقية بناءً على 400 خلية معدودة على الأقل للتحقق من الاختلافات، حيث ارتفعت نسبة الخلايا المتعادلة من قيمة وسيطة قدرها 3.2% (IQR: 1.8–5.6%) في مجموعة الضبط إلى 68.4% (IQR: 49.2–82.5%) في المجموعة المصابة (p < 0.001)، بينما انخفضت نسبة البلعميات السنخية من 88.2% (IQR: 82.4–92.5%) إلى 22.6% (IQR: 12.3–38.5%) (p < 0.001). وكانت النسب المئوية للخلايا الليمفاوية متشابهة بين المجموعتين (7.4% [4.8–11.3%] مقابل 6.5% [3.4–11.2%], p = 0.42).
أكدت تحليلات تحديد البوابات (gating) وتقليل الأبعاد ووسعت نطاق الأنماط الظاهرية الخلوية التي لوحظت عبر المجهر. فبعد استبعاد الحطام والخلايا المزدوجة والخلايا الميتة، شكلت الخلايا الحبيبية CD45⁺CD66b⁺ وسيطاً قدره 65.8% (IQR: 46.2–79.4%) من كرات الدم البيضاء CD45⁺ في مجموعة العدوى، مقابل 4.1% (IQR: 2.3–6.8%) في المجموعة الضابطة (p < 0.001). وضمن مجتمع الخلايا الحبيبية، شكلت الخلايا المتعادلة الناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ نسبة 92.4% (IQR: 87.5–95.8%) من جميع الخلايا الحبيبية في مجموعة العدوى، مقابل 88.6% (IQR: 82.3–93.5%) في المجموعة الضابطة، مما يشير إلى أن مجمع الخلايا المتعادلة المستقطبة كان يتكون إلى حد كبير من خلايا ناضجة ومتمايزة تماماً بدلاً من السلائف المبكرة. وأظهرت إسقاطات UMAP و t-SNE القائمة على مصفوفة البروتينات السطحية المحولة بـ arcsinh تضاريس متطابقة تقريباً، حيث شغلت حالات العدوى جزيرة بارزة من الخلايا المتعادلة الناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ التي كانت قليلة الكثافة في عينات المجموعة الضابطة، بينما أظهرت جزيرة البلاعم السنخية HLA-DR⁺CD14⁺ نمطاً معاكساً، حيث كانت كثيفة السكان في المجموعات الضابطة وقليلة الكثافة في حالات العدوى. وحدد التجميع الميتا-عنقودي بواسطة FlowSOM نحو 13 مجموعة فرعية، أظهرت من بينها مجموعة فرعية من الخلايا المتعادلة الناضجة (38.4% [22.6–56.2%] مقابل 2.8% [1.5–4.6%], p < 0.001) وعنقود من الخلايا المتعادلة المنشطة ذات التعبير الخافت لـ CD16 والتعبير العالي لـ CD11b (22.6% [11.4–32.5%] مقابل 0.4% [0.1–1.2%], p < 0.001) أكبر توسعات بين المجموعات.
فيما يتعلق بالعدد المطلق للخلايا المتعادلة، لوحظت زيادة تقريبية بمقدار 50 ضعفاً في الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) في مجموعة العدوى مقارنة بمجموعة الضبط. وارتفع العدد الإجمالي للخلايا ذات النوى لكل µL من BALF من 156 cells/µL (IQR 88–232) في مجموعة الضبط إلى 384 cells/µL (IQR 180–712) في مجموعة العدوى (p < 0.001)، كما ارتفعت أعداد الخلايا المتعادلة من 5 cells/µL (IQR 2–13) في مجموعة الضبط إلى 262 cells/µL (IQR 89–578) في مجموعة العدوى (p < 0.001). وظلت الفروق الزوجية في نسبة الخلايا المتعادلة والعدد المطلق بين المجموعات ذات دلالة إحصائية عالية بعد تعديل بنجاميني-هوشبيرج (BH) (q < 0.001).
الشكل 2: تصور تجنيد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF). توضح حقول دوران خلوي ممثلة ومصبوغة بصبغة Wright–Giemsa من مشارك ضابط ومشارك مصاب التحول من ملف خلوي في BALF تسوده الخلايا البلعمية إلى ملف تسوده الخلايا المتعادلة. يظهر جنباً إلى جنب للسماح بالمقارنة المباشرة للأنماط الظاهرية الخلوية المحددة في مجموعات الإصابة والمجموعة الضابطة: استراتيجية بوابات تدفق الخلايا المكونة من أربع خطوات (FSC singlets ← خلايا leukocytes حية CD45⁺ ← خلايا granulocytes موجبة لـ CD66b⁺ بعد استبعاد CD14⁺HLA-DR⁺ ← خلايا متعادلة ناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺)، وتضمين UMAP لبيانات تدفق الخلايا المحولة باستخدام arcsinh مع تراكب FlowSOM لـ 13 عنقوداً رئيسياً (metacluster) ملونة حسب التوصيف البيولوجي، ومخططات صندوقية لنسبة الخلايا المتعادلة في BALF والتركيز المطلق للخلايا المتعادلة (cells/µL، مقياس لوغاريتمي). الاختصارات: BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ؛ FSC = التشتت الأمامي؛ UMAP = التقريب والاسقاط المتشعب الموحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تصوير ملفات السيتوكينات الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF)
ميز نمط من الاستجابات المنسقة عبر محاور متعددة للسيتوكينات بين مجموعة الإصابة والمجموعة الضابطة، وقد صُنفت السيتوكينات إلى ثلاث وحدات وظيفية متسقة، كما هو موضح في الشكل 3. أنتج تجميع تركيزات السيتوكينات المحولة لوغاريتمياً (log₁₀) والمقيسة باستخدام طريقة Ward.D2 مخطط شجري (dendrogram) واضح للمجموعات مقسماً إلى مجموعتين، حيث شغلت عينات الإصابة والمجموعات الضابطة طرفين متقابلين من المخطط الشجري، ولوحظ وجود سبعة مشاركين فقط تم تصنيفهم بشكل خاطئ (ست حالات ضابطة تجمعت مع عينات الإصابة، ومعظمها كانت حالات سعال مزمن مع التهاب بسيط في المسالك الهوائية يتسم بزيادة الخلايا المتعادلة، وعينة إصابة واحدة تجمعت مع المجموعات الضابطة، وكانت تمثل حالة ذات رئة غير نمطية مبكرة). حدد المخطط الشجري للمواد التي تم تحليلها ثلاث مجموعات من السيتوكينات. أظهرت مجموعة الكيموكينات، التي تضم CXCL8 وCXCL1 وCXCL10 وCCL2 وCCL3، أكبر تغيير في الطية (fold change) بين مجموعتي الإصابة والضابطة وأعلى ارتباط داخل الوحدة الوظيفية. وأظهرت المجموعة المحفزة للالتهابات، التي تحتوي على IL-1β وIL-6 وIL-17A وTNF-α، ارتفاعات اتجاهية مماثلة، وإن كانت أقل وضوحاً إلى حد ما. كما ارتفعت المجموعة التنظيمية، التي تشمل IL-10 وIL-1RA وIFN-γ وG-CSF، في عينات الإصابة، مما يشير إلى أن الاستجابة لم تكن محفزة للالتهابات فحسب، بل فعلت في الوقت ذاته الأذرع المضادة للتنظيم والمضادة للفيروسات.
كانت الوسائط (IQRs) لجميع المواد التحليلية المختبرة أعلى في مجموعة العدوى مقارنة بمجموعة الضبط، وكانت قيمة p المعدلة أقل من 0.001 لجميع المواد التحليلية الثلاث عشرة بعد تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ القائم على BH (BH-FDR). ومن بين المواد التحليلية، سجل CXCL8/IL-8 أعلى تركيز وأكبر تضاعف في التغير (من 68 [32–142] pg/mL في مجموعة الضبط إلى 2,485 [842–6,520] pg/mL في مجموعة العدوى، وهو ما يمثل زيادة بنحو 36 ضعفاً). وظهر نمط موازٍ لـ CXCL1/GRO-α، بزيادة تقارب 21 ضعفاً (78 [36–148] مقابل 1,672 [524–3,890] pg/mL). كما أظهر IL-1β زيادة تقارب 13 ضعفاً (5.8 [2.6–11.4] مقابل 78 [29–184] pg/mL). بينما أظهر كل من IL-6 وIL-1RA وG-CSF زيادات تتراوح بين 13 إلى 16 ضعفاً (16.4 [7.8–30.5] مقابل 248 [82–612] pg/mL؛ و112 [48–258] مقابل 1,748 [658–3,964] pg/mL؛ و24 [10–52] مقابل 384 [125–912] pg/mL، على التوالي). وشملت الزيادات الأخرى الأصغر كل من TNF-α (~8 أضعاف)، وCXCL10/IP-10 (~9 أضعاف)، وCCL2/MCP-1 (~8 أضعاف)، وCCL3/MIP-1α (~10 أضعاف)، وIL-10 (~10 أضعاف)، وIFN-γ (~6 أضعاف)، وIL-17A (~4 أضعاف).
حدد تحليل خصائص تشغيل المستقبل (ROC) ضمن المجموعة أن كل من IL-8 (AUC 0.94)، وIL-1β (AUC 0.92)، وIL-6 (AUC 0.91)، وCXCL1 (AUC 0.91)، وG-CSF (AUC 0.89) هي المواد التحليلية ذات أقوى تمييز بعلامة منفردة بين مجموعتي العدوى والمجموعة الضابطة؛ وتلخص قيم AUC هذه التمييز ضمن مجموعة التحليل في ظل غياب مجموعة تحقق خارجية منفصلة. وقد أسفر تحليل الحساسية باستخدام التضمين المتعدد بواسطة المعادلات المتسلسلة (m = 20) عن تقديرات في حدود 5% من الوسائط للحالات الكاملة لكل مادة تحليلية، ولم يغير الترتيب الرتبي لأحجام التأثير.
استُخدمت تحليلات حساسية محددة مسبقاً لتقييم تأثير التعرض المسبق للمضادات الحيوية والنمط الفرعي للالتهاب الرئوي على الاختلافات الملحوظة في السيتوكينات. وعند تكرار المقارنات الأساسية بين المجموعات بعد استبعاد 41 مشاركاً من مجموعة العدوى (64.1%) الذين تلقوا مضادات حيوية خلال 72 h قبل عملية غسيل القصبات والأسناخ (BAL)، ظلت جميع التحاليل الـ 13 أعلى بشكل ملحوظ في حالات العدوى الـ 23 المتبقية مقارنة بالمجموعات الضابطة بعد تصحيح BH-FDR (قيمة p المعدلة < 0.001 لأهم خمسة مميزات)، مع تقديرات نقطية كانت أعلى قليلاً بدلاً من كونها أقل من وسيطات المجموعة الكاملة (على سبيل المثال، CXCL8/IL-8 2,860 [980–7,110] pg/mL و IL-1β 92 [34–210] pg/mL)، وهو ما يتفق مع التخميد الجزئي لسيتوكينات الممرات الهوائية بسبب التعرض للمضادات الحيوية قبل عملية غسيل القصبات والأسناخ. وأظهر تقسيم مجموعة العدوى حسب النمط الفرعي للالتهاب الرئوي نفس ترتيب رتب الكيموكينات والسيتوكينات المحرضة للالتهابات عبر الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع (n = 35)، والالتهاب الرئوي المكتسب من المستشفى (n = 19)، والالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي (n = 10)، حيث أظهرت المجموعة الفرعية للالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي أعلى مستويات وسيطة لـ CXCL8 و CXCL1 و IL-6 و G-CSF، ولم تؤدِ حالة التنفس الاصطناعي إلى تغيير اتجاه أي مقارنة بين المجموعات.
الشكل 3: تصور لملفات السيتوكينات الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF). خريطة حرارية للتجميع الهرمي لتركيزات 13 محللاً مقاسة، محولة إلى مقياس log₁₀ وموحدة وفقاً لدرجة z، لجميع المشاركين البالغ عددهم 112 مشاركاً، مع أشرطة تعليق توضيحية ملونة فوق الخريطة الحرارية تشير إلى تعيين المجموعة (ضابطة، عدوى)، والنوع الفرعي للالتهاب الرئوي (الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع CAP، أو المكتسب من المستشفى HAP، أو المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي VAP)، وفئة الممرض المسبب (عدوى بكتيريا سالبة الغرام، أو موجبة الغرام، أو غير نمطية، أو فيروسية، أو عدوى مختلطة). تقارن المخططات الصندوقية للسيتوكينات الأكثر وفرة وتمايزاً (CXCL8/IL-8، وIL-1β، وIL-6، وCXCL1/GRO-α، وG-CSF، وTNF-α؛ بمقياس log₁₀، pg/mL) بين مجموعتي العدوى والمجموعة الضابطة. *** p < 0.001 بعد تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب بطريقة BH. الاختصارات: BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ؛ BH = بنجاميني-هوشبرج؛ CAP = التهاب رئوي مكتسب من المجتمع؛ HAP = التهاب رئوي مكتسب من المستشفى؛ VAP = التهاب رئوي مرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التصوير المرتبط لاستنفار الخلايا المتعادلة وملفات السيتوكين
أظهر الربط بين المكونات الخلوية والذائبة وجود صلة بيولوجية قوية بين تجنيد الخلايا المتعادلة ونظام الكيموكينات، كما هو موضح في الشكل 4. وقد استُمد تصوير ثنائي الأبعاد من تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لمصفوفة السيتوكينات والخلايا الموحدة، حيث مثل المكون الرئيسي الأول (PC1) نسبة 51.1% من التباين الكلي، بينما مثل المكون الرئيسي الثاني (PC2) نسبة 12.7% إضافية، ليصل المجموع التراكمي إلى 63.8%. فصل PC1 مجموعة العدوى عن مجموعات الضبط، وتميز ذلك بوجود أحمال إيجابية عالية لكل من الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF)، وCXCL8، وCXCL1، وIL-6، وIL-1β، وG-CSF، وأحمال سلبية عالية للخلايا البلعمية. أما PC2 فقد فصل بين مسار غني بالكيموكينات (أحمال إيجابية عالية لـ CXCL8 وCXCL1) ومسار غني بالمنظمات (أحمال إيجابية لـ IL-10، وIL-1RA، وIFN-γ)، بحيث مال المشاركون ضمن مجموعة العدوى إلى الانفصال وفقاً لشدة الحالة، حيث وقعت حالات الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي الذين خضعوا للتهوية الميكانيكية في الربع الغني بالكيموكينات.
كشفت ارتباطات رتب سبيرمان الزوجية بين 17 سمة خلوية وذائبة عن وجود ارتباط إيجابي قوي بين عدد العدلات في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) ومحور الكيموكينات العام (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; وجميع قيم p المعدلة < 0.001). وتم رصد المستوى الثاني من الارتباطات ذات الدلالة الإحصائية بين أعداد العدلات ومحور الالتهاب (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51)، تليها ارتباطات إيجابية متوسطة مع المحور التنظيمي (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). وأظهرت نسبة الخلايا البلعمية ارتباطاً سلبياً عكسياً مع كل من محوري الكيموكينات والالتهاب وبقوة مماثلة. كانت الارتباطات داخل المحور الواحد أقوى بكثير من الارتباطات بين المحاور المختلفة (وسيط |ρ| داخل المحور = 0.68 مقابل وسيط |ρ| بين المحاور = 0.33)، مما يدعم مفهوم وجود مسارات تنظيمية عليا مشتركة تتحكم في محاور الكيموكينات، ومحور الالتهاب، والمحور التنظيمي.
رسمت شبكة الارتباط هذا الاقتران على مخطط بياني كانت فيه الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) هي العقدة المركزية الأكثر أهمية، مع بقاء جميع الحواف الـ 13 المؤدية إلى السيتوكينات صامدة بعد تصحيح BH للاختبارات المتعددة. ومن بين 136 اتصالاً زوجياً محتملاً بين الميزات الـ 17، استوفت 99 اتصالاً المعيار المشترك المتمثل في |ρ| ≥ 0.30 والقيمة المعدلة وفقاً لـ BH. p < كانت القيمة 0.05 وتم الاحتفاظ بها. وأظهر مخطط شبكة الارتباط بنية نمطية واضحة مكونة من ثلاث كتل تكرر المجموعات التي تم الحصول عليها من التجميع الهرمي: حيث كانت الروابط الأكثر كثافة وقوة بين وحدة الكيموكين وعدد ونسبة العدلات في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)، وربطت روابط متوسطة الوزن بين الوحدة المحفزة للالتهاب وكل من العدلات ووحدة الكيموكين، بينما ربطت روابط رفيعة من الوحدة التنظيمية بين كتلي الكيموكين والمحفزات للالتهاب. وكان عقدة نسبة البلاعم في الجهة المقابلة لكتلة العدلات والكيموكين، وربطت بها عبر مجموعة من الحواف ذات الأوزان السلبية. وبشكل جماعي، كشف تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ومصفوفة الارتباط ومخطط الشبكة عن نمط متسق يرتبط فيه تسلل العدلات في سائل غسيل القصبات والأسناخ واستجابة الكيموكين ارتباطاً قوياً على مستوى المشاركين الأفراد، بينما تعمل المسارات المحفزة للالتهاب والتنظيمية كوحدات محددة جيداً ولكنها مترابطة حول هذا المحور المتمثل في العدلات والكيموكين.
الشكل 4: التصوير المقترن لاستنفاد الخلايا المتعادلة وملفات السيتوكينات الالتهابية. مخطط ثنائي المكونات (biplot) لتحليل المكونات الرئيسية لمصفوفة الخلايا والسيتوكينات الموحدة، مع تلوين المشاركين حسب المجموعة، وخريطة حرارية لارتباط سبيرمان، ورسم بياني شبكي لجميع الميزات الخلوية والذائبة الـ 17 (أحجام العقد حسب الدرجة، والحواف مقيسة وفقاً لـ |ρ| ومفلترة حسب قيمة p المعدلة وفق طريقة BH بحيث تكون < 0.05 و |ρ| ≥ 0.30)، مع تسليط الضوء على مركز الخلايا المتعادلة والكيماوكين. الاختصارات: BH = Benjamini–Hochberg؛ PC = المكون الرئيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
توافر البيانات:
تتوفر مجموعة البيانات المجهولة على مستوى المشاركين وكود تحليل R المستخدم في هذه الدراسة كـ الجدول التكميلي S1 و الملف التكميلي 1تتوفر البيانات الأخرى التي تدعم نتائج هذه الدراسة من المؤلف المسؤول بناءً على طلب معقول.
الجدول التكميلي S1: مجموعة بيانات سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF).يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: ملف ZIP يحتوي على أكواد التحليل.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
تعتمد متانة هذا البروتوكول على عدة قرارات تم اتخاذها قبل التحليل وأثناءه. لقد كان تحديد الحد الأدنى لمعدل الاستعادة بنسبة 40% ودمج الأجزاء الثانية واللاحقة قراراً متعمداً، نظراً لأن الجزء الأول يحتوي على إثراء أعلى من مواد المسالك الهوائية الشعبية، بينما يتباين معدل الاستعادة بشكل منهجي وفقاً للعمر، والجنس، وتاريخ التدخين، والشعبة الهوائية المستهدفة18. ويعد حجب مستقبلات Fc ومعايرة الأجسام المضادة ضد النسائل الفردية لضمان حدود تقسيم صحيحة بين الخلايا المتعادلة الناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ والبالعات السنخية CD14⁺HLA-DR⁺ (وهي الخلايا السائدة في عينة BALF والتي تظهر أعلى مستويات الصبغ غير النوعي وخلفية الفلورة الذاتية) أمراً حيوياً للحفاظ على الاتساق بين المجموعتين19,20. كما أن القيد المفروض على عمليات التجميد والذوبان والإطار الزمني البالغ 2 h للتحليل المتعدد (multiplex analysis) لم يكن عشوائياً أيضاً؛ حيث أظهرت البيانات الخاصة بـ BALF البشري انخفاضاً ملحوظاً في نسب الخلايا المتعادلة من 6 إلى 24 h، حتى عند تخزينها في درجة حرارة 4 °C، بينما ظلت نسب البالعات والخلايا الليمفاوية ثابتة13. وقد تم تحديد معلمات خوارزميات t-SNE وUMAP، وكذلك معلمات شبكة FlowSOM المكونة من 100 عقدة ومعلمات 12–15 عنقوداً فوقياً (metaclusters)، مسبقاً قبل تحليل المجموعات لمنع الضبط اللاحق (post hoc tuning)، والذي يعد أحد الأسباب المعروفة لعدم إمكانية تكرار مسارات عمل قياس التدفق الخلوي16. ولا يزال من الممكن الاحتفاظ بهوية المشغلين واللوحة/التشغيل لكل حدث خلوي لتطبيق طرق تصحيح الدفعات في التحليلات واسعة النطاق مستقبلاً21.
هناك عدة أنماط فشل شائعة لا تتطلب إجراء تغييرات على البروتوكول. عادةً ما يعود انخفاض الاسترداد (<40%) إلى وضعية الإسفين غير الكافية أو الشفط المفرط؛ ويجب معالجة هذه المشكلة عن طريق ضبط وضع منظار القصبات وتقليل الشفط إلى <100 mmHg قبل سحب عينة أخرى. يمكن التخفيف من حدة الفلورة الذاتية المفرطة الناتجة عن البلاعم السنخية، والتي تعد العامل المربك الرئيسي في تحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا الرئة، من خلال تضمين ضوابط لخلايا رئة غير مصبوغة في كل دفعة، وتحديد بوابة البلاعم ذات التشتت الجانبي العالي بوضوح بدلاً من الاعتماد فقط على صبغات الحيوية19. غالباً ما تتأثر اللوحات المتعددة بانخفاض عدد الخرزات والقيم العالية الشاذة. إن إجراء منحنى تخفيف أولي لمجموعة فرعية من العينات المصابة وعينات الضبط قبل تثبيت تخفيف 1:2 يضمن تجنب تشبع إشارة CXCL8 وCXCL1 وG-CSF، الموجودة في أعلى جزء من منحنى المعايرة لعينات الالتهاب الرئوي، وذلك بسبب تأثير المصفوفة الذي اكتُشف سابقاً في عينات BALF22. يمكن تعديل البروتوكول بشكل أكبر بناءً على خصوصيات المجموعة المدروسة. فعندما تحتوي العينات بشكل أساسي على نوع واحد من الممرضات، فإن تقليص اللوحة الأساسية لتشمل الكيموكينات والوسطاء المؤيدين للالتهاب فقط من شأنه أن يحافظ على قوة إحصائية كافية. أما في حالة وجود مجموعة مختلطة تحتوي على بكتيريا وفيروسات وممرضات غير نمطية، فسيظل من المفيد قياس الوسطاء التنظيميين أيضاً، بما أنه ثبت مؤخراً وجود بصمة محددة للممرض في الخلايا المتعادلة والبلاعم السنخية23، كما تبين أن مزيجاً من سيتوكينات BALF المؤيدة والتنظيمية يعكس شدة المرض في حالات الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع24.
لا تكمن مساهمة سير العمل الحالي في الملاحظة الفردية لتدفق الخلايا المتعادلة أو ارتفاع مستويات الكيموكينات والسيتوكينات الموالية للالتهاب في العدوى التنفسية، حيث إن كلا الأمرين موثقان على نطاق واسع، بل تكمن في الربط بين لوحة قياس التدفق الخلوي المكونة من سبعة مؤشرات للخلايا المتعادلة والوحيدات، ومقايسة مناعية متعددة التحاليل تضم 13 تحليلًا، ضمن مسار تصور مشترك يُطبق على نفس عينة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF). إن تنفيذ لوحة من سبعة مؤشرات تستهدف الخلايا المتعادلة والوحيدات، إلى جانب مقايسة مناعية متعددة التحاليل بـ 13 تحليلًا، يتيح رصد التعقيد المظهري والتعقيد في السيتوكينات؛ وبدون ذلك، سيتطلب التحليل إجراء عدة اختبارات مستقلة بحجم من BALF أكبر بكثير مما يمكن الحصول عليه من عينة تنظير قصبي طبيعية. ويتوافق الإجراء الأول جيدًا مع أعمال سابقة أظهرت أن قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان يتمتع بنفس موثوقية الفحص المجهري اليدوي في تحديد أنواع الخلايا في عينات BALF15، بينما تعكس معايير القبول للإجراء الأخير أفضل الممارسات من برنامج معتمد لتقييم الكفاءة في المقايسات القائمة على الخرزات المتعددة والمتعددة المراكز16. وبوجه خاص، تكشف الخريطة الحرارية المدمجة، ومخطط الشبكة، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA) التي تم بناؤها باستخدام مدخلات معيارية متطابقة، عن علاقات بين أنواع الخلايا والعوامل المرتبطة بها والتي كان من الممكن استنتاجها سابقًا فقط عن طريق تجميع المخططات الشريطية المستقلة. وهذا الأمر مهم لأن الكيموكينات المشتقة من BALF وهي CXCL8 وCCL2 وCCL3 تعمل معًا لتجنيد الخلايا المتعادلة والوحيدات من سرير دوراني مشترك، ويحمل هيكلها المشترك معلومات لا يمكن استخلاصها من قراءات تحليلية فردية مستقلة9,10. وبما أن BALF يتم الحصول عليه بالفعل بشكل روتيني لأغراض سريرية ولا يتطلب حجمًا إضافيًا، فيمكن وضع سير العمل هذا كإضافة ترجمية لخدمات التنظير القصبي الحالية بدلاً من اعتباره إجراءً تشخيصيًا قائمًا بذاته.
يبلغ الوقت الفعلي لإنجاز سير العمل الكامل، والذي يشمل نقل العينات، والصبغ، واكتساب بيانات قياس التدفق الخلوي، وحضانة المقايسة المتعددة والقراءة، ومسار المعالجة الحاسوبية اللاحقة، حوالي 24 h في ظروف المختبرات البحثية. وبناءً على ذلك، يتم وضع سير العمل هذا كأداة للتنميط الظاهري العميق للتوصيف الميكانيكي ومراقبة الاستجابة للعلاج، وليس كمقايسة فرز سريرية عاجلة لاتخاذ قرارات حرجة زمنياً، مثل التمييز الفوري بين الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة العقيم، والتي تظل فيها المقايسات الميكروبيولوجية ومقايسات المؤشرات الحيوية أحادية الواسم الأسرع هي المعيار المتبع في الرعاية الصحية.
هناك عدة قيود يجب ذكرها. يتم جمع سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) من الحيز الهوائي وهو يمثل التفاعلات السطحية المباشرة للحيز الهوائي، ومع ذلك فهو لا يحتوي على الخلايا الموجودة داخل جدار الأسناخ والحواجز، حيث تتركز العديد من البلاعم المنشطة والخلايا اللمفاوية المقيمة في الأنسجة. وبناءً على ذلك، لا توجد نسبة تطابق تام بين الحالات المناعية للحيز الهوائي والبرانشيمة، وهو ما يتفق مع البيانات المنشورة سابقاً25. يعاني الكشف المعتمد على الخرزات المتعددة من التفاعل المتبادل للأجسام المضادة، بالإضافة إلى تأثيرات المصفوفة، والتي تكون منتشرة بشكل خاص في البيئة التي تحتوي على الميوسين والمؤثرات السطحية في سائل BALF مقارنة بمصل الدم؛ بالإضافة إلى ذلك، فإن عملية تخفيف سائل البطانة الظهارية بالمحلول الملحي لا يمكن التغلب عليها بواسطة أي من العلامات الداخلية، مثل اليوريا، بما يتفق مع الانتقادات المنشورة مؤخراً26. كان حجم الغسيل المسترد أقل بمتوسط 6 mL في مجموعة الإصابة مقارنة بالمجموعات الضابطة، لذا فإن التركيزات المطلقة المذكورة هنا تخضع لاختلاف طفيف في عامل التخفيف بين المجموعات، ولم يتم تطبيق أي علامة تخفيف داخلية. قد يؤدي التعرض المسبق للمضادات الحيوية في 41 من أصل 64 مشاركاً في مجموعة الإصابة (64.1%) إلى إضعاف تركيزات السيتوكينات في الممرات الهوائية واستعادة المسببات المرضية. والأهم من ذلك، أن البروتوكول يمثل فقط لقطة زمنية في نقطة واحدة أثناء تنظير القصبات المشار إليه سريرياً، مما يمنع تحليل حركية تجنيد العدلات، وأقصى إفراز للكيموكينات، وتحللها لدى المرضى بشكل فردي. تم اشتقاق قيم AUC للمحلل الواحد من نفس المجموعة المستخدمة لتحديد المؤشرات الحيوية، في ظل غياب مجموعة تحقق مستقلة، ويجب تفسيرها على أنها مقاييس للتمييز داخل المجموعة بدلاً من كونها أداءً تشخيصياً تم التحقق منه خارجياً؛ إن اعتماد أي نقطة قطع لمؤشر واحد في الممارسة السريرية يتطلب تحققاً استشرافياً في مجموعة مستقلة متعددة المراكز. لم تؤدِّ تحليلات الحساسية المحددة مسبقاً، والمقتصرة على العينات ذات الاسترداد الأعلى، والمشاركين الذين لم يتناولوا مضادات حيوية، والمصنفة حسب حالة التهوية الميكانيكية وحسب النوع الفرعي للالتهاب الرئوي (المكتسب من المجتمع، أو المكتسب من المستشفى، أو المرتبط بجهاز التنفس الصناعي)، إلى تغيير اتجاه المقارنات بين المجموعات.
في المستقبل، يمكن معالجة هذه القيود من خلال إضافة تسلسل RNA للخلية الواحدة أو تقنية CITE-seq إلى نفس رواسب سائل غسل القصبات والأسناخ (BALF) المستخدمة في تقدير كمية البروتين والخلايا، وهي تقنيات تم تطبيقها بنجاح في مجموعات كبيرة من مرضى الالتهاب الرئوي البكتيري والالتهاب الرئوي الناتج عن Mycoplasma pneumoniae لدى الأطفال، وذلك للكشف عن الخلايا المتعادلة السنخية والمجموعات الفرعية من البالعات التي لا يمكن تمييزها عن طريق قياس التدفق الخلوي التقليدي27,28. ومن شأن إضافة المعلومات التي يتم الحصول عليها عبر تحليلات الحيز الهوائي إلى تلك التي يوفرها قياس التدفق الكتلي التصويري أو علم النسخ المكاني للخزعات المتطابقة أو حتى مواد التشريح أن تضع هذه المعلومات في سياقها الصحيح29. كما أن ربط أخذ عينات BALF الطولية بتقييم مضادات CXCR1/CXCR2 وحصر مستقبلات IL-6، واللذين أظهرا فائدة في البقاء على قيد الحياة أو دعم الأعضاء في حالات الالتهاب الرئوي الشديد ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، من شأنه أن يسمح باختبار محور "الخلايا المتعادلة-الكيموكين" الذي أبرزه سير العمل هذا كأداة مساعدة في اتخاذ القرارات العلاجية30,31.
في الختام، تصف هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصور يتكون من إجراءات معيارية لجمع وتحضير سائل غسل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF)، ولوحة قياس تدفق خلوي تضم سبعة مؤشرات لتقدير تكوين الخلايا المتعادلة والخلايا الوحيدة، ومقايسة سيتوكينات متعددة تقيس 13 سيتوكينًا، ومنصة تصور مشتركة تشمل تحليلات UMAP، والتجميع الهرمي، وشبكة الارتباط، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA). ومن خلال تطبيق سير العمل هذا على مجموعة استباقية مكونة من 112 بالغًا يخضعون لتنظير القصبات لأسباب سريرية، حدد التحليل انتقالاً لافتاً في تكوين الخلايا المناعية السنخية من الخلايا البلعمية إلى الخلايا المتعادلة لدى المرضى المصابين بالعدوى، ورصد نمط استجابة سيتوكينية مكونًا من ثلاث وحدات، وكشف عن محور وثيق الترابط بين الخلايا المتعادلة والكيموكينات لا يمكن ملاحظته باستخدام قياسات المؤشرات الفردية. يعتمد هذا الإجراء حصريًا على المواد التي يتم جمعها أثناء التشخيص السريري، ولا يتطلب حجم عينة إضافيًا، وقد يكون قابلاً للتنفيذ في مختبرات الرعاية الثالثية المجهزة لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات وتحليل المصفوفات الخرزية المتعددة. وسيتطلب الاعتماد الأوسع وأي استخدام للمحللات الفردية كمؤشرات حيوية تشخيصية تحققًا استباقيًا في مجموعات مستقلة متعددة المراكز. وبذلك تقدم الدراسة منهجية قابلة للتكرار وغنية بالبيانات لتوصيف التهاب الممرات الهوائية في حالات العدوى التنفسية، وتوفر أساسًا لتطويرها مستقبلاً في دراسات طولية، وتحليلات خلوية مفردة ومكانية، وتقييم علاجي للتعديل المناعي الذي يستهدف محور الخلايا المتعادلة والكيموكينات.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نتوجه بخالص الشكر لجميع المرضى والمتطوعين الذين شاركوا في هذه الدراسة على تعاونهم القيم. كما نعرب عن امتناننا للجنة الأخلاقيات للحصول على الموافقة الأخلاقية (موافقة رقم 2026HL-038) وللتوجيهات المعيارية المقدمة خلال عملية البحث بأكملها.
نتقدم بالشكر إلى الطاقم الطبي في قسم الجهاز التنفسي ومركز منظار الشعب الهوائية والمختبر السريري لدعمهم في جمع العينات السريرية، ومعالجة سائل غسيل القصبات والأسناخ، والكشف الميكروبيولوجي. كما نقدر دعم المنصة التقنية من المختبر المركزي بالمستشفى لتجارب قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد وتوصيف السيتوكينات المتعددة.
لم يتلقَّ هذا البحث أي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة أو التجارية أو غير الربحية.
نشكر جميع الباحثين والفنيين وطاقم التمريض المشاركين في هذا المشروع على جهودهم في فحص المرضى، وإدارة العينات، والتشغيل التجريبي، وتنظيم البيانات.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأجسام المضادة لـ CD11b البشري، Brilliant Violet 421، مستنسخ ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | علامة تنشيط الخلايا المتعادلة؛ قناة الليزر البنفسجية URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD14 البشري، APC/Cyanine7، مستنسخ M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | علامة استبعاد الخلايا الوحيدة والبلعمية؛ قناة الليزر الحمراء URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD15 البشري، PE، مستنسخ HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | علامة سلالة الخلايا المتعادلة؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD16 البشري، Brilliant Violet 510، مستنسخ 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | علامة نضج الخلايا المتعادلة وعلامة الخلايا القاتلة الطبيعية؛ قناة الليزر البنفسجية URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD45 البشري، PerCP، مستنسخ HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | علامة شاملة لكريات الدم البيضاء؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| الأجسام المضادة لـ CD66b البشري، FITC، مستنسخ G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | علامة الخلايا المحببة؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ HLA-DR البشري، PerCP/Cyanine5.5، مستنسخ L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | علامة الخلايا المقدمة للمستضد؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://www.biolegend.com |
| محلل دم آلي (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | جهاز (طراز XN-1000) | يستخدم لتحديد إجمالي عدد الخلايا ذات النواة لحساب العدد المطلق للخلايا المتعادلة URL: https://www.sysmex.com |
| ألبومين المصل البقري | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | يستخدم في محلول صبغ التدفق الخلوي (0.5% w/v في PBS مع 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| حزمة ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.20 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لخرائط الحرارة ذات التجميع الهرمي لبيانات السيتوكينات المتعددة URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| جهاز طرد مركزي للخلايا (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | يستخدم لتحضير شرائح الخلايا من معلق خلايا سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| محلول تحلل كريات الدم الحمراء (BD FACS Lysing Solution، تركيز 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | يستخدم لتحلل كريات الدم الحمراء بعد الصبغ السطحي URL: https://www.bdbiosciences.com |
| حمض إيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA)، 0.5 M pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | يستخدم في محلول صبغ التدفق الخلوي بتركيز 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| صبغة حيوية قابلة للتثبيت (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | استبعاد الخلايا الحية والميتة قبل تحديد البوابة؛ قناة الليزر الحمراء URL: https://www.biolegend.com |
| منظار قصبات مرن بالفيديو | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | جهاز (طراز BF-1TQ290) | يستخدم لغسيل القصبات والأسناخ (BAL) تحت تخدير متوسط URL: https://www.olympus-global.com |
| مقياس التدفق الخلوي، متعدد الألوان (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | جهاز (طراز CytoFLEX LX، تكوين سداسي الليزر) | يستخدم للحصول على لوحة تدفق الخلايا المتعادلة/الوحيدة ذات العلامات السبعة URL: https://www.beckman.com |
| برنامج تحليل التدفق الخلوي (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | يستخدم للتعويض وتحديد البوابات اليدوية لملفات FCS URL: https://www.flowjo.com |
| حزمة FlowSOM (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.12 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لتجميع الخرائط ذاتية التنظيم والتجميع الميتا لبيانات التدفق الخلوي URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (برنامج رسم بياني إحصائي) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | يستخدم لإنشاء الأشكال النهائية URL: https://www.graphpad.com |
| كاشف حجب مستقبل Fc البشري (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | حجب مستقبل Fc قبل الصبغ بالأجسام المضادة URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| حزمة igraph (R) | CRAN | v2.0 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لبناء وتصور رسم شبكة الارتباط URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| أنابيب مبردة منخفضة الارتباط بالبروتين، 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | تستخدم لعليقات الطافي من سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) لتحليل السيتوكينات URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| منصة المقايسة المناعية القائمة على الخرزات المتعددة Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | جهاز (طراز MAGPIX) | تستخدم للحصول على مقايسة السيتوكينات المتعددة URL: https://www.luminexcorp.com |
| محلول صبغ May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | يستخدم لعد الخلايا التفريقي بواسطة جهاز Cytospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| حزمة mice (R) | CRAN | v3.16 (مفتوحة المصدر) | تستخدم للاسناد المتعدد عن طريق المعادلات المتسلسلة في تحليل الحساسية URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| لوحة السيتوكينات/الكيموكينات ذات الخرزات المغناطيسية المتعددة (13-plex، مخصصة؛ MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | لوحة مخصصة تقيس الـ 13 من المواد التحليلية الموضحة في القسم 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| مرشح خلايا من شبكة النايلون، 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | يستخدم للترشيح الميكانيكي لسائل BALF لإزالة تكتلات المخاط URL: https://www.corning.com |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | المحلول المنظم الأساسي لإعادة تعليق الخلايا وصبغها URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| حزمة pROC (R) | CRAN | v1.18 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لإنشاء منحنيات ROC وقيم AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (بيئة الحوسبة الإحصائية) | R Core Team | v4.4 (مفتوحة المصدر) | منصة للتحليلات الإحصائية والتصور URL: https://www.r-project.org |
| حزمة rstatix (R) | CRAN | v0.7 (مفتوحة المصدر) | تستخدم للمقارنات بين المجموعات وإحصائيات الارتباط URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| حزمة Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لتمثيلات t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| خرزات تعويض مصبوغة بلون واحد (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | تستخدم لضوابط تعويض اللون الواحد URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| محلول كلوريد الصوديوم للحقن، 0.9% (محلول ملحي معقم) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | يستخدم لغسيل القصبات والأسناخ (BAL) (100–150 mL، عليقات 20–40 mL عند 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| حزمة uwot (R) | CRAN | v0.2 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لتقليل الأبعاد بواسطة UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (برنامج الحصول على المقايسات المتعددة وملاءمة المنحنيات) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | برنامج خاص بالجهاز لملاءمة المنحنى القياسي 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
المراجع
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.