تقدم هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصور يجمع بين جمع ومعالجة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية وفق معايير موحدة، ولوحة قياس التدفق الخلوي المكونة من سبعة مؤشرات، ومقايسة سيتوكينات متعددة تحليلية تشمل 13 مادة تحليلية، ومسار تحليل موحد.
مقالة بحثية
التصور المتكامل لتجنيد العدلات وتوصيف السيتوكينات الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُعد سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) مصفوفة أخذ العينات الأكثر وصولاً بشكل مباشر لدراسة التهاب المسالك الهوائية السفلية، ومع ذلك، تعتمد التحليلات التقليدية على قياس التدفق الخلوي بعلامة واحدة مقترناً بمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لكل مادة تحليل على حدة، وهو نهج يحد من كثافة المعلومات ويحجب الاقتران بين الخلايا والعوامل. تقدم هذه الدراسة سير عمل للتصور المتكامل يربط بين عمليات الجمع والمعالجة المسبقة الموحدة مع لوحة قياس التدفق الخلوي لسبع علامات للخلايا المتعادلة والخلايا الوحيدة، ومقايسة السيتوكين المتعددة لـ 13 مادة تحليل، ومسار تحليل موحد يعتمد على التقريب والإسقاط متعدد الطيات الموحد (UMAP)، والتجميع الميتافيزيقي FlowSOM، والتجميع الهرمي، وشبكات ارتباط سبيرمان، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA).
تم تطبيق سير العمل على مجموعة أترابية مستقبلية في مركز واحد شملت 112 بالغاً خضعوا لمنظار القصبات، ضمت 64 مريضاً مصاباً بعدوى رئوية مؤكدة ميكروبيولوجياً و48 من ضوابط غير المصابين بالعدوى. وكشفت قراءات الخلوية وقياس التدفق الخلوي عن تحول واضح في الملف السنخي من هيمنة الخلايا البلعمية إلى هيمنة الخلايا المتعادلة أثناء العدوى، حيث ارتفعت نسبة الخلايا المتعادلة من وسيط قدره 3.2% إلى 68.4%، وزاد التركيز المطلق للخلايا المتعادلة بنحو 50 ضعفاً. كما حدد التوصيف المتعدد استجابة سيتوكينية منسقة مكونة من ثلاث وحدات، حيث شهدت وحدات الكيموكين، والمحفزات للالتهاب، والتنظيمية جميعاً زيادة في التنظيم، وأظهر كل من CXCL8/IL-8 وIL-1β وIL-6 وCXCL1/GRO-α وG-CSF أقوى تمييز للمؤشرات الفردية ضمن مجموعة الدراسة (المساحة تحت المنحنى [AUC] من 0.89 إلى 0.94). وكشف التصور التكاملي باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، ومصفوفة الارتباط، والرسم البياني للشبكة عن محور مترابط بإحكام بين الخلايا المتعادلة والكيموكينات على مستوى المشاركين، حيث برز تعداد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) كمركز محوري للشبكة.
يعتمد سير العمل هذا فقط على المواد التي يتم الحصول عليها بشكل روتيني من غسيل القصبات والأسناخ (BAL) المشار إليه سريرياً، ولا يتطلب أي حجم إضافي من العينة، ويوفر إطاراً غنياً بالمعلومات لتحليل التهاب الممرات الهوائية في حالات العدوى التنفسية، وهو ما قد يكون قابلاً للتطبيق في مختبرات الرعاية الثالثية المجهزة بمنصات قياس التدفق الخلوي متعدد المعايير ومنصات المصفوفات الخرزية المتعددة، ويمتد ليشمل الدراسات الطولية، ودراسات الخلية الواحدة، ودراسات تقييم العلاج. وسيتطلب الاعتماد السريري الأوسع للمواد التحليلية الفردية كعلامات حيوية إجراء تحقق استشرافي في مجموعات مستقلة متعددة المراكز.
المقدمة
ما تزال الوفيات المعدية الناجمة عن عدوى الجهاز التنفسي السفلي سببًا رئيسيًا للوفيات العالمية، على الرغم من التقدم الذي تم إحرازه في استراتيجيات اللقاحات وطرق العلاج؛ ومع ذلك، يظل هذا الأمر صحيحًا بشكل خاص بين الأطفال وكبار السن1. وتعد الخلايا المتعادلة (Neutrophils) هي الخلايا الأساسية التي تم الإبلاغ عنها في المراحل المبكرة من الاستجابة المناعية الفطرية في الجهاز التنفسي المصاب، وهي عملية حيوية للقضاء على الممرض الغازي؛ ومع ذلك، فإن الالتهاب المتعادل غير المنضبط يؤدي إلى انهيار الحاجز الشعيري السنخي، وتلف الأنسجة التأكسدي، وتطور متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)2,3. كما تظهر الخلايا المتعادلة في الحيز الهوائي للرئة حركية تجنيد، وأنماط استبقاء، وسلوكًا تأثيريًا يختلف عن الأنسجة الأخرى، وتؤثر هذه الاختلافات على ما إذا كانت العدوى ستزول أو ستتطور إلى التهاب رئوي حاد4.
يُعد سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) مصدراً هاماً للمعلومات حول البيئة المجهرية للأسناخ الرئوية، ويقدم التمثيل الأقرب للمناعة السريرية في هذا الموقع5. ويلعب الكيموكين CXCL8 دوراً أساسياً في جذب الخلايا المتعادلة إلى الرئتين عبر مستقبلاته CXCR1 وCXCR2، وذلك جنباً إلى جنب مع كيموكينات أخرى، بما في ذلك CXCL1 وCXCL2 وCXCL56. وتعمل السيتوكينات IL-1β وIL-6 وTNF-α على تعزيز هذه العملية بشكل أكبر، بينما يعمل IL-10 كسيتوكين مضاد. وقد تبين أن مستوياتها في سائل BALF ترتبط بشدة عدوى الرئتين وتطور المضاعفات الرئوية الناتجة عن الالتهابات الرئوية البكتيرية والفيروسية وغير النمطية7، ويتم حالياً اعتماد ملفات المؤشرات الحيوية المتعددة لسائل BALF من أجل التشخيص المبكر والتمييز بين المسببات المرضية في عدوى الجهاز التنفسي السفلي8.
عادة ما تفشل اختبارات سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) الروتينية في الإحاطة الكاملة بالبيولوجيا الكامنة وراء الاختبار. يمكن تقدير تعداد الخلايا عن طريق التمييز اليدوي للخلايا في عينات التدوير المركزي (cytospin)، بينما تُقاس الوسائط القابلة للذوبان باستخدام مقاييس الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) الفردية وتُعرض في شكل مخطط أعمدة. يتم تقييم الكيموكينات والسيتوكينات وكل نوع من الخلايا بشكل منفصل، دون إنشاء ارتباط بين تدرج تركيز كيموكين معين والمجتمعات الخلوية التي يؤثر عليها في العينة. وغالبًا ما يتم إغفال الجمع بين وحدات السيتوكينات، وعلاقات الاستجابة للجرعة بين الكيموكينات والعدلات، والمجموعات الفرعية من المرضى التي تملك سمات التهابية خاصة بها في غياب التحليل متعدد المتغيرات9.
تجعل التطورات في مجال الحوسبة مثل هذا النهج الشمولي واقعياً بشكل تدريجي. إن الجمع بين قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (multiparameter flow cytometry) وقياس التدفق الخلوي الطيفي (spectral flow cytometry) مع منهجيات تقليل الأبعاد، مثل التضمين العشوائي للجيران الموزع t (t-SNE) أو التقريب والاسقاط المتعدد المتجانس (UMAP)، يسمح برسم خرائط للأنماط الظاهرية المناعية عالية الأبعاد في فضاء ثنائي الأبعاد، حيث أثبت UMAP قدرة أفضل على الاحتفاظ بالطوبولوجيا العامة وقابلية التكرار عند تطبيقه على بيانات قياس التدفق الخلوي10. وتساعد لوحات تحليل السيتوكينات متعددة العناصر، متبوعة بالتجميع الهرمي وشبكات الارتباط، في تحديد البصمات المرتبطة بشدة المرض والتي لا يمكن تمييزها باستخدام منهجيات السيتوكين الواحد11. ورغم التقدم في هذا المجال، لا يوجد حتى الآن سير عمل يجمع هذه الطرق معاً لدراسة تجنيد الخلايا المتعادلة وبصمات السيتوكينات من عينات سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) نفسها في حالات العدوى التنفسية. تصف هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصور المرئي للبحث في تجنيد الخلايا المتعادلة باستخدام علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات، يليه تحليل UMAP وتحليل بصمات السيتوكينات عبر المقايسة المناعية المتعددة، مع التجميع الهرمي ومصفوفات الارتباط وتحليل المكونات الرئيسية. وينتج عن سير العمل هذا تصور مرئي متكامل يشمل القراءات المناعية الخلوية والذائبة للمجاري التنفسية في رسم بياني واحد، وذلك باستخدام عينات BALF التي يتم الحصول عليها روتينياً أثناء تنظير القصبات المشار إليه سريرياً في حالات عدوى الجهاز التنفسي السفلي.
البروتوكول
مجتمع الدراسة والأخلاقيات
كانت هذه دراسة رصدية استباقية أحادية المركز أُجريت في مستشفى تعليمي تخصصي في الفترة ما بين يناير 2026 وأبريل 2026. تمت الموافقة على البروتوكول تحت رقم الموافقة 2026HL-038، كما تم الحصول على موافقة مستنيرة مكتوبة من كل مشارك قبل البدء في أي إجراء من إجراءات الدراسة.
تم استقطاب بالغين تتراوح أعمارهم بين 18 و75 عاماً ممن خضعوا لعملية تنظير قصبي مرن تشخيصي مع غسل القصبات والأسناخ (BAL) كجزء من الرعاية السريرية الروتينية، وتم توزيعهم بالتتابع على مجموعة مصابة بالعدوى أو مجموعة ضابطة غير مصابة بناءً على تشخيصاتهم السريرية والميكروبيولوجية النهائية. يوضح الشكل 1 نظرة عامة على سير عمل التصوير المتكامل، بدءاً من استقطاب المرضى وصولاً إلى المخرجات المرئية المتكاملة.
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل التصوير المرئي المتكامل لتحليل تجنيد الخلايا المتعادلة واستجابات السيتوكينات الالتهابية بناءً على سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF). تلخص المراحل الخمس، من اليسار إلى اليمين، التجنيد الاستباقي لمجموعات العدوى والمجموعات الضابطة باستخدام تنظير القصبات وغسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BAL)، والمعالجة المسبقة لسائل BALF للحصول على كتلة خلوية وجزء طافٍ، والقياسات الخلوية المتوازية (علم الخلايا بصبغة Wright–Giemsa وقياس التدفق الخلوي متعدد المعايير) والقياسات الذائبة (المقايسة المناعية المعتمدة على الخرزات بـ 13 هدفاً)، ومسار التصوير المرئي الموحد (UMAP مع التجميع الميتافيزيقي FlowSOM، والخريطة الحرارية الهرمية، وتحليل المكونات الرئيسية، وشبكة ارتباط سبيرمان)، والمخرجات المرئية المتكاملة. الاختصارات: BAL = غسيل القصبات والأسناخ الرئوية؛ BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية؛ UMAP = تقريب وإسقاط المجموعات المنتظمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
كانت معايير الشمول لمجموعة الإصابة كما يلي: (1) المرضى الذين تم تشخيصهم إما بالالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع (CAP)، أو الالتهاب الرئوي المكتسب من المستشفى (HAP)، أو الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي (VAP) وفقاً لإرشادات جمعية الأمراض المعدية في أمريكا (IDSA) والجمعية الأمريكية للصدر (ATS)؛ (2) الكشف عن مسبب مرض واحد أو أكثر من خلال زراعة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) بنسبة ≥104 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)/mL، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعدد للجهاز التنفسي، أو تسلسل الجيل القادم الميتاجينومي لسائل BALF، أو اختبارات مستضد/جسم مضاد محددة من عينات تنفسية/مصلية مقترنة.
كانت معايير المجموعة الضابطة كما يلي: (1) أسباب غير معدية لإجراء تنظير القصبات، وتتمثل في تقييم عقدة رئوية غير محددة، أو نتائج إشعاعية غير طبيعية لا تشير إلى وجود عدوى، أو الفحص من أجل السعال المزمن؛ (2) عدم وجود عدوى رئوية حادة، وهو ما أثبتته النتائج السلبية للفحوصات الميكروبيولوجية وغياب أي علامات للالتهاب أو العدوى الجهازية في وقت إجراء تنظير القصبات؛ و(3) عدم استخدام المضادات الحيوية خلال 30 يومًا قبل المشاركة. تم استقطاب أفراد المجموعة الضابطة من المرضى الذين خضعوا لتنظير القصبات لأسباب رئوية أخرى تستدعي التدخل سريريًا، بدلاً من الاعتماد على متطوعين أصحاء، وذلك ليعكس المجتمع الذي يتم منه الحصول بشكل روتيني على غسول القصبات والأسناخ (BAL) بدواعي سريرية في مركز الدراسة.
شملت معايير الاستبعاد ما يلي: (1) الإصابة بأورام خبيثة و/أو تلقي علاج كيميائي سام للخلايا خلال الأشهر الستة السابقة؛ (2) إيجابية المصل لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV)؛ (3) زراعة أعضاء صلبة أو زراعة خلايا جذعية مكونة للدم؛ (4) العلاج المثبط للمناعة المستمر الذي يتضمن جرعة يومية مكافئة من البريدنيزون. > ٠.٣ مجم/كجم لأكثر من ٣ أسابيع؛ (٥) الإناث الحوامل أو المرضعات؛ (٦) وجود تاريخ من خلل التخثر النزفي أو أي موانع لإجراء تنظير القصبات المرن؛ (٧) وجود مرض تنفسي مزمن شديد مسبق (الداء الرئوي الانسدادي المزمن [COPD] وفقاً للمرحلة الثالثة أو الرابعة من تصنيف المبادرة العالمية للأمراض الرئوية الانسدادية المزمنة [GOLD]، أو التليف الرئوي مجهول السبب، أو الربو المستمر الشديد، أو توسع القصبات ذو الدلالة السريرية)؛ (٨) السل النشط؛ (٩) المشاركة في دراسة تداخلية أخرى خلال الـ ٣٠ يوماً الماضية. تم إجراء غسيل قصبي زعجالي (BAL) خلال عملية تنظير القصبات الأولى، وفي غضون ٧٢ ساعة من الدخول للمستشفى في حالات العدوى، وفي غضون ٤٨ ساعة من عملية التنبيب لدى المرضى الذين يعانون من عدوى ويخضعون للتنفس الاصطناعي.
رُكزت حسابات حجم العينة على النتيجة الخلوية الأولية: عدد الخلايا المتعادلة (neutrophils) في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) بين المجموعات. وبالنظر إلى حجم التأثير المتوقع البالغ 0.6 SD بين المسالك الهوائية المصابة وغير المصابة، ومع مراعاة نسبة تسرب تبلغ 15%، كان الحد الأدنى لحجم العينة المطلوب 45 شخصاً لكل مجموعة لتحقيق قيمة α = 0.05 ل testi-sided بقوة إحصائية تبلغ 80%. ومن بين 156 مرشحاً مؤهلاً، لم يستوفِ 27 منهم متطلبات الأهلية (18 فشلوا في استيفاء معايير الاشتمال، ويرجع ذلك أساساً إلى عدم القدرة على تحديد العامل الممرض المسؤول عن مرضهم خلال الفترة المحددة أو عدم الموافقة على الإجراء نفسه؛ و9 انتهكوا معايير الاستبعاد بشكل أساسي بسبب وجود ورم خبيث نشط أو تاريخ من تناول العلاج الكيميائي، أو الاستخدام المزمن للكورتيكوستيرويدات، أو وجود مرض رئوي مزمن شديد مسبقاً، أو وجود نزعة نزفية). خضع المشاركون الـ 129 المتبقون لعملية تنظير القصبات. لاحقاً، تم استبعاد 17 شخصاً من الدراسة (7 بسبب عدم كفاية إنتاجية BALF بنسبة < 40%؛ و4 بسبب سحب الموافقة أثناء التنويم في المستشفى؛ و6 بسبب إعادة تصنيف الأشخاص بعد التقييم الميكروبيولوجي النهائي – 4 من مرشحي مجموعة الضبط شُخصوا بإصابة خفية بناءً على نتائج المزرعة؛ و2 من مرشحي مجموعة الإصابة افتقروا إلى دليل على الإصابة بعد تحليل المزرعة). تكونت المجموعة النهائية من خاضعي الدراسة من 112 مشاركاً: 64 مصاباً و48 غير مصاب.
جمع ومعالجة سائل غسيل القصبات الرغامية (BALF)
أجرى مشغلون مهرة عملية تنظير القصبات باستخدام البروتوكول المؤسسي المعتمد، بما يتوافق مع التوصيات الفنية المنشورة لغسيل القصبات والأسناخ الرئوية12. استُخدم الليدوكائين موضعيًا، وتلقى المرضى تهدئة وريدية متوسطة مع توفير أكسجين تكميلي للحفاظ على تشبع الأكسجين (SpO₂) >92%. تم إدخال منظار القصبات المرن ووضعه في القطعة القصبي الرئوية التي تظهر بها تشوهات إشعاعية. وفي الحالات التي كانت فيها التشوهات الإشعاعية منتشرة أو غير محددة الموقع، تم اختيار الفص الأوسط الأيمن أو القطع اللسانية اليسرى. وبعد كل عملية غسيل، تم إجراء شفط يدوي لطيف بضغط سلبي < 100 mmHg. تم إعطاء ما مجموعه من ثلاث إلى خمس جرعات من المحلول الملحي المعقم عند درجة حرارة 37 °C، وبكمية 20–40 mL لكل جرعة، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100–150 mL. وقُدرت نسبة الاسترداد على أنها الحجم المسترد بالنسبة إلى الحجم المغسول، واعتُمدت فقط العينات التي بلغت نسبة الاسترداد فيها ≥40% للتحليل.
تم تجميع العينات التي تم جمعها من الغسلات الثانية واللاحقة لتقليل التلوث الشعبي والحصول على عينة غنية بالحويصلات الهوائية. حُفظ مجمع سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) على الجليد وعولج خلال ساعتين من الجمع، مع مراعاة النتائج الأخيرة المتعلقة بالتغيرات في التركيب الخلوي والعد التفريقي بعد التخزين المطول وتسخين عينات BALF البشرية13. وبعد الترشيح باستخدام شبكة نايلون معقمة بفتحات بحجم 70 ميكرون لتصفية المخاط، والتي تمت عن طريق التمرير الميكانيكي وحده دون إضافة عامل مذيب للمخاط أو مضاد للتكتل مثل dithiothreitol، حيث أظهرت الاختبارات الأولية أن ذلك كان كافياً لإزالة تكتلات المخاط دون فقدان ملموس في سلامة الحاتمات السطحية اللاحقة، خضع السائل للطرد المركزي عند 400 × g لمدة 10 دقائق عند 4 °C. تم سكب السائل العلوي وتوزيعه في أنابيب تجميد منخفضة الارتباط بالبروتين لتحليل السيتوكينات، وعُلقت الخلايا في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) مع 0.5% bovine serum albumin و 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)، مع الاحتفاظ بجزء منها من أجل علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي. جُمدت عينات السيتوكينات في النيتروجين السائل، وحُفظت عند –80 °C، ولم تخضع لأكثر من دورة تجميد وإذابة واحدة قبل الاستخدام.
علم الخلايا للخلايا المتعادلة والتقدير الكمي بواسطة قياس التدفق الخلوي
فيما يتعلق بدراسة الخلايا المرضية، تم وضع 100 µL من معلق خلايا سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) على شريحة زجاجية باستخدام جهاز طرد مركزي للخلايا (انظر جدول المواد) عند 300 × g لمدة 5 min، ثم جُففت في الهواء وصُبغت بصبغة Wright-Giemsa. وقد أجرى تقني مختبرات دم عمليات العد التفريقي دون معرفة بالتاريخ الطبي للمريض، حيث قام بعدد أدنى قدره 400 خلية لكل شريحة وحساب النسب المئوية لكل من البلاعم، والخلايا اللمفاوية، والخلايا المتعادلة، والخلايا الحمضية. واعتُبرت النسب المئوية للخلايا المتعادلة في سائل BALF مقياس النتيجة الأساسي للدراسة الخلوية المرضية، نظراً للأدلة الحالية التي تشير إلى فائدتها في التمييز بين أمراض الرئة المعدية وغير المعدية لدى المرضى الذين يعانون من ارتشاحات رئوية14.
اعتمد بروتوكول القياس الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي على عملية تحقق حديثة من بروتوكول تمايز الكريات البيضاء في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) رباعي الألوان15، وتضمن واسمات إضافية لتحديد الخلايا المتعادلة. وتحديداً، تم حجب حوالي 5 × 105 خلية معزولة من سائل BALF باستخدام كاشف حجب مستقبلات Fc البشرية (انظر جدول المواد) لمدة 10 min عند 4 °C، ثم صبغها لمدة 20 min عند 4 °C باستخدام أجسام مضادة ضد CD45 (النسيلة HI30)، وCD66b (النسيلة G10F5)، وCD15 (النسيلة HI98)، وCD16 (النسيلة 3G8)، وCD11b (النسيلة ICRF44)، وCD14 (النسيلة M5E2)، وHLA-DR (النسيلة L243)، بالإضافة إلى صبغة حيوية قابلة للتثبيت (انظر جدول المواد). ولتحلل الكريات الحمراء، استُخدم محلول تجاري لتحلل الكريات الحمراء (انظر جدول المواد) لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة. وبعد تحلل الكريات الحمراء، غُسلت الخلايا مرتين باستخدام PBS مضاف إليه 2% مصل عجل جنيني وأعيد تعليقها في محلول تدفق، ثم حُللت باستخدام مقياس تدفق خلوي متعدد الألوان (انظر جدول المواد). أُجري التعويض باستخدام حبيبات تعويض مصبوغة بلون واحد (انظر جدول المواد)، كما أُدرجت أنابيب خالية من الصبغة وأنابيب ناقصة اللون الواحد لكل لوحة.
تم الحصول على 1 × 105 حدث CD45⁺ على الأقل لكل عينة. تم تحديد الخلايا المفردة (Singlets) أولاً في مخطط FSC-A/FSC-H، تلتها خلايا CD45⁺ الكريات البيضاء الحية (viability dye⁻)، ومن ثم تم استبعاد الخلايا الوحيدة والبلعمية CD14⁺HLA-DR⁺ لاختيار الخلايا الحبيبية CD66b⁺ ذات التشتت الجانبي العالي. بعد ذلك، عُرِفت الخلايا المتعادلة ضمن مجموعة الخلايا الحبيبية على أنها أحداث CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. وقد رُسِمت بوابة خلايا CD66b⁺ الحبيبية الأولية هذه بشكل واسع حول جميع أحداث التشتت الجانبي العالي بدلاً من تقييدها بحدود CD15⁺CD16⁺CD11b⁺، وذلك لضمان بقاء الخلايا المتعادلة المنشطة ذات CD16-dim وCD11b-high والأشكال الأخرى الأقل نضجاً من الخلايا الحبيبية ضمن إجمالي عدد الخلايا المتعادلة الآلي؛ بينما طُبِق تعريف CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ الأكثر صرامة فقط لتوصيف مجموعة الخلايا المتعادلة الناضجة التي تم تسجيلها بشكل منفصل في تحليلات التجميع اللاحقة. تم تقدير عدد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) (cells/µL) بناءً على النسبة المئوية للخلايا المتعادلة وإجمالي عدد الخلايا ذات النواة الذي تم تحديده باستخدام محلل دم آلي (انظر جدول المواد). وتم أرشفة مصفوفات التعويض، واستراتيجية تحديد البوابات، وتقارير مراقبة الجودة لكل عينة، وظل المحللون غير مدركين لتوزيعات المجموعات المشاركة طوال عملية الحصول على البيانات وتحليلها.
تنميط السيتوكينات الالتهابية المتعددة
تم إذابة رواشح سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) مرة واحدة على ثلج رطب، ثم تلا ذلك رج سريع بجهاز الفورتكس وتصفية عن طريق الطرد المركزي بسرعة 10,000 × g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4 °C مباشرة قبل إجراء المقايسة. تم قياس 13 مادة تحليلية ضمن ثلاث فئات وظيفية باستخدام منصة مقايسة مناعية متعددة تعتمد على الخرز مع لوحة خرز مغناطيسية مخصصة (انظر جدول المواد). شملت المجموعة المحفزة للالتهاب IL-1β وIL-6 وIL-17A وTNF-α؛ وشملت مجموعة الكيموكينات CXCL8/IL-8 وCXCL1/GRO-α وCXCL10/IP-10 وCCL2/MCP-1 وCCL3/MIP-1α؛ بينما شملت المجموعة التنظيمية IL-10 وIFN-γ وIL-1RA وG-CSF. وقد استند اختيار المواد التحليلية إلى تلك التي يتم الإبلاغ عنها بشكل أكثر شيوعاً على أنها معلوماتية في التحليلات المتعددة لسيتوكينات BALF أو المصل في دراسات الالتهاب الرئوي/العدوى التنفسية الشديدة7,11. تم تحديد عامل التخفيف (1:2 في محلول المقايسة المنظم) من خلال تجربة استطلاعية أجريت على مجموعة فرعية ممثلة لكل من العينات المصابة وعينات الضبط لضمان أن >90% من القياسات تقع ضمن المنحنى القياسي.
وُجِدَت المنحنيات القياسية باستخدام تخفيفات تسلسلية من سبع نقاط للمعايرات المؤتلفة الخاصة بالشركة المصنعة، والتي حُضّرت في مكررات على كل لوحة، بما في ذلك بئر فارغ واحد لطرح الخلفية. وأُجري ملاءمة المنحنى عبر انحدار لوجستي خماسي المعالم (5PL) بواسطة برنامج الحصول على البيانات وتحليلها المملوك للجهاز (انظر جدول الموادتم حساب الحد الأدنى للتقدير الكمي (LLOQ) باعتباره أصغر كمية من المادة القياسية التي تعطي نسبة استعادة مجهزة (back-fit recovery) تتراوح بين 80% و120%، ومعامل تباين (CV) ضمن التشغيلة الواحدة ≤ 20%. وقد استُعيض عن القيم التي كانت أقل من الحد الأدنى للتقدير الكمي بـ LLOQ/√2. تم تقسيم عينتين من سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) المجمعة لغرض ضبط الجودة، إحداهما من مريض مصاب نموذجي والأخرى من شخص سليم، وتوزيعهما في شكل حصص وإضافتهما إلى كل لوحة لتتبع الأداء على المدى الطويل. وقد استندت معايير ضمان الجودة إلى توصيات أفضل الممارسات المستمدة من برنامج كفاءة المقايسة القائمة على الخرزات المتعددة في مواقع متعددة على مدار 12 عاماً.16بما في ذلك متطلبات ألا يتجاوز معامل الاختلاف (CV) داخل المقايسة نسبة 10% في الآبار المكررة، وألا يتجاوز معامل الاختلاف بين الصفائح نسبة 20% لمراقبة الجودة، مع حد أدنى لعدد الخرزات يبلغ 50 أو أكثر لكل مادة تحليلية في كل بئر. وقد أعيد تشغيل الصفائح التي لم تستوفِ المعايير المذكورة أعلاه. أُجري التحليل في دفعة واحدة خلال أربع أسابيع، باستخدام رقم تشغيلة واحد للمجموعة التحليلية، مع تداخل عشوائي لعينات العدوى والعينات الضابطة.
مسار تحليل التصور المرئي
تم تحليل ملفات معيار قياس التدفق الخلوي (FCS) أولاً باستخدام برنامج تجاري لقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) للتعويض وتحديد الخلايا الحية CD45⁺ أحاديات، ثم صُدرت لإجراء تحليل غير منحاز باستخدام برنامج R v4.4. وبالنسبة لكل عينة، تم تحديد 10,000 خلية CD45⁺ تـم تقليل عينة الأحداث ودمجها، وحُوِّلت شدة الإشارات باستخدام دالة arcsinh بمعامل مساعد قدره 150. وأُجري خفض الأبعاد وإسقاطات UMAP باستخدام حزمة uwot مع تحديد 15 جاراً أقرب ومسافة دنيا قدرها 0.1، إلى جانب تضمينات t-SNE متوازية باستخدام حزمة Rtsne مع قيمة حيرة (perplexity) تبلغ 30.10تم تحديد تجمعات الأنماط الظاهرية باستخدام FlowSOM مع 100 عقدة لخريطة التنظيم الذاتي، ثم قُسمت لاحقاً إلى 12-15 تجمعاً عبر التجميع الميتا-تحليلي (meta-clustering)، باستخدام نهج قائم على التحسين تم التحقق من صحته مؤخراً لبيانات قياس التدفق الخلوي عالية الأبعاد.17تم تعيين تسميات لكل عنقود بناءً على وسيط تعبير علامات السلالة والتنشيط، وجرت مراجعتها مقابل البوابات اليدوية.
لتحليل بيانات السيتوكينات المتعددة، تم أولاً تحويل القيم الخام باستخدام log₁₀، ثم جرى توحيدها بين المواد المُحللة عبر تقييم z-score قبل إجراء تحليلات إضافية. خضعت كل من المواد المُحللة والمرضى للتجميع الهرمي باستخدام المسافة الإقليدية (Euclidean distance) ورابط Ward.D2؛ وعُرِضت النتائج في خريطة حرارية مجمعة حسب الصفوف والأعمدة. استُخدم هذا النهج للكشف عن وحدات السيتوكينات ذات التعبير المشترك وتصنيف مجموعات فرعية من المرضى في مجموعات الالتهابات المتعددة9. كما أُنشئت مصفوفات الارتباط لجميع المؤشرات الحيوية الخلوية والذائبة باستخدام ارتباطات رتب سبيرمان الزوجية. ورُسمت الخرائط الحرارية لمصفوفات الارتباط إلى جانب شبكة تتوافق فيها العقد مع المؤشرات الحيوية، وتُشير الحواف إلى الارتباطات التي صمدت أمام تصحيح الاختبارات المتعددة باستخدام طريقة بنجاميني-هوشبيرج (BH). وتم تحديد عرض الحواف وفقاً لقيمة معامل الارتباط |ρ|، وأُدرجت الحواف فقط إذا كانت |ρ| ≥ 0.30 و p < 0.05 بعد التصحيح. أُجري تحليل المكونات الرئيسية (PCA) على المصفوفة الموحدة التي تحتوي على الخلايا والسيتوكينات باستخدام دالة prcomp() مع قياس تباين الوحدة. وتم إسقاط المشاركين على أول مكونين رئيسيين مع تراكب مجموعات الإصابة والمجموعات الضابطة. وقد ضمن التخفيض المتسق للعينات وتوحيد جميع التحليلات إمكانية المقارنة بين قراءات المؤشرات الحيوية الخلوية والذائبة في جميع الرسوم التوضيحية.
التحليل الإحصائي
تم وصف المتغيرات المستمرة باستخدام الوسيط (المدى الربيعي، IQR) عندما كانت غير طبيعية التوزيع وفقاً لاختبارات Shapiro–Wilk، وبالوسط الحسابي (الانحراف المعياري، SD) في الحالات الأخرى. ووُصفت المتغيرات الفئوية باستخدام التكرارات والنسب المئوية. وأجريت المقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار Mann–Whitney U عندما كانت المتغيرات المستمرة ذات توزيعات غير طبيعية، واختبار Welch t-test عندما كانت المتغيرات المستمرة موزعة طبيعياً، واختبار مربع كاي (chi-squared test)/اختبار Fisher الدقيق عند انطباقهما على المتغيرات الفئوية. وقُيمت الارتباطات بين المتغيرات المستمرة من خلال معامل ارتباط الرتب لـ Spearman. ولمعالجة معدل الاكتشافات الكاذبة (FDR) في تحليلات السيتوكينات المتعددة والارتباطات، عُدلت قيم p باستخدام طريقة Benjamini–Hochberg مع حد قطع q < 0.05. واعتبرت قيمة p < 0.05 ثنائية الجانب ذات دلالة إحصائية في جميع التحليلات الأولية. وحيثما أمكن، تم الإبقاء على الحالات ذات البيانات المفقودة في متغيرات فردية وتحليلها عن طريق تحليل الحالات الكاملة للمتغير المتأثر، بينما أجريت عمليات تعويض متعددة باستخدام المعادلات المتسلسلة (m = 20) لإجراء تحليلات الحساسية. وتم إنشاء منحنيات خصائص تشغيل المستقبل (ROC) والمساحة المقابلة تحت المنحنى (AUC) للسيتوكينات الفردية باستخدام حزمة pROC ضمن مجموعة الدراسة الكاملة؛ ولم تُستخدم مجموعة تحقق خارجية منفصلة. وكررت تحليلات الحساسية المحددة مسبقاً مقارنات المجموعات الأولية بعد استبعاد المشاركين الذين تلقوا مضادات حيوية خلال 72 h قبل تنظير القصبات، وبعد تقسيم مجموعة العدوى حسب حالة التهوية الميكانيكية وحسب النوع الفرعي للالتهاب الرئوي (المكتسب من المجتمع، أو المكتسب من المستشفى، أو المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي). وأجريت التحليلات باستخدام حزم rstatix وFlowSOM وuwot وComplexHeatmap وigraph وpROC وmice في برنامج R v4.4. وتم إنشاء الأشكال باستخدام برمجيات رسم بياني علمية تجارية (انظر جدول المواد).
النتائج
مجتمع الدراسة وخصائص العينة
ضمت مجموعة التحليل النهائية 112 شخصاً، من بينهم 64 شخصاً في مجموعة العدوى و48 شخصاً في مجموعة التحكم غير المصابة بالعدوى. كانت الخصائص الديموغرافية الأساسية متشابهة بين المجموعتين، بينما كانت المؤشرات المختبرية المتعلقة بالعدوى أعلى في مجموعة العدوى، كما هو موضح في الجدول 1. نتجت حالات العدوى بشكل أساسي عن بكتيريا سالبة الجرام، وكانت المسببات البكتيرية الرئيسية هي Klebsiella pneumoniae وPseudomonas aeruginosa وAcinetobacter baumannii. وشملت المسببات الأخرى Streptococcus pneumoniae وStaphylococcus aureus وعوامل غير نمطية وفيروسات وعدوى مختلطة.
استوفت معدلات استعادة سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) العتبة المحددة مسبقاً وهي ≥40% لجميع العينات المستبقاة، مع ملاحظة معدلات أقل قليلاً في مجموعة العدوى مقارنة بمجموعة التحكم (الوسيط 48.3% مقابل 53.3%، p = 0.03)، وهو ما يتفق مع زيادة التهاب الممرات الهوائية والاحتقان المخاطي في الممرات الهوائية المصابة. ونظراً لأن الحجم المستعاد اختلف أيضاً بين المجموعتين (58 mL مقابل 64 mL، p = 0.04)، فإن جميع تركيزات السيتوكينات المبلغ عنها قد تكون عرضة لاختلاف بسيط في عامل التخفيف بين المجموعتين؛ وقد أعاد تحليل الحساسية المحدد مسبقاً والمقتصر على العينات التي بلغت معدل استعادتها ≥50% (العدد = 42 في مجموعة العدوى، والعدد = 34 في مجموعة التحكم) إنتاج نفس اتجاه وحجم كل مقارنة بين المجموعات (أكبر تغيير في حجم التأثير < 8%)، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن يكون انحياز التخفيف هو السبب في الاختلافات الملحوظة. كان الوقت الفاصل بين الجمع والمعالجة 65 min لمجموعة العدوى و 62 min لمجموعة التحكم، وهو ما يقع ضمن النافذة الزمنية المحددة بساعتين. وأشارت معايير مراقبة الجودة (QC) على مستوى العينة إلى نتائج عالية الجودة. حيث تم الحصول على تعدادات خلوية تفريقية بناءً على عد ≥400 خلية في جميع العينات 112/112 (100%). واستوفت عمليات استحواذ قياس التدفق الخلوي المعيار المحدد مسبقاً وهو ≥1 × 105 من أحداث CD45⁺ في جميع العينات 112/112 (100%)، بمتوسط حيوية للخلايا الحية بلغ 89.4% (IQR 85.6–92.8%). كما استوفت جميع أطباق السيتوكينات المتعددة معايير مراقبة الجودة بعد إعادة تشغيل واحدة. وبالنسبة لجميع المواد التحليلية الـ 13، كان معامل التباين (CV) داخل المقايسة 4.7% (2.1–9.3%، وجميعها <10%)، وكان معامل التباين بين الأطباق لعينات مراقبة الجودة المجمعة 11.2% (6.8–18.4%، وجميعها <20%)، وكان متوسط عدد الخرزات 78 events/analyte/well (53–142، وجميعها ≥ 50).
| المتغير | العدوى (n = 64) | المجموعة الضابطة (n = 48) | القيمة الاحتمالية p value |
| العمر، سنة، الوسيط [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| ذكر، n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| مؤشر كتلة الجسم، kg/m2، الوسيط [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| تاريخ التدخين، n (%) | 0.52 | ||
| لم يدخن قط | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| مدخن سابق | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| مدخن حالي | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| ارتفاع ضغط الدم، n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| داء السكري، n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| مرض الشريان التاجي، n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| مرض الكلى المزمن، n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| دواعي إجراء تنظير القصبات، n (%) | — | ||
| الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع | 35 (54.7) | — | |
| الالتهاب الرئوي المكتسب من المستشفى | 19 (29.7) | — | |
| الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي | 10 (15.6) | — | |
| عقيدة رئوية غير محددة | — | 23 (47.9) | |
| تشوه إشعاعي مستمر | — | 15 (31.3) | |
| تقييم السعال المزمن | — | 10 (20.8) | |
| الممرض المسبب، n (%) | — | ||
| بكتيريا سالبة الغرام | 28 (43.8) | ||
| بكتيريا موجبة الغرام | 16 (25.0) | ||
| ممرضات غير نمطية | 7 (10.9) | ||
| فيروسات تنفسية | 8 (12.5) | ||
| عدوى مختلطة | 5 (7.8) | ||
| التهوية الميكانيكية عند إجراء غسيل القصبات والأسناخ (BAL)، n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| التعرض للمضادات الحيوية خلال 72 ساعة قبل غسيل القصبات والأسناخ (BAL)، n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| الحجم المصبوب، mL، الوسيط [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| الحجم المستعاد، mL، الوسيط [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| معدل استعادة سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)، %، الوسيط [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| الوقت المستغرق للمعالجة، min، الوسيط [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| كريات الدم البيضاء في الدم، × 10⁹/L، الوسيط [IQR] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| العدلات في الدم، %، الوسيط [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| البروتين التفاعلي C، mg/L، الوسيط [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| بروكالسيتونين، ng/mL، الوسيط [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
الجدول 1: الخصائص الديموغرافية والسريرية وخصائص معالجة سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) لمجموعة الدراسة. تتم مقارنة الخصائص الديموغرافية الأساسية، والأمراض المصاحبة، ودواعي إجراء تنظير القصبات، والمسببات المرضية، ومعايير الإجراء، وقيم مختبر الدم المحيطي بين 64 مشاركاً في مجموعة العدوى و48 مشاركاً في مجموعة التحكم غير المصابة بالعدوى. تم تسجيل المتغيرات المستمرة كقيمة وسيط [المدى الربيعي] ومقارنتها باستخدام اختبار Mann–Whitney U ؛ بينما سجلت المتغيرات الفئوية كعدد (نسبة مئوية n (%)) وقورنت باستخدام اختبار مربع كاي أو اختبار فيشر الدقيق حيثما كان ذلك مناسباً. الاختصارات: BAL = غسيل القصبات والأسناخ؛ BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ؛ BMI = مؤشر كتلة الجسم؛ IQR = المدى الربيعي؛ WBC = تعداد كرات الدم البيضاء.
تصوير تجنيد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)
لُوحظ تحول واضح في النسبة من مجتمع تهيمن عليه الخلايا البلعمية الكبيرة إلى مجتمع تهيمن عليه الخلايا المتعادلة بين الخاضعين للإصابة، كما هو موضح في الشكل 2. صُبغت تحضيرات جهاز الطرد المركزي الخلوي باستخدام تقنية Wright–Giemsa، وأظهر التلوين تمييزاً واضحاً بين المجموعتين؛ حيث احتوت مجموعة الضبط على عدد أكبر من البلعميات السنخية، وبعض الخلايا اللمفاوية، والقليل من الخلايا المتعادلة، بينما هيمنت الخلايا المتعادلة على المجموعة المصابة مع ظهور متكرر للبكتيريا داخل الخلايا، ونوى متحللة، وحبيبات سامة. استُخدمت التعدادات التفريقية بناءً على 400 خلية مُحصاة على الأقل للتحقق من الفروق، حيث ارتفعت نسبة الخلايا المتعادلة من قيمة وسيطة بلغت 3.2% (IQR: 1.8–5.6%) في مجموعة الضبط إلى 68.4% (IQR: 49.2–82.5%) في المجموعة المصابة (p < 0.001)، بينما انخفضت نسبة البلعميات السنخية من 88.2% (IQR: 82.4–92.5%) إلى 22.6% (IQR: 12.3–38.5%) (p < 0.001). وكانت نسب الخلايا اللمفاوية متقاربة بين المجموعتين (7.4% [4.8–11.3%] مقابل 6.5% [3.4–11.2%]، p = 0.42).
أكدت تحليلات تحديد البوابات (gating) وتقليل الأبعاد ووسعت نطاق الأنماط الظاهرية الخلوية التي لوحظت عبر المجهر. فبعد استبعاد الحطام والخلايا المزدوجة والخلايا الميتة، شكلت الخلايا الحبيبية CD45⁺CD66b⁺ وسيطاً قدره 65.8% (IQR: 46.2–79.4%) من كريات الدم البيضاء CD45⁺ في مجموعة العدوى مقابل 4.1% (IQR: 2.3–6.8%) في مجموعة الضبط (p < 0.001). وضمن مجتمع الخلايا الحبيبية، شكلت الخلايا المتعادلة الناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ نسبة 92.4% (IQR: 87.5–95.8%) من جميع الخلايا الحبيبية في مجموعة العدوى مقابل 88.6% (IQR: 82.3–93.5%) في مجموعة الضبط، مما يشير إلى أن مجمع الخلايا المتعادلة المستقطبة كان يتكون إلى حد كبير من خلايا ناضجة ومتمايزة تماماً بدلاً من السلائف المبكرة. وأظهرت إسقاطات UMAP وt-SNE بناءً على مصفوفة البروتينات السطحية المحولة باستخدام arcsinh تضاريس متطابقة تقريباً، حيث شغلت حالات العدوى جزيرة بارزة من الخلايا المتعادلة الناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ التي كانت قليلة الكثافة في عينات الضبط، بينما أظهرت جزيرة البلاعم السنخية HLA-DR⁺CD14⁺ نمطاً معاكساً، إذ كانت كثيفة السكان في عينات الضبط وقليلة الكثافة في حالات العدوى. وحدد التجميع الفائق (Meta-clustering) بواسطة FlowSOM وجود 13 مجموعة فرعية، أظهرت من بينها مجموعة فرعية من الخلايا المتعادلة الناضجة (38.4% [22.6–56.2%] مقابل 2.8% [1.5–4.6%], p < 0.001) وعنقود من الخلايا المتعادلة المنشطة CD16-dim CD11b-high (22.6% [11.4–32.5%] مقابل 0.4% [0.1–1.2%], p < 0.001) أكبر توسعات بين المجموعات.
أما فيما يتعلق بالعدد المطلق للخلايا المتعادلة، فقد حدثت زيادة تقريبية بمقدار 50 ضعفاً في عدد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) في مجموعة العدوى مقارنة بمجموعة الشواهد. وارتفع العدد الإجمالي للخلايا ذات النواة لكل µL من سائل BALF من 156 cells/µL (IQR 88–232) في مجموعة الشواهد إلى 384 cells/µL (IQR 180–712) في مجموعة العدوى (p < 0.001)، كما ارتفعت أعداد الخلايا المتعادلة من 5 cells/µL (IQR 2–13) في مجموعة الشواهد إلى 262 cells/µL (IQR 89–578) في مجموعة العدوى (p < 0.001). وظلت الفروق الزوجية في نسبة الخلايا المتعادلة والعدد المطلق بين المجموعات ذات دلالة إحصائية عالية بعد تعديل Benjamini–Hochberg (BH) (q < 0.001).
الشكل 2تصوير تجنيد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ. توضح حقول تمثيلية من لطاخات الخلايا المجمعة بالطرد المركزي (cytospin) والمصبوغة بصبغة رايت-جيمزا (Wright–Giemsa) لمشارك من مجموعة الضبط ومشارك مصاب التحول في المظهر الخلوي لسائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) من نمط تسوده البلاعم إلى نمط تسوده الخلايا المتعادلة. وتتضمن استراتيجية تقسيم الخلايا (gating) في قياس التدفق الخلوي أربع خطوات (الخلايا المفردة بناءً على التشتت الأمامي FSC) → خلايا CD45 الحية⁺ خلايا الدم البيضاء → CD66b⁺ الخلايا المحببة بعد CD14⁺HLA-DR⁺ استبعاد → CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ خلايا متعادلة ناضجة)، وتضمين UMAP لبيانات قياس التدفق الخلوي المحولة باستخدام arcsinh مع تراكب لعنقود-كلي FlowSOM مكون من 13 عنقوداً ملوناً وفقاً للتصنيف البيولوجي، ومخططات صندوقية لنسبة الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) والتركيز المطلق للخلايا المتعادلة (خلية/µL، ومقياس لوغاريتمي) معروضة جنباً إلى جنب للسماح بالمقارنة المباشرة للأنماط الظاهرية الخلوية التي تم تحديدها في مجموعتي العدوى والضابطة. الاختصارات: BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ؛ FSC = التشتت الأمامي؛ UMAP = التقريب والإسقاط المتشعب الموحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تصوير ملامح السيتوكينات الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)
ميز نمط من الاستجابات المنسقة عبر عدة محاور للسيتوكينات مجموعة العدوى عن مجموعة الضبط، حيث صُنفت السيتوكينات إلى ثلاث وحدات وظيفية متسقة، كما هو موضح في الشكل 3. أنتج تجميع تركيزات السيتوكينات المحولة وفق مقياس log₁₀ والمطبعة باستخدام طريقة Ward.D2 مخطط شجري واضح للمجموعتين، حيث احتلت عينات العدوى وعينات الضبط طرفين متقابلين من المخطط الشجري، ولوحظ وجود سبعة مشاركين فقط تم تصنيفهم بشكل خاطئ (ستة من مجموعة الضبط تجمعت مع عينات العدوى، ومعظمهم كانت حالات سعال مزمن مع التهاب بسيط في المجاري التنفسية مرتبط بالنيوتروفيل، وعينة عدوى واحدة تجمعت مع مجموعة الضبط، والتي كانت تمثل التهاباً رئوياً غير نمطي في مراحله المبكرة). وحدد المخطط الشجري للمواد التي تم تحليلها ثلاث مجموعات من السيتوكينات. أظهرت مجموعة الكيموكينات، التي تضم CXCL8 وCXCL1 وCXCL10 وCCL2 وCCL3، أكبر تغيير مضاعف بين مجموعتي العدوى والضبط وأعلى ارتباط داخل الوحدة الواحدة. وأظهرت المجموعة المحفزة للالتهاب، التي تحتوي على IL-1β وIL-6 وIL-17A وTNF-α، ارتفاعات اتجاهية مماثلة، وإن كانت أقل وضوحاً إلى حد ما. كما ارتفعت المجموعة التنظيمية، التي تشمل IL-10 وIL-1RA وIFN-γ وG-CSF، في عينات العدوى، مما يشير إلى أن الاستجابة لم تكن محفزة للالتهاب فحسب، بل أشركت أذرعاً تنظيمية مضادة ومضادة للفيروسات في الوقت ذاته.
كانت الوسائط (IQRs) لجميع المواد التحليلية المختبرة أعلى في مجموعة الإصابة مقارنة بمجموعة الضابطة، وكانت قيمة p المعدلة أقل من 0.001 لجميع المواد التحليلية الـ 13 بعد تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب القائم على طريقة BH (BH-FDR). ومن بين المواد التحليلية، سجل CXCL8/IL-8 أعلى تركيز وأكبر تغير في الطيات (من 68 [32–142] pg/mL في مجموعة الضابطة إلى 2,485 [842–6,520] pg/mL في مجموعة الإصابة، أي زيادة بنحو 36 ضعفاً). وظهر نمط موازٍ لـ CXCL1/GRO-α، بزيادة تقارب 21 ضعفاً (78 [36–148] مقابل 1,672 [524–3,890] pg/mL). وأظهر IL-1β زيادة تقارب 13 ضعفاً (5.8 [2.6–11.4] مقابل 78 [29–184] pg/mL). بينما سجل IL-6 وIL-1RA وG-CSF زيادات تتراوح بين 13 إلى 16 ضعفاً (16.4 [7.8–30.5] مقابل 248 [82–612] pg/mL؛ و112 [48–258] مقابل 1,748 [658–3,964] pg/mL؛ و24 [10–52] مقابل 384 [125–912] pg/mL، على التوالي). وشملت الزيادات الأخرى الأصغر TNF-α (~8-fold)، وCXCL10/IP-10 (~9-fold)، وCCL2/MCP-1 (~8-fold)، وCCL3/MIP-1α (~10-fold)، وIL-10 (~10-fold)، وIFN-γ (~6-fold)، وIL-17A (~4-fold).
حدد تحليل خصائص تشغيل المستقبل (receiver operating characteristic analysis) ضمن المجموعة أن كل من IL-8 (AUC 0.94)، وIL-1β (AUC 0.92)، وIL-6 (AUC 0.91)، وCXCL1 (AUC 0.91)، وG-CSF (AUC 0.89) هي المواد التحليلية ذات أقوى تمييز أحادي المؤشر بين مجموعتي العدوى والمجموعة الضابطة؛ وتلخص قيم AUC هذه التمييز داخل مجموعة التحليل في ظل غياب مجموعة تحقق خارجية منفصلة. وقد أسفر تحليل الحساسية باستخدام التضمين المتعدد عبر المعادلات المتسلسلة (m = 20) عن تقديرات ضمن نطاق 5% من وسيط الحالات الكاملة لكل مادة تحليلية، ولم يغير الترتيب التصنيفي لأحجام التأثير.
استُخدمت تحليلات الحساسية المحددة مسبقاً لتقييم تأثير التعرض المسبق للمضادات الحيوية والنوع الفرعي للالتهاب الرئوي على الاختلافات الملحوظة في السيتوكينات. وعندما تكررت المقارنات الأساسية بين المجموعات بعد استبعاد 41 مشاركاً من مجموعة العدوى (64.1%) ممن تلقوا مضادات حيوية خلال 72 h قبل عملية غسل القصبات والأسناخ (BAL)، ظلت جميع المحللات الـ 13 أعلى بشكل ملحوظ في حالات العدوى الـ 23 المتبقية مقارنة بالمجموعات الضابطة بعد تصحيح BH-FDR (قيمة p المعدلة < 0.001 للمميزات الخمس الرائدة)، مع تقديرات نقطية كانت أعلى قليلاً بدلاً من أن تكون أقل من وسيطات المجموعة بأكملها (على سبيل المثال، CXCL8/IL-8 2,860 [980–7,110] pg/mL و IL-1β 92 [34–210] pg/mL)، وهو ما يتفق مع التخميد الجزئي لسيتوكينات الممرات الهوائية بسبب التعرض للمضادات الحيوية قبل عملية BAL. وأظهر تقسيم مجموعة العدوى حسب النوع الفرعي للالتهاب الرئوي نفس الترتيب التنازلي للكيموكينات والسيتوكينات المحفزة للالتهابات عبر الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع (n = 35)، والالتهاب الرئوي المكتسب من المستشفى (n = 19)، والالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي (n = 10)، حيث أظهرت المجموعة الفرعية للالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي أعلى مستويات وسيطة لكل من CXCL8 و CXCL1 و IL-6 و G-CSF، ولم تؤدِ حالة التنفس الاصطناعي إلى تغيير اتجاه أي من المقارنات بين المجموعات.
الشكل 3تصوير ملامح السيتوكينات الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF). خريطة حرارية للتجميع الهرمي للقيم اللوغاريتمية₁₀تركيزات الـ 13 من المواد المُقاسة والمحولة لوغاريتمياً والمُقيسة بدرجة z لجميع المشاركين البالغ عددهم 112 مشاركاً، مع أشرطة تعليق ملونة فوق الخريطة الحرارية تشير إلى تعيين المجموعة (مجموعة ضابطة، عدوى)، والنوع الفرعي للالتهاب الرئوي (الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع CAP، أو الالتهاب الرئوي المرتبط بالرعاية الصحية HAP، أو الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي VAP)، وفئة الممرض المسبب (عدوى سالبة الغرام، أو موجبة الغرام، أو غير نمطية، أو فيروسية، أو عدوى مختلطة). وتوضح المخططات الصندوقية للسيتوكينات الأكثر وفرة وتمايزاً (CXCL8/IL-8, IL-1β، IL-6، CXCL1/GRO-α، وعامل تحفيز مستعمرات الخلايا المحببة (G-CSF)، وعامل نخر الورم-ألفا (TNF-α)αسجل₁₀ (المقياس، بيكوجرام/مل) تقارن بين مجموعتي العدوى والضابطة. *** p < 0.001 بعد تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ وفق طريقة Benjamini–Hochberg. الاختصارات: BALF = سائل غسيل القصبات والأسناخ؛ BH = Benjamini–Hochberg؛ CAP = الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع؛ HAP = الالتهاب الرئوي المكتسب في المستشفى؛ VAP = الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التصور المقترن لاستقطاب الخلايا المتعادلة وملفات السيتوكينات
كشف الربط بين المكونات الخلوية والقابلة للذوبان عن وجود علاقة بيولوجية قوية بين استقطاب الخلايا المتعادلة ونظام الكيموكينات، كما هو موضح في الشكل 4. وقد استُمد تمثيل ثنائي الأبعاد من تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لمصفوفة الخلايا والسيتوكينات الموحدة، حيث مثل المكون الرئيسي الأول (PC1) نسبة 51.1% من التباين الإجمالي، بينما مثل المكون الرئيسي الثاني (PC2) نسبة 12.7% إضافية، ليصل المجموع التراكمي إلى 63.8%. وقد فصل المكون الرئيسي الأول (PC1) مجموعة الإصابة عن مجموعات الضبط، وتميز بوجود حمولات موجبة عالية للخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)، وCXCL8، وCXCL1، وIL-6، وIL-1β، وG-CSF، وحمولات سالبة عالية للخلايا البلعمية. أما المكون الرئيسي الثاني (PC2) فقد فصل بين مسار غني بالكيموكينات (حمولات موجبة عالية لـ CXCL8 وCXCL1) ومسار غني بالتنظيم (حمولات موجبة لـ IL-10 وIL-1RA وIFN-γ)، بحيث مال المشاركون ضمن مجموعة الإصابة إلى الانفصال وفقاً لشدة الحالة، حيث وقعت حالات الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي الذين خضعوا للتهوية الميكانيكية في ربع الكيموكينات المرتفع.
كشفت ارتباطات رتب سبيرمان الزوجية بين 17 سمة خلوية وذائبة عن وجود ارتباط إيجابي قوي بين عدد الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) ومحور الكيموكينات العام (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; جميع قيم p المعدلة < 0.001). وتم رصد المستوى الثاني من الارتباطات ذات الدلالة الإحصائية بين أعداد الخلايا المتعادلة والمحور المحفز للالتهاب (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51)، تلتها ارتباطات إيجابية متوسطة مع المحور التنظيمي (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). وأظهرت نسبة الخلايا البلعمية ارتباطاً سلبياً عكسياً مع كل من محوري الكيموكينات والمحفزات للالتهاب وبقوة مماثلة. كانت الارتباطات ضمن المحور الواحد أقوى بكثير من الارتباطات بين المحاور المختلفة (وسيط |ρ| ضمن المحور = 0.68 مقابل وسيط |ρ| بين المحاور = 0.33)، مما يدعم مفهوم وجود مسارات تنظيمية مشتركة في المنبع تتحكم في محاور الكيموكينات، والمحفزات للالتهاب، والمحاور التنظيمية.
رسمت شبكة الارتباط هذا الاقتران على شكل مخطط بياني كانت فيه الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF) هي العقدة المركزية الأكثر أهمية، مع بقاء جميع الحواف الـ 13 المؤدية إلى السيتوكينات صامدة بعد تصحيح BH للاختبارات المتعددة. ومن بين 136 اتصالاً زوجياً محتملاً بين السمات الـ 17، استوفت 99 اتصالاً المعيار المشترك لـ |ρ| ≥ 0.30 ومُعدلة وفقاً لطريقة بنجاميني-هوكويبرج (BH-adjusted) p < 0.05 وتم الاحتفاظ بها. وأظهر رسم شبكة الارتباط بنية نموذجية واضحة مكونة من ثلاث كتل أعادت إنتاج العناقيد التي تم الحصول عليها من التجميع الهرمي: حيث كانت الروابط الأكثر كثافة وقوة بين نموذج الكيموكين وعدد ونسبة الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)، وربطت روابط متوسطة الوزن بين النموذج المحفز للالتهاب وكل من الخلايا المتعادلة ونموذج الكيموكين، بينما جسرت روابط رفيعة من النموذج التنظيمي الكتل الكيموكينية والمحفزة للالتهاب. واستقرت عقدة نسبة البلاعم في الجهة المقابلة لكتلة الخلايا المتعادلة والكيموكين، وكانت مرتبطة بها عبر مروحة من الحواف ذات الأوزان السالبة. وبشكل جماعي، كشف تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، ومصفوفة الارتباط، ورسم الشبكة عن نمط متسق يرتبط فيه ارتشاح الخلايا المتعادلة في سائل غسيل القصبات والأسناخ والاستجابة الكيموكينية ارتباطاً وثيقاً على مستوى المشاركين الأفراد، بينما تعمل المسارات المحفزة للالتهاب والتنظيمية كنماذج محددة جيداً ولكنها مترابطة حول هذا المحور المتمثل في الخلايا المتعادلة والكيموكين.
الشكل 4: تصور مقترن لاستنفار الخلايا المتعادلة وملفات السيتوكينات الالتهابية. مخطط ثنائي الرسم (biplot) لتحليل المكونات الرئيسية لمصفوفة الخلايا والسيتوكينات الموحدة مع تلوين المشاركين حسب المجموعة، وخريطة حرارية لارتباط Spearman، ورسم بياني شبكي لجميع السمات الخلوية والذائبة الـ 17 (حجم العقد يتناسب مع الدرجة، والحواف مقيسة وفقاً لـ |ρ| ومصفاة حسب قيمة p المعدلة بطريقة BH < 0.05 و |ρ| ≥ 0.30)، مما يبرز مركز الربط بين الخلايا المتعادلة والكيموكينات. الاختصارات: BH = Benjamini–Hochberg؛ PC = المكون الرئيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
توافر البيانات:
تتوفر مجموعة البيانات على مستوى المشاركين مجهولة الهوية ورمز تحليل R المستخدم في هذه الدراسة في الجدول التكميلي S1 والملف التكميلي 1. كما يمكن الحصول على البيانات الأخرى التي تدعم نتائج هذه الدراسة من المؤلف المسؤول عند تقديم طلب معقول.
الجدول التكميلي S1: مجموعة بيانات سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF).يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: ملف ZIP يحتوي على أكواد التحليل.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
تعتمد متانة هذا البروتوكول على عدة قرارات تم اتخاذها قبل التحليل وأثناءه. لقد كان تحديد الحد الأدنى لمعدل الاستعادة بنسبة 40% ودمج الأجزاء الثانية واللاحقة قراراً متعمداً، نظراً لأن الجزء الأول يحتوي على إثراء أعلى من مواد المسالك الهوائية الشعبية، بينما يتباين معدل الاستعادة بشكل منهجي وفقاً للعمر، والجنس، وتاريخ التدخين، والشعبة الهوائية المستهدفة18. ويعد حجب مستقبلات Fc ومعايرة الأجسام المضادة ضد النسائل الفردية لضمان حدود تقسيم صحيحة بين الخلايا المتعادلة الناضجة CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ والبالعات السنخية CD14⁺HLA-DR⁺ (وهي الخلايا السائدة في عينة BALF والتي تظهر أعلى مستويات الصبغ غير النوعي وخلفية الفلورة الذاتية) أمراً حيوياً للحفاظ على الاتساق بين المجموعتين19,20. كما أن القيد المفروض على عمليات التجميد والذوبان والإطار الزمني البالغ 2 h للتحليل المتعدد (multiplex analysis) لم يكن عشوائياً أيضاً؛ حيث أظهرت البيانات الخاصة بـ BALF البشري انخفاضاً ملحوظاً في نسب الخلايا المتعادلة من 6 إلى 24 h، حتى عند تخزينها في درجة حرارة 4 °C، بينما ظلت نسب البالعات والخلايا الليمفاوية ثابتة13. وقد تم تحديد معلمات خوارزميات t-SNE وUMAP، وكذلك معلمات شبكة FlowSOM المكونة من 100 عقدة ومعلمات 12–15 عنقوداً فوقياً (metaclusters)، مسبقاً قبل تحليل المجموعات لمنع الضبط اللاحق (post hoc tuning)، والذي يعد أحد الأسباب المعروفة لعدم إمكانية تكرار مسارات عمل قياس التدفق الخلوي16. ولا يزال من الممكن الاحتفاظ بهوية المشغلين واللوحة/التشغيل لكل حدث خلوي لتطبيق طرق تصحيح الدفعات في التحليلات واسعة النطاق مستقبلاً21.
هناك عدة أنماط فشل شائعة لا تتطلب إجراء تغييرات على البروتوكول. عادةً ما يعود انخفاض الاسترداد (<40%) إلى وضعية الإسفين غير الكافية أو الشفط المفرط؛ ويجب معالجة هذه المشكلة عن طريق ضبط وضع منظار القصبات وتقليل الشفط إلى <100 mmHg قبل سحب عينة أخرى. يمكن التخفيف من حدة الفلورة الذاتية المفرطة الناتجة عن البلاعم السنخية، والتي تعد العامل المربك الرئيسي في تحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا الرئة، من خلال تضمين ضوابط لخلايا رئة غير مصبوغة في كل دفعة، وتحديد بوابة البلاعم ذات التشتت الجانبي العالي بوضوح بدلاً من الاعتماد فقط على صبغات الحيوية19. غالباً ما تتأثر اللوحات المتعددة بانخفاض عدد الخرزات والقيم العالية الشاذة. إن إجراء منحنى تخفيف أولي لمجموعة فرعية من العينات المصابة وعينات الضبط قبل تثبيت تخفيف 1:2 يضمن تجنب تشبع إشارة CXCL8 وCXCL1 وG-CSF، الموجودة في أعلى جزء من منحنى المعايرة لعينات الالتهاب الرئوي، وذلك بسبب تأثير المصفوفة الذي اكتُشف سابقاً في عينات BALF22. يمكن تعديل البروتوكول بشكل أكبر بناءً على خصوصيات المجموعة المدروسة. فعندما تحتوي العينات بشكل أساسي على نوع واحد من الممرضات، فإن تقليص اللوحة الأساسية لتشمل الكيموكينات والوسطاء المؤيدين للالتهاب فقط من شأنه أن يحافظ على قوة إحصائية كافية. أما في حالة وجود مجموعة مختلطة تحتوي على بكتيريا وفيروسات وممرضات غير نمطية، فسيظل من المفيد قياس الوسطاء التنظيميين أيضاً، بما أنه ثبت مؤخراً وجود بصمة محددة للممرض في الخلايا المتعادلة والبلاعم السنخية23، كما تبين أن مزيجاً من سيتوكينات BALF المؤيدة والتنظيمية يعكس شدة المرض في حالات الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع24.
لا تكمن مساهمة سير العمل الحالي في الملاحظة الفردية لتدفق الخلايا المتعادلة أو ارتفاع مستويات الكيموكينات والسيتوكينات الموالية للالتهاب في العدوى التنفسية، حيث إن كلا الأمرين موثقان على نطاق واسع، بل تكمن في الربط بين لوحة قياس التدفق الخلوي المكونة من سبعة مؤشرات للخلايا المتعادلة والوحيدات، ومقايسة مناعية متعددة التحاليل تضم 13 تحليلًا، ضمن مسار تصور مشترك يُطبق على نفس عينة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF). إن تنفيذ لوحة من سبعة مؤشرات تستهدف الخلايا المتعادلة والوحيدات، إلى جانب مقايسة مناعية متعددة التحاليل بـ 13 تحليلًا، يتيح رصد التعقيد المظهري والتعقيد في السيتوكينات؛ وبدون ذلك، سيتطلب التحليل إجراء عدة اختبارات مستقلة بحجم من BALF أكبر بكثير مما يمكن الحصول عليه من عينة تنظير قصبي طبيعية. ويتوافق الإجراء الأول جيدًا مع أعمال سابقة أظهرت أن قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان يتمتع بنفس موثوقية الفحص المجهري اليدوي في تحديد أنواع الخلايا في عينات BALF15، بينما تعكس معايير القبول للإجراء الأخير أفضل الممارسات من برنامج معتمد لتقييم الكفاءة في المقايسات القائمة على الخرزات المتعددة والمتعددة المراكز16. وبوجه خاص، تكشف الخريطة الحرارية المدمجة، ومخطط الشبكة، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA) التي تم بناؤها باستخدام مدخلات معيارية متطابقة، عن علاقات بين أنواع الخلايا والعوامل المرتبطة بها والتي كان من الممكن استنتاجها سابقًا فقط عن طريق تجميع المخططات الشريطية المستقلة. وهذا الأمر مهم لأن الكيموكينات المشتقة من BALF وهي CXCL8 وCCL2 وCCL3 تعمل معًا لتجنيد الخلايا المتعادلة والوحيدات من سرير دوراني مشترك، ويحمل هيكلها المشترك معلومات لا يمكن استخلاصها من قراءات تحليلية فردية مستقلة9,10. وبما أن BALF يتم الحصول عليه بالفعل بشكل روتيني لأغراض سريرية ولا يتطلب حجمًا إضافيًا، فيمكن وضع سير العمل هذا كإضافة ترجمية لخدمات التنظير القصبي الحالية بدلاً من اعتباره إجراءً تشخيصيًا قائمًا بذاته.
يبلغ الوقت الفعلي لإنجاز سير العمل الكامل، والذي يشمل نقل العينات، والصبغ، واكتساب بيانات قياس التدفق الخلوي، وحضانة المقايسة المتعددة والقراءة، ومسار المعالجة الحاسوبية اللاحقة، حوالي 24 h في ظروف المختبرات البحثية. وبناءً على ذلك، يتم وضع سير العمل هذا كأداة للتنميط الظاهري العميق للتوصيف الميكانيكي ومراقبة الاستجابة للعلاج، وليس كمقايسة فرز سريرية عاجلة لاتخاذ قرارات حرجة زمنياً، مثل التمييز الفوري بين الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة العقيم، والتي تظل فيها المقايسات الميكروبيولوجية ومقايسات المؤشرات الحيوية أحادية الواسم الأسرع هي المعيار المتبع في الرعاية الصحية.
هناك عدة قيود يجب ذكرها. يتم جمع سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) من الحيز الهوائي وهو يمثل التفاعلات السطحية المباشرة للحيز الهوائي، ومع ذلك فهو لا يحتوي على الخلايا الموجودة داخل جدار الأسناخ والحواجز، حيث تتركز العديد من البلاعم المنشطة والخلايا اللمفاوية المقيمة في الأنسجة. وبناءً على ذلك، لا توجد نسبة تطابق تام بين الحالات المناعية للحيز الهوائي والبرانشيمة، وهو ما يتفق مع البيانات المنشورة سابقاً25. يعاني الكشف المعتمد على الخرزات المتعددة من التفاعل المتبادل للأجسام المضادة، بالإضافة إلى تأثيرات المصفوفة، والتي تكون منتشرة بشكل خاص في البيئة التي تحتوي على الميوسين والمؤثرات السطحية في سائل BALF مقارنة بمصل الدم؛ بالإضافة إلى ذلك، فإن عملية تخفيف سائل البطانة الظهارية بالمحلول الملحي لا يمكن التغلب عليها بواسطة أي من العلامات الداخلية، مثل اليوريا، بما يتفق مع الانتقادات المنشورة مؤخراً26. كان حجم الغسيل المسترد أقل بمتوسط 6 mL في مجموعة الإصابة مقارنة بالمجموعات الضابطة، لذا فإن التركيزات المطلقة المذكورة هنا تخضع لاختلاف طفيف في عامل التخفيف بين المجموعات، ولم يتم تطبيق أي علامة تخفيف داخلية. قد يؤدي التعرض المسبق للمضادات الحيوية في 41 من أصل 64 مشاركاً في مجموعة الإصابة (64.1%) إلى إضعاف تركيزات السيتوكينات في الممرات الهوائية واستعادة المسببات المرضية. والأهم من ذلك، أن البروتوكول يمثل فقط لقطة زمنية في نقطة واحدة أثناء تنظير القصبات المشار إليه سريرياً، مما يمنع تحليل حركية تجنيد العدلات، وأقصى إفراز للكيموكينات، وتحللها لدى المرضى بشكل فردي. تم اشتقاق قيم AUC للمحلل الواحد من نفس المجموعة المستخدمة لتحديد المؤشرات الحيوية، في ظل غياب مجموعة تحقق مستقلة، ويجب تفسيرها على أنها مقاييس للتمييز داخل المجموعة بدلاً من كونها أداءً تشخيصياً تم التحقق منه خارجياً؛ إن اعتماد أي نقطة قطع لمؤشر واحد في الممارسة السريرية يتطلب تحققاً استشرافياً في مجموعة مستقلة متعددة المراكز. لم تؤدِّ تحليلات الحساسية المحددة مسبقاً، والمقتصرة على العينات ذات الاسترداد الأعلى، والمشاركين الذين لم يتناولوا مضادات حيوية، والمصنفة حسب حالة التهوية الميكانيكية وحسب النوع الفرعي للالتهاب الرئوي (المكتسب من المجتمع، أو المكتسب من المستشفى، أو المرتبط بجهاز التنفس الصناعي)، إلى تغيير اتجاه المقارنات بين المجموعات.
في المستقبل، يمكن معالجة هذه القيود من خلال إضافة تسلسل RNA للخلية الواحدة أو تقنية CITE-seq إلى نفس رواسب سائل غسل القصبات والأسناخ (BALF) المستخدمة في تقدير كمية البروتين والخلايا، وهي تقنيات تم تطبيقها بنجاح في مجموعات كبيرة من مرضى الالتهاب الرئوي البكتيري والالتهاب الرئوي الناتج عن Mycoplasma pneumoniae لدى الأطفال، وذلك للكشف عن الخلايا المتعادلة السنخية والمجموعات الفرعية من البالعات التي لا يمكن تمييزها عن طريق قياس التدفق الخلوي التقليدي27,28. ومن شأن إضافة المعلومات التي يتم الحصول عليها عبر تحليلات الحيز الهوائي إلى تلك التي يوفرها قياس التدفق الكتلي التصويري أو علم النسخ المكاني للخزعات المتطابقة أو حتى مواد التشريح أن تضع هذه المعلومات في سياقها الصحيح29. كما أن ربط أخذ عينات BALF الطولية بتقييم مضادات CXCR1/CXCR2 وحصر مستقبلات IL-6، واللذين أظهرا فائدة في البقاء على قيد الحياة أو دعم الأعضاء في حالات الالتهاب الرئوي الشديد ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، من شأنه أن يسمح باختبار محور "الخلايا المتعادلة-الكيموكين" الذي أبرزه سير العمل هذا كأداة مساعدة في اتخاذ القرارات العلاجية30,31.
في الختام، تصف هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصور يتكون من إجراءات معيارية لجمع وتحضير سائل غسل القصبات والأسناخ الرئوية (BALF)، ولوحة قياس تدفق خلوي تضم سبعة مؤشرات لتقدير تكوين الخلايا المتعادلة والخلايا الوحيدة، ومقايسة سيتوكينات متعددة تقيس 13 سيتوكينًا، ومنصة تصور مشتركة تشمل تحليلات UMAP، والتجميع الهرمي، وشبكة الارتباط، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA). ومن خلال تطبيق سير العمل هذا على مجموعة استباقية مكونة من 112 بالغًا يخضعون لتنظير القصبات لأسباب سريرية، حدد التحليل انتقالاً لافتاً في تكوين الخلايا المناعية السنخية من الخلايا البلعمية إلى الخلايا المتعادلة لدى المرضى المصابين بالعدوى، ورصد نمط استجابة سيتوكينية مكونًا من ثلاث وحدات، وكشف عن محور وثيق الترابط بين الخلايا المتعادلة والكيموكينات لا يمكن ملاحظته باستخدام قياسات المؤشرات الفردية. يعتمد هذا الإجراء حصريًا على المواد التي يتم جمعها أثناء التشخيص السريري، ولا يتطلب حجم عينة إضافيًا، وقد يكون قابلاً للتنفيذ في مختبرات الرعاية الثالثية المجهزة لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات وتحليل المصفوفات الخرزية المتعددة. وسيتطلب الاعتماد الأوسع وأي استخدام للمحللات الفردية كمؤشرات حيوية تشخيصية تحققًا استباقيًا في مجموعات مستقلة متعددة المراكز. وبذلك تقدم الدراسة منهجية قابلة للتكرار وغنية بالبيانات لتوصيف التهاب الممرات الهوائية في حالات العدوى التنفسية، وتوفر أساسًا لتطويرها مستقبلاً في دراسات طولية، وتحليلات خلوية مفردة ومكانية، وتقييم علاجي للتعديل المناعي الذي يستهدف محور الخلايا المتعادلة والكيموكينات.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نتوجه بخالص الشكر لجميع المرضى والمتطوعين الذين شاركوا في هذه الدراسة على تعاونهم القيم. كما نعرب عن امتناننا للجنة الأخلاقيات للحصول على الموافقة الأخلاقية (موافقة رقم 2026HL-038) وللتوجيهات المعيارية المقدمة خلال عملية البحث بأكملها.
نتقدم بالشكر إلى الطاقم الطبي في قسم الجهاز التنفسي ومركز منظار الشعب الهوائية والمختبر السريري لدعمهم في جمع العينات السريرية، ومعالجة سائل غسيل القصبات والأسناخ، والكشف الميكروبيولوجي. كما نقدر دعم المنصة التقنية من المختبر المركزي بالمستشفى لتجارب قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد وتوصيف السيتوكينات المتعددة.
لم يتلقَّ هذا البحث أي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة أو التجارية أو غير الربحية.
نشكر جميع الباحثين والفنيين وطاقم التمريض المشاركين في هذا المشروع على جهودهم في فحص المرضى، وإدارة العينات، والتشغيل التجريبي، وتنظيم البيانات.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأجسام المضادة لـ CD11b البشري، Brilliant Violet 421، مستنسخ ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | علامة تنشيط الخلايا المتعادلة؛ قناة الليزر البنفسجية URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD14 البشري، APC/Cyanine7، مستنسخ M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | علامة استبعاد الخلايا الوحيدة والبلعمية؛ قناة الليزر الحمراء URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD15 البشري، PE، مستنسخ HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | علامة سلالة الخلايا المتعادلة؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD16 البشري، Brilliant Violet 510، مستنسخ 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | علامة نضج الخلايا المتعادلة وعلامة الخلايا القاتلة الطبيعية؛ قناة الليزر البنفسجية URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ CD45 البشري، PerCP، مستنسخ HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | علامة شاملة لكريات الدم البيضاء؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| الأجسام المضادة لـ CD66b البشري، FITC، مستنسخ G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | علامة الخلايا المحببة؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://www.biolegend.com |
| الأجسام المضادة لـ HLA-DR البشري، PerCP/Cyanine5.5، مستنسخ L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | علامة الخلايا المقدمة للمستضد؛ قناة الليزر الزرقاء URL: https://www.biolegend.com |
| محلل دم آلي (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | جهاز (طراز XN-1000) | يستخدم لتحديد إجمالي عدد الخلايا ذات النواة لحساب العدد المطلق للخلايا المتعادلة URL: https://www.sysmex.com |
| ألبومين المصل البقري | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | يستخدم في محلول صبغ التدفق الخلوي (0.5% w/v في PBS مع 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| حزمة ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.20 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لخرائط الحرارة ذات التجميع الهرمي لبيانات السيتوكينات المتعددة URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| جهاز طرد مركزي للخلايا (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | يستخدم لتحضير شرائح الخلايا من معلق خلايا سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| محلول تحلل كريات الدم الحمراء (BD FACS Lysing Solution، تركيز 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | يستخدم لتحلل كريات الدم الحمراء بعد الصبغ السطحي URL: https://www.bdbiosciences.com |
| حمض إيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA)، 0.5 M pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | يستخدم في محلول صبغ التدفق الخلوي بتركيز 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| صبغة حيوية قابلة للتثبيت (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | استبعاد الخلايا الحية والميتة قبل تحديد البوابة؛ قناة الليزر الحمراء URL: https://www.biolegend.com |
| منظار قصبات مرن بالفيديو | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | جهاز (طراز BF-1TQ290) | يستخدم لغسيل القصبات والأسناخ (BAL) تحت تخدير متوسط URL: https://www.olympus-global.com |
| مقياس التدفق الخلوي، متعدد الألوان (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | جهاز (طراز CytoFLEX LX، تكوين سداسي الليزر) | يستخدم للحصول على لوحة تدفق الخلايا المتعادلة/الوحيدة ذات العلامات السبعة URL: https://www.beckman.com |
| برنامج تحليل التدفق الخلوي (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | يستخدم للتعويض وتحديد البوابات اليدوية لملفات FCS URL: https://www.flowjo.com |
| حزمة FlowSOM (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.12 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لتجميع الخرائط ذاتية التنظيم والتجميع الميتا لبيانات التدفق الخلوي URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (برنامج رسم بياني إحصائي) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | يستخدم لإنشاء الأشكال النهائية URL: https://www.graphpad.com |
| كاشف حجب مستقبل Fc البشري (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | حجب مستقبل Fc قبل الصبغ بالأجسام المضادة URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| حزمة igraph (R) | CRAN | v2.0 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لبناء وتصور رسم شبكة الارتباط URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| أنابيب مبردة منخفضة الارتباط بالبروتين، 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | تستخدم لعليقات الطافي من سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) لتحليل السيتوكينات URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| منصة المقايسة المناعية القائمة على الخرزات المتعددة Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | جهاز (طراز MAGPIX) | تستخدم للحصول على مقايسة السيتوكينات المتعددة URL: https://www.luminexcorp.com |
| محلول صبغ May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | يستخدم لعد الخلايا التفريقي بواسطة جهاز Cytospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| حزمة mice (R) | CRAN | v3.16 (مفتوحة المصدر) | تستخدم للاسناد المتعدد عن طريق المعادلات المتسلسلة في تحليل الحساسية URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| لوحة السيتوكينات/الكيموكينات ذات الخرزات المغناطيسية المتعددة (13-plex، مخصصة؛ MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | لوحة مخصصة تقيس الـ 13 من المواد التحليلية الموضحة في القسم 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| مرشح خلايا من شبكة النايلون، 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | يستخدم للترشيح الميكانيكي لسائل BALF لإزالة تكتلات المخاط URL: https://www.corning.com |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | المحلول المنظم الأساسي لإعادة تعليق الخلايا وصبغها URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| حزمة pROC (R) | CRAN | v1.18 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لإنشاء منحنيات ROC وقيم AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (بيئة الحوسبة الإحصائية) | R Core Team | v4.4 (مفتوحة المصدر) | منصة للتحليلات الإحصائية والتصور URL: https://www.r-project.org |
| حزمة rstatix (R) | CRAN | v0.7 (مفتوحة المصدر) | تستخدم للمقارنات بين المجموعات وإحصائيات الارتباط URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| حزمة Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لتمثيلات t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| خرزات تعويض مصبوغة بلون واحد (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | تستخدم لضوابط تعويض اللون الواحد URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| محلول كلوريد الصوديوم للحقن، 0.9% (محلول ملحي معقم) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | يستخدم لغسيل القصبات والأسناخ (BAL) (100–150 mL، عليقات 20–40 mL عند 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| حزمة uwot (R) | CRAN | v0.2 (مفتوحة المصدر) | تستخدم لتقليل الأبعاد بواسطة UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (برنامج الحصول على المقايسات المتعددة وملاءمة المنحنيات) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | برنامج خاص بالجهاز لملاءمة المنحنى القياسي 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
المراجع
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.