مقالة منهجية

النظام البصري لتقييم ميكانيكا الأذين والبطين في قلوب الفئران المرواة بطريقة لانجندورف

DOI:

10.3791/72264

⸱

أغسطس 14, 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراءات استخراج قلب الفأر وقسطرته، بالإضافة إلى تحضير وتجهيز نظام لانجندورف للإرواء التراجعي. يرتبط الإعداد التجريبي بنظام بصري عالي الدقة مصمم لتقييم الاستجابات الميكانيكية للأذينين والبطينين مع الحفاظ على ديناميكياتهما الطبيعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يُعد قلب الفأر نموذجاً شائع الاستخدام في أبحاث القلب والأوعية الدموية، وذلك بفضل التقدم في التقنيات الهندسية. ومع ذلك، لا يزال تقييم انقباضية الأذين والبطين يمثل تحدياً بسبب صغر حجم قلب الفأر. تقدم هذه الدراسة منهجية جديدة لتقييم الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم. يتيح استخدام قلب فأر يتم ترويته بطريقة Langendorff بالتزامن مع نظام بصري عالي الدقة تقييم انقباضية الأذين والبطين. ويعالج الإعداد التجريبي التحديات المرتبطة بصغر حجم القلب ومعدلات الانقباض السريعة مع الحصول على إشارات عالية الدقة. وكان التزامن بين تردد التحفيز وتردد انقباض القلب في نطاق يتراوح من 420 إلى 660 نبضة في الدقيقة (bpm) متسقاً مع النتائج المستخلصة من طريقة auxotonic. بالإضافة إلى ذلك، تسمح قياسات تقصير البطين والإشارات الديناميكية للأذين بتحديد الانقباض الأذيني البطيني. وتعتبر هذه الطريقة مناسبة لتقييم الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم دون تأثيرات صيدلانية أو جهازية. وتظهر هذه النتائج أن النظام البصري يتيح قياس استجابات تقصير البطين والأذين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك الكثير لاكتشافه في فسيولوجيا القلب؛ حيث تُعد العمليات الرئيسية، مثل تنظيم ضربات القلب واقتران الاستثارة والتقلص، من المبادئ الأساسية التي تخضع للبحث المستمر1. ورغم أن تأثيرات الضوضاء البيولوجية على انقباضية القلب2 ونشاط تنظيم ضربات القلب لا تزال غير مفهومة بشكل جيد1، إلا أن طرق التصوير الضوئي الجديدة سمحت بطرح نماذج معرفية جديدة3,4.

لقد قدمت منهجيتان تجريبيتان تستخدمان نظام لانجندورف (Langendorff) مساهمات قيمة في قياس الوظائف القلبية. الأولى هي طريقة الانقباض متساوي الحجم (isovolumic contraction)، حيث يتم الحصول على إشارة من بالون صغير يتم إدخاله في البطين الأيسر5,6,7. والثانية هي طريقة تسجيل الانقباضات الأوكسوتونية (auxotonic recording)، حيث يتم الحصول على إشارة عن طريق خياطة أحد طرفي خيط في قمة القلب والطرف الآخر في جهاز تسجيل ميكانيكي لقياس الانقباضات الأوكسوتونية على طول محور القلب2,8. ومع ذلك، فإن تقييم قدرة الأذين والبطين على الانقباض في قلب الفأر يمثل تحدياً نظراً لصغر حجمه. علاوة على ذلك، يتطلب التحضير درجة معينة من الرفق، لأن القلب عرضة للإصابة9,10,11,12,13.

يتميز النظام البصري لتقييم الديناميكيات الميكانيكية لقلوب الفئران بالعديد من الخصائص والمزايا المبتكرة. أولاً، تعد هذه الطريقة مناسبة لتقييم القدرة الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم في غياب التأثيرات الدوائية أو الجهازية. كما يمكن توظيف هذا البروتوكول بفعالية في التجارب التي تقيم إصابة نقص التروية وإعادة التروية عند دراسة العلاجات القائمة على الأدوية، أو تجديد الخلايا، أو العلاج بالأكسجين.

نقدم في هذه الورقة بروتوكولاً لتسجيل المعاملات الفيزيائية الحيوية لوظيفة انقباض قلب الفأر باستخدام نظام بصري عالي الدقة. وتساعد هذه الطريقة في تقييم القدرة الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم. علاوة على ذلك، فهي تسمح بتقييم القدرة الانقباضية للأذين والبطين. ويمثل تحضير قلب الفأر بطريقة لانجندورف (Langendorff) تحسيناً يتضمن تعديلاً طفيفاً لتقليل فقدان درجة حرارة سائل التروية وتقليل الشوائب الحركية دون تثبيط الانقباضات العضلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أُجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقًا للوائح الفيدرالية لتجارب ورعاية الحيوان، واعتمدتها لجنة رعاية الحيوان في CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). في هذه الدراسة، استُخدمت فئران ذكر من سلالة C57BL/6J، تتراوح أوزانها بين 28–34 g، وأعمارها بين 8–14 أسبوعًا. جميع المواد والمعدات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد. توفر الملفات التكميلية 1–11 الرسوم التوضيحية الداعمة، وأدلة البرمجيات، وبرامج التحليل، وبيانات تنظيم ضربات القلب، وملفات التطبيق الخاصة بالبروتوكول.

1. تحضير المحاليل المخزنة

  1. قم بتحضير محلولين قياسيين مسبقاً وتخزينهما في الثلاجة عند 4 °C: (1) المحلول القياسي I، بحجم 1 L (في ماء منزوع الأيونات؛ بتركيز g/L: 76.13 NaCl، و4.02 KCl، و1 MgCl2(6H2O)، و0.4 NaH2PO4) و(2) المحلول القياسي II، بحجم 0.1 L (في ماء منزوع الأيونات؛ بتركيز g/L: 73.5 CaCl2(2H2O)).
    ملاحظة: يمكن استخدام المحاليل لمدة تصل إلى 30 يوماً بعد التحضير. تُحفظ عند 4 °C.

2. توصيل وتنظيف نظام لانجيندورف

  1. قم بتوصيل الخزان (1)، والحمام الحراري للخزان (2)، ومضخة التروية (3)، والملف الحلزوني (4)، ومعيد تدوير الملف الحلزوني (5)، ونظام المراقبة (6)، ونظام التصريف (8)، كما هو موضح في الشكل 1أ.
    ملاحظة: يظهر الاتصال بين نظام المراقبة ونظام التصريف بمزيد من التفصيل في الملف التكميلي 1.
  2. املأ نظام Langendorff بـ 1 لتر من الماء منزوع الأيونات عند 50 °C، ثم ابدأ بتشغيل مضخات التروية والتصريف (الملف التكميلي 1، نظام التصريف)بعد مرور 20-30 دقيقة تقريبًا، قم بإزالة السائل من النظام، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: تحقق من عدم وجود تسريبات أو انخفاض في الضغط داخل النظام. وفي حال حدوث ذلك، لا تواصل إجراء التجربة.
  3. املأ النظام بـ 1 لتر من حمض الأسيتيك بتركيز 1% (مذاب في ماء منزوع الأيونات)، ثم أوقف تشغيل مضخات التروية والتصريف وانتظر لمدة 60 دقيقة، ثم قم بتشغيل المضخات لإزالة السائل.
  4. كرر الخطوة 2.2 مرتين.
  5. املأ النظام بإيثانول بتركيز 70% (مذاب في ماء منزوع الأيونات) لمنع التصاق مكونات المحلول.
    ملاحظة: يجب تنظيف نظام تروية لانجندورف كل عشر تجارب أو شهرياً. تم شرح بروتوكول التنظيف المسبق للتجربة في القسم 4وبينما يتم تفصيل بروتوكول التنظيف بعد التجربة في القسم 8.

3. تحضير محلول تايرود أثناء التجربة

  1. قم بتحضير 1 L من المحلول بالتركيزات التالية (mM): 130.25 NaCl، و5.4 KCl، و0.53 MgCl2(6H2O)، و0.33 NaH2PO4، و1.8 CaCl2(2H2O)، و10 D-glucose، و10 HEPES، مع ضبط الرقم الهيدروجيني pH عند 7.35 ± 0.05 باستخدام NaOH.
    1. امزج 100 mL من Stock I مع 700 mL من الماء منزوع الأيونات تحت تحريك مستمر، ثم ارفع درجة حرارة المحلول إلى 37 °C؛ وحافظ على أكسجة المحلول عن طريق توصيل خزان O2 بحجر الهواء كما هو موضح في الشكل 1A (1).
    2. أضف 3.6 mL من Stock II و96.4 mL من الماء منزوع الأيونات للحصول على تركيز 1.8 mM من CaCl2(2H2O)، ثم أضف NaOH لضبط الرقم الهيدروجيني pH عند 7.35 ± 0.05.
    3. أكمل الحجم بالماء منزوع الأيونات للحصول على 1 L من محلول Tyrode.
      ملاحظة: يُوصى بتخزين 100 mL من المحلول في الثلاجة عند 4 °C؛ حيث سيُطلب هذا الحجم لاحقاً في الخطوة 6.

4. تحضير نظام لانجيندورف

ملاحظة: إذا لم يتم ملء نظام Langendorff بالإيثانول في يوم التجربة، فلا يُنصح بالمتابعة في الإجراء؛ وبدلاً من ذلك، كرر القسم 2.

  1. قم بتشغيل مضخات التروية والتصريف. اضبط معدل تدفق مضخة التروية على 3 mL/min ومضخة التصريف على 10 mL/min. قم بتصريف النظام.
  2. املأ النظام بـ 1 L من الماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 37 °C، ثم قم بتصريف الماء.
  3. املأ النظام بمحلول Tyrode الذي تم تحضيره في الخطوة 3 وحافظ على المحلول في درجة الحرارة الفسيولوجية ومع أكسجة ثابتة.
  4. قم بتشغيل الحمامات الحرارية للخزان وجهاز إعادة تدوير الملف الحلزوني. اضبط درجة حرارة الخزان (الشكل 1A (2)) على 38 °C للحفاظ على المحلول تحت الظروف الفسيولوجية. اضبط درجة حرارة الملف الحلزوني (الشكل 1A (5)) عند 40 °C. يعوض هذا الإجراء فقدان درجة الحرارة في محلول نظام Langendorff.
    ملاحظة: إذا لم تكن درجة حرارة محلول Tyrode عند مخرج النظام فسيولوجية (37 ± 0.5 °C)، فقم بتعديل درجة حرارة جهاز إعادة تدوير الملف الحلزوني. لا يُنصح بالانتقال إلى الخطوة 6 حتى تستقر درجة الحرارة عند القيمة المناسبة.
  5. قم بتشغيل مراقب الضغط (الملف التكميلي 1، نظام المراقبة) وقم بمعايرته في نطاق 0–200 mmHg. يتوفر تطبيق المراقبة والتنظيم للمساعدة في معايرة النظام (الملف التكميلي 3 والملف التكميلي 11).
    ملاحظة: من الضروري التحقق من عدم وجود فقدان في الضغط وعدم وجود فقاعات في النظام. إذا كان النظام يحتوي على فقاعات، فقم بسد المخرج السفلي للملف الحلزوني مؤقتًا وافتح الصمام العلوي؛ سيؤدي ذلك إلى ملء العمود، مما يسمح بخروج الفقاعات إلى الخارج. لا يُنصح بالمضي قدمًا في التجربة حتى يتم التحقق من هذا الشرط.

5. النظام البصري14

  1. قم بتجميع كاميرا CMOS (الشكل 1A، 10)، وعدسة الكاميرا القابلة للتعديل (LC)، ونظام الإضاءة.
    ملاحظة: يتكون نظام الإضاءة من اثنين من مصابيح LED (الشكل 1A، 9)، وعدستين للإضاءة محدبتين مستويتين (LI)، ووحدة تحكم في الإضاءة (الشكل 1A، 11)، وبطاقة استحواذ (الملف التكميلي 1، نظام المراقبة)، وقطع دعم مصممة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 1).
  2. ضع جسماً مرجعياً بحجم 1,000 mm3 تقريباً على مسافة 100–200 mm من عدسة الكاميرا (مركز الشكل 1A).
    ملاحظة: يجب وضع الجسم في موقع القلب في نظام Langendorff. يمكن ملاحظة هذا الموقع في الشكل 1B، وتحديداً في مركز الصورة حيث تسقط حزم الضوء.
  3. قم بتشغيل برنامج استحواذ الكاميرا، ثم اضبط الكاميرا على أخذ عينات فرعية بمقدار 4x (4 بكسل = 1 بكسل فرعي). حدد منطقة اهتمام (ROI) بمساحة 200 x 200 بكسل فرعي (الملف التكميلي 2).
    ملاحظة: باستخدام هذا التكوين، يمكن تحقيق دقة زمنية تبلغ 750 إطاراً في الثانية (fps).
  4. قم بتشغيل نظام الإضاءة (الملف التكميلي 1)، واضبط حزم الضوء لتركيزها على الجسم المرجعي، وتحقيق إضاءة متجانسة (الشكل 1B).
  5. اضبط شدة الضوء على الجسم المرجعي لتجنب التعريض المفرط للصورة.
    ملاحظة: يجب أن تبدو الصورة مثل الشكل 2A (أو الشكل 1C، كمبيوتر التحكم). يجب تقليل الانعكاسات على سطح الجسم (القلب) قدر الإمكان دون فقدان دقة محيطه. يمكن القيام بذلك عن طريق ضبط طاقة وحدة التحكم في الإضاءة أو تقليل وقت التعريض في إعدادات الكاميرا.
  6. قم بضبط تركيز عدسة الكاميرا للحصول على صورة واضحة للجسم المرجعي (الشكل 1C، كمبيوتر التحكم). تأكد من أن الجسم المرجعي يشغل 80% من مجال الرؤية (الشكل 2A) للحصول على مقياس تحويل يبلغ 61 µm تقريباً لكل بكسل فرعي.
    ملاحظة: يقوم النظام البصري بتنشيط نظام الإضاءة تلقائياً عندما يتم ضبط الكاميرا على وضع الاستحواذ (الشكل 1A والملف التكميلي 2). يوصى بإبقاء الكاميرا في وضع الاستعداد بحيث يظل نظام الإضاءة مطفأً، ويتم تنشيطه فقط خلال فترات جمع البيانات التجريبية لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.

6. الإجراءات الجراحية وعمليات القسطرة

  1. الهبرنة والتخدير
    1. قم بتحضير خليط تخدير يحتوي على تيلتامين-زولازيبام (40 mg/kg من وزن جسم الفأر) وزيلازين (10 mg/kg من وزن جسم الفأر)، ثم خففه إلى 200 µL بمحلول ملحي.
    2. احقن خليط التخدير داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 G. اترك الفأر حتى يدخل في حالة تخدير عميق.
      ملاحظة: تحقق من غياب المنعكس استجابةً لمحفز في الأطراف أو الذيل (عادةً ما تكون 10 min كافية).
    3. احقن 200 UI من الهيبارين غير المجزأ داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 G وانتظر حوالي 5 min للمتابعة في التجربة.
  2. الاستخراج والقثطرة
    1. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري، وقم بإزالة الفراء والجلد من المنطقة الصدرية باستخدام مقص جراحي.
    2. أجرِ شقاً بطنياً أسفل الحجاب الحاجز، مع الحرص على الحفاظ على سلامته.
    3. تابع بإجراء شق مستعرض في الحجاب الحاجز ثم أجرِ بسرعة عملية فتح صدر صاعدة ثنائية الجانب عبر الأضلاع، ثم قم بإزالة الجدار الضلعي.
      ملاحظة: توخَّ الحذر لعدم إتلاف القلب. إذا تعرض القلب للخطر أو التلف أثناء الإجراء، يُوصى بعدم المتابعة في التجربة.
    4. أمسك التراكيب العلوية للقلب بلطف باستخدام ملاقط دقيقة، وهي القوس الأبهري والأوعية المجاورة. ارفعها بلطف لإجراء قطع من الأسفل وإلى الأعلى، وقم بإزالة القلب والرئتين معاً.
    5. انقل القلب بسرعة إلى طبق بتري يحتوي على 50 mL من محلول Tyrode عند درجة حرارة 4 °C لإجراء غسيل أولي.
      ملاحظة: منذ لحظة شق الحجاب الحاجز، سيبدأ الحيوان في المعاناة من ضائقة تنفسية؛ ومن هذه النقطة فصاعداً، هناك نافذة زمنية مدتها 60 s لتنفيذ الخطوات من 6.2.3 إلى 6.2.6. قد يؤدي تجاوز هذا الحد الزمني إلى حدوث تلف إسكيمي.
    6. قم بإزالة الرئتين والأنسجة الدهنية الزائدة للكشف عن القوس الأبهري باستخدام مجهر ستيريو ومقص دقيق.
      ملاحظة: عند تنظيف الأنسجة، تأكد من عدم تلف القوس الأبهري. إذا قُطع الأبهر أسفل الشريان الرأسي العضدي، ستكون القثطرة صعبة، مما قد يؤدي إلى تسرب الضغط.
    7. انقل القلب إلى قاعدة قثطرة مصنعة خصيصاً تحتوي على 50 mL من محلول Tyrode المنظم عند درجة حرارة 4 °C وأدخل الطرف الأبهري في القثطرة المصنعة خصيصاً من إبرة 20 G (Supplementary File 1).
      ملاحظة: احذر من إتلاف الصمام الأبهري. إذا تضرر الصمام، سيتورم القلب، ولن يتم غسل الدورة التاجية بشكل صحيح.
    8. اربط عقدتي قثطرة باستخدام خيط جراحي حريري 4/0: الأولى في المنخفض البعيد عن طرف القثطرة والثانية قبل الجذع الرأسي العضدي (Supplementary File 1).
    9. أضف محلول Tyrode ببطء باستخدام سرنجة 1 mL مملوءة بالمحلول المنظم في درجة حرارة الغرفة. تحقق من صفاء الأنسجة التاجية لتأكيد نجاح القثطرة.
    10. قم بإزالة الأنسجة الدهنية للسماح بالوصول إلى البطينين والأذينين.
      ملاحظة: تجنب تجاوز 5 min من القثطرة للحفاظ على حيوية القلب.
    11. انقل القلب إلى نظام Langendorff واتركه ليستقر لمدة 30 min.
      ملاحظة: يُوضع القلب في مركز النظام (Figure 1A,B)، معلقاً بشكل رأسي. عند تعليق القلب، توخَّ الحذر الشديد لمنع تكون فقاعات هواء. إذا حدث ذلك، سيرتفع الضغط فوق 140 mmHg، وسيبدأ القلب في التورم، ولن يعود صالحاً للاستخدام.
      ملاحظة: يكتمل تركيب نظام Langendorff عندما يظهر القلب استجابة مستقرة ميكانيكياً، وتردداً تذبذبياً طبيعياً يبلغ حوالي 360 نبضة في الدقيقة (BPM)، وضغط تروية يتراوح بين 60 و 110 mmHg.

7. بروتوكول تحديد السرعة والتسجيل المرئي

  1. حيوية القلب
    1. تحقق من أن الضغط التاجي يقع في النطاق 60–110 mmHg باستخدام مضخة تروية بمعدل 3 mL/min. إذا انخفض ضغط التروية التاجي إلى أقل من 60 mmHg، فزد معدل تدفق مضخة التروية قليلاً (سيؤدي الضغط المنخفض إلى جعل القلب شاحباً ورخواً). وعلى العكس من ذلك، إذا تجاوز الضغط 110 mmHg، فقلل معدل تدفق المضخة قليلاً (سيؤدي الضغط المفرط إلى تحفيز وذمة في الأنسجة وزيادة تدريجية في الضغط حتى يحدث توقف قلبي).
      ملاحظة: سيؤدي الحفاظ على ضغط التروية خارج النطاق الأمثل المذكور سابقاً لفترة طويلة إلى إضعاف حيوية القلب بشكل غير قابل للاسترجاع.
    2. ضع القلب في وضع أمامي بحيث يتم الحصول على رؤية أمامية كاملة في الكاميرا. اضبط الموضع بحيث يكون كلا الأذينين مرئيين في الكاميرا (الشكل 2A).
    3. ضع الأقطاب الكهربائية البلاتينية بلطف وبشكل سطحي على الجزء العلوي من الأذين الأيمن عند العقدة الناظمة. استخدم بث الكاميرا كدليل لإدخال الأقطاب الكهربائية في مجال الرؤية. ضع القطب بحيث لا يعيق الرؤية عن الأذين الأيمن. أثناء مراقبة العرض المباشر للكاميرا، قم بتقديم القطب الكهربائي ببطء حتى يلامس نسيج الأذين، مع الحرص على عدم ممارسة ضغط مفرط (مما قد يؤدي إلى تسطح الأذين الأيمن في الصورة).
      ملاحظة: إذا تم التنفيذ بشكل صحيح، فستشبه رؤية الكاميرا الشكل 2A.
    4. قم بتشغيل تطبيق المراقبة والتنظيم (الملف التكميلي 11) وقم بتشغيل بطاقة الاستحواذ (الشكل 1A (6)). اضبط قيم معاملات التحفيز: السعة عند 2 V، والتردد عند 420 و 540 و 720 نبضة في الدقيقة (PPM) مع نبضة مربعة بدورة عمل 7 ms (إدراج الشكل 2A).
    5. طبق تحفيزات الحيوية بدءاً من أدنى تردد، باستخدام مدة تحفيز تبلغ 20 s تليها فترة تعافي (وقت راحة) تبلغ 20 s بين الأحداث.
      ملاحظة: قم بتقييم حيوية القلب عبر مراقبة الكاميرا. إذا كان العضو يعمل وظيفياً من الناحية الفسيولوجية، فسيتم ملاحظة تزامن بين التحفيز المطبق والاستجابة القلبية، مصحوباً بتنسيق مناسب بين حجرات القلب. وعلى العكس من ذلك، فإن نقص الحيوية سيظهر من خلال فقدان التنسيق بين الحجرات أو من خلال الوجود الحصري لانقباضات أذينية معزولة.
    6. أغلق باب الغرفة لأن التجربة حساسة لضوء الغرفة والتقلبات الحرارية (الشكل 1C).
      ملاحظة: يجب أن يظل باب الغرفة مغلقاً خلال وقت التجربة. راقب حيوية القلب بواسطة الكاميرا وضغط التروية.
  2. تسجيل البيانات
    1. طبق بروتوكول التنظيم، والذي يتكون من سلاسل نبضات مربعة بمدة 30 s، تليها 30 s بدون إشارة. اضبط قيم معاملات التحفيز في كل سلسلة تنظيم: السعة عند 2 V، ودورة عمل 7 ms، والتردد في النطاق من 360 إلى 720 PPM.
      ملاحظة: يبدأ بروتوكول التنظيم عند 360 PPM ويزداد بمقدار 60 PPM عند كل نقطة زمنية (إدراج الشكل 2A).
    2. سجل مقاطع فيديو بشكل مستمر لديناميكيات المنظر الأمامي للقلب بتنسيق .avi باستخدام برنامج استحواذ الكاميرا (الملف التكميلي 2). قم بعمل تسجيل فيديو لمدة 20 s لكل سلسلة تنظيم. سجل المقطع الذي مدته 20 s والذي يبدأ بعد 5 s من التنظيم. يتوفر تسجيل خام ممثل في المقطع المرئي التكميلي 1.
      ملاحظة: يقوم الكمبيوتر بتسجيل سلسلة التنظيم المطبقة (.xls، الملف التكميلي 9) بالتزامن مع كل فيديو مسجل (.avi)، والتي يتم إنشاؤها بواسطة تطبيق المراقبة والتنظيم وبرنامج استحواذ الكاميرا، على التوالي (الملف التكميلي 2 و الملف التكميلي 3).
    3. تحقق من حيوية القلب من خلال مقارنة الفيديو الأول، المسجل قبل بدء بروتوكول التحفيز، مع الفيديو الثاني، المسجل بعد تطبيق البروتوكول (الشكل 2B).

8. تنظيف نظام لانجيندورف للتروية بعد التجربة

  1. قم بإزالة أقطاب التحفيز وأقطاب البلاتين الخاصة بتخطيط كهربائية القلب (ECG). قم بإزالة القلب من النظام وتصريف جميع محاليل Tyrode المتبقية.
  2. أغلق النظام البصري وأغلق صمام O2.
  3. اشطف النظام باستخدام 1 L من الماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 37 °C، ثم قم بتصريف النظام.
  4. كرر الخطوتين 2.4 و2.5.
  5. قم بإيقاف تشغيل جميع الأنظمة والمعدات.

9. معالجة الفيديو

  1. ابدأ باستيراد كل مقطع فيديو إلى برنامج حوسبة وتطبيق دالة تسوية الفيديو15.
  2. حدد منطقة اهتمام (ROI) تشمل منطقة القلب. قم بإجراء تجزئة للصورة لإزالة ضوضاء الخلفية، والأقطاب الكهربائية، والقنية (الملف التكميلي 4).
    ملاحظة: لاختيار منطقة الصورة المراد إزالتها بشكل صحيح، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  3. أجرِ تحليلاً للديناميكيات الميكانيكية العامة (الملف التكميلي 5). تظهر أمثلة على التباين والإشارات الداعمة في الشكل التكميلي S1، والشكل التكميلي S2، والشكل التكميلي S3.
    1. طبق مؤثرات مورفولوجية على كل إطار من إطارات الفيديو للكشف عن محيط القلب، ثم طبق خوارزمية ملء الإطار لإنشاء قناع15.
    2. احسب عدد البكسلات داخل المنطقة المجزأة في كل إطار، ثم قم بتسوية هذا العدد بقسمته على إجمالي عدد البكسلات في الصورة لإنتاج إشارة ديناميكية (مدرج في الشكل 2B و الشكل التكميلي S3).
    3. طبق مرشح Butterworth ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة بين 3 و 100 Hz على الإشارة التي تم الحصول عليها لكبت الضوضاء عالية التردد والتشوهات الناتجة عن تقطير التروية15.
    4. قم بتسوية الإشارات عبر جميع مقاطع الفيديو باستخدام القيم القصوى والدنيا المسجلة.
    5. حدد معدل ضربات القلب عن طريق حساب الفاصل الزمني بين قيمتين ذات سعة قصوى (IAA (s)) لكل إشارة ديناميكية ومحفزة.
    6. احصل على التردد بوحدة BPM باستخدام الصيغة التالية:
      figure-protocol-1
    7. أنشئ خرائط Poincaré من بيانات IAA لتوضيح التباين على الفترات القصيرة والطويلة16,17,18 (الشكل التكميلي S1 و الشكل التكميلي S2).
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات التفصيلية، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  4. أجرِ تحليلاً قطاعياً للديناميكيات الميكانيكية البطينية (الملف التكميلي 6).
    1. طبق عملية ثنائية الصورة. استخدم المؤثرات المورفولوجية لتحديد منطقة البطين، مع ضبطها لتتخذ هندسة إهليلجية دون المساس بمنطقة الاهتمام ROI15.
    2. قم بمطابقة أصغر شكل إهليلجي مع منطقة البطين في كل إطار. استخرج إحداثيات مجموعة من النقاط البعيدة في الإطار. استخدم مجموعة من 10–20 نقطة في كل طرف على طول محور Y (الشكل 3A). يتوفر مخرج تمثيلي لتقدير الشكل الإهليلجي في المقطع التكميلي 2.
    3. احسب القصر البطيني باعتباره متوسط المسافة بين النقاط الطرفية على طول محور Y في كل فيديو19.
    4. طبق مرشح Butterworth ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة بين 3 و 100 Hz على الإشارة التي تم الحصول عليها لكبت الضوضاء عالية التردد والتشوهات الناتجة عن تقطير التروية15.
    5. قم بتسوية إشارة القصر البطيني بالنسبة لجميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها لكل عملية تحفيز، واحسب معدل ضربات القلب والتأخير كما في الخطوات 9.3.5–9.3.6.
      ملاحظة: يتم الحصول على المعلمات، مثل مدة الدورة البطينية (DVE)، ومدة الاسترخاء (DVW)، والفاصل بين البطينين (IVV)، والسعة البطينية (VA) (الشكل 3A).
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات التفصيلية، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  5. أجرِ تحليلاً قطاعياً للديناميكيات الميكانيكية للأذينين (الملف التكميلي 7).
    1. استخدم منطقتي اهتمام (ROIs) لتحديد الأذينين (الشكل 3C).
    2. حلل كل أذين على حدة.
      1. استخدم المؤثرات المورفولوجية لتحديد الأذينين مع ضبطهما دون المساس بمنطقة الاهتمام ROI15. استخدم خوارزمية زيادة التباين لتحديد كل أذين20,21.
      2. طبق عملية ثنائية الصورة وقم بقياس عدد البكسلات التي تختلف عن الصفر لكل إطار للحصول على إشارة ديناميكية أذينية.
      3. طبق مرشح Butterworth ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة بين 3 و 100 Hz على الإشارات التي تم الحصول عليها لكبت الضوضاء عالية التردد والتشوهات الناتجة عن تقطير التروية15.
      4. احسب متوسط إشارتي الأذينين (الشكل 3D).
    3. قم بتسوية إشارة القصر الأذيني بالنسبة لجميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها لكل عملية تحفيز واحسب معدل ضربات القلب والتأخير كما في الخطوات 9.3.5–9.3.6.
      ملاحظة: يتم الحصول على المعلمات، مثل مدة الدورة الأذينية (DAE)، والفاصل الأذيني-الأذيني (IAT)، والسعة الأذينية (AA) (الشكل 3D). لمزيد من المعلومات التفصيلية، ارجع إلى الملف التكميلي 10.
  6. أجرِ تحليلاً كهروميكانيكياً13,22 (الملف التكميلي 8).
    1. قارن بيانات التحفيز بالإشارات الأذينية والبطينية (الشكل 3D).
    2. احسب زمن الانتشار في نظام التوصيل القلبي، للحصول على التأخير بين الأحداث الأذينية والبطينية (AVD)، مع اتخاذ المحفز المطبق كمرجع.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تُجرى تجارب الوظيفة الميكانيكية القلبية باستخدام جهاز لانغندورف (Langendorff)، كما هو موضح في الشكل 1أ (أعلى)تتيح أنظمة المراقبة والأنظمة البصرية تسجيل الفيديو عند تفعيل التحكم في الإضاءة، كما هو موضح في الشكل 1أ (أسفل). الشكل 1ج يوضح المنظر الخارجي للخزانة ذات التحكم الثرموستاتي، المصممة للحفاظ على القلب معزولاً عن التقلبات الحرارية والضوء المحيط. وكما هو موضح في الشكل 1بيتم وضع القلب المعزول كجسم مرجعي في الإعداد التجريبي الذي يتكون من جهاز Langendorff، ونظام بصري، وأنظمة تحفيز.

كما هو موضح في الشكل 2A، تم وضع القلب المعزول للحصول على عرض أمامي واضح للأذينين والبطينين تحت التروية الارتجاعية. وكان استخدام قاعدة التصريف (الملف التكميلي 1، نظام التصريف) ضروريًا لتخفيف آثار الحركة الناتجة عن تقطير سائل التروية ولتثبيت الإشارات المكتسبة. تكونت بروتوكولات التحفيز من سلاسل نبضية (2 V، 7 ms) بترددات تتراوح من 360 إلى 720 bpm، وتستغرق كل منها 30 s.

يقوم النظام البصري بتسجيل التغيرات في منطقة القلب (HA). وتسمح هذه الإشارة الديناميكية أيضاً بالحصول على الفاصل الزمني بين القمم (IAA) (المربع الداخلي في الشكل 2B). تم تقييم حيوية النموذج من خلال مقارنة متوسط معدل ضربات القلب قبل (Start) وبعد (End) بروتوكول التحفيز في مجموعة مكونة من n = 6 قلوب. ولم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط معدلات ضربات القلب (Start: 385 ± 38 BPM مقابل End: 372 ± 18 BPM، اختبار Student’s t-test P > 0.05)، مما يشير إلى أن الإجراء التجريبي لم يؤثر على الوظيفة القلبية (الشكل 2B).

يُظهر الشكل 2C استجابة التردد للقلب تجاه سبعة ترددات تحفيز مختلفة، مما يوضح وجود علاقة خطية واضحة2 (R2 = 0.98 ± 0.01, 1:1 mode). وتكون القيمة الدنيا لتنظيم ضربات القلب مقيدة بالخصائص الفسيولوجية للفأر (360 bpm)22,23. ويُظهر القلب المروى بطريقة Langendorff نمط تسرع القلب. وقد تم توضيح محفزات تنظيم ضربات القلب الممثلة والاستجابات المقابلة لها في الملحقات الخاصة بـ الشكل 2C.

بعد ذلك، ولتقييم ديناميكيات حجرات القلب، يتم تطبيق تقنيات تقسيم محددة. تم الحصول على معاملات القصر البطيني من التسجيلات البصرية (الشكل 3A). يوضح المربع الداخلي في الشكل 3A القصر البطيني المعياري. ومن هذه الإشارة الديناميكية، يتم الحصول على أربعة معاملات: سعة القصر البطيني (VA)، والفاصل الزمني بين الانقباضات البطينية (IVV)، ومدة الانقباض البطيني (DVE)، ومدة الارتخاء البطيني (DVW).

الشكل 3B يوضح سعة القصر البطيني لسبع قيم تنظيم ضربات القلب. تمثل الأعمدة الزرقاء هذه الدراسة. وتتوافق الأعمدة البرتقالية مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التسجيل auxotonic2. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA) متبوعًا باختبار Sidak. تزداد سعة القصر البطيني (VA) بشكل ملحوظ لقيم تنظيم الضربات الأعلى، 600 PPM و 660 PPM، على التوالي (P < 0.05*, P < 0.005**). VA (ref. 15 vs. 360 P > 0.05, ref. 15 vs. 420 P > 0.05, ref. 15 vs. 480 P > 0.05, ref. 15 vs. 540 P > 0.05, ref. 15 vs. 600 P < 0.005, ref. 15 vs. 660 P < 0.05, ref. 15 vs. 720 P > 0.05).

للحصول على منطقة الأذين، يتم تطبيق تقنيات تقسيم محددة (الشكل 3C). يتم تحديد منطقة اهتمام (ROI) في كل أذين. يوضح الشكل 3D متوسط الإشارة الأذينية وتقصير البطين. ومن هذه الإشارة الديناميكية، يتم الحصول على معيارين: السعة الأذينية (AA) والفاصل الزمني بين الانقباضات الأذينية (IAT). ومن خلال مقارنة الإشارات البطينية والأذينية، يتم الحصول على التأخير بين الأحداث الأذينية والبطينية (AVD).

figure-results-1
الشكل 1. الإعداد التجريبي لقلب Langendorff المعزول والنظام البصري المثبت في خزانة. (أ) مخطط تخطيطي لنظام تروية Langendorff الراجع ذو التدفق المستمر والمقترن بنظام بصري. يتضمن نظام Langendorff (في الأعلى): (1) خزان يحتوي على محلول Tyrode مؤكسج باستمرار. يتم الحفاظ على درجة حرارة سائل التروية عند 37 °C بواسطة (2) خزان حمام حراري و(5) معاد تدوير لولبي. (3) مضخة تروية تمعجية تضمن تدفقاً ثابتاً بمعدل 3 mL/min. (8) نظام تصريف لإزالة المحلول. (4) يعمل ملف التبريد كمبادل حراري ومصيدة للفقاعات في آن واحد. يتم التحكم في مراقبة الضغط وتطبيقات التحييز الكهربائي بواسطة (6) نظام المراقبة. يتضمن النظام البصري (في الأسفل) المزامنة بين (11) التحكم في الإضاءة، و(10) الكاميرا عالية السرعة المزودة بعدسة مركزية (telecentric lens)، ومصدرين للضوء (LEDs). تسمح عدسة الكاميرا بالتركيز اليدوي في نطاق يتراوح بين 100–200 mm. (9) صمامان ثنائيان باعثان للضوء (LEDs)، مقترنان بعدسة مستوية محدبة (LI)، يضيئان القلب بشكل متجانس. يتم تسجيل بيانات التحييز باستخدام تطبيق المراقبة والتحفيز (الملف التكميلي 11). (7) يتصل جهاز الكمبيوتر المتحكم بالكاميرا وتطبيق المراقبة والتحفيز لتسجيل البيانات (الفيديو والتحييز الكهربائي) في وقت واحد. (ب) عرض داخلي للخزانة. يظهر الموضع الرأسي للقلب من خلال الجسم المرجعي، مع توضيح العناصر الأخرى لجهاز Langendorff. (ج) عرض خارجي للخزانة. الخزانة معزولة حرارياً، وتعمل الجدران الداخلية والخارجية السوداء على تقليل الانعكاسات والضوء المحيط. يظهر الكمبيوتر الذي يشغل تطبيقات المراقبة واكتساب الفيديو. الاختصارات: LC = عدسة مركزية (telecentric lens)؛ LEDs = صمامات ثنائية باعثة للضوء؛ LI = عدسة إضاءة؛ PC = كمبيوتر شخصي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. تثبيت قلب الفأر والتحقق من صحة النظام البصري. (A) منظر أمامي للقلب يوضح الأذينين، والبطينين، وأقطاب التنظيم والـ ECG. تتوافق الصورة مع إطار عند تنظيم ضربات القلب بمعدل 420 bpm (Supplementary Movie 1). يوضح المربع الداخلي التنظيم المطبق. تم الحصول على الفيديو بين 5 و 25 من بروتوكول التحفيز. (B) اختبار حيوية القلب. تم تسجيل فيديوهين للحصول على تردد التذبذب، أحدهما قبل تطبيق بروتوكول التنظيم والآخر بعده. تم حساب تردد الاستجابة. تم تطبيق اختبار Student’s t-test (P > 0.05). الفرق بين المجموعات غير معنوي. البيانات معروضة كقيم متوسطة ± الانحراف المعياري (n = 6). يوضح المربع الداخلي منطقة القلب (HA) التي تم الحصول عليها من خطوة البروتوكول 9.3 والتنظيم المطبق. (C) استجابة معدل ضربات القلب للتنظيم المطبق. تشير الأشرطة الزرقاء إلى استجابة القلب لسبع قيم تنظيم (R2 = 0.98 ± 0.01). تتوافق الأشرطة البرتقالية مع البيانات التي أبلغ عنها Peña-Romo2. يوضح المربع الداخلي آثار الاستجابة النموذجية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام two-way ANOVA متبوعًا باختبار Sidak. الفرق بين المجموعات غير معنوي (P > 0.05). البيانات معروضة كقيم متوسطة ± الانحراف المعياري (n = 6). الاختصارات: ANOVA = تحليل التباين؛ BPM = نبضة في الدقيقة؛ ECG = تخطيط كهربائية القلب؛ HA = منطقة القلب؛ PPM = نبضة في الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. تحليل الاستجابة الميكانيكية للأذين والبطين. (A) التقصير البطيني. تتوافق الصورة مع إطار عند تحفيز بمعدل 420 bpm (Supplementary Movie 1). يسمح الشكل البيضاوي الأحمر بتقدير التقصير البطيني (VS) (Supplementary Movie 2). يتم حساب VS عن طريق حساب متوسط القيم القصوى والدنيا عبر مجموعة من 10–20 خطاً على طول المحور الرئيسي (NV؛ الخطوط البرتقالية). يظهر التقصير البطيني المعياري في الشكل المدرج. يمكن الحصول على مجموعة من المعلمات: مدة التقصير (DVE)، ومدة الارتخاء (DVW)، والفاصل الزمني بين الانقباضات البطينية (IVV)، وسعة التقصير البطيني (VA). (B) تظهر سعة الاستجابة القلبية، VA كدالة في التحفيز. تمثل الأشرطة الزرقاء هذه الدراسة. وتتوافق الأشرطة البرتقالية مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التسجيل الأوكسوتونية (auxotonic recording method)2. تم تطبيق تحليل إحصائي باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعاً باختبار Sidak. تزداد سعة التقصير البطيني (VA) بشكل ملحوظ عند قيم التحفيز الأعلى، 600 PPM و 660 PPM، على التوالي (P < 0.05*, P < 0.005**). (VA: المرجع 15 مقابل 360 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 420 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 480 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 540 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 600 P < 0.005، المرجع 15 مقابل 660 P < 0.05، المرجع 15 مقابل 720 P > 0.05). البيانات معروضة كقيم متوسطة ± الانحراف المعياري (n = 6). (C) تقسيم الأذين. تتوافق الصورة مع إطار عند تحفيز بمعدل 420 bpm (Supplementary Movie 1). توضح الصورة مناطق الاهتمام المطبقة على الأذين الأيمن (الدائرة الصفراء) والأذين الأيسر (الدائرة الزرقاء). يتم الحصول على الإشارة الميكانيكية الأذينية عن طريق حساب متوسط منطقتي الاهتمام (ROIs). (D) ديناميكيات الأذين والبطين. تظهر الاستجابات المعيارية لمتوسط مساحة الأذين (الخط الأسود)، والتقصير البطيني (الخط الأزرق)، والتحفيز (الخط الأحمر) عند 420 bpm. يمكن الحصول على مجموعة من المعلمات: الفاصل الزمني بين الانقباضات الأذينية (IAT)، ومتوسط السعة الأذينية (AA)، والتأخر الأذيني البطيني (AVD). الاختصارات: AA = السعة الأذينية؛ ANOVA = تحليل التباين؛ AVD = التأخر الأذيني البطيني؛ DVE = مدة التقصير البطيني؛ DVW = مدة الارتخاء البطيني؛ IAT = الفاصل الأذيني الأذيني؛ IVV = الفاصل بين البطينين؛ NV = عدد الخطوط البطينية؛ PPM = نبضة في الدقيقة؛ ROI = منطقة الاهتمام؛ VA = سعة التقصير البطيني؛ VS = التقصير البطيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو التكميلي 1. فيديو تحت تحفيز 420 PPM. تسجيل لقلب فأر معزول تم التقاطه بدقة مكانية تبلغ 200 × 200 بكسل فرعي ودقة زمنية تبلغ 750 fps. الاختصارات: fps = إطار في الثانية؛ PPM = نبضة في الدقيقة.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 2. فيديو تمثيلي لتقدير الشكل البيضاوي لتقصير البطين. عرض لخوارزمية التجزئة باستخدام التسجيل من الفيديو التكميلي 1، والذي تمت إعادة أخذ عيناته بمعدل 75 fps. الاختصار: fps = إطار في الثانية.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1. تحليل التباين في فترات مساحة القلب. (A) الحالة الأساسية بدون تحفيز، (B) 360 PPM، (C) 420 PPM، و (D) 480 PPM. تم حساب التباين قصير المدى وطويل المدى على أنه التشتت بالنسبة لمتوسط البيانات، كما هو موضح في الشكل البيضاوي الأحمر. الاختصارات: IAA = فترة مساحة القلب؛ PPM = نبضة في الدقيقة؛ SD1 = التباين قصير المدى؛ SD2 = التباين طويل المدى.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2. تحليل التباين لفترات مساحة القلب. (A) 540 PPM، و(B) 600 PPM، و(C) 660 PPM، و(D) 720 PPM. تم حساب التباين قصير المدى وطويل المدى على أنه التشتت بالنسبة لمتوسط البيانات، كما يشير الشكل البيضاوي الأحمر. الاختصارات: IAA = فترة مساحة القلب؛ PPM = نبضة في الدقيقة؛ SD1 = التباين قصير المدى؛ SD2 = التباين طويل المدى.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3. رسم بياني زمني للإشارات المعيرة المستمدة من ديناميكيات الانقباض. كان التحفيز المطبق 420 PPM (باللون الأحمر)، وتشمل الاستجابات مساحة القلب الكلية (باللون الأسود)، وتقصير البطين (باللون الأزرق)، وديناميكيات مساحة الأذين (باللون الأصفر). الاختصار: PPM = نبضة في الدقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملفات التكميلية 1–11. الخوارزميات والوثائق التقنية. مجلد مضغوط يحتوي على: 1) صور ومواصفات الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد. 2) أدلة تفصيلية لبرنامج الحصول على الصور بالكاميرا. 3) أدلة تفصيلية لتطبيقات المراقبة والتنظيم. 4) برنامج حاسوبي لمعايرة وتقسيم الفيديو (الخطوات 9.1–9.2). 5) برنامج حاسوبي لحساب الميكانيكا العامة للقلب (الخطوة 9.3). 6) برنامج حاسوبي للحساب المجزأ لميكانيكا البطين (الخطوة 9.4). 7) برنامج حاسوبي لتقسيم ميكانيكا الأذينين (الخطوة 9.5). 8) برنامج حاسوبي لحساب التأخير الأذيني البطيني (الخطوة 9.6). 9) التنظيم الكهربائي المطبق على الفيديو التكميلي 1. 10) دليل تفصيلي حول تشغيل البرامج الحاسوبية (الملفات 4–7). 11) تطبيق المراقبة والتنظيم. بالإضافة إلى ذلك، هناك خمس وظائف خارجية (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) مطلوبة لتشغيل البرامج الحاسوبية.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتسم قلب الفأر بحساسية شديدة للتغيرات في درجات الحرارة2,9,10,11,22. وفي هذه التجربة، تم وضع القلب المروي في وضع رأسي. وقد أدخلنا تعديلاً طفيفاً للحد من فقدان درجة حرارة سائل التروية وتقليل التداخلات الحركية في طريقة تروية لانجندورف (Langendorff perfusion method). حيث تمت إضافة مضخة إعادة تدوير إلى الأنبوب المتعرج لتقليل فقدان درجة حرارة سائل التروية عند 37 ± 0.5 °C، كما تمت إضافة قاعدة تصريف لتقليل التداخلات الحركية. علاوة على ذلك، تم استخدام كابينة معزولة حرارياً مجهزة بنظام بصري ومصدرين للضوء من نوع LED بقوة إضاءة قابلة للتعديل، موضوعين على الجانبين لإشعاع الأنسجة القلبية بشكل موحد، كما هو موضح في الشكل 1.

لبحث مدى جدوى التركيب التجريبي، أُجريت مجموعة من التجارب لتتبع التغيرات في مساحة القلب تحت ظروف تنظيم ضربات مختلفة. وتم الحصول على نطاق تزامن بين التنظيم والاستجابة الترددية للقلب، وهو ما يتوافق مع منطقة التزامن التي أوردها Peña-Romo2، والذي استخدم طريقة التسجيل auxotonic8. ويمكننا الاستنتاج بأن الإعداد التجريبي البصري كافٍ لدعم المزيد من الدراسات التجريبية حول تقصر البطين (الشكل 2).

لقد بحثنا بشكل أكبر فيما إذا كانت إشارات تقصير البطين وديناميكيات مساحة الأذين تتيح تحليل الاقتران الكهروميكانيكي للقلب. تسمح الإشارات البطينية والأذينية بتحديد مدة التأخير في الانقباض الأذيني البطيني (AVD). وعند تردد تحفيز قدره 420 PPM، تم الحصول على قيمة 53 ± 14 ms (المتوسط ± الانحراف المعياري). تتفق هذه النتيجة مع نتائج VanderBrink24، الذي سجل فترة PR قدرها 44 ± 6 ms تم قياسها بواسطة تخطيط كهربائية القلب (ECG).

تتضمن هذه الطريقة أيضاً بعض القيود؛ حيث يمكن أن تعود عدم الدقة في التأخير الأذيني البطيني مقارنة بتقنيات ECG، وسعة البطين مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها من طريقة التسجيل auxotonic، كما هو موضح في الشكل 3B، إلى آثار حركية خارجية.

تساهم هذه الطريقة في تقييم القدرة التقلصية ومعدل ضربات القلب دون تأثيرات دوائية أو جهازية في قلب معزول سليم. وتوضح هذه النتائج أن النظام البصري يسمح بقياس استجابات تقاصر البطينين والأذينين في القلب، مما يبرز فائدته في دراسات عدم انتظام ضربات القلب التي تؤثر على التنسيق الأذيني البطيني أو لتقييم التأثيرات الدوائية.

توجد لهذه الطريقة أيضاً بعض القيود. أولاً، ونظراً لأنها تقريب ثنائي الأبعاد (2D)، فمن غير الممكن قياس قوة الانقباض كما هو الحال في طريقة auxotonic. كما تساهم هذه الطريقة في تقليل الشوائب الحركية الناتجة عن قطرات المحلول والتحكم في درجة حرارته. ثانياً، تؤثر الفروق بين الجنسين في نماذج الفئران بشكل كبير على صحة الأبحاث الطبية الحيوية وقابلية تكرارها وسلامتها. وتاريخياً، فضل الباحثون بشكل كبير الفئران الذكور لتجنب التباين في البيانات الناتج عن دورات الشبق لدى الإناث، وهو افتراض ثبت لاحقاً أنه غير صحيح إلى حد كبير25,26. وبناءً على نوع الدراسة، يمكن تطبيق هذا البروتوكول في الدراسات التي تشمل الفئران الذكور أو الإناث.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منحة سكرتارية العلوم والعلوم الإنسانية والتكنولوجيا والابتكار (SECIHTI) الممولة تحت رقم LN-2025-C-23.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سرنجة 1 mLBD Plastipak302485إجراء جراحي
إبرة 20 GNIPROAH-2032قنية أبهريّة
عدسة قابلة للتعديل 25 mm بتكبير 8x-100xGenericN/Aعدسة كاميرا النظام البصري؛ أشير إليها بشكل عام كعدسة كاميرا قابلة للتعديل
إبرة 27 GBD PrecisionGlide302358إجراء جراحي
قطع دعم مصممة ثلاثية الأبعادCINVESTAVN/Aقطع دعم مخصصة مصممة ثلاثية الأبعاد
خياطة حريرية 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901قنية أبهريّة
مزود طاقة 40-ASTERENPRL-25مزود طاقة LED
حجر هواءN/AN/Aأكسجة محلول تايرود
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306محلول تايرود
D-GlucoseJ.T. Baker1916-01محلول تايرود
مضخة تصريفCINVESTAVN/Aمضخة تصريف مخصصة؛ أشير إليها بشكل عام كمضخة تصريف
عدسة مستوية محدبة، F = 25.4 mmTHORLABSLA1951-Aعدسة إضاءة النظام البصري؛ أشير إليها بشكل عام كعدسة إضاءة مستوية محدبة
حمض الأسيتيك الثلجيSigma-Aldrich695092تنظيف نظام لانجندورف
هيبارينPiSA060M91مضاد للتخثر
HEPESSigma-AldrichH3375محلول تايرود
مصابيح LED عالية الطاقةLuminiusCBT-90-G-L11-C12مصدر ضوء LED
نظام إضاءةCINVESTAVN/Aنظام إضاءة مخصص؛ أشير إليه بشكل عام كنظام إضاءة
KClCTR SCIENTIFICCTR02196محلول تايرود
برنامج LabVIEW إصدار 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aبرنامج مستخدم لتشغيل تطبيق المراقبة والتحفيز؛ أشير إليه بشكل عام كتطبيق المراقبة والتحفيز
برنامج MATLABThe MathWorksN/Aبرنامج حاسوبي لبرامج تسوية الفيديو وتقسيمه وتحليله؛ أشير إليه بشكل عام كبرنامج حاسوبي
أكسجين طبيGRUPO INFRAN/Aأكسجة محلول تايرود
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104محلول تايرود
مضخة صغيرة متغيرة التدفقCONTROL COMPANY3385مضخة تروية
طقم جراحة للفئرانKent ScientificINSMOUSEKITإجراء جراحي
NaClSigma-AldrichS5886محلول تايرود
NaH2PO4DEQDEQF290400250محلول تايرود
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108ضبط pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01بطاقة استحواذ
أقطاب بلاتينية، قطر 0.25 mmSigma-Aldrich349402أقطاب تحفيز كهربائي
مزود طاقة (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Aمزود طاقة لإعادة التدوير
جهاز مراقبة الضغطCINVESTAVN/Aجهاز مراقبة ضغط مخصص؛ أشير إليه بشكل عام كجهاز مراقبة الضغط
محول طاقة الضغطLA BOUVETB17295جهاز مراقبة الضغط لنظام لانجندورف
كحول إيثيلي نقيSigma-Aldrich493511إيثانول لتنظيف النظام
حمام حراري لإعادة التدوير (LXC)PolyScienceL113A0412جهاز إعادة تدوير الخزان
محلول ملحيPiSA111848محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) بتركيز 0.9%
حمام حراري لولبيCINVESTAVN/Aجهاز إعادة تدوير/حمام حراري لولبي مخصص
مجهر ستيريوN/AN/Aإجراء جراحي
إضاءة مجهر ستيريوN/AN/Aإجراء جراحي
برنامج uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Aبرنامج استحواذ الكاميرا؛ أشير إليه بشكل عام كبرنامج استحواذ الكاميرا
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624كاميرا CMOS عالية السرعة؛ أشير إليها بشكل عام ككاميرا CMOS
زايلزينPiSA4001211مخدر
Zoletil 100Virbac83048907مخدر تيلتامين-زولازيبام؛ أشير إليه بشكل عام كمزيج مخدر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة