يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

النظام البصري لتقييم ميكانيكا الأذين والبطين في قلوب الفئران المرواة بطريقة لانجندورف

66 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

أغسطس 14, 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراءات استخراج قلب الفأر وقسطرته، بالإضافة إلى تحضير وتجهيز نظام لانجندورف للإرواء التراجعي. يرتبط الإعداد التجريبي بنظام بصري عالي الدقة مصمم لتقييم الاستجابات الميكانيكية للأذينين والبطينين مع الحفاظ على ديناميكياتهما الطبيعية.

الملخص

يُعد قلب الفأر نموذجاً شائع الاستخدام في أبحاث القلب والأوعية الدموية، وذلك بفضل التقدم في التقنيات الهندسية. ومع ذلك، لا يزال تقييم انقباضية الأذين والبطين يمثل تحدياً بسبب صغر حجم قلب الفأر. تقدم هذه الدراسة منهجية جديدة لتقييم الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم. يتيح استخدام قلب فأر يتم ترويته بطريقة Langendorff بالتزامن مع نظام بصري عالي الدقة تقييم انقباضية الأذين والبطين. ويعالج الإعداد التجريبي التحديات المرتبطة بصغر حجم القلب ومعدلات الانقباض السريعة مع الحصول على إشارات عالية الدقة. وكان التزامن بين تردد التحفيز وتردد انقباض القلب في نطاق يتراوح من 420 إلى 660 نبضة في الدقيقة (bpm) متسقاً مع النتائج المستخلصة من طريقة auxotonic. بالإضافة إلى ذلك، تسمح قياسات تقصير البطين والإشارات الديناميكية للأذين بتحديد الانقباض الأذيني البطيني. وتعتبر هذه الطريقة مناسبة لتقييم الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم دون تأثيرات صيدلانية أو جهازية. وتظهر هذه النتائج أن النظام البصري يتيح قياس استجابات تقصير البطين والأذين.

المقدمة

هناك الكثير لاكتشافه في فسيولوجيا القلب؛ حيث تُعد العمليات الرئيسية، مثل تنظيم ضربات القلب واقتران الاستثارة والتقلص، من المبادئ الأساسية التي تخضع للبحث المستمر1. ورغم أن تأثيرات الضوضاء البيولوجية على انقباضية القلب2 ونشاط تنظيم ضربات القلب لا تزال غير مفهومة بشكل جيد1، إلا أن طرق التصوير الضوئي الجديدة سمحت بطرح نماذج معرفية جديدة3,4.

لقد قدمت منهجيتان تجريبيتان تستخدمان نظام لانجندورف (Langendorff) مساهمات قيمة في قياس الوظائف القلبية. الأولى هي طريقة الانقباض متساوي الحجم (isovolumic contraction)، حيث يتم الحصول على إشارة من بالون صغير يتم إدخاله في البطين الأيسر5,6,7. والثانية هي طريقة تسجيل الانقباضات الأوكسوتونية (auxotonic recording)، حيث يتم الحصول على إشارة عن طريق خياطة أحد طرفي خيط في قمة القلب والطرف الآخر في جهاز تسجيل ميكانيكي لقياس الانقباضات الأوكسوتونية على طول محور القلب2,8. ومع ذلك، فإن تقييم قدرة الأذين والبطين على الانقباض في قلب الفأر يمثل تحدياً نظراً لصغر حجمه. علاوة على ذلك، يتطلب التحضير درجة معينة من الرفق، لأن القلب عرضة للإصابة9,10,11,12,13.

يتميز النظام البصري لتقييم الديناميكيات الميكانيكية لقلوب الفئران بالعديد من الخصائص والمزايا المبتكرة. أولاً، تعد هذه الطريقة مناسبة لتقييم القدرة الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم في غياب التأثيرات الدوائية أو الجهازية. كما يمكن توظيف هذا البروتوكول بفعالية في التجارب التي تقيم إصابة نقص التروية وإعادة التروية عند دراسة العلاجات القائمة على الأدوية، أو تجديد الخلايا، أو العلاج بالأكسجين.

نقدم في هذه الورقة بروتوكولاً لتسجيل المعاملات الفيزيائية الحيوية لوظيفة انقباض قلب الفأر باستخدام نظام بصري عالي الدقة. وتساعد هذه الطريقة في تقييم القدرة الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم. علاوة على ذلك، فهي تسمح بتقييم القدرة الانقباضية للأذين والبطين. ويمثل تحضير قلب الفأر بطريقة لانجندورف (Langendorff) تحسيناً يتضمن تعديلاً طفيفاً لتقليل فقدان درجة حرارة سائل التروية وتقليل الشوائب الحركية دون تثبيط الانقباضات العضلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أُجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقاً للوائح الفيدرالية الخاصة بتجارب ورعاية الحيوان، وحصلت على موافقة لجنة رعاية الحيوان في CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). في هذه الدراسة، استُخدمت فئران ذكور من سلالة C57BL/6J، بوزن يتراوح بين 28–34 g، وعمر يتراوح بين 8–14 أسبوعاً. جميع المواد والمعدات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد. توفر الملفات التكميلية 1–1 الرسوم التوضيحية الداعمة، وأدلة البرمجيات، وبرامج التحليل، وبيانات التنظيم، وملفات التطبيق الخاصة بالبروتوكول.

1. تحضير المخزون

  1. قم بتحضير محلولين مركزين مسبقاً وتخزينهما في الثلاجة عند 4 °C: (1) المحلول المركز I، بحجم 1 L (في ماء منزوع الأيونات؛ وبتركيز g/L: 76.13 NaCl، و4.02 KCl، و1 MgCl2(6H2O)، و0.4 NaH2PO4) و (2) المحلول المركز II، بحجم 0.1 L (في ماء منزوع الأيونات؛ وبتركيز g/L: 73.5 CaCl2(2H2O)).
    ملاحظة: يمكن استخدام المحاليل لمدة تصل إلى 30 يوماً بعد التحضير. تُحفظ عند 4 °C.

2. توصيل وتنظيف نظام لانغيندورف

  1. قم بتوصيل الخزان (1)، والحمام الحراري للخزان (2)، ومضخة التروية (3)، والملف الحلزوني (4)، ومعيد تدوير الملف الحلزوني (5)، ونظام المراقبة (6)، ونظام التصريف (8)، كما هو موضح في الشكل 1أ.
    ملاحظة: يظهر الاتصال بين نظام المراقبة ونظام التصريف بتفصيل أكبر في الملف التكميلي 1.
  2. املأ نظام لانغندورف (Langendorff) بـ 1 لتر من الماء منزوع الأيونات عند 50 °C، ثم ابدأ بتشغيل مضخات التروية والتصريف (الملف التكميلي 1، نظام تصريف)بعد مرور 20-30 دقيقة تقريبًا، قم بإزالة السائل من النظام، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: تحقق من عدم وجود تسريبات أو انخفاض في الضغط داخل النظام. في حال حدوث ذلك، لا تستكمل التجربة.
  3. املأ النظام بـ 1 لتر من حمض الأسيتيك بتركيز 1% (المذاب في ماء منزوع الأيونات)، ثم أوقف تشغيل مضخات التروية والتصريف وانتظر لمدة 60 دقيقة، ثم قم بتشغيل المضخات لإزالة السائل.
  4. كرر الخطوة 2.2 مرتين.
  5. املأ النظام بإيثانول بتركيز 70% (مذاب في ماء منزوع الأيونات) لمنع التصاق مكونات المحلول.
    ملاحظة: يجب تنظيف نظام لانجندورف للتروية كل عشر تجارب أو شهرياً. وُشرح بروتوكول التنظيف الذي يسبق التجربة في القسم 4بينما تم تفصيل بروتوكول التنظيف بعد التجربة في القسم 8.

3. تحضير محلول تيرود أثناء التجربة

  1. قم بتحضير 1 لتر من محلول بالتركيزات التالية (ملي مولار): 130.25 NaCl، و5.4 KCl، و0.53 MgCl22(6H2O)، 0.3 NaH2أوكسيد الفوسفور (PO)4، 1.8 CaCl22(2H2أو)، 10 دي-جلوكوز، 10 HEPES، مع ضبط الأس الهيدروجيني (pH) ليكون 7.35 ± 0.05 باستخدام NaOH.
    1. امزج ١٠ مل من المحلول المخزون I مع ٧٠٠ مل من الماء منزوع الأيونات مع التقليب المستمر، ثم ارفع درجة حرارة المحلول إلى 37 °C؛ حافظ على أكسجة المحلول عن طريق توصيل الـ O2 الخزان إلى حجر التهوية كما هو موضح في الشكل 1أ (1).
    2. أضف 3.6 مل من المخزون الثاني (Stock II) و96.4 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على تركيز 1.8 ملي مولار من CaCl2.2(2H2)، ثم أضف NaOH لضبط الأس الهيدروجيني (pH) ليكون 7.35 ± 0.05.
    3. أكمل الحجم باستخدام الماء منزوع الأيونات للحصول على 1 لتر من محلول تيرود (Tyrode).
      ملاحظة: يُوصى بتخزين 10 مل من المحلول في الثلاجة عند 4 °C؛ وسيكون هذا الحجم مطلوباً لاحقاً في الخطوة 6.

4. تحضير نظام لانجندورف

ملاحظة: إذا لم يكن نظام Langendorff مملوءاً بالإيثانول في يوم التجربة، فلا يُنصح بالمضي قدماً في الإجراء؛ وبدلاً من ذلك، كرر القسم 2.

  1. قم بتشغيل مضخات التروية والتصريف. اضبط معدل تدفق مضخة التروية على 3 مل/دقيقة ومضخة التصريف على 10 مل/دقيقة. قم بتصريف النظام.
  2. املأ النظام بـ 1 لتر من الماء منزوع الأيونات عند 37 °C، ثم صَفِّ الماء.
  3. املأ النظام بمحلول Tyrode الذي تم تحضيره في الخطوة 3 مع الحفاظ على المحلول في درجة الحرارة الفسيولوجية وأكسجة ثابتة.
  4. قم بتشغيل حمامات الخزان الحرارية وجهاز إعادة تدوير السوائل الحلزوني. اضبط درجة حرارة الخزان (الشكل 1A (2)) على 38 °C للحفاظ على المحلول تحت ظروف فسيولوجية. اضبط درجة حرارة الملف الحلزوني (الشكل 1-أ (5)) في 40 °Cويعوض ذلك فقدان درجة الحرارة في محلول نظام لانغندورف (Langendorff).
    ملاحظة: إذا كانت درجة حرارة محلول تايرود (Tyrode) عند مخرج النظام غير فسيولوجية (37 ± 0.5 °C)، اضبط درجة حرارة جهاز إعادة التدوير الحلزوني. ولا يُنصح بالانتقال إلى الخطوة 6 حتى تستقر درجة الحرارة عند القيمة المناسبة.
  5. قم بتشغيل جهاز مراقبة الضغط (الملف التكميلي 1، نظام المراقبة) ومعايرته في النطاق من 0 إلى 20 ملم زئبق. يتوفر تطبيق المراقبة والتحفيز للمساعدة في معايرة النظام (الملف التكميلي 3 و الملف التكميلي 1).
    ملاحظة: من الضروري التحقق من عدم وجود فقد في الضغط أو فقاعات في النظام. وفي حالة وجود فقاعات في النظام، يجب سد المخرج السفلي للملف الحلزوني مؤقتاً وفتح الصمام العلوي؛ مما سيؤدي إلى ملء العمود، وهو ما يسمح بخروج الفقاعات إلى الخارج. ولا يُنصح بالمضي قدماً في التجربة حتى يتم التحقق من استيفاء هذا الشرط.

5. النظام البصري14

  1. تجميع كاميرا CMOS (الشكل 1-أ, 10)، وعدسة كاميرا قابلة للضبط (LC)، ونظام إضاءة.
    ملاحظة: يتكون نظام الإضاءة من اثنين من الثنائيات الباعثة للضوء (LEDs) (الشكل 1أ, 9)، وعدستي إضاءة مستويتيّ المحدبيّتين (LI)، ووحدة تحكم في الإضاءة (الشكل 1-أ, 11)، وبطاقة استحواذ (الملف التكميلي 1، ونظام مراقبة)، وقطع دعم مصممة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 1).
  2. ضع جسماً مرجعياً بحجم تقريبي يبلغ 1,0 مم³3 على مسافة 10-20 مم من عدسة الكاميرا (مركز الشكل 1أ).
    ملاحظة: يجب وضع العضو في موضع القلب ضمن نظام لانغندورف (Langendorff). يمكن ملاحظة هذا الموضع في الشكل 1ب, تحديداً في مركز الصورة حيث تسقط حزم الضوء.
  3. قم بتشغيل برنامج التقاط الصور بالكاميرا، ثم اضبط الكاميرا على تقليل عينات بمقدار 4x (كل 4 بكسلات = 1 بكسل فرعي). حدد منطقة اهتمام (ROI) بحجم 20 × 20 بكسل فرعي (الملف التكميلي 2).
    ملاحظة: يمكن تحقيق دقة زمنية تصل إلى 750 إطارًا في الثانية (fps) باستخدام هذا التكوين.
  4. قم بتشغيل نظام الإضاءة (الملف التكميلي 1)، واضبط حزم الضوء لتركيزها على الجسم المرجعي، وتحقيق إضاءة متجانسة (الشكل 1ب).
  5. اضبط شدة الإضاءة على الجسم المرجعي لتجنب التعريض المفرط للصورة.
    ملاحظة: يجب أن تبدو الصورة مثل الشكل 2-أ (أو الشكل 1ج, جهاز الكمبيوتر المتحكم (Controller PC). يجب تقليل الانعكاسات على سطح الجسم (القلب) قدر الإمكان دون فقدان دقة تحديد معالمه. ويمكن القيام بذلك عن طريق ضبط قدرة التحكم في الإضاءة أو تقليل وقت التعرض في إعدادات الكاميرا.
  6. قم بضبط تركيز عدسة الكاميرا للحصول على صورة واضحة للجسم المرجعي (الشكل 1ج، وجهاز كمبيوتر للتحكم). تأكد من أن الجسم المرجعي يشغل 80% من مجال الرؤية (الشكل 2أ) للحصول على مقياس تحويل تقريبي قدره 61 µm لكل بكسل فرعي.
    ملاحظة: يقوم النظام البصري بتنشيط نظام الإضاءة تلقائياً عندما يتم ضبط الكاميرا على وضع الالتقاط (الشكل 1أ و الملف التكميلي 2ويوصى بإبقاء الكاميرا في وضع الاستعداد بحيث يظل نظام الإضاءة مطفأً، ولا يتم تفعيله إلا خلال فترات جمع البيانات التجريبية لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.

6. الإجراءات الجراحية والقسطرة

  1. استخدام الهيبارين والتخدير
    1. قم بتحضير خليط تخدير يحتوي على tiletamine-zolazepam (بتركيز 40 mg/kg من وزن جسم الفأر) و xylazine (بتركيز 10 mg/kg من وزن جسم الفأر)، ثم خففه ليصل إلى 20 µL باستخدام محلول ملحي.
    2. احقن خليط التخدير داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 G. اترك الفأر حتى يدخل في حالة تخدير عميق.
      ملاحظة: تحقق من غياب رد الفعل الاستجابي للمؤثرات في الأطراف أو الذيل (عادةً ما تكفي 10 min لذلك).
    3. احقن 20 UI من الهيبارين غير المجزأ داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 G وانتظر حوالي 5 min قبل المتابعة في التجربة.
  2. الاستخراج والقسطرة
    1. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري، وأزل الفراء والجلد من منطقة الصدر باستخدام مقص جراحي.
    2. قم بعمل شق بطني تحت الحجاب الحاجز، مع الحرص على الحفاظ على سلامته.
    3. تابع بعمل شق عرضي في الحجاب الحاجز ثم قم بسرعة بإجراء عملية بضع الصدر الصاعد ثنائي الجانب عبر الأضلاع، ثم أزل جدار الأضلاع.
      ملاحظة: يجب الحذر من إتلاف القلب. إذا تضرر القلب أو تأذى أثناء الإجراء، يُوصى بعدم المتابعة في التجربة.
    4. أمسك الهياكل العلوية للقلب بلطف باستخدام ملاقط دقيقة، والقوس الأبهري، والأوعية المجاورة. ارفعها بلطف لإجراء قطع من الأسفل إلى الأعلى، ثم استخرج القلب والرئتين معاً.
    5. انقل القلب بسرعة إلى طبق بتري يحتوي على 50 mL من محلول Tyrode عند درجة حرارة 4 °C لإجراء غسيل أولي.
      ملاحظة: منذ لحظة شق الحجاب الحاجز، سيبدأ الحيوان في المعاناة من ضيق التنفس؛ ومن هذه النقطة فصاعداً، هناك نافذة زمنية مدتها 60 s لتنفيذ الخطوات من 6.2.3 إلى 6.2.6. قد يؤدي تجاوز هذا الحد الزمني إلى حدوث تلف إقفاري.
    6. أزل الرئتين والأنسجة الدهنية الزائدة للكشف عن القوس الأبهري باستخدام مجهر ستيريو ومقص دقيق.
      ملاحظة: عند تنظيف الأنسجة، تأكد من عدم إتلاف القوس الأبهري. إذا تم قطع الأبهر أسفل الشريان الرأسي العضدي، ستكون القسطرة صعبة، مما قد يؤدي إلى تسرب الضغط.
    7. انقل القلب إلى قاعدة قسطرة مخصصة تحتوي على 50 mL من محلول Tyrode المنظم عند درجة حرارة 4 °C وأدخل الطرف الأبهري في القسطرة المصنوعة خصيصاً من إبرة قياس 20 G (Supplementary File 1).
      ملاحظة: احذر من إتلاف الصمام الأبهري. إذا تضرر الصمام، سيتورم القلب ولن يتم غسل الدورة التاجية بشكل صحيح.
    8. اربط عقدتي قسطرة باستخدام خياطة حريرية 4/0: الأولى في التلم البعيد عن طرف القسطرة والثانية قبل الجذع الرأسي العضدي (Supplementary File 1).
    9. قم بتطبيق محلول Tyrode ببطء باستخدام حقنة 1 mL مملوءة بالمحلول المنظم في درجة حرارة الغرفة. تحقق من تصفية أنسجة الشرايين التاجية للتأكد من نجاح القسطرة.
    10. أزل الأنسجة الدهنية للسماح بالوصول إلى البطينين والأذين.
      ملاحظة: تجنب تجاوز 5 min من عملية القسطرة للحفاظ على حيوية القلب.
    11. انقل القلب إلى نظام Langendorff واتركه ليستقر لمدة 30 min.
      ملاحظة: يوضع القلب في مركز النظام (Figure 1A,B)، معلقاً بشكل رأسي. عند تعليق القلب، توخَّ الحذر الشديد لمنع تكون فقاعات الهواء. إذا حدث ذلك، سيزداد الضغط فوق 140 mmHg، وسيبدأ القلب في التورم، ولن يصبح صالحاً للاستخدام.
      ملاحظة: يكتمل تركيب نظام Langendorff عندما يظهر القلب استجابة مستقرة ميكانيكياً، وتردداً تذبذبياً طبيعياً يبلغ حوالي 360 نبضة في الدقيقة (BPM)، وضغط تروية يتراوح بين 60 و 10 mmHg.

7. بروتوكول ضبط السرعة والتسجيل المرئي

  1. حيوية القلب
    1. تحقق من أن الضغط التاجي يقع في النطاق 60-10 مليمتر زئبقي باستخدام مضخة تروية بمعدل 3 مل/دقيقة. إذا انخفض ضغط التروية التاجية عن 60 مليمتر زئبقي، فقم بزيادة معدل تدفق مضخة التروية قليلاً (حيث يؤدي الضغط المنخفض إلى شحوب القلب وارتخائه). وعلى العكس من ذلك، إذا تجاوز الضغط 10 مليمتر زئبقي، فقم بتقليل معدل تدفق المضخة قليلاً (إذ يؤدي الضغط المفرط إلى تحفيز وذمة الأنسجة وزيادة تدريجية في الضغط حتى يحدث توقف القلب).
      ملاحظة: إن الحفاظ على ضغط التروية خارج النطاق الأمثل المذكور سابقاً لفترة طويلة سيؤدي إلى تضرر حيوية القلب بشكل غير قابل للإصلاح.
    2. ضع القلب في وضعية أمامية بحيث يتم الحصول على عرض أمامي كامل في الكاميرا. اضبط الوضعية بحيث يظهر كلا الأذينين في الكاميرا (الشكل 2أ).
    3. ضع الأقطاب البلاتينية برفق وبشكل سطحي على الجزء العلوي من الأذين الأيمن عند العقدة الناظمة. استخدم بث الكاميرا كدليل لجلب الأقطاب إلى مجال الرؤية. حدد موضع القطب بحيث لا يعيق الأذين الأيمن. وأثناء مراقبة العرض المباشر للكاميرا، قم بدفع القطب ببطء حتى يلامس نسيج الأذين، مع الحرص على عدم ممارسة ضغط مفرط (مما قد يؤدي إلى تسطح الأذين الأيمن في الصورة).
      ملاحظة: في حال التنفيذ بشكل صحيح، ستبدو رؤية الكاميرا كما يلي الشكل 2أ.
    4. قم بتشغيل تطبيق المراقبة والتنظيم (الملف التكميلي 1) وقم بتشغيل بطاقة الاستحواذ (الشكل 1-أ (6)). ضبط قيم معاملات التحفيز: السعة عند 2 فولت، والتردد عند 420 و540 و720 نبضة في الدقيقة (PPM) مع نبضة مربعة بدورة تشغيل تبلغ 7 مللي ثانية (مربع داخلي لـ الشكل 2أ).
    5. طبق تحفيزات الحيوية بدءاً من التردد الأدنى، مع استخدام مدة تحفيز قدرها 20 ثانية تليها فترة استشفاء (وقت راحة) مدتها 20 ثانية بين كل حدثين.
      ملاحظة: يتم تقييم حيوية القلب عبر المراقبة بالكاميرا. فإذا كانت العضو يعمل وظيفياً، سيُلاحظ وجود تزامُن بين المحفز المطبق والاستجابة القلبية، يصاحبه تنسيق سليم بين حجرات القلب. وعلى العكس من ذلك، فإن نقص الحيوية سيظهر في شكل فقدان للتنسيق بين الحجرات أو من خلال وجود انقباضات أذينية معزولة فقط.
    6. أغلق باب الغرفة لأن التجربة حساسة لإضاءة الغرفة والتقلبات الحرارية (الشكل 1ج).
      ملاحظة: يجب أن يظل باب الحجرة مغلقاً خلال فترة التجربة. راقب حيوية القلب باستخدام الكاميرا وضغط التروية.
  2. تسجيل البيانات
    1. طبّق بروتوكول التحفيز، والذي يتكون من سلاسل نبضات مربعة لمدة 30 ثانية، تليها 30 ثانية بدون إشارة. اضبط قيم معاملات التحفيز في كل سلسلة تحفيز: السعة عند 2 فولت، ودورة تشغيل قدرها 7 مللي ثانية، وتردد يتراوح بين 360 إلى 720 نبضة في الدقيقة (PPM).
      ملاحظة: يبدأ بروتوكول التنظيم بـ 360 نبضة في الدقيقة، ويزداد بمقدار 60 نبضة في الدقيقة عند كل نقطة زمنية (صورة مُدرجة لـ الشكل 2أ).
    2. سجل مقاطع فيديو بشكل مستمر لديناميكيات المنظر الأمامي للقلب بصيغة .avi باستخدام برنامج الحصول على الصور من الكاميرا (الملف التكميلي 2قم بتسجيل مقطع فيديو مدته 20 ثانية لكل سلسلة تحفيز. سجل المقطع الذي تبلغ مدته 20 ثانية بدءاً من بعد 5 ثوانٍ من بدء التحفيز. يتوفر تسجيل خام نموذجي في الفيديو التكميلي 1.
      ملاحظة: يقوم جهاز كمبيوتر بتسجيل سلسلة التحفيز المطبقة في آن واحد (.xls، الملف التكميلي 9) لكل مقطع فيديو مسجل (.avi)، تم إنشاؤه بواسطة تطبيق المراقبة وتنظيم السرعة وبرمجيات التقاط الصور بالكاميرا، على التوالي (الملف التكميلي 2 و الملف التكميلي 3).
    3. تحقق من حيوية القلب من خلال مقارنة الفيديو الأول، الذي تم تسجيله قبل بدء بروتوكول التحفيز، بالفيديو الثاني الذي تم تسجيله بعد تطبيق البروتوكول (الشكل 2ب).

8. تنظيف نظام تروية لانجندورف بعد التجربة

  1. قم بإزالة جهاز التحفيز وأقطاب تخطيط كهربائية القلب (ECG) البلاتينية. أخرج القلب من النظام وقم بتصريف جميع محاليل Tyrode المتبقية.
  2. أوقف تشغيل النظام البصري وأغلق صمام O2.
  3. اشطف النظام باستخدام 1 L من الماء منزوع الأيونات عند 37 °C، ثم قم بتصريف النظام.
  4. كرر الخطوتين 2.4 و2.5.
  5. أوقف تشغيل جميع الأنظمة والمعدات.

9. معالجة الفيديو

  1. ابدأ باستيراد كل مقطع فيديو إلى برنامج حوسبة وتطبيق وظيفة تسوية الفيديو.15.
  2. حدد منطقة الاهتمام (ROI) التي تشمل منطقة القلب. أجرِ تجزئة للصورة لإزالة ضجيج الخلفية والأقطاب الكهربائية والقُنِيّة (الملف التكميلي 4).
    ملاحظةلتحديد منطقة الصورة المراد إزالتها بشكل صحيح، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  3. إجراء تحليل للديناميكا الميكانيكية الشاملة (الملف التكميلي 5). وتظهر أمثلة التباين والإشارات الداعمة في الشكل التكميلي S1, الشكل التكميلي S2، و الشكل التكميلي S3.
    1. طبّق مؤثرات مورفولوجية على كل إطار من إطارات الفيديو لتحديد محيط القلب، ثم طبّق خوارزمية ملء الإطار لإنشاء قناع.15.
    2. احسب عدد البكسلات ضمن المنطقة المجزأة في كل إطار، ثم قم بتطبيع هذا العدد بقسمته على العدد الإجمالي للبكسلات في الصورة لإنتاج إشارة ديناميكية (مُدرَج في الشكل 2ب و الشكل التكميلي S3).
    3. طَبِّق مرشح "باتروورث" (Butterworth) ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة في نطاق يتراوح بين 3 و10 هرتز على الإشارة التي تم الحصول عليها، وذلك لكبح ضوضاء الترددات العالية والتشوهات الناتجة عن تقطير التروية.15.
    4. قم بتوحيد الإشارات في جميع مقاطع الفيديو باستخدام القيم القصوى والدنيا المسجلة.
    5. حدد معدل ضربات القلب عن طريق حساب الفترة الزمنية بين قيمتين ذات سعة قصوى (IAA (s)) لكل من الإشارة الديناميكية وإشارة التحفيز.
    6. احصل على التردد بوحدة نبضة في الدقيقة (BPM) باستخدام المعادلة التالية:
      معادلة حساب التردد التي توضح أن معدل ضربات القلب مقاساً بعدد النبضات في الدقيقة (BPM) يساوي 60 مقسوماً على الفاصل الزمني بين النبضات (IAA).
    7. إنشاء خرائط بوانكاريه من بيانات الفترات بين ضربات القلب (IAA) لتوضيح التباين على مدى فترات قصيرة وطويلة الأجل16,17,18 (الشكل التكميلي S1 و الشكل التكميلي S2).
      ملاحظة: للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  4. إجراء تحليل قطاعي للديناميكيات الميكانيكية البطينية (الملف التكميلي 6).
    1. قم بتطبيق ثنائية الصور (image binarization). استخدم المؤثرات المورفولوجية لتحديد منطقة البطين، مع ضبطها لتتخذ هندسة إهليلجية دون المساس بمنطقة الاهتمام (ROI).15.
    2. قم بملاءمة أقل قطع ناقص للمساحة البطينية في كل إطار. استخرج إحداثيات مجموعة من النقاط القاصية في الإطار. استخدم مجموعة تتكون من 10 إلى 20 نقطة في كل طرف على طول المحور Y (الشكل 3-أ). ويتم تقديم مخرج نموذجي لتقدير القطع الناقص في المقطع المرئي التكميلي 2.
    3. احسب التقصير البطيني باعتباره متوسط المسافة بين النقاط القصوى على طول المحور Y في كل مقطع فيديو.19.
    4. طبق مرشح "باتروورث" (Butterworth) ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة في النطاق ما بين 3 و10 هرتز على الإشارة التي تم الحصول عليها، وذلك لكبح الضجيج عالي التردد والشوائب الناتجة عن تقطير التروية.15.
    5. قم بتطبيع إشارة القصر البطيني بالنسبة لجميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها لكل عملية تحفيز، واحسب معدل ضربات القلب والتأخير كما هو موضح في الخطوتين 9.3.5-9.3.6.
      ملاحظة: يتم الحصول على المعايير، مثل مدة الدورة البطينية (DVE)، ومدة الارتخاء (DVW)، والفترة البينية البطينية (IVV)، وسعة البطين (VA)، (الشكل 3أ).
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات التفصيلية، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  5. إجراء تحليل قطاعي للديناميكيات الميكانيكية للأذين (الملف التكميلي 7).
    1. استخدم منطقتين من اهتمام (ROIs) لتحديد الأذين (الشكل 3ج).
    2. حلل كل أذين بشكل منفصل.
      1. استخدم المؤثرات المورفولوجية لتحديد الأذين مع ضبطها دون التأثير سلبًا على المنطقة ذات الاهتمام (ROI)15استخدم خوارزمية لزيادة التباين لتحديد كل أذين.20,21.
      2. قم بتطبيق ثنائية الصورة (image binarization) وحساب عدد البكسلات التي تختلف قيمتها عن الصفر في كل إطار للحصول على إشارة ديناميكية أذينية.
      3. طَبِّق مرشح "بترورث" (Butterworth) ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة، بنطاق تردد بين 3 و10 هرتز، على الإشارات التي تم الحصول عليها لكبح ضجيج الترددات العالية والشوائب الناتجة عن تقطير التروية.15.
      4. احسب متوسط إشارتين أذينتين (الشكل 3D).
    3. قم بتوحيد إشارة تقصير الأذين بالنسبة لجميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها لكل عملية تحفيز، ثم احسب معدل ضربات القلب والتأخير كما هو موضح في الخطوتين 9.3.5-9.3.6.
      ملاحظة: يتم الحصول على المعلمات، مثل مدة الدورة الأذينية (DAE)، والفاصل الأذيني-الأذيني (IAT)، والسعة الأذينية (AA)، (الشكل 3D). لمزيد من المعلومات المفصلة، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  6. إجراء تحليل كهروميكانيكي13,22 (الملف التكميلي 8).
    1. قارن بيانات التنظيم بـإشارات الأذين والبطين (الشكل 3D).
    2. احسب زمن الانتشار في نظام التوصيل القلبي، وذلك لاستنتاج التأخير الزمني بين أحداث الأذين والبطين (AVD)، مع اتخاذ المحفز المطبق كمرجع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تُجرى تجارب الوظائف الميكانيكية للقلب باستخدام جهاز لانجندورف (Langendorff apparatus)، كما هو موضح في الشكل 1-أ (أعلى)تتيح أنظمة المراقبة والأنظمة البصرية تسجيل الفيديو عند تفعيل التحكم في الإضاءة، كما هو موضح في الشكل 1-أ (أسفل). الشكل 1ج يوضح المنظر الخارجي للخزانة التي يتم التحكم في درجة حرارتها بواسطة منظم حراري (thermostat)، والمصممة للحفاظ على القلب معزولاً عن التقلبات الحرارية المحيطة والضوء....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتسم قلب الفأر بحساسية شديدة للتغيرات في درجات الحرارة2,9,10,11,22. وفي هذه التجربة، تم وضع القلب المروي في وضع رأسي. وقد أدخلنا تعديلاً طفيفاً للحد من فقدان درجة حرارة سائل التروية وتقليل التداخلات الحركية في طريقة تروية لانجندورف (Langendorff perfusion method). حيث تمت إضافة مضخة إعادة تدوير إلى الأنبوب المتعرج لتقليل فقدان درجة حرارة سائل التروية عند 37 ± 0...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منحة سكرتارية العلوم والعلوم الإنسانية والتكنولوجيا والابتكار (SECIHTI) الممولة تحت رقم LN-2025-C-23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سرنجة 1 mLBD Plastipak302485إجراء جراحي
إبرة 20 GNIPROAH-2032قنية أبهريّة
عدسة قابلة للتعديل 25 mm بتكبير 8x-100xGenericN/Aعدسة كاميرا النظام البصري؛ أشير إليها بشكل عام كعدسة كاميرا قابلة للتعديل
إبرة 27 GBD PrecisionGlide302358إجراء جراحي
قطع دعم مصممة ثلاثية الأبعادCINVESTAVN/Aقطع دعم مخصصة مصممة ثلاثية الأبعاد
خياطة حريرية 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901قنية أبهريّة
مزود طاقة 40-ASTERENPRL-25مزود طاقة LED
حجر هواءN/AN/Aأكسجة محلول تايرود
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306محلول تايرود
D-GlucoseJ.T. Baker1916-01محلول تايرود
مضخة تصريفCINVESTAVN/Aمضخة تصريف مخصصة؛ أشير إليها بشكل عام كمضخة تصريف
عدسة مستوية محدبة، F = 25.4 mmTHORLABSLA1951-Aعدسة إضاءة النظام البصري؛ أشير إليها بشكل عام كعدسة إضاءة مستوية محدبة
حمض الأسيتيك الثلجيSigma-Aldrich695092تنظيف نظام لانجندورف
هيبارينPiSA060M91مضاد للتخثر
HEPESSigma-AldrichH3375محلول تايرود
مصابيح LED عالية الطاقةLuminiusCBT-90-G-L11-C12مصدر ضوء LED
نظام إضاءةCINVESTAVN/Aنظام إضاءة مخصص؛ أشير إليه بشكل عام كنظام إضاءة
KClCTR SCIENTIFICCTR02196محلول تايرود
برنامج LabVIEW إصدار 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aبرنامج مستخدم لتشغيل تطبيق المراقبة والتحفيز؛ أشير إليه بشكل عام كتطبيق المراقبة والتحفيز
برنامج MATLABThe MathWorksN/Aبرنامج حاسوبي لبرامج تسوية الفيديو وتقسيمه وتحليله؛ أشير إليه بشكل عام كبرنامج حاسوبي
أكسجين طبيGRUPO INFRAN/Aأكسجة محلول تايرود
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104محلول تايرود
مضخة صغيرة متغيرة التدفقCONTROL COMPANY3385مضخة تروية
طقم جراحة للفئرانKent ScientificINSMOUSEKITإجراء جراحي
NaClSigma-AldrichS5886محلول تايرود
NaH2PO4DEQDEQF290400250محلول تايرود
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108ضبط pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01بطاقة استحواذ
أقطاب بلاتينية، قطر 0.25 mmSigma-Aldrich349402أقطاب تحفيز كهربائي
مزود طاقة (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Aمزود طاقة لإعادة التدوير
جهاز مراقبة الضغطCINVESTAVN/Aجهاز مراقبة ضغط مخصص؛ أشير إليه بشكل عام كجهاز مراقبة الضغط
محول طاقة الضغطLA BOUVETB17295جهاز مراقبة الضغط لنظام لانجندورف
كحول إيثيلي نقيSigma-Aldrich493511إيثانول لتنظيف النظام
حمام حراري لإعادة التدوير (LXC)PolyScienceL113A0412جهاز إعادة تدوير الخزان
محلول ملحيPiSA111848محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) بتركيز 0.9%
حمام حراري لولبيCINVESTAVN/Aجهاز إعادة تدوير/حمام حراري لولبي مخصص
مجهر ستيريوN/AN/Aإجراء جراحي
إضاءة مجهر ستيريوN/AN/Aإجراء جراحي
برنامج uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Aبرنامج استحواذ الكاميرا؛ أشير إليه بشكل عام كبرنامج استحواذ الكاميرا
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624كاميرا CMOS عالية السرعة؛ أشير إليها بشكل عام ككاميرا CMOS
زايلزينPiSA4001211مخدر
Zoletil 100Virbac83048907مخدر تيلتامين-زولازيبام؛ أشير إليه بشكل عام كمزيج مخدر

المراجع

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.