يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

يثبط ليوي ديهوانغ وان تكوين العظم العضلي وفقدان العظم الناتج عن استئصال المبيض من خلال تثبيط إشارات NF-κB

107 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72270

⸱

يوليو 28, 2026

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

أظهرت هذه الدراسة أن ليوي ديهوانغ وان (LWDHW) يثبط تمايز الخلايا العظمية وفقدان العظم الناتج عن استئصال المبيض من خلال تثبيط مسار إشارات NF-κB، كما يتضح من خلال تحليل LC-MS/MS، وعلم الأدوية الشبكي، والتحقق في الجسم الحي.

الملخص

ليوي ديهوانغ وان (LWDHW)، وهي تركيبة كلاسيكية للطب الصيني التقليدي، تستخدم على نطاق واسع لعلاج مختلف الأمراض المرتبطة بنقص الكلى وأظهرت فعالية سريرية مرضية في هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (PMOP). ومع ذلك، لا تزال آلياته الدوائية غير واضحة. لمعالجة ذلك، قمنا أولا بتحليل المكونات الكيميائية ل LWDHW باستخدام LC-MS/MS، الذي حدد 1,615 مكونا. ثم تنبأت الدواء الشبكي بأن الالتهاب ومسار إشارة NF-κB هما آليات علاجية محتملة تكمن وراء تأثيرات LWDHW على PMOP. لاحقا، تم تعيين 27 فأرا أنثى من نوع C57BL/6J بشكل عشوائي إلى مجموعات الشام، والنموذج، وLWDHW. خضعت الفئران في المجموعتين الأخيرتين لاستئصال المبيض الثنائي (OVX)، وتلقت الفئران في مجموعة LWDHW استئصال LWDHW الفموي بجرعة 9.75 جرام/كغ/يوم لمدة 8 أسابيع. تم جمع عينات من المصل وعظم الفخذ لإجراء اختبار الأشعة المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA)، والتصوير المقطعي الدقيق المحوسب (μCT)، والفحص النسيجي، والكيمياء المناعية (IHC). تمت معالجة البلعم المشتقة من نخاع العظم الأولية (BMMs) ب LWDHW ثم خضعت لتلوين TRAP وqRT-PCR. في فئران OVX، خفف LWDHW بشكل كبير من فقدان العظام وتدهور البنية الدقيقة العظمية، مصحوبا بانخفاض مستويات β-CTX في المصل وانخفاض أعداد العظميات في الأنسجة الفخذية. أظهر تلوين IHC عن تعبير أقل ملحوظا ل TNF-α وIL-1β وp-P65 في أنسجة الفخذ للفئران المعالجة ب LWDHW مقارنة بمجموعة النموذج. في المختبر، أظهر التلوين بتقنية TRAP أن LWDHW يثبط تمايز الخلايا العظمية الناجم عن RANKL/M-CSF في BMMs ويقلل من تعبير Ctsk وMMP9 وNfatc1. أظهر تحليل ويسترن بلوت أيضا أن مستويات البروتين في P65 وp-P65 وIκBα وp-IκBα انخفضت بشكل ملحوظ في BMMs بعد علاج LWDHW. بشكل جماعي، يخفف LWDHW من هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، ربما عن طريق تثبيط تكوين العظم الذي يعبر عن إشارات NF-κB.

المقدمة

هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (PMOP) هي مرض عظمي أيضي شائع يتميز بفقدان كتلة العظم وتدهور البنية الدقيقةالعظمية 1. مع تزايد شيخوخة السكان، أصبح تزايد معدل PMOP قضية صحية عامة عالمية تهدد بشكل خطير صحة النساء بعد انقطاع الطمث2. في الصين، يبلغ انتشار PMOP الإجمالي 32.1٪3. الأشخاص المصابون أكثر عرضة للمضاعفات الشديدة مثل آلام الظهر المزمنة، وتشوهات العمود الفقري، وكسور الهشاشة4،5. حاليا، تشمل الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء لهشاشة العظام بيسفوسفونات6، وهرمون الغدة الجار درقية6 7 ودينوسوماب8، وهي أدوية تستخدم على نطاق واسع في الممارسة السريرية. ومع ذلك، غالبا ما يكون تطبيقها طويل الأمد محدودا بسبب آثار جانبية مختلفة.9. لذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير عوامل علاجية أكثر أمانا وفعالية ل PMOP. من بين البدائل المحتملة، حظيت الأدوية العشبية الصينية باهتمام متزايد بسبب فعاليتها المعترف بها وملف سلامتها الإيجابي.10.

ليوي ديهوانغ وان (LWDHW) هو صيغة كلاسيكية في الطب الصيني التقليدي (TCM)، تم توثيقها لأول مرة في النص القديم "مفتاح علاج أمراض الأطفال خلال عهد أسرة سونغ". على مدى آلاف السنين، استخدم LWDHW على نطاق واسع في الممارسة السريرية لعلاج أمراض مختلفة تنسب إلى نقص الكلى 11,12,13,14. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي (TCM حول "تحكم العظام الكلى"، فإن فقدان كتلة العظم وتدهور العظام لدى مرضى PMOP ناتجان بشكل أساسي عن نقص التغذية من جوهر الكلى15. وبالتالي، يستخدم LWDHW بشكل شائع في الإدارة السريرية ل PMOP وقد أظهر فعالية علاجية واضحة16,17. ومع ذلك، وعلى الرغم من أن الدراسات الحيوانية والسريرية كشفت أن LWDHW له تأثيرات دوائية متعددة، بما في ذلك مضاد الأكسدة18، ومضاد الالتهابات19، ومضاد للألياف14، إلا أن آليته الأساسية ضد PMOP لا تزال مجهولة إلى حد كبير.

يعتمد توازن العظم على التوازن بين امتصاص العظم بواسطة الخلايا العظمية وتكوين العظم بواسطة الخلايا العظمية20. يتعطل هذا التوازن مع تحسن تمايز ونشاط العظم في الظروف الالتهابية، مما يؤدي إلى تسارع امتصاص العظام. في هذه العملية، يعمل مسار NF-κB كمنظم أساسي. يمكن للعوامل الالتهابية مثل TNF-α وIL-1β أن تحفز الفسفرة وتحلل IκBα، مما يؤدي إلى انتقال نووي لفطر p65 (p-P65)22. وبالتالي، يتم تنشيط جينات خاصة بالعظام في المراحل اللاحقة، بما في ذلك Ctsk وMmp9 وNfatc1، لتعزيز تكوين العظم23,24.

علم الأدوية الشبكي هو مجال متعدد التخصصات يجمع بين علوم الحاسب، علم الأدوية، والمعلوماتية الحيوية25. يظهر مزايا واضحة في استكشاف الآليات الدوائية الكامنة وراء التأثيرات العلاجية للأعشاب الصينية بشكل شامل.26. في هذه الدراسة، تم استخدام علم الأدوية الشبكي للتنبؤ بالعمليات البيولوجية المحتملة ومسارات الإشارات المرتبطة بالتأثيرات المضادة للهشاشة العظمية ل LWDHW. في الوقت نفسه، تم تحليل المكونات الكيميائية ل LWDHW باستخدام LC-MS/MS. علاوة على ذلك، أجريت التحقق الداخلي باستخدام نموذج فأر OVX وتجارب في المختبر مع البلعم المشتقة من نخاع العظم الأولي (BMMs) لدراسة الآلية الدوائية ل LWDHW ضد PMOP. يتم عرض سير العمل في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة تشجيانغ الطبية الصينية (IACUC-202402-07).

تحضير وتحليل LC-MS/MS ل LWDHW

تتكون صيغة LWDHW من ستة أعشاب صينية: Rehmannia glutinosa (Gaertn.)، Cornus officinalis (Sieb.)، Paeonia suffruticosa (أندر.)، Dioscoreae مقابل (Thunb.)، Poria cocos (Schw.)، وأليسما أورينتال (Sam.). المعلومات التفصيلية عن هذه الأعشاب مدرجة في الجدول 1. تم تزويد جميع الأعشاب الخام من قبل المستشفى الأول التابع لجامعة تشجيانغ الطبية الصينية (هانغتشو، الصين) وغليت في ماء منقى بنسبة الأعشاب إلى الماء 0.1 كجم/لتر. تم ترشيح المستخلص المائي الناتج وتركيزه إلى محلول يعمل بقوة 0.5 جرام/ملتر لإجراء تحليل لاحق لاختبار LC-MS/MS والتجارب الحيوانية. علاوة على ذلك، تم معالجة المحلول العامل إلى مسحوق مجفف بالتجميد لتجارب الخلايا.

في تحليل LC-MS/MS، كانت ظروف الكروماتوغرافيا السائلة كما يلي: الطور المحمول A (المائي) والطور المحمول B (عضوي) يتكونان من 0.1٪ حمض الفورميك في الماء والأسيتونيتريل على التوالي لوضع الأيون الموجب، أو 5 ملليمول فورمات أمونيوم في الماء والأسيتونيتريل على التوالي لوضع الأيون السالب. كان إجمالي مدة التشغيل 8 دقائق، مع معدل تدفق 0.3 مل/دقيقة، ودرجة حرارة عمود 40 درجة مئوية، وحجم حقن 2 ميكرولتر. في مطيافية الكتلة، تم جمع البيانات في وضع MS-ddMS2 الكامل، مع جهود رش عند +3.50 كيلوفولت (موجب) و–2.50 كيلوفولت (سالب).

المكونات الحيوية النشطة والأهداف التنبؤ ب LWDHW

تم إدخال أسماء الأعشاب المكونة الستة في قاعدة بيانات علم الأدوية لنظام الطب الصيني التقليدي (TCMSP) للحصول على القائمة الكاملة لمكونات LWDHW. تم فحص المكونات النشطة الحيوية لاحقا باستخدام المعايير الدوائية الحراكية (OB) ≥ 30٪ ونسبة التشابه الدوائي (DL) ≥ 0.18،27، 28، 29، 30. تم تحديد البروتينات المقابلة للمكونات النشطة حيويا وتقديمها إلى UniProt لاسترجاع أسماء جيناتها الموحدة، والتي عرفت كأهداف جينية نهائية ل LWDHW.

أهداف متداخلة بين LWDHW وPMOP

تم استرجاع الأهداف الجينية المرتبطة ب PMOP من خلال البحث عن الكلمة المفتاحية "هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث" في كل من قواعد بيانات GeneCards وDisGeNET في 2 أكتوبر 2024. تم تصفية الأهداف باستخدام عتبات الدرجات >0.1 في DisGeNET و>10 في بطاقات الجينات، وتمت إزالة مدخلات مكررة للحصول على مجموعة غير مكررة من الجينات المرتبطة ب PMOP. لاحقا، تم استيراد الأهداف المشتقة من الأعشاب ل LWDHW والأهداف المرتبطة بها إلى أداة فيني الإلكترونية لإنشاء مخطط فين يصور الأهداف المتداخلة بين LWDHW وPMOP.

تحليل أنطولوجيا الجينات (GO) وتحليل إثراء مسارات الإشارات

كانت الأهداف المتداخلة بين LWDHW وPMOP خاضعة لتحليل إثراء GO باستخدام قاعدة بيانات DAVID. تم تصنيف مصطلحات GO المسترجعة إلى ثلاث فئات، تشمل المكون الخلوي، والوظيفة الجزيئية، والعملية البيولوجية (BP). بعد تصفية FDR < 0.01، تم سرد أعلى 30 مدة من BP في مخطط فقاعي بترتيب تنازلي من حيث تخصيب الطية.

بعد ذلك، تم إدخال الأهداف المتداخلة في قاعدة بيانات موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) وقاعدة بيانات ميتاسكيب لتحليل إثراء مسارات الإشارات. تم ترتيب المسارات المثرية من قواعد بيانات KEGG وMetascape حسب عدد الأهداف المقابلة بالترتيب التنازلي، وتم عرض أفضل 25 مسارا من كل قاعدة بيانات كمخططات شريطية.

بناء الشبكة

تم إنشاء شبكتي "الحليب والأعشاب والمكونات والأهداف والمرض" و"الأهداف والمسارات" في سايتوسكيب لتصوير العلاقات المتبادلة بين المكونات. تم إنشاء شبكة تفاعل بروتين (PPI) عن طريق إدخال الأهداف المتداخلة في قاعدة بيانات STRING. تم تحديد أهداف المركز داخل الشبكة من خلال الفحص بناء على الميزات الطوبولوجية، بما في ذلك مركزية الدرجة (DC)، مركزية المسافة (BC)، ومركزية القرب (CC).

تجميع الحيوانات، نموذج هشاشة العظام الناتجة عن OVX والتدخل الدوائي

تم توفير ما مجموعه 27 فأرا أنثى C57BL/6J (عمرها شهران، وزنها 22 ± 2 جم) من قبل مركز تجارب الحيوانات في جامعة تشجيانغ الطبية الصينية (هانغتشو، تشجيانغ). تم إيواء جميع الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة، ودرجة حرارة محيطة عند 25 درجة مئوية، ورطوبة بين 40٪ و60٪، مع وصول مجاني إلى الطعام والماء. بعد أسبوع من التغذية التكيفية، تم توزيع الفئران عشوائيا إلى ثلاث مجموعات (n = 9 لكل مجموعة) باستخدام جدول أرقام عشوائي: الوهم، النموذج، وLWDHW. خضعت الفئران في مجموعتي النموذج وLWDHW لاستئصال المبيض الثنائي (OVX) لتأسيس نموذج PMOP، بينما خضعت مجموعة شام لإجراء وهمي يتضمن استئصال حجم مكافئ من نسيج الدهون في الظواهر. ابتداء من يومين من الجراحة، تلقت فئران مجموعة LWDHW تجويف يومي من محلول LWDHW العامل بجرعة 9.75 جرام/كجم/يوم (محولة من الجرعة المكافئة البشرية بناء على مساحة سطح الجسم)، بينما حصلت مجموعتا النموذج والشامي على حجم متساو من المحلول الملحي. تم جمع عينات بيولوجية، بما في ذلك أنسجة المصل وعظم الفخذ، بعد 8 أسابيع من الإعطاء للتحليل اللاحق. لم يحدث أي وفاة أو وفاة غير متوقعة في أي من المجموعات طوال فترة التجارب.

اختبار إنزيم المناعة المرتبط بالإنزيم في الدم (ELISA)

تم جمع الدم الكامل من الضفيرة الرجعية الحجاجية وتم طرد مركزه بحرارة 1000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على المصل. تم قياس تركيزات الأوستيوكالسين (OCN) والتيلوببتيد الطرفي β-C من الكولاجين من النوع الأول (β-CTX) في المصل باستخدام مجموعات ELISA المقابلة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.

ميكرو مقطعي الميكرو والتحليل الميكانيكي الحيوي

تم مسح عينات الفخذ باستخدام جهاز تصوير مقطعي دقيق محوسوب عالي الدقة (μCT) بدقة متساوية الخواص تبلغ 10 ميكرومتر. تم إعادة بناء البنية المجهرية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لفخذ الفخذ البعيد من الصور التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج NRecon. لاحقا، تم قياس معايير البنية العظمية المجهرية التالية، بما في ذلك كثافة المعادن العظمية (BMD، g/mm3)، نسبة حجم العظم (BV/TV، ٪)، سمك الترابيكولار (Tb.Th، مم)، وعدد الترابيكولار (Tb.N، 1/مم)، ضمن منطقة الاهتمام (ROI) من عظم الفخذ البعيد.

تم تقييم الخصائص البيوميكانيكية لعينات الفخذ (n = 3 لكل مجموعة) من خلال اختبار انحناء ثلاثي النقاط باستخدام نظام اختبار الإجهاد المحوري. تم تطبيق حمل ضغط على منتصف السحب بمعدل إزاحة ثابت يبلغ 2 مم/دقيقة حتى فشل هيكلي. كان الحد الأقصى للحمل (N) يسجل تلقائيا بواسطة برنامج النظام.

الشكل النسيجي، الكيمياء المناعية النسيجية (IHC)، والتلوين الفلوري المناعي (IF)

بعد التثبيت ب 4٪ بارافورمالديهيد، وإزالة الكالسية في محلول EDTA بنسبة 14٪، والتجفاف عبر سلسلة إيثانول متدرجة، تمت معالجة عينات الفخذ إلى مقاطع بارافين بسماكة 3 ميكرومتر كما هو موضح سابقا31. تم صبغ الأقسام بهيماتوكسيلين أزرق ألسي (ABH)/Orange G للتقييم الشملي. تم إجراء تحليل كمي لمنطقة العظم الترابيكولار في الميتافيزيس الفخذي البعيد باستخدام برنامج OsteoMetrics.

تم تثبيت عينات الكبد والكلى، ودمج البارفين، وقطعها إلى أقسام بحجم 4 ميكرومتر. بعد إزالة البارافين الروتينية وإعادة الترطيب، تم صبغ الأقسام بالهيماتوكسيلين والإيوزين. تم إجراء الفحص النسيجي تحت المجهر الضوئي.

تم إجراء اختبارات IHC وIF على مقاطع مدمجة بالبارافين وفقا للإجراءات المعتمدة. باختصار، تم استرجاع المستضدات عن طريق حضنة أقسام في حاجز سترات بعمق 0.01 متر عند 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. ثم تم حضن الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية بما في ذلك ALP (1:300)، IL-1β (1:500)، TNF-α (1:500)، وp-P65 (1:300). بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 20 دقيقة، تم تعريض الأقسام لمحلول دامينوبينزيدين (DAB) وصبغ مضاد بالهيماتوكسيلين لعلاج IHC أو صبغت ب DAPI لوضع وسم نووي في الصيام المتقطع. لقياس التلوين الإيجابي، تم التقاط أربعة حقول مختارة عشوائيا من كل من ثلاثة أقسام أنسجة لكل عينة. في التلوين بتقنية IHC، تم تعريف متوسط الكثافة البصرية بأنه نسبة الكثافة البصرية المتكاملة (IOD) إلى مساحة التجويف المقابلة، كما يتم تحديدها باستخدام برنامج Image-Pro Plus. في التلوين المتساوي (IF)، تم تطبيع مساحة التلوين الإيجابية على مساحة الحقل والتعبير عنها كنسبة مئوية، وتم إجراء القياس باستخدام نفس البرنامج.

اختبار زراعة وفحص عد الخلايا لزراعة البلاعم أولية نخاع العظم (BMMs)

تم طرد خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ والساق لفئران C57BL/6 التي تبلغ من العمر شهرين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تم ترشيح تعليق الخلية الناتج عبر مصفاة بحجم 70 ميكرومتر وتم طرد مركزه عند 200 × g لمدة 5 دقائق. تم إعادة تعليق الحبيبة الخلوية في وسط كامل α-MEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي بنسبة 5٪ CO، تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة. لتحفيز تمايز البلعميات، تم زراعة الخلايا الملتصقة في وسط يحتوي على عامل تحفيز مستعمرة البلاعم 50 نانوغرام/مل (M-CSF) و40 نانوغرام/مل RANKL لمدة 5–7 أيام حتى تم ملاحظة BMMs الناضجة.

تم طلاء أجهزة BMM بحجم 3 × 104 خلايا/بئر في صفائح بسعة 96 بئرا. بعد 24 ساعة من المعالجة بتركيزات تدرج من LWDHW، تم حضنة BMMs بمحلول عمل 10٪ Cell Counting Kit-8 (CCK-8) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم قياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوبلايت.

التحليل الكمي للتعبير الجيني على BMMs الأولية

تم زرع الميكروبات الميدانية في أطباق بحجم 6 سم بكثافة 3 × 10خلايا في كل طبق. بعد المعالجة بجرعات 500 و1000 ميكروغرام/مل LWDHW لمدة 24 ساعة، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من وحدات BMM باستخدام مجموعة التنقية السريعة RNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد القياس الكمية بواسطة القياس الطيفي الضوئي (spectrophotome)، تم نسخ 500 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA. تم إجراء عملية PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) باستخدام بادئات جينية محددة (الجدول 2)، وكانت ظروف دورة PCR كما يلي: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 °م لمدة 30 ثانية، تلتها 40 دورة بدرجة حرارة 95 °م لمدة 5 ثوان و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم تحليل مستويات التعبير الجيني باستخدام طريقة 2δδct ، مع GAPDH كجين مرجعي داخلي.

تحليل البلوت الغربي على BMMs الأولية

بعد أن تم تلوين 3 × 10 خلاياو6 خلايا في كل طبق في أطباق بحجم 6 سم، تم علاج الطب الحيوي بعدة تدخلات ثم تحلل على الثلج باستخدام محلول تحلل RIPA. تم جمع البروتين الكلي وقياسه باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA. تم فصل عينات البروتين (30 ميكروغرام لكل مسار) بواسطة SDS-PAGE على جل بولي أكريلاميد بنسبة 12.5٪ ونقلها إلى أغشية PVDF بحجم 0.2 ميكرومتر. بعد الحجب لمدة 20 دقيقة، تم حضان الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: P65 (1:1000)، p-P65 (1:1000)، IκBα (1:1000)، p-IκBα (1:1000)، و β-أكتين (1:1000). في اليوم التالي، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام مجموعة كشف الإضاءة الكيميائية ECL وتم التقاطها باستخدام نظام تحليل صور تلألؤ كيميائي تلقائي.

تلوين TRAP لأنسجة الفخذ وBMM

تم صبغ أقسام نسيج الفخذ ونماذج BMM المغطاة في ألواح 24 بئر بحجم 1 × 105 خلايا/بئر باستخدام مجموعة تلوين فوسفاتاز الحمض المقاوم للتارترات (TRAP) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم قياس سطح العظم الترابيكولوجي المغطى بالعقد العظمي (Oc.S/BS) في مقاطع الأنسجة ومنطقة تكوين العظم العظمي في مزارع BMM باستخدام برنامج Image-Pro Plus.

التحليل الإحصائي

تم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. تم استخدام تحليل جديد أحادي الاتجاه يليه اختبار دانيت للتحليل الإحصائي في SPSS. *p < 0.05 و **p < 0.01 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المكونات الكيميائية ل LWDHW تم تحليلها بواسطة LC-MS/MS

تم تمييز الملف الكيميائي للمحلول المائي LWDHW بتحليل LC-MS/MS. تم تحديد ما مجموعه 1615 مكونا، منها 968 تم اكتشافها في وضع التأين الإيجابي و647 في وضع التأين السلبي (الشكل 2A). تفاصيل أفضل 10 مكونات من كل وضع تأين مدرجة في الشكل 2B,C.

التنبؤ بالأهداف العلاجية ل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مع شيخوخة السكان العالميين، أصبح PMOP مصدر قلق صحي خطير عالمي، يؤثر على ملايين النساء سنويا36 عاما. نظرا للآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية الحالية المضادة لاستقطاع العظام، من الضروري تطوير استراتيجيات علاجية أكثر أمانا وفعالية. LWDHW هو تركيبة كلاسيكية لتقوية الكلى في الطب الصيني التقليدي وتعمل كعلاج بديل لعلاج أمراض العظام المختلفة37,38. أظهرت الأدلة السريرية فعاليته في زيادة كتلة العظم لدى مرضى PMOP

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود مصالح مالية أو غير مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعمت مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (ZCLQN25H2701) هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.01 M citrate bufferSolarbioC1010لإعادة استرجاع المستضد من مقاطع الفخذ لـ IHC و IF staining في خطوة البروتوكول 10
0.2 μm PVDF membranes BioRad1620177لنقل البروتينات بالكهرباء من SDS-PAGE إلى الغشاء في خطوة البروتوكول 13
12.5% polyacrylamide gelsEpizyme BiotechPG113لفصال البروتينات في SDS-PAGE في خطوة البروتوكول 13
ALP antibody ARIGOARG57422لكشف IHC في مقاطع الفخذ في خطوة البروتوكول 10
Automatic Chemiluminescence Image Analysis System Tanon 5200لرؤية فرق Western blot في خطوة البروتوكول 13
Axial-Torsion Fatigue Testing System Instronmodel 5569R1412لاختبار الخواص الميكانيكية لعينات الفخذ في خطوة البروتوكول 9
BCA Protein Assay KitBeyotimeP0010Sلتقدير كمية البروتين قبل Western blot في خطوة البروتوكول 13
CCK-8BeyotimeC0039لقياس حيوية الخلايا BMMs في خطوة البروتوكول 11
CytoscapeNot applicableNot applicableالإصدار 3.8.0
DAVID databaseNot applicableNot applicableالإصدار 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
DisGeNET databaseNot applicableNot applicablehttps://www.disgenet.org/
ECL Chemiluminescence Detection KitVazymeE411-04لاكتشاف إشارات Western blot بالضوء في خطوة البروتوكول 13
ELISA kit of OCNMEIMIANMM-0551M1لقياس مستويات أوستيوكالسين في المصل في خطوة البروتوكول 8
ELISA kit of β-CTXMEIMIANMM-44858M1لقياس مستويات β-CTX في المصل في خطوة البروتوكول 8
GeneCards databaseNot applicableNot applicablehttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830Aلتحليل qRT-PCR في خطوة البروتوكول 12
High-resolution micro-computed tomography (μCT) equipmentBrukerSkyscan 1176لتصوير عالي الدقة بـ micro-CT لبنية عظام الفخذ في خطوة البروتوكول 9
IL-1β antibody BIOSSbs6319Rلكشف IHC في مقاطع الفخذ في خطوة البروتوكول 10
IκBαantibodyCST4812لكشف Western blot في خطوة البروتوكول 13
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database Not applicableNot applicablehttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1لإحداث فرق الخلايا BMMs في خطوة البروتوكول 11
Metascape databaseNot applicableNot applicablehttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher ScientificBRE725531لتحليل LC-MS/MS من LWDHW في خطوة البروتوكول 2
P65 antibodyCST8242لكشف Western blot في خطوة البروتوكول 13
p-IκBα antibodyCST2859لكشف Western blot في خطوة البروتوكول 13
p-P65 antibodyCST3033Sلكشف Western blot في خطوة البروتوكول 13
p-P65 antibodySuzhou Ruiying RLP0187لكشف IHC في مقاطع الفخذ في خطوة البروتوكول 10
PrimeScript RT Reagent Kit TakaraRR047Aلعكس نسخ الحمض النووي الريبي الكلي في الخلايا BMMs لتحليل qRT-PCR في خطوة البروتوكول 12
QuantStudio 5 systemApplied BiosystemsA28573لتحليل qRT-PCR لجين علامات الخلايا العظمية في خطوة البروتوكول 12
RANKLAMIZONAAMK1001-S1لإحداث فرق الخلايا BMMs في خطوة البروتوكول 11
RIPA lysis bufferEpizyme BiotechPC101لإستخراج البروتين الكلي من الخلايا BMMs في خطوة البروتوكول 13
RNA-Quick Purification Kit TransGen BiotechER501-01-V2لإستخراج الحمض النووي الريبي الكلي في الخلايا BMMs في خطوة البروتوكول 12
SPSS software IBMالإصدار 26لتحليل إحصائي للبيانات التجريبية في خطوة البروتوكول 15
STRING database Not applicableNot applicablehttps://string-db.org/
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP) staining kitAMIZONAAMK1001-S1لصبغة TRAP لتحديد الكمية الخلايا العظمية في خطوة البروتوكول 14
Thermo Vanquish UPLC systemThermo Fisher ScientificTSLC-002لتحليل LC-MS/MS من LWDHW في خطوة البروتوكول 2
TNF-αantibodySuzhou Ruiying RLM3472لكشف IHC في مقاطع الفخذ في خطوة البروتوكول 10
Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP) database Not applicableNot applicablehttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
UniProt database Not applicableNot applicablehttps://www.uniprot.org/
UPLC ColumnWatersACQUITY HSS T3لتحليل LC-MS/MS من LWDHW في خطوة البروتوكول 2
Venny online tool Not applicableNot applicablehttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
β-actin antibodyAbcamab8227لكشف Western blot في خطوة البروتوكول 13

المراجع

  1. Liang H, et al. Global epidemiology and burden of osteoporosis among postmenopausal women: insights from the Global Burden of Disease Study 2021. NPJ Aging. 2025;11(1):78.
  2. Yi YT, Zhao HF, Wang WZ, Li X. Osteosarcopenia: epidemiology, molecular mechanisms, and management. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1577758.
  3. Wang J, et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Front Public Health. 2023;11:1084005.
  4. Peris P, et al. Effect of gender on the evolution of pain and quality of life after treatment of symptomatic vertebral fragility fractures. Osteoporos Int. 2024;35(3):515-21.
  5. McClung MR. Sequential and long-term therapy for osteoporosis. Curr Osteoporos Rep. 2025;23(1):15.
  6. Tamechika S, Ohmura S, Maeda S, Naniwa T. Efficacy of denosumab on bisphosphonate-treated osteoporosis and osteopenia in systemic rheumatic disease patients receiving glucocorticoids. J Bone Miner Metab. 2023;41(2):203-11.
  7. Fuggle N, et al. Parathyroid hormone receptor agonists in the management of osteoporosis. Nat Rev Rheumatol. 2025;21(10):599-611.
  8. Curtis JR, et al. Comparative effectiveness of denosumab vs alendronate among postmenopausal women with osteoporosis. J Bone Miner Res. 2024;39(7):826-34.
  9. Thomasius F, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis and treatment of osteoporosis. Dtsch Arztebl Int. 2025;122(1):12-18.
  10. Tan M, Li Q, Yang B, Wang S, Chen Z. Insight of Chinese herbal medicine in treating osteoporosis: achievements from 2013 to 2023. Am J Chin Med. 2024;52(5):1303-28.
  11. Qiu Z, et al. Liuwei Dihuang Pills alleviate the polycystic ovary syndrome with improved insulin sensitivity through PI3K/Akt signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2020;250:111965.
  12. Zheng W, Wang G, Zhang Z, Wang Z, Ma K. Research progress on classical traditional Chinese medicine formula Liuwei Dihuang pills in the treatment of type 2 diabetes. Biomed Pharmacother. 2020;121:109564.
  13. Song J, et al. Liuwei Dihuang improved cognitive functions in SAMP8 mice by inhibiting COX-2 expression and subsequent neuroinflammation. J Ethnopharmacol. 2022;296:115491.
  14. Wang H, et al. Liu Wei Di Huang Decoction alleviates renal fibrosis by inhibiting endothelial mesenchymal transitions via upregulating Sirt1 expression and inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6587-603.
  15. Zhou Z, et al. Transcriptional sequencing analysis reveals the potential use of deer antler for "tonifying the kidney and strengthening bone". J Orthop Surg Res. 2022;17(1):419.
  16. Liu Y, et al. Liuwei Dihuang Decoction for primary osteoporosis: a protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2019;98(16):e15282.
  17. Long Z, et al. Research on the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction for osteoporosis based on systematic biological strategies. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:7017610.
  18. Liu B, et al. Liuwei Dihuang Decoction alleviates cognitive dysfunction in mice with D-galactose-induced aging by regulating lipid metabolism and oxidative stress via the microbiota-gut-brain axis. Front Neurosci. 2022;16:949298.
  19. Perry B, Zhang J, Saleh T, Wang Y. Liuwei Dihuang, a traditional Chinese herbal formula, suppresses chronic inflammation and oxidative stress in obese rats. J Integr Med. 2014;12(5):447-54.
  20. Wang L, You X, Zhang L, Zhang C, Zou W. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 2022;10(1):16.
  21. Luo J, et al. Oxidative stress and inflammation: roles in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1611932.
  22. Jing R, et al. Toll-like receptor 7 promotes periodontal inflammation and alveolar bone resorption through the NF-κB signaling pathway. J Periodontal Res. 2025;60(8):823-34.
  23. Tao H, et al. Urolithin A suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and postmenopausal osteoporosis by suppressing inflammation and downstream NF-κB-activated pyroptosis pathways. Pharmacol Res. 2021;174:105967.
  24. Xue C, et al. Aconine attenuates osteoclast-mediated bone resorption and ferroptosis to improve osteoporosis via inhibiting NF-κB signaling. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1234563.
  25. Zhang P, et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 2023;25(1).
  26. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  27. Xia C, Zhu H, Li J, Jin H, Fu D. Network pharmacology-based mechanism prediction and pharmacological validation of Bushenhuoxue formula attenuating postmenopausal osteoporosis in ovariectomized mice. J Orthop Surg Res. 2023;18(1):200.
  28. Gu Y, et al. Exploring the efficacious constituents and underlying mechanisms of Sini Decoction for sepsis treatment through network pharmacology and multi-omics. Phytomedicine. 2024;123:155212.
  29. Tian M, Wang K, Chen D. Efficacy and mechanisms of Xiangsha Liujunzi Decoction for gastroesophageal reflux disease: a study integrating meta-analysis, network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 2026;151:157766.
  30. Ma Y, et al. Multi-omics and experimental validation reveal the mechanism of Danxia Tiaoban Decoction in treating atherosclerosis. Phytomedicine. 2025;147:157216.
  31. Xia C, et al. β-catenin inhibition disrupts the homeostasis of osteogenic/adipogenic differentiation leading to the development of glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head. Elife. 2024;12.
  32. He Q, et al. Amlexanox enforces osteogenic differentiation and bone homeostasis through inhibiting ubiquitin-dependent degradation of β-catenin. Int J Biol Sci. 2024;20(13):5254-71.
  33. Feng X, et al. CX3CL1 promotes M1 macrophage polarization and osteoclast differentiation through NF-κB signaling pathway in ankylosing spondylitis in vitro. J Transl Med. 2023;21(1):573.
  34. Wang X, et al. Isoliquiritigenin alleviates periodontitis by suppressing inflammation via NF-κB signaling pathway of immune cell. J Inflamm Res. 2025;18:6133-48.
  35. Guo Q, et al. NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):53.
  36. Walker MD, Shane E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 2023;389(21):1979-91.
  37. Liang B, et al. Liuwei Dihuang pills attenuate ovariectomy-induced bone loss by alleviating bone marrow mesenchymal stem cell senescence via the Yes-associated protein-autophagy axis. Pharm Biol. 2024;62(1):42-52.
  38. Liu MM, et al. Therapeutic potential of Liuwei Dihuang pill against KDM7A and Wnt/β-catenin signaling pathway in diabetic nephropathy-related osteoporosis. Biosci Rep. 2020;40(9).
  39. Xie Y, et al. Clinical practice guideline for postmenopausal osteoporosis with traditional Chinese medicine. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2021;46(22):5992-8.
  40. Li YQ, et al. Astragaloside IV modulates oxidative stress and osteoimmune-Wnt signaling in ovariectomized rats: an integrated study of RNA sequencing, molecular docking, and experimental validation. Front Nutr. 2026;13:1785452.
  41. Zhao J, et al. Yishen Qianggu Mixture formulation suppresses osteometabolic inflammation by modulating the IL-17/NF-κB/MAPK signaling axis. J Ethnopharmacol. 2026;358:121011.
  42. Chen C, et al. Hydrolyzed egg yolk peptide prevented osteoporosis by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway in ovariectomized rats. Sci Rep. 2024;14(1):10227.
  43. Yang Y, et al. Nrf2 mitigates RANKL and M-CSF induced osteoclast differentiation via ROS-dependent mechanisms. Antioxidants (Basel). 2023;12(12).
  44. Wang Y, et al. Xian Huang Fang inhibits the PKCδ/MAPK signaling pathway to attenuate renal tubular epithelial cell senescence and thereby delay renal interstitial fibrosis. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6991-7004.
  45. Niu MY, et al. Fanlian Huazhuo Formula alleviates high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by modulating autophagy and lipid synthesis signaling pathway. World J Gastroenterol. 2024;30(30):3584-608.
  46. Huang G, et al. Artemisia capillaris Thunb. water extract attenuates adriamycin-induced renal injury by regulating apoptosis through the ROS/MAPK axis. J Food Biochem. 2022;46(2):e14065.
  47. Zhao J, et al. Liuwei Dihuang Pills enhance osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells through the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(1).
  48. Zhang X, Xu D, Zhang R, Wang H, Yang G. Interaction between diabetes and osteoporosis: imbalance between inflammation and bone remodeling. Osteoporos Int. 2025;36(12):2401-9.
  49. Zhao W, et al. Osteoclast activation and inflammatory bone diseases: focusing on receptors in osteoclasts. J Inflamm Res. 2025;18:3201-13.
  50. Zeng J, et al. Comparison of donepezil, memantine, melatonin, and Liuwei Dihuang Decoction on behavioral and immune endocrine responses of aged senescence-accelerated mouse resistant 1 mice. Front Pharmacol. 2020;11:350.
  51. Wu Y, et al. Effect of Bifidobacterium on osteoclasts: TNF-α/NF-κB inflammatory signal pathway-mediated mechanism. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1109296.
  52. Zulfiqar Z, et al. Zn glycine attenuates LPS-induced inflammatory bone loss in geese through suppression of osteoclastogenesis via reducing TLR-4/NFκB signaling. Ecotoxicol Environ Saf. 2026;309:119655.
  53. Kingeter LM, Lin X. C-type lectin receptor-induced NF-κB activation in innate immune and inflammatory responses. Cell Mol Immunol. 2012;9(2):105-12.
  54. Zhao Y, et al. Trimethylamine-N-oxide promotes osteoclast differentiation and oxidative stress by activating NF-κB pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(10):9251-63.
  55. Zhang Q, et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 2021;34:43-63.
  56. Tseng YT, Chang FR, Lo YC. The Chinese herbal formula Liuwei Dihuang protects dopaminergic neurons against Parkinson's toxin through enhancing antioxidative defense and preventing apoptotic death. Phytomedicine. 2014;21(5):724-33.
  57. Xu Y, et al. Pharmacology-based molecular docking of 4-methylcatechol and its role in RANKL-mediated ROS/Keap1/Nrf2 signalling axis and osteoclastogenesis. Biomed Pharmacother. 2023;159:114101.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

علم الأحياءالعدد 233هشاشة العظام التالية لانقطاع الطمثمسار إشارات NF-κBالالتهاب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.