نقدم هنا بروتوكولاً لتصميم وتجميع وتشغيل جهاز ميكروفلويديك (microfluidic) مغلق الحلقة وخالٍ من الفقاعات، مخصص لزراعة الخلايا البطانية تحت ظروف تدفق فسيولوجية في بيئة جاذبية صغرى محاكية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
منصة للزراعة المستمرة للخلايا البطانية تحت ظروف تدفق فسيولوجية في بيئة جاذبية صغرى محاكة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تُعد الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة (MPS) نماذج قيمة in vitro تعيد تكوين بنية ووظيفة الأنسجة البشرية. وبشكل أكثر تحديداً، تعمل شرائح الأنسجة أو الأعضاء على الرقاقة (tissue- or organ-on-chips) التي تدمج تقنية الموائع الدقيقة على محاكاة البيئة الميكانيكية والكيميائية الحيوية داخل الجسم (in vivo)، مع السماح بمراقبة نمو الخلايا وتطورها في الوقت الفعلي. ويمكن أن تكون هذه الأنظمة مفيدة بشكل خاص في دراسات الرحلات الفضائية، حيث يمكن إرسالها إلى الفضاء، كما هو الحال في محطة الفضاء الدولية (ISS)، للتحقيق في تأثير السفر الفضائي على جسم الإنسان. ويتمثل العائق الرئيسي أمام نجاح الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة في تكون الفقاعات، والتي قد تكون أكثر وضوحاً في ظروف الجاذبية الصغرى. تصف هذه الورقة تصميم وتجميع وتشغيل نظام زراعة خلايا فسيولوجي دقيق للاستخدام في الجاذبية الصغرى المحاكات (على سبيل المثال، التشغيل باستخدام آلة تحديد المواقع العشوائية أو جهاز الكلينوستات). وقد ثبت أن دمج مصيدة فقاعات مستقلة عن الاتجاه في الدائرة المائعية فعال للغاية في إزالة فقاعات الهواء في الجاذبية الصغرى وتمكين زراعة الخلايا البطانية على المدى الطويل. يمكن استخدام هذا النظام الموائعي الدقيق مغلق الحلقة والمستقل عن الاتجاه للتشغيل الخالي من الفقاعات لشرائح الأنسجة أو الأعضاء على الرقاقة لمحاكاة التأثيرات المشتركة للجاذبية الصغرى والتدفق، أو للنشر في المهمات الفضائية.
المقدمة
لقد ثبت الآن جيداً، من خلال آليات قيد البحث، أن القوى الميكانيكية تلعب دوراً حاسماً في الوظائف الخلوية وفي الحفاظ على التوازن الدقيق بين الصحة والمرض1. ومن بين جميع الضغوط البيئية، تعد قوة الجاذبية فريدة من نوعها، ويُفترض بحق أنها متجه ثابت لا يتغير في الغالبية العظمى من العلوم الطبية الحيوية. ومع ذلك، توفر الرحلات الفضائية بيئة فريدة من الجاذبية الصغرى، والتي قد يختلف فيها سلوك الكائنات الحية عما هو عليه على الأرض. وتظهر تجارب الرحلات الفضائية التي تشمل الحيوانات والبشر تغيرات ملحوظة في الفسيولوجيا، مما يؤكد دور الجاذبية في التوازن الداخلي للخلايا والكائنات الحية2.
أبدت وكالة ناسا ووكالات خاصة أخرى في الآونة الأخيرة اهتماماً ملحوظاً بتطوير رقائق نسيجية (أو أعضاء على رقاقة) لنشرها في المهمات الفضائية.3صُممت شرائح الأنسجة لمحاكاة الـ في الكائن الحي بنية تتيح لهم نمذجة التأثير الفسيولوجي والميكانيكي للجاذبية الصغرى وإشعاعات الفضاء بدقة عالية4من خلال استخدام خلايا مشتقة من المتبرعين، يمكن أيضاً استخدام الرقائق النسيجية لاستقصاء مدى حساسية رواد الفضاء للجاذبية الصغرى والإشعاع الفضائي، وتطوير تدابير وقائية مضادة.5على مدار السنوات الخمس الماضية، تمت محاكاة العديد من أجهزة الجسم، بما في ذلك الدماغ والكبد والأمعاء والأوعية الدموية والقلب والكلى والرئتين، باستخدام رقائق الأنسجة، وأُطلقت على متن محطة الفضاء الدولية (ISS).6. داخل الجسم الحيتُروى الأعضاء عن طريق الأوعية الدموية بدرجات متفاوتة، وهو ما يحدد فسيولوجيتها؛ فعلى سبيل المثال، يتوفر تروية دموية عالية في الكبد، بينما تكون أقل بكثير في الغضروف. لذا، ومن أجل محاكاة وظائف الأعضاء بدقة في المختبر، يُعد دمج التدفق السوائلي في الأنسجة والخلايا اعتباراً هاماً عند تطوير أنظمة الأعضاء على شريحة.
لقد استُخدمت الموائع الدقيقة لتروية الخلايا والأنسجة في أنظمة الأعضاء على شريحة7,8. ولا تقتصر مستويات تدفق السوائل المناسبة على دعم نقل العناصر الغذائية إلى النظام وإزالة الفضلات منه فحسب، بل تحافظ أيضاً على إجهاد القص الفسيولوجي الذي تتعرض له الخلايا. ومع ذلك، وفي الأبعاد الصغيرة، تشكل الفقاعات تحدياً مستمراً عند الحدود الطورية، مما يؤدي إلى قياسات غير دقيقة وأضرار وانسدادات9. وللتخفيف من هذه المشكلة، استُخدمت مصائد الفقاعات بتصاميم نشطة (مثل إزالة الغازات بالتفريغ أو المجالات الخارجية مثل الموجات الصوتية أو الحرارية) وتصاميم خاملة (مثل الغشاء شبه المنفذ الذي يعتمد على خصائص السطح)10,11. غير أن تصاميم مزيلات الفقاعات المائعية الدقيقة هذه تزيد من تعقيد تصنيع الأجهزة، وتؤثر سلباً على سلامة العينة، وتؤدي إلى الانسداد واختراق الحاجز. وتتفاقم هذه المشكلات في الفضاء، حيث يكون التنوي وتكون الفقاعات أكثر وضوحاً بكثير، وتصبح استراتيجيات التخفيف من الفقاعات الفعالة على الأرض غير فعالة إلى حد كبير12. ويمكن إنشاء نظائر للجاذبية الصغرى على الأرض باستخدام أجهزة مثل وعاء الجدار الدوار (RWV) أو آلة التموضع العشوائي (RPM)13,14. ومن المثير للاهتمام أنه في آلة RPM، يتم إعادة توجيه متجه الجاذبية باستمرار، مما يؤدي تقريباً إلى تصفير متوسط المحفز الجذبي الصافي بمرور الوقت على العينة. لقد أبلغنا مؤخراً عن تصميم وتصنيع وتطبيق مصيدة فقاعات مستقلة عن التوجيه للزراعة التروية للخلايا البطانية تحت جاذبية صغرى محاكات باستخدام RPM15. ونصف في هذا المقال عملية التجميع والتشغيل خطوة بخطوة لنظام تروية ذي حلقة مغلقة باستخدام مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه، ونوضح مدى قابليتها للتطبيق في زراعة الخلايا البطانية لوريد السرة البشري كنموذج لزراعة الخلايا المستمرة في جاذبية صغرى محاكات.
يتكون نظام الحلقة المغلقة من متحكم دقيق مزود بمشغل محرك لتشغيل مضخة دقيقة يتم التحكم في ترددها وجهدها، ومستشعر لتدفق السوائل، ومصيدة فقاعات15، وقناة مائعية دقيقة تحتوي على خلايا بطانية ملتصقة. تتوفر تفاصيل المكونات المحددة في جدول المواد. تصف البروتوكولات أدناه تجميع إلكترونيات النظام (الخطوة 1)، وتجميع الدوائر المائعية (الخطوة 2)، والتعقيم والتحضير (الخطوة 3 و4)، وتكامل زراعة الخلايا المائعية الدقيقة (الخطوة 4)، وتجميع المضخات الدقيقة والمتحكم (الخطوة 5)، وتجميع النظام بأكمله داخل غلاف (الخطوة 6). تم تركيب نظام تدفق الحلقة المغلقة فوق جهاز RPM لمحاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام غلاف مصنع خصيصاً (الخطوة 7).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إلكترونيات النظام
- قم بتوصيل مشغل المضخة بالمتحكم الدقيق في المقابس المخصصة والمسمى "mp-Highdriver4".
- قم بتوصيل كابل مضخة واحد في الموقع المخصص على جانب مشغل المضخة المسمى "CH1 CH2".
- قم بتوصيل مضخة دقيقة واحدة بأحد منافذ كابل المضخة. تأكد من سحب منفذ التوصيل الأبيض برفق بعيداً عن الأسلاك الملونة لإدخال المضخة الدقيقة بالكامل. وبمجرد إدخال المضخة الدقيقة تماماً في منفذ التوصيل، ادفع منفذ التوصيل الأبيض برفق مرة أخرى باتجاه الأسلاك الملونة لتثبيت المضخة الدقيقة في مكانها.
- استخدم كابل macro-to-mini-USB لتوصيل لوحة Nano بجهاز كمبيوتر مثبت عليه تطبيق المتحكم الدقيق.
- قم بتثبيت وصلتي مهماز مسننتين (threaded barb adapter fittings) على طرفي مستشعر تدفق السوائل. استخدم مستشعر تدفق السوائل لمراقبة وتسجيل بيانات معدل تدفق السائل. يظهر النظام المجمّع في الشكل 1.
ملاحظة: لا يلزم استبدال جميع المكونات الواردة في القسم 1 إلا عند الضرورة، كما هو الحال عند تلفها أو عندما يبدأ الأداء في التدهور.
2. توصيلات مائيات النظام
- املأ تجويف مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه بنسبة 80% تقريباً من السعة القصوى بسائل العمل التجريبي أثناء عملية التحضير.
ملاحظة: يسمح مستوى الملء هذا بمعدلات أعلى لاحتجاز الفقاعات مع الحفاظ على غمر منافذ الدخول والخروج في سائل العمل. تحتوي مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه على منفذين جانبيين بالقرب من مركزها يعملان كوصلات مباشرة بنظام التدفق ذي الحلقة المغلقة، ومنفذ علوي متوافق مع Luer يسمح بمزيد من ملء التجويف عند فتحه. قبل بدء التجربة، من الضروري إغلاق المنفذ العلوي لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه تماماً باستخدام مزيج من شريط Teflon وسدادة Luer لضمان وجود نظام مغلق بالكامل. - اقطع أربعة أطوال من أنابيب PVC بطول 10 cm لكل منها (1.59 mm I.D. × 3.18 mm O.D.) لتوصيل جميع مكونات حلقة التدفق معاً.
- قم بتوصيل قطعة واحدة من أنبوب PVC بمخرج المضخة الدقيقة (يشير السهم الموجود إلى اتجاه التدفق من المدخل إلى المخرج). استخدم فاصلًا دائريًا من النايلون الأسود مقاس 3 mm (3.2 mm I.D.) حول أنبوب PVC لتثبيت الأنبوب بإحكام في المضخة الدقيقة. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PVC بأي من المنفذين الجانبيين لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه.
- استخدم القطعة الثانية من أنبوب PVC لتوصيل المنفذ الجانبي الآخر لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه بوصلة محول المدخل الشائكة لمستشعر تدفق السوائل (يشير السهم الموجود إلى اتجاه التدفق من المدخل إلى المخرج).
- استخدم القطعة الثالثة من أنبوب PVC لتوصيل وصلة محول المخرج الشائكة لمستشعر تدفق السوائل (أي الجانب الذي يشير إليه السهم) بموصل Luer كوع واحد.
- قم بتوصيل القطعة الأخيرة من أنبوب PVC بمدخل نفس المضخة الدقيقة (يشير السهم الموجود إلى اتجاه التدفق من المدخل إلى المخرج). استخدم فاصلًا دائريًا من النايلون الأسود مقاس 3 mm (3.2 mm I.D.) حول أنبوب PVC لتثبيت الأنبوب بإحكام في المضخة الدقيقة. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PVC بموصل Luer كوع واحد.
ملاحظة: يجب استبدال جميع الأنابيب بين كل تجربة وأخرى.
3. التحضير التجريبي وتعقيم النظام
- جهز كابينة السلامة الحيوية لعملية التعقيم لضمان التعقيم الكامل والسلامة من أجل المزرعة الخلوية.
- جهز أنبوب طرد مركزي ذاتي الوقوف سعة 50 mL يحتوي على إيثانول بتركيز 70%، وأنبوب طرد مركزي ذاتي الوقوف آخر سعة 50 mL يحتوي على ماء مزرعة خلوية معقم.
- ضع المتحكم الدقيق في كيس بلاستيكي صغير، مع ترك كابل المضخة والمضخة الدقيقة خارج الكيس. استخدم رباطاً بلاستيكياً (zip tie) لإغلاق الكيس البلاستيكي لحماية المكونات الإلكترونية.
- استخدم زجاجة بخاخ إيثانول بتركيز 70% ومناشف ورقية لتعقيم الأسطح الخارجية لجميع مكونات حلقة التدفق وجميع المواد التجريبية المتنوعة. لا تستخدم بخاخ الإيثانول بتركيز 70% على أي من الموصلات الكهربائية. ضع كل مكون ومادة داخل كابينة السلامة الحيوية فور مسحها بالإيثانول بتركيز 70%.
- قم بتوصيل محطة كمبيوتر متنقلة بالمتحكم الدقيق باستخدام كابل macro-to-mini-USB، وافتح تطبيق الكمبيوتر الخاص بالمتحكم الدقيق لضبط التردد والجهد للمضختين الدقيقتين على 100 Hz و 240 V، على التوالي. أبقِ المضخة الدقيقة مطفأة.
- اغمر موصل Luer الكوعي المتصل بالمضخة الدقيقة مباشرة في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 mL الذي يحتوي على إيثانول بتركيز 70%. قم بتوصيل محقنة سعة 12 mL مزودة بمقرن Luer (أنثى-إلى-أنثى) بموصل Luer الكوعي الآخر في حلقة التدفق نفسها.
- اضغط يدوياً على طول أنبوب PVC الذي يربط بين المضخة الدقيقة وموصل Luer الكوعي، وتأكد من إغلاق المنفذ العلوي لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه باستخدام شريط تيفلون و سدادة Luer. استخدم يدك الأخرى لسحب محقنة 12 mL بمقدار 5 mL تقريباً لخلق فراغ كافٍ في جميع أنحاء النظام.
- قم بتشغيل المضخة الدقيقة وحرر المشبك من الخطوة السابقة. اسمح لـ 5 mL من الإيثانول بتركيز 70% بالمرور إلى المحقنة لضمان التعقيم الشامل للنظام.
- افتح المنفذ العلوي لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه للسماح بامتلاءها بالإيثانول بتركيز 70%. وبمجرد أن تصل مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه إلى سعة 80% تقريباً من الإيثانول بتركيز 70%، أطفئ المضخة وأغلق المنفذ العلوي تماماً باستخدام شريط تيفلون وسدادة Luer. رج مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه برفق لضمان تعقيم الجزء الداخلي بالكامل.
- أخرج موصل Luer الكوعي من أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على إيثانول بتركيز 70% وشغل المضخة الدقيقة لتفريغ النظام. وبمجرد سحب كل الإيثانول بتركيز 70% إلى محقنة 12 mL، افصل مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه من النظام، وأزل سدادة Luer، وأفرغ مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه مباشرة في حاوية النفايات للتخلص من الإيثانول بتركيز 70%.
- كرر الخطوات من 3.6 إلى 3.10 باستخدام أنبوب الطرد المركزي ذاتي الوقوف سعة 50 mL الذي يحتوي على ماء مزرعة خلوية معقم بدلاً من الإيثانول بتركيز 70%، واسمح لـ 15 mL من ماء المزرعة الخلوية المعقم بالمرور عبر كل حلقة تدفق.
4. تحضير النظام ودمج القناة الخلوية للموائع الدقيقة
- بعد اكتمال التعقيم، احتفظ بالنظام داخل كابينة السلامة البيولوجية لإجراء التحضير بالتفريغ باستخدام السائل التشغيلي.
- اغمر موصل Luer الكوعي المتصل بالمضخة الدقيقة مباشرة في حاوية بلاستيكية (أبعادها التقريبية 80 mm × 50 mm × 25 mm) مملوءة بـ 30 mL من وسط زراعة الخلايا. قم بتوصيل محقنة سعة 12 mL بموصل Luer الكوعي الآخر في نفس حلقة التدفق باستخدام قارن Luer من أنثى إلى أنثى.
- استخدم إصبع السبابة والإبهام من يدك اليسرى لغلق قطعة PVC Tygon التي تربط بين المضخة الدقيقة وموصل Luer الكوعي، واستخدم يدك اليمنى لسحب المحقنة سعة 12 mL بمقدار 5 mL تقريباً لإنشاء فراغ كافٍ في جميع أنحاء النظام. تأكد من أن المنفذ العلوي لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه محكم الإغلاق باستخدام شريط Teflon و سدادة Luer.
- قم بتشغيل المضخة الدقيقة وتحرير الغلق من الخطوة السابقة. اسمح لـ 5 mL من وسط زراعة الخلايا بالمرور إلى المحقنة لضمان التحضير الكامل للنظام.
- افتح المنفذ العلوي لمصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه للسماح بملئها بوسط زراعة الخلايا. بمجرد أن تصل مصيدة الفقاعات المستقلة عن التوجيه إلى سعة 80% تقريباً من وسط زراعة الخلايا، أوقف تشغيل المضخة وأغلق المنفذ العلوي تماماً باستخدام شريط Teflon وسدادة Luer.
- ضع القناة المائعية الدقيقة المزروعة بالخلايا مباشرة في الحاوية البلاستيكية ذات الأبعاد 80 mm × 50 mm × 25 mm، وضع قضيب التحريك المغناطيسي في مركز القناة المائعية الدقيقة المزروعة بالخلايا لمنعها من الطفو. املأ الحاوية البلاستيكية بمزيد من وسط زراعة الخلايا حتى تغمر الشريحة بالكامل.
ملاحظة: تمت زراعة الخلايا البطانية في ibidi µ-Slide VI0.4 حتى تصل إلى 80% من الالتحام باستخدام البروتوكولات القياسية قبل دمجها في حلقة التدفق16. - أثناء إبقاء موصلات Luer الكوعية لحلقة تدفق واحدة مغمورة في وسط زراعة الخلايا، قم بتشغيل المضخة الدقيقة الخاصة بتلك الحلقة. قم بتوصيل موصلات Luer الكوعية بعناية بإحدى القنوات المائعية الدقيقة وتأكد من عدم تكون فقاعات هواء عند نقاط التوصيل. بمجرد الانتهاء من ذلك، أوقف تشغيل المضخة الدقيقة.
5. غلاف المتحكم الدقيق والمضخات الدقيقة (اختياري)
- استخدم برغيين من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 × 8، وحلقتين من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3، وصامولتين من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 لتثبيت حامل العارضة العرضي المصنع خصيصاً بلوحة التثبيت السفلية المصنعة خصيصاً.
- استخدم أربعة براغي من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 × 12، وأربع حلقات من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3، وأربع صواميل من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 لتثبيت الجزء السفلي من غلاف البولي كربونات بلوحة التثبيت السفلية المصنعة خصيصاً. استخدم ثماني حلقات نايلون بمقاس M3 (حلقتان عند كل برغي M3 × 12) لترك مسافة صغيرة بين الجزء السفلي من الغلاف ولوحة التثبيت السفلية.
- استخدم أربعة براغي بمقاس M3، وأربعة فواصل سداسية من النايلون (ذكر-أنثى) بمقاس M3، وأربع صواميل من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 لتثبيت المتحكم الدقيق بلوحة التثبيت الداخلية الأكريليكية المصنعة خصيصاً. ضع الفواصل السداسية من النايلون بين الجزء السفلي من المتحكم الدقيق ولوحة التثبيت الأكريليكية.
- استخدم برغيين من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 × 8، وحلقتين من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3، وصامولتين من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 لتثبيت حامل المضخات الدقيقة المصنع خصيصاً بالجزء العلوي من لوحة التثبيت الداخلية الأكريليكية.
- ضع المضخات الدقيقة في حامل المضخات الدقيقة المصنع خصيصاً بحيث يشير السهم الموجود على المضخات الدقيقة باتجاه مشغل المضخة.
- استخدم أربعة براغي ذات رأس زرّي من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 × 8 وأربع حلقات من الفولاذ المقاوم للصدأ بمقاس M3 لتثبيت لوحة التثبيت الداخلية الأكريليكية بالداخل من غلاف البولي كربونات.
- أدخل أربع حلقات مطاطية مانعة للتسرب في أحد جانبي غلاف البولي كربونات الذي يحتوي على أربعة ثقوب متتالية. كرر العملية للجانب المقابل الذي يحتوي على أربعة ثقوب متتالية.
- استخدم آلة صنع الملصقات لترقيم الحلقات المطاطية من 1 إلى 4 من اليسار إلى اليمين على كلا جانبي غلاف البولي كربونات.
- ثبّت حلقتي O-Rings حول الجزء المسنن من كابل mini-USB (ذكر-أنثى). بمجرد القيام بذلك، أدخل الطرف الأنثوي من كابل mini-USB (ذكر-أنثى) عبر الثقب الموجود في غلاف البولي كربونات من نفس جانب أسهم المضخات الدقيقة. ثبّت الطرف الأنثوي من كابل mini-USB (ذكر-أنثى) بتثبيت حلقة O-Ring أخرى حول الجزء المسنن من الخارج في غلاف البولي كربونات.
- أغلق الثقب المتبقي في جانب غلاف البولي كربونات باستخدام شريط لاصق متعدد الأغراض. يظهر النظام المجمّع في الشكل 2.
6. لوحة تثبيت السطح العلوي (اختياري)
- استخدم أربع قطع من M2 × 8 براغي من الفولاذ المقاوم للصدأ وأربع صواميل M2 من الفولاذ المقاوم للصدأ لتثبيت مشبكي تركيب مستشعر التدفق بلوحة تثبيت السطح العلوي المصنوعة من الأكريليك والمصممة خصيصاً.
- استخدم أربعة براغي من نوع M3 × 12 برغيًا من الفولاذ المقاوم للصدأ وأربع صواميل M3 من الفولاذ المقاوم للصدأ لتثبيت حاملي مصيدة فقاعات (bubble trap holders) مُصنَّعَين خصيصاً ومستقلَّيْن عن التوجيه في لوحة تثبيت السطح العلوي المصنوعة من الأكريليك والمصنَّعة خصيصاً.
- استخدم كماشة لقص قضيب فولاذي مسنن M4 إلى أربع قطع بطول 110 مم تقريباً لكل منها. استُخدم هذه القطع الأربع كدعامات عمودية لتثبيت لوحة تركيب السطح العلوي فوق الغلاف المصنوع من البوليكربونات.
- استخدم مقصاً لقص أربعة قطع من أنبوب البولي يوريثان (بقطر خارجي 6.35 مم) بطول 40 مم لكل قطعة. مرر قطع قضيب الفولاذ المسنن M4 عبر أقسام هذه الأنابيب لضمان وجود خلوص كافٍ بين لوحة تثبيت السطح العلوي وغطاء الغلاف المصنوع من البولي كربونات.
- باستخدام حوامل مصيدة الفقاعات المصممة خصيصاً والمستقلة عن التوجيه، ومع توجيه مشابك التثبيت إلى الأعلى، مرر إحدى قطع القضبان المسننة M4 الأربعة إلى منتصف كل زاوية من زوايا لوحة تثبيت السطح العلوي المصنوعة من الأكريليك والمصممة خصيصاً. وفي الطرف العلوي من كل قطعة قضيب مسنن، ثبت صامولة مجنحة M4 واحدة، وصامولة M4 واحدة، وحلقة معدنية واحدة.
- مرر كل قطعة من القضيب المسنن M4 عبر فاصل دائري واحد من النايلون الأسود بقطر 6 مم (قطر داخلي 3.2 مم) وقطعة واحدة من أنبوب البولي يوريثان بطول 40 مم. وأخيرًا، ثبت صامولة مجنحة M4 واحدة في أسفل كل قضيب مسنن M4. رتب المكونات وفق الترتيب التالي: صامولة مجنحة M4 من الفولاذ، صامولة M4 من الفولاذ المقاوم للصدأ، حلقة M4 من الفولاذ المقاوم للصدأ، لوحة تثبيت السطح العلوي، فاصل دائري من النايلون الأسود، أنبوب البولي يوريثان، وصامولة مجنحة أخرى M4 من الفولاذ.
- استخدم شريطاً لاصقاً عام الأغراض لتثبيت قطعتين بطول 75 مم × تثبيت قطع أكريليك خام بعرض 25 مم مقابل بعضها البعض وجهاً لوجه، بحيث تكون أطوال ألواح الأكريليك متوازية فيما بينها.
- استخدم مقصاً لقص قطعة من الشريط الرغوي مزدوج الوجه بطول 75 مم (وعرض 25 مم) × (بسماكة 1.6 مم). ألصق أحد جانبي الشريط الرغوي مزدوج الوجه بطول 75 مم على الجزء الذي يبلغ طوله 75 مم × قطعة أكريليك فارغة بعرض 25 مم، بحيث يكون طول الشريط الرغوي وطول قطعة الأكريليك الفارغة متوازيين فيما بينهما.
- استخدم هذه القطعة الأكريليكية الفارغة المثبتة بشريط رغوي كوسادة تستقر فوق موصلات "لوير" المرفقية بالشريحة الدقيقة لمنع ارتخائها أثناء تجارب الجاذبية الصغرى المحاكية. ثبّت الوسادة الأكريليكية الفارغة المثبتة بشريط رغوي والشريحة الدقيقة معاً باستخدام حامل شرائح دقيقة مصنع خصيصاً لهذا الغرض.
7. التثبيت على جهاز تحديد المواقع العشوائي (RPM)
- استخدم شريطاً رغويّاً مزدوج الوجه لتثبيت جميع مكونات نظام التدفق على لوحة تثبيت جهاز الـ RPM. تجنب وضع الشريط مباشرة أسفل القنوات الدقيقة لاستزراع الخلايا للسماح بالتبادل الغازي الخلوي أثناء التجربة. تأكد من تثبيت الشريحة الدقيقة في مركز لوحة التثبيت لضمان بقاء الشريحة الدقيقة عند محاور دوران جهاز الـ RPM أثناء التجربة.
- مرر لوحة التثبيت عبر الفتحة الأعلى في إطار U الخاص بجهاز الـ RPM، وثبّت لوحة التثبيت بإطار U باستخدام المسمار والحلقة المرفقين مع الجهاز.
- استخدم موصل تقسيم DB15 تم توصيله سلكياً بشكل صحيح مسبقاً لربط محطة الكمبيوتر مباشرة بجهاز الـ RPM، والذي سيتم توصيله بدوره بالمتحكم الدقيق ومستشعرات تدفق السوائل باستخدام موصل تقسيم DB15 ثانٍ تم توصيله سلكياً مسبقاً.
ملاحظة: تعمل الحلقة الانزلاقية لجهاز الـ RPM على ربط موصلي DB15، مما يربط محطة الكمبيوتر فعلياً بالمتحكم الدقيق ومستشعر التدفق. - قم بتوصيل كابلات الطاقة للمتحكم الدقيق ومستشعر التدفق، وثبّت أطوال الكابلات الفائضة باستخدام روابط بلاستيكية. يجب تثبيت الكابلات بإحكام، مع التأكد من أن التوصيلات الكهربائية ليست معرضة للإجهاد. يظهر النظام المجمّع في الشكل 3.
8. جمع بيانات التدفق
- افتح برنامج مستشعر التدفق على محطة الكمبيوتر لمراقبة معدل التدفق.
- استخدم التطبيق الحاسوبي للمتحكم الدقيق لضبط جهد المضخة حتى يقرأ مستشعر التدفق معدل التدفق المطلوب.
- بمجرد ضبط معدل التدفق، ابدأ في تسجيل بيانات التدفق لمدة 24 h.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قبل جمع النتائج المتعلقة بالديناميكا المائعية أو المزارع الخلوية، كما هو موضح أدناه، يجب التحقق من سلامة النظام عند كل نقطة تفتيش رئيسية في البروتوكول طوال عمليات التجميع والتحضير. يمكن فحص التوصيلات الإلكترونية بسهولة عن طريق توصيل المتحكم الدقيق ومستشعر تدفق السوائل بجهاز كمبيوتر والتواصل مع كل مكون عبر برنامج التطبيق الخاص به. وتعتبر توصيلات الأنابيب عند الوصلات المسننة كافية بمجرد دفع الأنبوب إلى ما بعد السن، ويجب استبدال أي مكون مائعي تظهر به أي شقوق على الفور. كما يجب أن يؤدي تحضير النظام إلى تكوين حلقة تدفق ليست م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطوير نظام مائعات دقيقة مغلق الحلقة ومستقل عن التوجه، قادر على العمل في غياب الجاذبية، وأثبتت التجارب فعاليته في زراعة الخلايا البطانية تحت ظروف التدفق الفسيولوجية. وتتمثل المكونات الرئيسية للنظام في متحكم دقيق، ومضخة دقيقة، ومستشعر لتدفق السوائل، وشريحة زراعة خلوية دقيقة، ومصيدة فقاعات مستقلة عن التوجه ومطبوعة بتقنية ثلاثية الأبعاد ومصممة خصيصاً.
تم تصنيع مصائد الفقاعات المستخدمة في هذا العمل من راتنج الطباعة بالتجسيم 15، والذي يتميز عمومًا بتوافق خلوي منخفض عند است...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
إن مصيدة الفقاعات متعددة الاتجاهات محمية بموجب طلب براءة الاختراع US 18634723. لا توجد تضاربات مصالح إضافية.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة بيولوجيا الفضاء من وكالة ناسا (NASA Space Biology) رقم 80NSSC21K0272.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إيثانول 100% | Fisher Scientific | A4094 | تُستخدم لتحضير محلول إيثانول بتركيز 70% لتعقيم النظام (الحد الأدنى المطلوب 35 مل) |
| فاصل دائري من النايلون الأسود بمقاس 6 مم، القطر الخارجي 7 مم، والقطر الداخلي 3.2 مم | إكسكوتو (Exqutoo) | ZH-0050 | تثبيت الجزء العلوي في الهيكل (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| لوح أكريليك، بطول 75 مم × عرض 25 مم | بوليمرسان (Polymersan) | نظام التحكم في التكييف والتدفئة والتهوية المركزي (ACRCS) | تثبيت محولات Luer الكوعية بالشريحة ذات القنوات الدقيقة (العدد الأدنى المطلوب: 1) |
| كابل USB 2.0 من نوع A-male إلى mini-B | شركة يوجرين المحدودة (Ugreen Group Limited) | 10355 | لتوصيل الكمبيوتر بالمتحكم الدقيق (الحد الأدنى المطلوب 1) |
| مصيدة الفقاعات | (مخصص) | لمنع مرور الفقاعات إلى الشريحة المجهرية (الحد الأدنى المطلوب: 1) | |
| حامل مصيدة الفقاعات | مخصص | حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد لتثبيت مصيدة الفقاعات في مكانها (مطلوب 2 كحد أدنى) | |
| ماء بدرجة نقاوة مناسبة للاستزراع الخلوي | Fisher Scientific | MT25055CI | تُستخدم لشطف جميع آثار الإيثانول بعد التعقيم (الحد الأدنى المطلوب 30 مل) |
| حامل وحدة التحكم والمضخة والغطاء (حامل داخلي) | مخصص | لوحة تثبيت داخل الغلاف (الحد الأدنى المطلوب 1) | |
| حامل القضيب العرضي | مخصص | لوحة تثبيت الغلاف الملحقة بقضيب تثبيت عرضي (الحد الأدنى المطلوب: 1) | |
| موصلات DB15 تفريعية ذكر + أنثى | ANMBEST | ANMBEST_MDDB15 | لتوصيل الكمبيوتر بآلة التموضع العشوائي ثم بالمتحكم الدقيق (الحد الأدنى المطلوب 1) |
| موصل لوير كوع إلى شائكة | ibidi | 10802 | يربط الشريحة المجهرية بدورة التدفق (الحد الأدنى المطلوب 2) |
| شريط رغوي مزدوج الوجه | 3M | 4026 | لضغط محولات Luer الزاوية على شريحة القنوات الدقيقة (الحاجة الدنيا: 1) |
| غلاف (60 مم × 140 مم × 140 مم) | هاموند | 1554Q2GYCL | يحتوي على المتحكم الدقيق والمضخات الدقيقة (الحد الأدنى المطلوب 1) |
| حامل الغلاف (حامل سفلي) | مخصص | لوحة تثبيت أسفل الغلاف (الحد الأدنى المطلوب 1) | |
| وصلة لوير أنثى-أنثى | بواو | حقن بو آو-WAD2354 | تُستخدم لتوصيل المحقنة بموصل لوير (Luer) الكوع لتحضير وسط المزرعة الخلوية (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| وسط زراعة الخلايا Gibco RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875093 | تُستخدم لاستزراع الخلايا البطانية (الحد الأدنى المطلوب 50 مل) |
| حلقات تثبيت، 9/16" قطر الثقب و1/8" السُمك، 1/8" معرف | McMaster-Carr | 9307K863 | لتمرير الأنابيب من وإلى الحاوية (الحد الأدنى المطلوب 8) |
| وصلة محول IDEX P-646، 1/16" وصلة مسننة إلى 1/4-28 | إندكس (IDEX) | P-646 | توصيل مستشعر التدفق بدائرة التدفق (يلزم وجود 2 كحد أدنى) |
| مستشعر تدفق السوائل | Sensirion | SLF3-1300F | لجمع بيانات التدفق (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| مشبك تثبيت مستشعر تدفق السوائل | Sensirion | مشبك تثبيت SLF3x | حامل SLF3x (الحد الأدنى المطلوب 2) |
| حقنة ذات قفل لوير (12 مل) | McKesson | 414624 | للتجهيز بالتفريغ (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| سدادة لوير (Luer plug) | Cole-Parmer | UX-50110-33 | لإحكام إغلاق مصائد الفقاعات المستقلة عن الاتجاه (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| صامولة M2 من الفولاذ المقاوم للصدأ | VIGRUE | B07PJQC7T6 | تثبيت مستشعرات تدفق السوائل في الحامل العلوي (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| M2×8 براغي من الفولاذ المقاوم للصدأ | VIGRUE | B07PJQC7T6 | تثبيت مستشعرات تدفق السوائل في الحامل العلوي (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| فاصل سداسي من النايلون M3 ذكر-أنثى | ميجبول | B0GC6GN9S7 | تثبيت لوحة mp-Multiboard في الحامل الداخلي (يلزم 4 على الأقل) |
| حلقة مانعة للتسرب من النايلون M3 | سوتيمريبور (Sutemribor) | 7.81573E+11 | تثبيت الغلاف في القاعدة (العدد الأدنى المطلوب 16) |
| صامولة M3 من الفولاذ المقاوم للصدأ | فيغرو (VIGRUE) | B07PJQC7T6 | تثبيت الهيكل بالقاعدة السفلية، والعارضة العرضية بالقاعدة السفلية، وحامل المضخة بالقاعدة الداخلية (العدد الأدنى المطلوب 16) |
| حلقة تثبيت (واشر) من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس M3 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | تثبيت العارضة العرضية في قاعدة التثبيت السفلية، والغلاف في قاعدتي التثبيت السفلية والداخلية، وقاعدة التثبيت الداخلية في حامل المضخة (الحد الأدنى المطلوب 12) |
| M3×برغي رأس زر من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 12 | فيجرو (VIGRUE) | B07PJQC7T6 | تثبيت الغلاف بالقاعدة (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| M3×برغي سداسي الرأس بمقبس من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 12 | شكل | FG001-3 | يُثبت حامل مصيدة الفقاعات في قاعدة السطح العلوي (يُشترط وجود 2 كحد أدنى) |
| M3×6 براغي فيليبس ذات رأس مقوس | ميجبول | B0GC6GN9S7 | تثبيت mp-Multiboard في حامل داخلي (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| M3×٨ براغي من الفولاذ المقاوم للصدأ | فيغرو (VIGRUE) | B07PJQC7T6 | تثبيت العارضة العرضية في القاعدة السفلية، والغطاء في المثبت الداخلي، وحامل المضخة في المثبت الداخلي (الحد الأدنى المطلوب 8) |
| صامولة M4 من الفولاذ المقاوم للصدأ | VIGRUE | B07PJQC7T6 | تثبيت القاعدة العلوية بالهيكل (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| حلقة تثبيت (وردة) من الفولاذ المقاوم للصدأ M4 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | تثبيت الحامل العلوي بالهيكل (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| قضيب مسنن من فولاذ M4-0.7 | يبدو أن النص المدخل "Arwnnklo" لا يحمل معنى علمياً أو لغوياً معروفاً، ويرجح أن يكون خطأً مطبعياً أو سلسلة عشوائية من الحروف. يرجى تزويدي بالنص العلمي المطلوب ترجمته. | AR01 | تقطع إلى أطوال تبلغ حوالي 6 بوصات (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| كابل USB صغير (ذكر إلى أنثى) | Plinkwirekb | PCM-0725-L | لتوصيل الكمبيوتر بالمتحكم الدقيق (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| موصل mini USB قائم الزاوية، ذكر إلى أنثى | سرطان بطانة الرحم | 4326453558 | لتوصيل الكمبيوتر بالمتحكم الدقيق (اختياري) (الحد الأدنى المطلوب 1) |
| حامل القنوات الدقيقة | مخصص | حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد للحفاظ على تمركز القناة الدقيقة (الحد الأدنى المطلوب: 1) | |
| شريحة ذات قنوات دقيقة، µ-الشريحة VI 0.4 | ibidi | 80606 | لاختبارات الخلايا تحت التدفق (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| مضخة دقيقة | بارتيلز | MP6-HYB | لإنتاج التدفق (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| حامل المضخة الدقيقة | مخصص | مثبت تثبيت لحمل المضخة الدقيقة (الحد الأدنى المطلوب: 1) | |
| لوحة mp-Multiboard مع mp-Highdriver4 | بارتلز | BM-E-0005 | للتحكم في إعدادات التردد والجهد للمضخات الدقيقة (الحاجة الدنيا: 1) |
| كابل المضخة mp-pump | بارتيلز | BM-A-0055 | تُستخدم لتوصيل لوحة mp-Multiboard كهربائيًا بالمضخات الدقيقة (الحد الأدنى المطلوب: 1) |
| فاصل نايلون دائري، القطر الخارجي 7 مم، القطر الداخلي 3.2 مم | هارفينجتون | 2037015 | لتثبيت الأنابيب بالمضخة الدقيقة (الحد الأدنى المطلوب 2) |
| حلقة دائرية مانعة للتسرب | ZDBB | 7.17327E+11 | تثبيت كابل mini USB (ذكر إلى أنثى) بالهيكل (اختياري) (الحد الأدنى المطلوب 3) |
| وعاء بلاستيكي | هيردوزا (Herdusa) | صندوق بلاستيكي HDS10 | تُستخدم كخزان مفتوح لوسط زراعة الخلايا (الحد الأدنى المطلوب 1) |
| أنابيب بولي يوريثان، 1/8 بوصة" القطر الداخلي، 1/4" الكثافة الضوئية | باركر | 95U-4-062-BLU-0100 | تثبيت الحامل العلوي في الهيكل (الحد الأدنى المطلوب 1.6 سم) |
| جهاز التموضع العشوائي | إيرباص | جهاز تحديد المواقع العشوائي 2.0 (الحد الأدنى المطلوب 1) | |
| كابل SCC1-USB | Sensirion | SCC1-USB 2M | توصيل مستشعرات تدفق السوائل بالكمبيوتر (يُشترط وجود واحد على الأقل) |
| أنبوب طرد مركزي ذاتي الوقوف | PEKYBIO | B0C13GZVD6 | تُستخدم لحفظ مياه زراعة الخلايا/إيثانول بتركيز 70% (الحد الأدنى المطلوب: 2) |
| فاصل، بقطر خارجي 8 مم، وطول 20 مم، من الألمنيوم | McMaster-Carr | 94669A062 | الحد الأدنى المطلوب 4 |
| أنبوب Tygon PVC مقاس 1/16" المعرف x 1/8" الكثافة الضوئية | Saint-Gobain | B-44-3 | يربط جميع مكونات حلقة التدفق (الحد الأدنى المطلوب 40 سم) |
| قاعدة تثبيت السطح العلوي | مخصص | لوحة تثبيت متصلة بمستشعرات تدفق السوائل ومصيدة فقاعات (الحد الأدنى المطلوب 1) | |
| صامولة مجنحة، M4 x 0.7 مم، فولاذ مطلي بالزنك | سيبتنك (Siptenk) | S-TH-DLM-002 | تثبيت الحامل العلوي بالهيكل (الحد الأدنى المطلوب 4) |
| رباط تثبيت بلاستيكي | يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته. | 7.32073E+11 | تثبيت الكابلات عند تركيب النظام على RPM (الحد الأدنى المطلوب 4) |
المراجع
- Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
- Krittanawong C, et al. Human health during space travel: state-of-the-art review. Cells. 2023;12(1):40.
- Parafati M, et al. Human skeletal muscle tissue chip autonomous payload reveals changes in fiber type and metabolic gene expression due to spaceflight. NPJ Microgravity. 2023;9:77.
- Mair DB, Tsui JH, Higashi T, Kim D. Spaceflight-induced contractile and mitochondrial dysfunction in an automated heart-on-a-chip platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(40):e2404644121.
- Kim S, et al. Skeletal muscle-on-a-chip in microgravity as a platform for regeneration modeling and drug screening. Stem Cell Rep. 2024;19(8):1061-1073.
- Mu X, et al. Small tissue chips with big opportunities for space medicine. Life Sci Space Res (Amst). 2022;35:150-157.
- Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23:467-491.
- Kong JS, Kim J, Jang J, Cho D. Advances and applications of organ-on-a-chip technology. Cell Rep Methods. 2026;6(3):101361.
- He X, et al. How to prevent bubbles in microfluidic channels. Langmuir. 2021;37(6):2187-2194.
- Gao Y, Wu M, Lin Y, Xu J. Trapping and control of bubbles in various microfluidic applications. Lab Chip. 2020;20(24):4512-4527.
- Yang M, et al. Emergence of debubblers in microfluidics: A critical review. Biomicrofluidics. 2022;16(3):031503.
- Zhang Q, et al. Bubble nucleation and growth on microstructured surfaces under microgravity. NPJ Microgravity. 2024;10:13.
- Radtke AL, Herbst-Kralovetz MM. Culturing and applications of rotating wall vessel bioreactor derived 3D epithelial cell models. J Vis Exp. 2012;(62):e3868.
- Wadhwa A, Bruun L, Petersen JCG, Petersen LG. Guidelines for use of the random positioning machine as a reduced-gravity analog. Sci Rep. 2026;16:10012.
- Vegunta B, et al. Orientation-independent bubble trap with internal partition for robust operation of microfluidic systems. Lab Chip. 2025;25(14):3423-3429.
- Evani SJ, et al. Monocytes mediate metastatic breast tumor cell adhesion to endothelium under flow. FASEB J. 2013;27(8):3017-3029.
- Musgrove HB, Catterton MA, Pompano RR. Applied tutorial for the design and fabrication of biomicrofluidic devices by resin 3D printing. Anal Chim Acta. 2022;1209:339742.
- Nam N, Hwangbo N, Jin G, Shim J, Kim J. Effects of heat-treatment methods on cytocompatibility and mechanical properties of dental products 3D-printed using photopolymerized resin. J Prosthodont Res. 2023;67(1):121-131.
- Shelhamer M, et al. Selected discoveries from human research in space that are relevant to human health on Earth. NPJ Microgravity. 2020;6:5.
- Fisher AB, Chien S, Barakat AI, Nerem RM. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001;281(3):L529-L533.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
