جمع عينات براز متوافقة مع الإسكان الجماعي الطوعي في الفئران باستخدام نظام أقفاص مخصص

ملخص

يصف هذا البروتوكول نظام أقفاص مخصص لجمع عينات براز طوعية، صديقة للرفاهية، وبشكل متزامن وفردي من فئران مقيدة في مجموعات.

الملخص

يتطلب القياس الموثوق لمستقلبات الكورتيكوستيرون البرازية عينات براز يمكن تعيينها لحيوانات فردية وجمعها ضمن نافذة زمنية محددة. وهذا يمثل تحديا في الفئران الجماعية، حيث لا تسمح عينات الأقفاص المجمعة بتوزيع الأفراد على حدة، وقد يؤثر الانفصال المؤقت على رفاهية الحيوان ونتائج الدراسة. هدف هذا البروتوكول هو تقديم نظام أقفاص بسيط وغير مكلف يتيح جمع عينات براز طوعية ومتزامنة وفردية من فئران مقيدة في مجموعات. يتكون النظام من قفص منزلي مكون من البولي كربونات بسقف سلكي، متصل بثلاثة صناديق جمع فردية. بعد التعود والتدريب، تدخل الفئران الصناديق طوعا للحصول على مكافأة طعام صغيرة. يمكن بعد ذلك إغلاق الأبواب دون مطاردة أو التعامل أو النقل القسري. يتم جمع حبيبات البراز من كل صندوق بشكل منفصل، مما يسمح بتخصيص عينات للحيوانات الفردية مع الحفاظ على السكن الاجتماعي خارج فترة أخذ العينات. يدعم هذا البروتوكول أخذ عينات طولية غير جراحية وهو مناسب للدراسات التي تقيس مستقلبات الكورتيكوستيرون البرازية أو مؤشرات حيوية أخرى في البراز. التصميم سهل البناء من مادة أقفاص قياسية وزجاج أكريليك، ويمكن تفكيكه للتنظيف، ويسمح بأخذ عينات من عدة أقفاص بالتوازي. من خلال تقليل الاضطرابات المرتبطة بالتعامل وتحسين توحيد نافذة العينة، توفر الطريقة تحسينا عمليا لمراقبة الغدد الصماء في الفئران الجماعية.

المقدمة

تحد كبير في تقييم تركيزات كورتيكوستيرون البلازما هو أن إجراء أخذ العينة نفسه قد يؤدي إلى زيادة حادة في الكورتيكوستيرون، مما يربك القياس ويؤثر على تفسير نتائج الدراسة ^1,2,3. يوفر قياس مستقلبات الكورتيكوستيرون البرازية (FCMs) بديلا غير جراحي، حيث تعكس تركيزات FCM مستويات الجلوكوكورتيكويد المتداولة قبل عدة ساعات من أخذ العينة، وذلك حسب النوع والسلالة والجنس ووقت مرور الأمعاء ^4,5. ومع ذلك، لا يزال التحليل الموثوق للركوب الوظيفي في الفئران المجمعة أمرا صعبا. لا يمكن تخصيص عينات البراز المجمعة من القفص المنزلي لحيوانات فردية وقد تظهر تنوعا كبيرا بسبب الفروق بين الأفراد في إفراز الجلوكوكورتيكويد وعدم اليقين في نافذة الأخذ الدقيقة للعينات. فصل الحيوانات لفترات طويلة قد يتداخل مع أهداف الدراسة، بينما الفصل قصير الأمد لجمع العينات الفردية يتطلب جهدا كبيرا، ويحد من معدل الإنتاجية، وقد يسبب بحد ذاته توترا².

لتمكين جمع عينات براز فردية من فئران مقيدة في مجموعات مع التعامل البسيط، تم تطوير قفص جمع براز مخصص (الشكل 1A-E). تم تعديل التصميم من قفص جمع براز موصوف سابقا للفئران الشوكية⁶ وتم تعديله لاستخدامه مع فئران المختبر. يتكون النظام من قفص بولي كربونات عادي من النوع الثالث متصل بثلاثة صناديق جمع فردية، يمكن للحيوانات الوصول إليها طوعا وإغلاقها باستخدام أبواب منزلقة. يتيح هذا النظام جمع عينات البراز من فئران فردية دون التعامل المباشر خلال فترة أخذ العينات، كما يتيح أخذ عينات متزامنة من عدة حيوانات. لذلك، يوفر القفص نهجا عمليا لأخذ عينات FCM غير جراحية وتنسب فرديا في الفئران الجماعية.

يصف البروتوكول التالي نظام أخذ عينات من البراز يسمح بجمع وتحديد عينات البراز من فئران فردية مع الحفاظ على بيئة إسكان جماعي، باستخدام أقفاص مخصصة لأخذ عينات البراز بدون تلامس.

البروتوكول

تم استشارة لجنة أخلاقيات الحيوانات المسؤولة في جامعة فيينا الطبية قبل إجراء الدراسة وأبلغت بعدم الحاجة إلى ترخيص رسمي لتجارب الحيوانات؛ لذلك، لا يتوفر رقم موافقة أو بروتوكول. شملت الدراسة فقط ممارسات التربية والتربية المعتمدة، إلى جانب جمع عينات براز غير جراحية. لم تجرى أي إجراءات جراحية. وفقا للتوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي، تم تقييم العبء المتوقع على الحيوانات على أنه أقل من عتبة الألم أو المعاناة أو الضيق أو الأضرار الدائمة التي تعادل أو أعلى من تلك الناتجة عن إدخال الإبرة وفقا للممارسة البيطرية الجيدة. تم إيواء جميع الحيوانات ورعايتها وفقا لمعايير رفاهية الحيوانات المؤسسية.

1. بناء الأقفاص (انظر قائمة المواد)

1. اقطع الأجزاء 1-4 من زجاج بليكسي/أكريليك بقطر 5 مم وفقا للقوالب الموضحة في الشكل 2A-C.
   ملاحظة: يمكن طباعة القوالب ذات الأبعاد الدقيقة بصيغة DIN A3 (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2).
2. اقطع أسفل قفص البولي كربونات النوع الثاني (PTII) كما هو موضح في الشكل 2D. سيستخدم هذا الجزء لاحقا كغطاء علوي لصناديق جمع البراز.
3. احفر الثقوب والفتحات في أسفل قفص PTII السابق كما هو موضح في الشكل 2D.
   ملاحظة: الأبعاد الدقيقة موضحة في الشكل الإضافي 3.
4. احفر ثقوبا في الجانب الأمامي والقصير من قفص PTIII كما هو موضح في الشكل 2E.
   ملاحظة: الأبعاد الدقيقة موضحة في الشكل التكميلي 4.
5. استخدم الجزء الثاني كقالب لتحديد ثقوب الحفر المقابلة على الجانب القصير من قفص PTIII وعلى الجانب الطويل من قفص PTII.
6. احفر الثقوب المحددة وثبت قفص PTIII وقفص PTII والجزء الثاني باستخدام البراغي الملولبة، كما هو موضح في الشكل 2F.
7. أدخل الجزء الأول كأسفل قفص PTII. ضع الجزئين 4a و4b بحيث يثبتان الجزء 1 في مكانه وقسم قفص العينات إلى صناديق تجميع منفصلة. استخدم مسدس الغراء الساخن لتثبيتها في مكانها.
8. قم بإدخال البروزات السفلية للجزءين 4a و4b في فتحات الجزء 1. تشكل هذه البروزات أرجل صناديق الجمع.
9. قم بتمرير البروزات العلوية للجزأين 4a و4b عبر الغطاء العلوي، وهو الجزء السفلي السابق من قفص PTII، لتثبيته في مكانه.
10. قم بخيط عيدان الطعام الخشبية أو القضبان عبر الفتحات في البروزات، باستخدام قضيب واحد في الأعلى وقضيبان في الأسفل، لتثبيت وتثبيت البناء.
    ملاحظة: يجب استخدام المواد الخشبية في الحديقة فقط إذا كانت قابلة للتخلص منها، لأنها غير قابلة للتنظيف. إذا لم يكن هذا هو الحال، يجب استخدام قضبان بتركيب بديل.
11. أغلق الفجوات المتبقية أو الأخطاء الطفيفة باستخدام مسدس الغراء الساخن. استخدم الأجزاء 3أ، 3ب، و3ج (الشكل 2B) كأبواب منزلقة بين قفص المنزل وصناديق الجمع.
    ملاحظة: تأكد من عدم وجود حواف حادة أو بقايا غراء أو مواد بارزة متاحة للحيوانات. المكونات الزجاجية الأكريليكية/البلاستيكية المستخدمة في هذا النموذج الأولي غير مناسبة لتعقيم المعقم بالبخار. لذلك، إذا تم استخدام النظام في منشآت SPF التي تتطلب مواد معقمة مرتبطة بالأقفاص، فيجب إما استخدام إجراء تعقيم غير معقم معتمد مؤسسيا، أو يجب استبدال مكونات الأكريليك بمادة قابلة للتعقيم مع الحفاظ على نفس الأبعاد.

2. تحضير الحيوانات وإسكانها

1. احصل على العدد المطلوب من فئران السلالة المناسبة للدراسة.
   ملاحظة: تم الحصول على البيانات التمثيلية من 30 فأرا عمرها ثمانية أسابيع من نوع C57BL/6J، تضم 20 أنثى و10 ذكور. كانت الفئران خالية من الممرضات المحددة وفقا لمعايير FELASA، وتم الحصول عليها من مختبرات تشارلز ريفر في سولزفيلد، ألمانيا.
2. الحيوانات المنزلية في الظروف التقليدية في أقفاص البولي كربونات من النوع الثالث المتكيفة مع حد أقصى ثلاثة فئران بالغة في كل قفص.
   ملاحظة: تم وضع الذكور المنفصلين في أقفاص البولي كربونات من النوع الثاني القياسية لهذه الدراسة.
3. حافظ على غرفة الحيوانات عند 22 ± 2 درجة مئوية و55 ± رطوبة نسبية 10٪ خلال دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة مع إضاءة في الساعة 6:00 صباحا.
4. قدم نظاما غذائيا قياسيا للصيانة والماء بحرية الآن.
5. أضف أغطية خشب الحور، ولفافة تواليت ورقية، وبيت بلاستيكي شفاف أحمر، ومناشف ورقية كمواد تعشيش لكل قفص.
6. حدد الفئران بشكل أساسي من خلال علامات الذيل الطبيعية. ضع علامات القلم مؤقتا على الحيوانات التي تحمل علامات ذيل مشابهة أثناء الوزن إذا لزم الأمر.

3. التعود وتدريب الحيوانات

ملاحظة: القفص المكتمل يتكون من قفص منزلي (PTIII)، متصل بقفص أخذ عينات يحتوي على ثلاثة صناديق جمع منفصلة، PTII. يمكن استخدام أقفاص المنزل مثل الأقفاص التقليدية، مع فراش، وتعزيز الأقفاص، وغطاء سلكي بدون مثبتات خارجية، وتوفير الطعام والماء. يمكن تفكيك النظام للغسيل ولا يمكن استخدامه إلا خلال أسابيع العينة. خلال أسابيع بدون أخذ عينات، يمكن إيواء الحيوانات في أقفاص PTIII القياسية.

1. ضع الحيوانات في نظام الأقفاص قبل أسبوعين على الأقل من أول جلسة أخذ عينات مخطط لها.
2. تعود الحيوانات على صناديق الجمع عن طريق إزالة الأبواب المنزلقة لليلة واحدة، مما يسمح لها باستكشاف الصناديق بحرية.
3. قم بإجراء ثلاث جلسات تدريبية قبل أول جلسة أخذ عينات. إجراء التدريب تحت نفس ظروف الضوء وفي نفس الوقت المخطط له للعينات لاحقا، ويفضل تحت الضوء الأحمر بعد بداية المرحلة المظلمة مباشرة.
4. ضع كمية صغيرة من المكافأة، مثل كريمة البندق، زبدة الفول السوداني، معجون الشعير، أو طعام لذيذ مشابه، على الحائط المقابل لمدخل كل صندوق جمع.
5. في أول يوم تدريب، اترك الأبواب مفتوحة ودع الحيوانات تكتشف وتستهلك المكافأة طوعا.
6. في اليوم الثاني من التدريب، انتظر حتى يدخل حيوان صندوق الجمع ويبدأ في لعق المكافأة. أغلق الباب المنزلق خلف الحيوان بحذر وأطلقه بعد 10 دقائق.
7. في اليوم الثالث من التدريب، كرر الإجراء وقم بتمديد الوقت الذي تبقى فيه الحيوانات في صناديق الجمع تدريجيا.
   ملاحظة: يجب أن يكون التدريب هادئا ومستمرا. تجنب مطاردة الحيوانات إلى الصناديق، لأن ذلك قد يزيد من التوتر ويقلل من المشاركة الطوعية في جلسات الأخذ اللاحقة.

4. جمع عينات البراز

1. توقيت جمع العينات
   1. خطط وقت أخذ العينات وفقا للسؤال البيولوجي والتأخير المتوقع بين إخراج كورتيكوستيرون البلازما واستقلاب الكورتيكوستيرون البرازي. في الفئران، تعكس مستقلبات الكورتيكوستيرون البرازية عادة مستويات الجلوكوكورتيكويدات المتداولة حوالي 8-10 ساعات قبل أخذ العينة.
      ملاحظة: إذا كان التوقيت الدقيق أمرا حاسما، قم بإجراء دراسة تجريبية لتحديد المسار الزمني لإخراج FCM في السلالة المحددة والجنس والظروف التجريبية المستخدمة. يمكن دمج هذا الطيران مع جلسات التدريب.
   2. أخذ عينات جدولية خلال فترة إنتاج براز مرتفع. عادة ما يكون أخذ العينات أكثر كفاءة في بداية المرحلة المظلمة والنشطة.
   3. قم بإجراء جميع جلسات أخذ العينات في نفس الوقت من اليوم طوال الدراسة لتقليل التباين الناتج عن إيقاع النهار لمستويات FCM.
      ملاحظة: من خلال تجربتنا، فإن الأحداث التي تحدث في الصباح حوالي الساعة 10:00 صباحا تنعكس بشكل جيد عند جدولة أخذ العينات بين الساعة 6:00 مساء و8:00 مساء، حسب جدول إضاءة غرفة الحيوانات.
2. إجراءات أخذ العينات والنصائح العملية
   1. ضع علامة على الحيوانات بشكل فردي قبل أخذ العينة. استخدم علامات الأذن أو علامات الذيل الفردية.
      ملاحظة: قد يكون من الصعب التعرف على علامات الأصابع ورموز الألوان داخل الصناديق تحت الضوء الأحمر.
   2. جهز صناديق الجمع خلال مرحلة الضوء بتطبيق المكافأة على الجدار الخلفي لكل صندوق.
      ملاحظة: تحضير الصناديق خلال النهار يحسن الرؤية للجرب ويسمح للحيوانات بشم المكافأة قبل أخذ العينة.
   3. في وقت أخذ العينات المقرر، افتح صناديق الجمع وانتظر حتى تدخل الحيوانات طوعا.
   4. بمجرد دخول الفأر إلى صندوق الجمع، أغلق الباب المنزلق خلفه بحذر.
   5. بعد دخول جميع الحيوانات إلى صندوق، سجل هوية وموقع كل فأر في ورقة عينات محضرة.
   6. إذا تم أخذ عينات من أكثر من 10 أقفاص في جلسة واحدة، يجب إشراك مجرب ثان لدعم تحديد هوية الحيوانات، والتعامل مع الأبواب، والتوثيق.
   7. احتفظ بالحيوانات في صناديق الجمع لمدة العينات المخططة، عادة من 30 دقيقة إلى ساعتين، حسب إنتاج البراز المتوقع وتصميم الدراسة.
      ملاحظة: استبعد العينات إذا لم يكن بالإمكان تحديد هوية فردية بشكل مؤكد، أو إذا كانت حبيبات البراز ملوثة بالبول أو الفراش أو براز حيوان آخر، أو إذا انحرفت مدة أخذ العينات بشكل كبير عن النافذة الزمنية المخططة، أو إذا كانت كمية البراز غير كافية لتحليل FCM.
      ملاحظة: استخدام 50 ملغ هو بروتوكولنا القياسي، وقد تم استخدام هذه الكمية في جميع الاختبارات الصحية وجميع الأوراق الأخرى^{5، 7، 8}. عادة، يمكن الحصول عليها بسهولة.
   8. في نهاية فترة العينة، افتح الأبواب المنزلقة ودع الفئران تعود إلى قفص المنزل.
   9. أغلق صناديق الجمع فورا بعد مغادرة الفئران لمنع إعادة الدخول والتلوث المتقاطع للعينات.
   10. أزل حبيبات البراز من كل صندوق جمع باستخدام ملقط طويل وانقلها إلى أنابيب جمع معنونة بشكل فردي.
   11. تخزين العينات عند -20 درجة مئوية حتى التحضير الإضافي لاختبار FCM.
       ملاحظة: إذا كانت الصناديق مغلقة بإحكام ولا يمكن إعادة الدخول من قبل الفئران، يمكن تأجيل جمع الحبيبات البرازية حتى المرحلة الضوئية التالية. ومع ذلك، يجب أن يتم ذلك بشكل متسق داخل الدراسة.
   12. احتفظ بالحيوانات في جزء القفص المنزلي (PTIII) حتى تغيير القفص التالي. بعدها يمكن تفكيكها وغسلها في غسالة أقفاص عادية.

النتائج

تم قياس مستقلبات الكورتيكوسترون البرازي (FCMs) بنجاح من عينات تم جمعها باستخدام أقفاص أخذ عينات البراز المخصصة في دراسة طولية قارنت بين الفئران التي تم تربيتها بشكل دائم ومتقطع. شمل تحليل FCM التمثيلي 30 حيوانا: مجموعة مربوطة بشكل دائم، n = 15 حيوانا في 5 أقفاص؛ المجموعة التي تم تربيتها بشكل متقطع، n = 10 حيوانات في 5 أقفاص، مع 5 ذكور في مأوى فردي باستثناء 3 فعاليات تكاثر، حيث تم إقامتهم مع الإناث. تم جمع العينات في 19 نقطة زمنية نصف شهرية في أيام تبديل الأقفاص وكذلك في عطلات نهاية الأسبوع. كان متوسط الوقت حتى دخلت معظم الحيوانات إلى الصندوق 7.5 دقائق (SD = 3.07)، مع متوسط 27.6 فئران (SD = 1.44) من 30 فأرا في المجموع. دخلت جميع الفئران الصندوق بعد متوسط 11.69 دقيقة (SD = 3.29). كان متوسط مدة الحجز لجميع الفئران 24.56 دقيقة (SD = 15.51)، ومتوسط الوقت من دخول الفأرة الأولى إلى الصندوق حتى بداية الإطلاق كان 43.14 دقيقة (SD = 8.51). كان متوسط مدة الإفراج 14.86 دقيقة (SD = 22.82)، ومتوسط مدة العملية بأكملها 68.00 دقيقة (SD = 11.87). من بين 19 عينة (3 تجارب + 16 عينة منتظمة)، متوقعة 480 عينة، كانت عينتان مفقودتين لأن الفئران لم تتغوط أثناء الحبس، ولم يكن بالإمكان جمع ثلاث عينات لأن الفئران كانت إما حاملا بشدة أو بعد الولادة بفترة قصيرة، و5 فئران احتاجت إلى دعم لطيف للدخول. كان متوسط وزن العينات المأخوذة من أول ثلاث عينات 51.16 ملغ (SD = 25.39). من بين جميع العينات التي تم جمعها (475)، تم تحليل 473 وأعطيت نتائج.

اعتبرت الحيوانات الفردية النسخ البيولوجية. تم التعامل مع عينات البراز المتكررة التي جمعت من نفس الحيوانات خلال فترة الدراسة التي استمرت ثمانية أسابيع كقياسات طولية متكررة وليس كنسخ بيولوجية مستقلة. تم إجراء التحليل باستخدام نموذج خطي مختلط التأثيرات مع الجنس، ومجموعة التكاثر، ويوم أخذ العينة، وعدد الفئران في كل قفص كتأثيرات ثابتة، والقفص كتقاطع عشوائي. تم تضمين التفاعلات بين الجنس، ومجموعة التكاثر، ويوم أخذ العينة في النموذج. تم تضمين عدد الفئران في كل قفص كتأثير ثابت إضافي لكنه لم يختبر من حيث التفاعل، لأن هذا المتغير كان مشوشا جزئيا مع تصميم التجربة، خصوصا في الذكور الذين تم تكاثرهم بشكل متقطع.

أظهر النموذج تأثيرا واضحا للجنس على تركيزات FCM (الشكل 3A-D). كانت الإناث لديها تركيزات أعلى من FCM مقارنة بالذكور عبر ظروف التكاثر وأيام العينة، حيث التقدير = 28.30، SE = 2.58، t = 10.98، P < 0.0001. أكدت المقارنات بعد الحدث هذا الاختلاف الجنسي داخل مجموعتي التكاثر وفي كلا يومي العينة. في الحيوانات المرباة بشكل دائم، كانت الإناث تحظى بتركيزات FCM أعلى من الذكور أيام الأحد، حيث التقدير = 53.41، SE = 8.28، P < 0.0001، وفي أيام الأربعاء، التقدير = 55.27، SE = 8.37، P < 0.0001. لوحظ نفس النمط في الحيوانات التي تم تربيتها بشكل متقطع أيام الأحد، حيث التقدير = 58.04، SE = 12.00، P < 0.0001، وفي أيام الأربعاء، التقدير = 59.68، SE = 9.88، P < 0.0001.

أشار النموذج أيضا إلى تأثير رئيسي مهم لمجموعة التكاثر، حيث التقدير = 11.59، SE = 4.65، t = 2.49، P = 0.0227. ومع ذلك، لم تكشف المقارنات اللاحقة المعدلة بتوكي عن فروق ذات دلالة إحصائية بين الحيوانات التي تم تربيتها بشكل دائم ومتقطع ضمن تركيبات الجنس/اليوم الفردية. في الإناث، لم تختلف الحيوانات التي تم تربيتها بشكل دائم ومتقطع بشكل كبير في أيام الأحد، حيث كان التقدير = 24.51، SE = 12.20، P = 0.2085، أو في أيام الأربعاء، التقدير = 17.31، SE = 12.20، P = 0.4950. وبالمثل، لم يلاحظ في الذكور أي فرق كبير في مجموعات التكاثر أيام الأحد، حيث التقدير = 29.14، SE = 14.00، P = 0.1708، أو في أيام الأربعاء، التقدير = 21.72، SE = 13.30، P = 0.3682. لذا يجب تفسير التأثير الرئيسي الكبير لمجموعة التربية كتأثير على مستوى النموذج العام، في حين أن المقارنات اللاحقة المعدلة بتوكي لم تحدد فرقا قويا بين المجموعات الزوجية.

غياب فرق كبير في مجموعة التكاثر بين الذكور أمر مهم بشكل خاص، حيث كان الذكور دائما يقيمون في منزل واحد أيام الأحد. لذا، تظهر مقارنة يوم الأحد في الذكور أن طريقة أخذ العينات نفسها لا تزيد من تركيزات FCM، على الأقل في ذكور الفئران. كما تم استخدام أقفاص أخذ عينات البراز في دراسة أخرى قارنت بين ال FCM في فئران الحراس المتسخة مع الضابطين⁹.

الشكل 1: نظرة عامة على قفص أخذ عينات البراز المخصص. يسمح نظام الأقفاص بجمع عينات البراز من فئران فردية محتجزة في قفص جماعي دون التعامل المباشر أثناء أخذ العينات. (أ) نظام قفص مركب بالكامل يتكون من قفص منزلي وقفص أخذ عينات براز ملحق. (ب) منظر جانبي لقفص العينات الملحق. (ج) منظر علوي يظهر المداخل الثلاثة المنفصلة لصناديق الجمع الفردية. (د) منظر من داخل قفص المنزل نحو مداخل صناديق العينات. (ه) قفص أخذ عينات مفتوح، مما يسمح بالوصول إلى صناديق الجمع لإزالة وتنظيف حبيبات البراز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: مخطط البناء وتجميع قفص أخذ عينات البراز. (A-C) تستخدم أجزاء من الزجاج الأكريليكي لبناء الأرضية، والجدران الجانبية، والأبواب المنزلقة، والفواصل في قفص العينة. (د) تعديل قفص البولي كربونات النوع الثاني بإزالة القاع وحفر ثقوب وفتحات لغطاء صندوق التجميع. (ه) تعديل قفص المنزل من النوع الثالث المصنوع من البولي كربونات عن طريق حفر ثلاث فتحات مدخل في الجانب الأمامي. (و) عرض جانبي تخطيطي لنظام القفص المجمع، يظهر قفص المنزل من نوع بولي كربونات النوع الثالث المتصل بقفص عينات بولي كربونات المعدل من النوع الثاني ووضع الأجزاء 1 و2 و4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: بيانات FCM التمثيلية التي تم الحصول عليها بعد جمع عينات البراز باستخدام القفص المخصص. تم قياس مستقلبات الكورتيكوسترون البرازية (FCMs) في عينات براز جمعت بشكل فردي من فئران مقيدة في مجموعات باستخدام قفص أخذ عينات مخصص. تعرض القيم عبر ثماني نقاط عينة أسبوعية للفئران التي تم تربيتها بشكل دائم ومتقطع. تم جمع العينات إما في أيام تبديل الأقفاص أو في عطلات نهاية الأسبوع. تمثل النقاط والخطوط المتصلة الوسائل الجماعية في كل نقطة زمنية. تشير أشرطة الخطأ والأشرطة المظللة إلى متوسط الانحراف المعياري ± (SD). (أ) عينات من الإناث في أيام تبديل القفص. (ب) الإناث يتم أخذ عينات منها خلال عطلات نهاية الأسبوع. (ج) الذكور الذين تم أخذ عينات من عينات في أيام تغيير القفص. (د) الذكور الذين يأخذون عينات خلال عطلات نهاية الأسبوع. يوضح الشكل أن الطريقة أنتجت تركيزات FCM قابلة للقياس عبر جميع المجموعات والنقاط الزمنية. أظهرت الإناث عموما تركيزات أعلى من FCM مقارنة بالذكور، بينما كانت الفروقات بين مجموعات التكاثر أقل اتساقا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: قوالب لمكونات الزجاج الأكريليكي 1-3. قوالب لقطع الأجزاء 1 و2 و3a-c من زجاج أكريليك/بليكسي جلاس بقطر 5 مم لبناء قفص أخذ عينات البراز. الجزء الأول يعمل كإدخال سفلي لقفص البولي كربونات المعدل من النوع الثاني. يستخدم الجزء الثاني لربط قفص البولي كربونات النوع الثالث بقفص البولي كربونات من النوع الثاني ولتحديد ثقوب الحفر المقابلة. تشكل الأجزاء 3a-c فواصل داخلية/عناصر هيكلية لنظام التحصيل. تشير العلامات الدائرية البيضاء إلى ثقوب الهواء، والعلامات الأصغر تشير إلى ثقوب البراغي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: قوالب لمكونات الزجاج الأكريليكي 4a و4b. قوالب لقطع الأجزاء 4a و4b من زجاج أكريليك/بليكسي جلاس بحجم 5 مم. يتم إدخال هذه الأجزاء في الجزء الأول لتثبيت الإدخال السفلي في مكانه ولتقسيم قفص العينات إلى صناديق جمع براز منفصلة. تشكل النتوءات السفلية أرجل صناديق التجميع، بينما تمر النتوءات العلوية عبر الغطاء العلوي وتثبت بقضبان خشبية أو عيدان لتثبيت البناء. تشير الدوائر البيضاء إلى فتحات للقضبان أو فتحات الهواء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: تعديل قفص البولي كربونات النوع الثاني. قالب تخطيطي لتعديل قفص البولي كربونات النوع الثاني. يتم قطع الجزء السفلي من القفص كما هو موضح ويستخدم لاحقا كغطاء علوي لصناديق جمع البراز. يتم حفر ثقوب وفتحات في الجزء السفلي الذي تم إزالته للسماح بإدخال وتثبيت الجزئين 4a و4b. تستخدم فتحات البراغي لتثبيت قفص البولي كربونات النوع الثاني، وقفص البولي كربونات النوع III، والجزء 2. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: تعديل واجهة القفص البولي كربونات النوع الثالث. قالب تخطيطي لحفر الجانب الأمامي من قفص البولي كربونات النوع III. يتم حفر ثلاث فتحات دائرية في الجانب القصير من القفص للسماح بالوصول بين قفص المنزل وقفص أخذ عينات البراز. تستخدم فتحات براغي إضافية لتثبيت الجزء 2 وقفص البولي كربونات النوع الثاني. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول نظام أقفاص بسيط لجمع عينات براز قابلة للتخصيص فرديا من الفئران المحفوظة في مجموعات. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تجمع بين نسبة العينات الفردية والحفاظ على الجوانب الرئيسية للإسكان الاجتماعي، خاصة الاتصال البصري والشم مع شركاء القفص. وهذا مهم لأن السكن الجماعي غالبا ما يكون مطلوبا لرفاهية الحيوان وقد يكون أيضا جزءا من التصميم التجريبي¹⁰. على عكس أخذ عينات الأقفاص المنزلية المجمعة، يسمح النظام بتعيين قيم FCM للحيوانات الفردية، مع تجنب الإسكان الفردي لفترة طويلة قبل أو أثناء جمع العينات.

تشمل الطرق الشائعة لجمع عينات البراز في فئران المختبر أخذ عينات مجمعة من أقفاص المنزل، والمساكن الفردية المؤقتة في أقفاص نظيفة، وأقفاص أيضية، والجمع المباشر بعد التعامل أو النقل. عينات الأقفاص المجمعة سهلة الحصول عليها، غير غازية، رخيصة، ومتوافقة مع أخذ عينات موازية من العديد من الأقفاص، لكنها لا تسمح بتحديد العينات الفردية في الحيوانات الجماعية. يتيح السكن المؤقت الفردي أو النقل إلى أقفاص نظيفة تعيين عينات فردية، لكنه يبعد الحيوانات من مجموعتها الاجتماعية وقد يسبب ضغطا حادا بسبب التعامل أو الجدة أو الانفصال الاجتماعي. وهذا مهم بشكل خاص لتحليل FCM، لأن القياسات المتعلقة بالكورتيكوستيرون حساسة للضغط الناتج عن إجراء أخذ العينات^نفسه. توفر الأقفاص الأيضية جمع عينات محكمة وتسمح بفصل البراز والبول، لكنها تتطلب معدات متخصصة، وأقل توافقا مع التربية الروتينية، وعادة ما تتضمن مساكن فردية. يمكن أن يوفر الجمع القائم على التعامل المباشر عينات منسوب بشكل فردي، لكنه يتطلب تكرارا في التعامل أو التلاعب بالحيوانات، وبالتالي قد يؤثر على قراءات مرتبطة بالتوتر.

مقارنة بهذه الأساليب القائمة، تم تصميم النظام الحالي كتحسين متوافق مع المساكن الجماعية لأخذ عينات فردية متكررة وغير جراحية. بعد التعود والتدريب، تدخل الفئران صناديق العينات طوعا استجابة لمكافأة طعام صغيرة. لذلك يمكن جمع العينات دون مطاردة أو التعامل أو نقلها القسري إلى قفص منفصل. لا ينبغي تفسير النظام على أنه مثبت على تحسين الرفاهية أو تقليل التوتر بمعنى تجريبي صارم، لأن تدابير الرعاية الاجتماعية المباشرة لم تدرج في هذه الدراسة. ومع ذلك، فقد صمم لتقليل درجة الانفصال الاجتماعي أثناء جمع العينات، وبالتالي قد يكون أقل إزعاجا من طرق الجمع الفردية التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أخذ عينات من عدة حيوانات وعدة أقفاص بالتوازي، مما يساعد على توحيد نافذة العينة، وهو أمر مهم لأن تركيزات FCM تعتمد على الإيقاع اليومي وتعكس إفراز الجلوكوكورتيكويد قبل عدة ساعات من أخذ العينة ^5,12.

تظهر النتائج الممثلة أن النظام مناسب لجمع عينات البراز التي يمكن تحليلها لتركيزات FCM. تم الحصول على تركيزات قابلة للقياس لعلاج التخدير الجندري عبر المجموعات والنقاط الزمنية، وكشفت الطريقة الفرق الواضح المتوقع بين الجنسين، مع تركيزات أعلى لدى الإناث مقارنة بالذكور. شملت الدراسة أيضا مقارنة داخلية مع السكن الفردي التقليدي للذكور. في أيام الأحد، كان الذكور في مجموعة التكاثر المتقطع يملكون في منزل واحد، بينما تم أخذ عينات من الذكور الذين تم تربيتهم بشكل دائم باستخدام نظام الجمع الجديد. لم تختلف تركيزات FCM بشكل كبير بين هذه المجموعات أيام الأحد. يشير هذا إلى أن الدخول الطوعي إلى قفص العينات والإقامة القصيرة في صندوق الجمع لم يؤدا إلى زيادة ملحوظة في تركيزات FCM مقارنة بالجمع التقليدي في السكن الواحد. ومع ذلك، كانت هذه المقارنة مقتصرة على الذكور ولم تصمم كدراسة مخصصة للتعادلات أو التحقق من التقاطع. لذا يجب أن تقارن الدراسات الإضافية النظام مع الأساليب المعتمدة للسكن الفردي أو الأقفص الأيضي تحت ظروف تجريبية متوازنة، وتشمل مؤشرات سلوكية للتوتر الحاد أثناء أخذ العينات.

بعيدا عن تقييم مستقلبات الكورتيكوستيرون البرازية، قد يكون النظام مفيدا أيضا لتطبيقات أخرى تتطلب جمعا مؤقتا لعينات براز فردية. تشمل التطبيقات المحتملة الفحوصات الطفيلية، وتحليل الميكروبيوتا، ودراسات الهضم، أو اختبارات مؤشرات البراز الأخرى. مع بعض التعديلات التقنية الطفيفة، يمكن أيضا تكييف النظام لجمع البول، على سبيل المثال، عن طريق إدخال أرضية مثقبة وصينية جمع مناسبة تحت الحيوان. لهذه التطبيقات، قد تكون إمكانية الحفاظ على القرب من رفقاء الأقفاص أثناء جمع العينات ميزة مقارنة بالطرق التقليدية في السكن الفردي أو الأقفاص الأيضي. ومع ذلك، يجب التحقق من ملاءمة النظام لكل نوع عينة محدد وكل تحليل لاحق، خاصة عندما تكون التلوث، حجم العينة، وقت الجمع، أو ظروف التخزين حرجة.

بشكل عام، يجب أن تعتاد الحيوانات على الصناديق قبل أول جلسة أخذ عينات، ويجب أن تكون العلامات الفردية واضحة تحت ظروف الإضاءة المستخدمة، ويجب إجراء العينات في نفس وقت اليوم طوال الدراسة. يجب استبعاد العينات إذا كانت هوية الفرد غير مؤكدة، أو إذا كانت الحبيبات ملوثة، أو إذا اختلفت مدة أخذ العينات بشكل كبير عن النافذة الزمنية المخططة، أو إذا كانت المادة البرازية غير كافية للتحليل¹³. قد تؤثر عدة عوامل عملية على تطبيق نظام العينات، بما في ذلك تسلسل الهيمنة، والتفاعلات العدوانية، وتفاوت الدافع الغذائي، واختلافات الإجهاد، وانخفاض الحركة أو السلوك التغير في الحيوانات السمنة، أو المسنة، والحوامل، وما بعد الولادة، أو التي تعاني من إعاقة أخرى. ومع ذلك، في الدفعة الحالية، كان النجاح في الدخول الطوعي وأخذ العينات مرتفعا. من بين 480 عينة منتظمة متوقعة، كانت عينة مفقودة لأن الفئران لم تتغوط أثناء الحبس، وثلاثة لم يكن بالإمكان جمعها لأن الحيوانات كانت إما حاملا بشدة أو بعد الولادة بفترة قصيرة. وبذلك، تم جمع 475 عينة، منها 473 أعطت نتائج قابلة للتحليل. تشير هذه البيانات إلى أن رفض دخول الصناديق والفشل في الحصول على عينات كانا نادرين في الظروف المستخدمة في هذه الدراسة. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات إضافية على التعود أو البروتوكول لسلالات أخرى أو مجموعات أكبر أو حيوانات ذات تغيرات في الحركة أو حالة الجسم أو الحالة الصحية أو السلوك الاجتماعي. قيود أخرى هي أن الطريقة تتطلب تدريبا وهي مصممة حاليا لمجموعات صغيرة من ثلاثة فئران، وأن مكونات الزجاج الأكريليك/البلاستيك الزجاجي ليست قابلة للاستخدام بالبخار.

القفص غير مكلف، سهل البناء من مادة قفص قياسية وزجاج أكريليك، ولا يحتاج إلى مكونات إلكترونية. يتيح تصميمه التفكيك والتنظيف والدمج في روتين تغيير الأقفاص المنتظمة، مما يجعله مناسبا لأخذ عينات طولية متكررة. بشكل عام، يمثل النظام نهجا عمليا ومتوافقا مع الإسكان الجماعي لأخذ عينات براز غير جراحية وقابلة للتخصيص فرديا في الفئران.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Drill bit 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diameter; Quantity 1
Drill bits 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diameter; Quantity 1
Drill bits 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diameter; Quantity 1
Drilling machine	Makita	25730054	Standard handheld or bench drill; Quantity 1
Hot glue gun	Einhell	29051207	For cage assembly; Quantity 1
Hot glue sticks	Einhell	29049664	Compatible with hot glue gun; Quantity 5-10
Makrolon cage	Animalab	31200129	Standard Type II cage; Quantity 1
Makrolon cage	Animalab	31200256	Standard Type III cage; Quantity 1
Plexiglass / acrylic glass	Bauhaus	29122352	Approx. 0.25 m² total; 5 mm thickness; Quantity  2DIN A3 sheets
Saw or milling device	Scheppach	32079641	Small band saw, jigsaw, or CNC mill; Quantity 1
Threaded screws	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Quantity 4
Wooden chopsticks / rods	Ikea	903.429.71	Round wooden rods; Quantity 3