يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج فأري لإصابة الرئة المصاحبة لمرض فيروس كورونا 2019 المستحثة بواسطة فيروس كورونا المرتبط بالمتلازمة التنفسية الحادة 2 وعديد السكاريد الدهني

109 مشاهدة

⸱

سبتمبر 11, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذجًا للفئران لإصابة الرئة المرتبطة بمرض فيروس كورونا 2019، والتي يتم تحفيزها عن طريق الإعطاء المشترك عبر الأنف لفيروس SARS-CoV-2 وعديد السكاريد الشحمي (lipopolysaccharide). يتيح هذا النموذج دراسة الاستجابات الالتهابية الرئوية، وضعف استجابات الإنترفيرون من النوع الأول، والتدخلات العلاجية المحتملة.

الملخص

على الرغم من التطبيق الواسع للنطاق للتطعيمات والعلاجات المضادة للفيروسات، لا تزال عدوى SARS-CoV-2 تسبب معدلات مراضة ووفيات كبيرة بين الفئات السكانية الأكثر عرضة للخطر، مما يؤكد الحاجة الملحة لنماذج تجريبية موثوقة للتحقيق في الإمراض الخاص بـ COVID-19، وتوضيح آليات عمل الأدوية، وتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة. يمكن أن تسبب عدوى SARS-CoV-2 إصابة رئوية شديدة، تتميز باستجابات التهابية مفرطة وضعف في المناعة المضادة للفيروسات التي يتوسطها الإنترفيرون من النوع الأول (IFN-I)؛ ومع ذلك، لا تزال النماذج الحيوانية الحالية محدودة في محاكاة الاستجابات المناعية الالتهابية المختلة المرتبطة بـ COVID-19. لذا، تم تطوير نموذج فأر للإصابة الرئوية المرتبطة بـ COVID-19 والمحفزة بواسطة SARS-CoV-2 وLPS لمحاكاة السمات المناعية المرضية الرئيسية لـ COVID-19. ويحفز هذا النموذج سمات مرضية بارزة في أنسجة الرئة، بما في ذلك ارتشاح الخلايا الالتهابية، وتدمير البنية السنخية، وارتفاع تعبير السيتوكينات المحفزة للالتهابات، يصاحب ذلك ضعف في استجابات IFN-I. تقدم هذه الدراسة وصفاً تفصيلياً للإجراءات المستخدمة لإنشاء نموذج الفأر للإصابة الرئوية المحفزة بواسطة SARS-CoV-2 وLPS، وتتميز النموذج بشكل منهجي من خلال تحليلات التغيرات النسيجية المرضية للرئة، والحمل الفيروسي، والسيتوكينات الالتهابية، ومستويات IFN-I. يوفر هذا النموذج منصة تجريبية للتحقيق في الآليات المناعية الالتهابية الكامنة وراء الإصابة الرئوية المرتبطة بـ COVID-19 والعمليات المشاركة في إصلاح أنسجة الرئة، بينما يوفر أيضاً أساساً لتقييم الاستراتيجيات العلاجية التي تهدف إلى تخفيف الاختلال المناعي الالتهابي وتعزيز استعادة الوظيفة الرئوية.

المقدمة

منذ ظهوره في أواخر عام 2019، تسبب فيروس SARS-CoV-2 في تحدٍ عالمي للصحة العامة، ولا يزال التطور الفيروسي المستمر يفرض تحديات أمام اللقاحات والاستراتيجيات العلاجية الحالية1,2,3. لذلك، فإن إجراء المزيد من الاستقصاءات حول إصابة الرئة المرتبطة بـ COVID-19 أمر ضروري لتوضيح آليات المرض وتطوير الاستراتيجيات العلاجية.

يمكن أن تسبب العدوى بـ SARS-CoV-2 إصابة رئوية شديدة، وقد تتطور إلى متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) ومتلازمة خلل وظائف الأعضاء المتعدد4,5. وتشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن الآلية المرضية للإصابة الرئوية المرتبطة بـ COVID-19 معقدة للغاية، حيث تتمثل السمة الرئيسية فيها في اختلال تنظيم الاستجابات المناعية والالتهابية6,7,8,9. فمن ناحية، يمكن للعدوى بـ SARS-CoV-2 أن تحفز استجابة التهابية مفرطة، تؤدي إلى إطلاق كميات هائلة من السيتوكينات المحفزة للالتهاب مثل interleukin-6 (IL-6)، وinterleukin-1β (IL-1β)، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، مما يؤدي إلى حدوث ما يسمى "عاصفة السيتوكين"10,11، والتي تُعتبر محركاً رئيسياً للإصابة الرئوية وتطور المرض. ومن ناحية أخرى، في المرحلة المبكرة من العدوى، يمكن لـ SARS-CoV-2 تثبيط استجابة IFN-I لدى المضيف من خلال آليات متعددة، مما يؤدي إلى ضعف المناعة المضادة للفيروسات التي يتوسطها IFN-I12,13,14. وبناءً على ذلك، تُعتبر الاستجابة المتأخرة للإنترفيرون المصحوبة بارتفاع مستويات السيتوكينات المحفزة للالتهاب سمة مميزة لـ COVID-196,15.

تعتمد النماذج الحيوانية المتاحة حالياً لمرض COVID-19 بشكل كبير على الفئران المعدلة وراثياً بـ hACE2، أو السلالات الفيروسية المتكيفة مع الفئران، أو أنواع أخرى مثل ابن عرس والرئيسيات غير البشرية16,17. ومع ذلك، غالباً ما تفشل نماذج عدوى SARS-CoV-2 التقليدية في الفئران في محاكاة السمات الالتهابية المفرطة لـ COVID-19 بشكل كامل18,19,20. ويؤدي LPS، وهو ناهض لـ TLR4، إلى استجابات التهابية قوية ويُستخدم على نطاق واسع في نماذج إصابة الرئة الحادة21. وبناءً على ذلك، تم تصميم النموذج المستحث بواسطة SARS-CoV-2 وLPS الموصوف في هذه الدراسة لإجراء تحقيقات تركز على إصابة الرئة المرتبطة بـ COVID-19، وخاصة الآليات الكامنة وراء التنشيط الالتهابي المفرط وضعف الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات. وبالمقارنة مع النماذج التي تعتمد على SARS-CoV-2 وحده، يبرز هذا النهج السمات المناعية الالتهابية مع الحفاظ على سياق العدوى الفيروسية. ويمتلك هذا النموذج إمكانات كبيرة لاستقصاء الآليات المناعية الالتهابية، بدلاً من نمذجة الانتقال الفيروسي أو المسار الطبيعي الكامل لعدوى SARS-CoV-2.

يوضح هذا البروتوكول الخطوات الإجرائية لإنشاء نموذج فأر للإصابة الرئوية المرتبطة بـ COVID-19 والمحفزة بواسطة SARS-CoV-2 وLPS. ونظراً لمحدودية النماذج الحالية في إعادة إنتاج الخلل المناعي الالتهابي المرتبط بـ COVID-19، يوفر هذا النهج منصة عملية لدراسة آليات المرض وتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة. وقد تم تقييم النموذج بشكل منهجي من خلال الفحص الهيستوباثولوجي للرئة، والحمل الفيروسي، والسيتوكينات الالتهابية، واستجابات IFN-I.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أثبتت هذه الدراسة نموذج فأر لإصابة الرئة المرتبطة بـ COVID-19 عن طريق التقطير الأنفي لـ SARS-CoV-2 وLPS، مما يوفر بديلاً مستقراً ومنخفض التكلفة لنماذج الفئران المعدلة وراثياً. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل مركز سيتشوان للسيطرة على الأمراض والوقاية منها، وحصل على موافقة أخلاقيات التعامل مع الحيوان [Sichuan CDC (Animal Ethics) Approval No. 005 (2025)]. وقد نُفذت جميع الإجراءات وفقاً صارماً للإرشادات ذات الصلة ولوائح السلامة البيولوجية.

تتوفر معلومات مفصلة حول الكواشف والمعدات الأساسية في جدول المواد.

1. تصميم بروتوكول الدراسة

  1. وزع فئران BALB/c عشوائياً على المجموعة الضابطة أو مجموعة النموذج.
  2. قم بإعطاء SARS-CoV-2 عن طريق الأنف للفئران في مجموعة النموذج في اليوم 0.
  3. قم بإعطاء LPS عن طريق الأنف للفئران في مجموعة النموذج في اليوم 2.
  4. قم بإعطاء حجم متساوٍ من المحلول الملحي العادي عن طريق الأنف لفئران المجموعة الضابطة في النقاط الزمنية المقابلة.
  5. قم بقتل جميع الفئران رحيمًا في اليوم 3 بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2 واجمع أنسجة الرئة للتحقق من صحة النموذج.
    ملاحظة: تم توضيح سير العمل التجريبي في الشكل 1A.

2. التحضير

  1. تحضير الحيوانات
    1. استخدم إناث فئران BALB/c خالية من مسببات الأمراض النوعية (SPF) تتراوح أعمارها بين 6 و8 أشهر وتزن حوالي 25–30 g.
    2. وزع الفئران عشوائياً على مجموعة ضابطة أو مجموعة نموذج باستخدام جدول أرقام عشوائي، بواقع أربعة حيوانات لكل مجموعة.
    3. أبقِ الفئران في ظروف مخبرية قياسية مع إتاحة الوصول الحر إلى الطعام والماء.
      ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة أن الفئران المسنة تكون أكثر عرضة للإصابة بفيروس SARS-CoV-2 عن طريق الأنف مقارنة بالفئران الأصغر سناً18,22. لذلك، تم اختيار فئران BALB/c مسنة في هذه الدراسة لتسهيل إنشاء نموذج لإصابة الرئة المرتبطة بفيروس SARS-CoV-2.
    4. قم بتلقيح كل فأر عن طريق الأنف بـ 100 µL من المعلق الفيروسي، وهو ما يعادل جرعة معدية نهائية قدرها 4.5 x 105 TCID₅₀ لكل فأر.
      ملاحظة: تم توفير فيروس SARS-CoV-2 من قبل مركز سيتشوان لمكافحة الأمراض والوقاية منها. السلالة المستخدمة في هذه الدراسة هي متغير Omicron من SARS-CoV-2، بتركيز مخزون فيروسي قدره 4.5 x 106 TCID₅₀/mL.
      تنبيه: نظراً لأن SARS-CoV-2 ميكروب شديد الإمراض، يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالفيروس في مرفق مستوى السلامة البيولوجية الحيوانية الثالث (ABSL-3). قم بتحسين الجرعة المعدية بناءً على التجارب الأولية عند استخدام متغيرات فيروسية أو نماذج حيوانية مختلفة.
  2. تحضير المخزون التشغيلي
    1. تحضير المحلول المخزون من LPS: زن 3 mg من مسحوق LPS وأذبه في 1 mL من المحلول الملح الفسيولوجي العادي. اخلط بلطف أو استخدم جهاز المرج (vortex) باستمرار حتى يذوب تماماً للحصول على محلول مخزون بتركيز 3 mg/mL. قبل الإعطاء، خفف المحلول المخزون بشكل إضافي باستخدام المحلول الملح الفسيولوجي العادي للوصول إلى التركيز التشغيلي المطلوب وفقاً لوزن جسم الفئران.
    2. تحضير المحلول المخدر: أعد تكوين المسحوق باستخدام مياه الحقن المعقمة المتوفرة في عبوة Zoletil لتحضير محلول بنسبة الكتلة إلى الحجم المطلوبة للاستخدام اللاحق.
    3. تحضير المحلول الفيروسي التشغيلي: أذب 1 mL من معلق فيروس SARS-CoV-2 ببطء على الثلج داخل خزانة السلامة البيولوجية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: اتبع تعليمات الشركات المصنعة المعنية عند تحضير واستخدام جميع المحاليل التشغيلية.

3. الإعطاء عن طريق الأنف في الفئران

  1. قم بوزن كل فأر قبل الإعطاء وسجل وزن الجسم.
  2. احسب جرعات Zoletil وLPS بناءً على وزن الجسم لكل فأر.
  3. قم بتحضير المحاليل العاملة المقابلة واسحب الأحجام المطلوبة باستخدام حقنة مناسبة للإعطاء اللاحق.
  4. تقييد الفأر: أمسك الفأر برفق من القفا باستخدام إبهام وسبابة اليد اليسرى، مع الإمساك بالجلد خلف الأذنين والرقبة.
  5. ضع الحيوان في راحة اليد مع استخدام البنصر والخنصر لتثبيت الظهر والذيل. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري بحيث يكون البطن مكشوفًا تمامًا والجسم مستقرًا.
  6. التطهير: قم بتطهير موقع الحقن البطني باستخدام 75% ethanol بواسطة مسحة قطنية معقمة.
  7. التخدير: أدخل إبرة الحقنة التي تحتوي على Zoletil (25mg/kg) على بُعد 0.5 cm تقريبًا من الخط الناصف للبطن السفلي. ادفع الإبرة بزاوية 45° في التجويف البريتوني إلى عمق يتراوح بين 2–3 mm تقريبًا بعد اختراق الجلد. قم بسحب المكبس للتأكد من عدم وجود دم، ثم أعطِ المخدر ببطء.
    ملاحظة: قم بتحسين جرعة المخدر بناءً على التجارب الاسترشادية لضمان التخدير الكافي وتقليل الوفيات. تجنب الوخز المتكرر لتقليل تلف الأنسجة.
  8. التأكد من التخدير: تأكد من حالة التخدير من خلال ملاحظة تنفس مستقر ومنتظم دون علامات عسر التنفس أو الضيق التنفسي.
  9. التقطير الأنفي لفيروس SARS-CoV-2 (اليوم 0): أعطِ 100 µL من معلق فيروس SARS-CoV-2 (50 µL لكل فتحة أنف) ببطء وعلى شكل قطرات على فتحات الأنف الخارجية باستخدام ماصة دقيقة أو حقنة أثناء دورة تنفسية مستقرة وعند بداية الشهيق.
  10. بدّل بين فتحات الأنف لتسهيل الاستنشاق الموحد. عالج فئران المجموعة الضابطة بحجم مساوٍ من المحلول الملحي العادي باستخدام نفس الإجراء.
    ملاحظة: أعطِ المحلول على شكل قطرات، مع التأكد من استنشاق كل قطرة داخل التجويف الأنفي قبل وضع القطرة التالية حتى الوصول إلى الحجم المستهدف.
  11. التعامل بعد الإعطاء: حافظ على رأس الفأر في وضع مرتفع قليلاً لمدة 30–60 s تقريبًا بعد التقطير الأنفي لتسهيل وصول المحلول إلى الجهاز التنفسي السفلي. أعد الفئران إلى أقفاصها بمجرد ملاحظة علامات التعافي من التخدير وراقبها حتى استعادة الوعي الكامل.
  12. التسجيل والمراقبة: سجل حجم الإعطاء ورقم تعريف كل فأر. راقب الحيوانات باستمرار طوال الفترة التجريبية للتأكد من حالة البقاء على قيد الحياة والحالة الفسيولوجية العامة.
  13. التقطير الأنفي لـ LPS (اليوم 2): أعطِ LPS للفئران في اليوم 2 بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2. قم بالإعطاء الأنفي لـ LPS (5 mg/kg) باتباع نفس البروتوكول المستخدم لإعطاء SARS-CoV-2. أعطِ حجمًا مساويًا من المحلول الملحي العادي لفئران المجموعة الضابطة باستخدام نفس الإجراء.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، تم إعطاء LPS والمحلول الملحي العادي باتباع نفس إجراء تلقيح SARS-CoV-2، بما في ذلك التخدير والإيصال الأنفي.

4. تشريح الفأر وجمع أنسجة الرئة

  1. يتم القتل الرحيم للفئران في اليوم الثالث بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 لجمع الأنسجة. تُخدر الحيوانات أولاً ثم تُذبح عن طريق الخلع العنقي. تُعالج فئران المجموعة الضابطة باستخدام الإجراء نفسه.
    ملاحظة: للحصول على إجراءات مفصلة تتعلق بالخلع العنقي، راجع الملف التكميلي 1.
  2. ثبّت الفأر الذي تم إخضاعه للقتل الرحيم في وضعية الاستلقاء الظهري على لوح التشريح، مع كشف المنطقتين البطنية والصدرية بالكامل. رطّب فراء البطن باستخدام إيثانول بتركيز 75% لتقليل التلوث.
  3. استخدم مقصاً معقماً لقص عظمة القص بعناية على طول الحواف الضلعية الثنائية، وافتح التجويف الصدري تدريجياً. استخدم الملاقط لإبعاد الأنسجة برفق وتشريح الرئتين خطوة بخطوة من الهياكل الصدرية المحيطة مع تقليل الإصابات الميكانيكية لأنسجة الرئة.
    ملاحظة: يجب التحكم في اتجاه أطراف المقص بدقة أثناء القص لتجنب إلحاق الضرر بالقلب والرئتين والهياكل الوعائية الرئيسية.
  4. ضع أنسجة الرئة المستأصلة فوراً في محلول PBS أو محلول ملحي عادي مبرد مسبقاً، واشطفها برفق من 2 إلى 3 مرات لإزالة بقايا الدم والحطام. جفف السوائل الزائدة عن السطح بعناية باستخدام ورق ترشيح خالٍ من الوبر، وتجنب الضغط لمنع حدوث تلف هيكلي في الأنسجة.
  5. زن أنسجة الرئة المعالجة على الفور باستخدام ميزان إلكتروني وسجل القياسات.
  6. استأصل الفص الذيلي الأيمن وثبته فوراً في بارافورمالديهيد بتركيز 4% بحجم يعادل 10 أضعاف حجم النسيج، وذلك لإجراء التحليل الهستوباثولوجي اللاحق.
    تنبيه: مادة البارافورمالدهيد سامة؛ لذا يجب التعامل معها وفقاً لإرشادات السلامة المؤسسية.
  7. اجمع أنسجة الرئة المتبقية، وقسمها إلى حصص في أنابيب تجميد (cryovials)، ثم جمدها بسرعة في النيتروجين السائل، وخزنها في درجة حرارة −80 °C لغرض الحفظ. خصص الفص القحفي الأيمن، والفص الأوسط الأيمن، والفص الملحق للكشف عن الحمل الفيروسي لـ SARS-CoV-2 والسيتوكينات المحرضة للالتهاب، واحتفظ بالرئة اليسرى لتحليل ELISA.
    تنبيه: النيتروجين السائل شديد البرودة؛ لذا يجب ارتداء قفازات مخصصة للتعامل مع المواد المبردة ونظارات واقية عند التعامل معه لتجنب الحروق الباردة أو لسعات الصقيع.
  8. نظف وعقم جميع الأدوات جيداً وفقاً للإجراءات القياسية بعد الانتهاء من عملية التشريح. تخلص من جثث الحيوانات والنفايات البيولوجية وفقاً للإرشادات المؤسسية والتنظيمية الخاصة بالتجارب على الحيوانات.

5. صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE)23

  1. تثبيت أنسجة الرئة الطازجة في 4% Paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 h.
    ملاحظة: يجب التحكم في وقت التثبيت بدقة؛ لتجنب التثبيت غير الكافي الذي قد يؤدي إلى عدم حفظ الأنسجة بشكل كامل، وتجنب التثبيت المطول الذي قد يسبب ارتباطاً تشابكياً مفرطاً للبروتينات ويؤثر على جودة الصبغ.
  2. معالجة الأنسجة المثبتة باستخدام جهاز معالجة الأنسجة الآلي لإجراء عمليات التجفيف المتدرج، والترويق، والتغلغل بالشمع (paraffin).
    ملاحظة: البروتوكول الخاص بجهاز معالجة الأنسجة الآلي متوفر في Supplementary File 2.
  3. وضع الأنسجة المتغلغلة بالشمع في قوالب التضمين، ثم إضافة الشمع المصهور وتوجيه النسيج بعناية.
  4. نقل القوالب إلى لوح تبريد للتصلب، ثم إخراج كتل الشمع من القوالب بعد التصلب التام.
  5. تركيب كتل الشمع على الميكروتوم (microtome) وضبط سطح القطع ليكون موازياً للشفرة، ثم الحصول على مقاطع تسلسلية بسمك يتراوح تقريباً بين 3–5 µm.
  6. نقل المقاطع فوراً إلى حمام مائي عند درجة حرارة 45 °C تقريباً لتعويمها والسماح لها بالتمدد الكامل.
  7. التقاط المقاطع باستخدام الشرائح عن طريق غمس أحد طرفي الشريحة رأسياً في الماء، واستخدام الملقط للمساعدة في التصاق المقاطع بشكل صحيح على سطح الشريحة.
  8. وضع الشرائح في مجفف شرائح عند 65 °C لمدة ساعة واحدة تقريباً لتعزيز التصاق الأنسجة.
    ملاحظة: يتم ضبط وقت التجفيف وفقاً لنوع النسيج، وسُمك المقطع، وحالة الجهاز، مع تجنب التسخين المفرط لمنع تلف الأنسجة.
  9. إجراء صبغ HE على المقاطع المجففة باستخدام جهاز صبغ آلي.
    ملاحظة: البروتوكول الخاص بجهاز الصبغ الآلي متوفر في Supplementary File 3.
  10. إخراج المقاطع المصبوغة وتركها تجف في الهواء، ثم وضع قطرة من وسط تثبيت محايد وتغطية الشرائح بغطاء زجاجي (coverslip)، وفحص المقاطع تحت المجهر الضوئي بعد تصلب وسط التثبيت.

6. تعبير الحمل الفيروسي لـ SARS-CoV-2 والسيتوكينات المحفزة للالتهابات في أنسجة الرئة

  1. تجانس أنسجة الرئة
    1. قم بتحضير أنابيب التجانس الخالية من RNase بإضافة 4–5 خرزات من الفولاذ المقاوم للصدأ (بقطر 3 mm) و 900 µL من محلول التحلل (lysis buffer) المبرد مسبقاً كوسط للتجانس.
      ملاحظة: اضبط حجم محلول التحلل وفقاً لوزن النسيج، وعادة ما تكون النسبة تقريباً 9 mL لكل 1 g من النسيج.
    2. زِن حوالي 50 mg من نسيج الرئة، وقم بتقطيع النسيج بدقة، ثم انقله إلى أنبوب التجانس.
    3. قم بتجانس النسيج باستخدام مطحنة أنسجة (60 Hz، لمدة 60 s، لـ 2–3 دورات مع فواصل زمنية قدرها 10 s بين الدورات).
      ملاحظة: قم بتحسين معاملات التجانس وفقاً للجهاز ونوع النسيج.
    4. افحص العينة بعد التجانس لضمان التفكك الكامل. كرر عملية التجانس إذا ظلت هناك شظايا نسيج مرئية حتى يتم الحصول على مستخلص متجانس.
  2. استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (total RNA) من أنسجة الرئة باستخدام الأعمدة
    ​ملاحظة: يتم استخلاص total RNA من أنسجة الرئة باستخدام طريقة تنقية تعتمد على الأعمدة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يتم تنفيذ طرق استخلاص RNA البديلة وفقاً لأدلة المنتجات المقابلة عند الاقتضاء.
    1. انقل المستخلص المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 mL وخالٍ من RNase. أضف 100 µL من محلول gDNA Eliminator. أحكم إغلاق غطاء الأنبوب ورجه بقوة لمدة 15–20 s.
    2. افتح الغطاء لفترة وجيزة، وأضف 180 µL من الكلوروفورم، ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) جيداً لمدة 15 s.
      تنبيه: الكلوروفورم مادة متطايرة وسامة؛ تعامل معها في منطقة جيدة التهوية أو داخل خزانة استنشاق كيميائية (chemical fume hood) وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتجنب الاستنشاق وملامسة الجلد.
    3. حضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 min، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 12,000 x g لمدة 15 min عند 4 °C.
    4. انقل الطور المائي العلوي بعناية إلى أنبوب جديد. أضف حجماً مساوياً من الإيثانول بتركيز 70% واخلط جيداً بالرج باستخدام الفورتكس.
      ملاحظة: تجنب تعكير الطور البيني والطبقة العضوية عند جمع الطور المائي لضمان نقاء RNA. انتقل إلى الخطوة التالية مباشرة بعد إضافة الإيثانول بتركيز 70% دون إجراء طرد مركزي.
    5. انقل الخليط إلى عمود دوران (spin column) وقم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 x g لمدة 15 s. تخلص من السائل المار.
    6. أضف 700 µL من محلول الغسيل (wash buffer) إلى عمود الدوران وقم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 x g لمدة 15 s. تخلص من السائل المار.
    7. أضف 500 µL من محلول الغسيل إلى عمود الدوران وقم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 x g لمدة 15 s. كرر خطوة الغسل هذه مرة واحدة.
    8. انقل عمود الدوران إلى أنبوب تجميع جديد وقم بالطرد المركزي بسرعة 12,000 x g لمدة 1 min لإزالة محلول الغسيل المتبقي.
    9. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL وخالٍ من RNase. أضف 30 µL من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى مركز الغشاء وقم بالطرد المركزي بسرعة 8,000 x g لمدة 1 min لاستخلاص (elute) RNA.
      ملاحظة: اضبط حجم الماء الخالي من RNase بين 30–50 µL وفقاً للتطبيقات اللاحقة. استخدم حجم استخلاص أقل عندما يكون مطلوباً تركيز أعلى من RNA.
  3. الكشف عن الحمل الفيروسي لـ SARS-CoV-2 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي مع النسخ العكسي (RT-dPCR)
    ​ملاحظة: تم استخدام مقايسة RT-dPCR من خطوة واحدة للتقدير الكمي المطلق لـ SARS-CoV-2 RNA. استُخدمت مجموعات محددة من البادئات والمجسات التي تستهدف جين القفيصة النووية (N) لتحديد أعداد نسخ RNA الفيروسي.
    1. أذب عينات RNA والكواشف على الثلج.
    2. حضر خليط تفاعل RT-dPCR وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. اجمع 20 µL من خليط تفاعل RT-dPCR مع 20 µL من قالب RNA. رج الخليط باستخدام الفورتكس لفترة وجيزة، وقم بطرده مركزياً بدورة قصيرة، واحفظه على الثلج.
    4. قم بتحميل خليط التفاعل بحجم 40 µL في آبار شريحة الـ digital PCR وأغلق الشريحة وفقاً لبروتوكول الجهاز.
    5. قم بإجراء التضخيم باستخدام ظروف الدورات الحرارية التالية: 50 °C لمدة 40 min (دورة واحدة)، 95 °C لمدة 2 min (دورة واحدة)، تليها 40 دورة من 95 °C لمدة 15 s و 57 °C لمدة 60 s. اضبط قنوات الكشف على الأخضر GREEN (250 ms) والأحمر RED (150 ms).
  4. الكشف عن تعبير السيتوكينات الالتهابية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي (RT-qPCR)
    1. حدد تركيز ونقاء RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية (UV spectrophotometer).
    2. استخدم 1,000 ng من total RNA لكل تفاعل للنسخ العكسي لتصنيع الحمض النووي المكمل (cDNA) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. أجرِ RT-qPCR باستخدام 100 ng من cDNA لكل تفاعل كقالب مع مزيج SYBR Green PCR master mix وبادئات خاصة بالجينات. استخدم ظروف الدورات التالية: 95 °C لمدة 2 min، تليها 40 دورة من 95 °C لمدة 5 s و 60 °C لمدة 10 s. تسلسلات البادئات مدرجة في الجدول 1.
      ملاحظة: قم بتحسين ظروف التفاعل وفقاً للكواشف والأجهزة المحددة المستخدمة، واتبع تعليمات الشركة المصنعة المقابلة.
    4. استخدم GAPDH كجين مرجعي داخلي واحسب مستويات التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt.

7. الكشف عن السيتوكينات المحفزة للالتهاب في أنسجة الرئة بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)24

ملاحظة: استخدم أطقم ELISA وفقاً للبروتوكولات المحددة المقدمة من مختلف الشركات المصنعة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة المقابلة بدقة عند استخدام أطقم من موردين بديلين.

  1. قم بتجنيس أنسجة الرئة كما هو موضح أعلاه. استخدم PBS أو محلول منظم لتحلل الأنسجة خاص باختبار ELISA كوسط للتجنيس.
  2. قم بطرد العينات المجنسة مركزياً (على سبيل المثال، 12,000 x g، عند 4 °C، لمدة 10 min) واجمع الراشح لإجراء التحليل اللاحق.
  3. اترك مجموعة ELISA لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min قبل الاستخدام. أخرج شرائط اللوح الدقيق المطلوبة من كيس رقائق الألومنيوم.
  4. جهز العينات القياسية، وآبار العينات، والآبار الفارغة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 50 µL من المحاليل القياسية إلى الآبار القياسية، و10 µL من العينة بالإضافة إلى 40 µL من محلول تخفيف العينات إلى آبار العينات. قم بإجراء مكررين تقنيين لكل محلول قياسي وعينة.
  5. أضف 100 µL من الأجسام المضادة للكشف المقترنة ببيروكسيداز الفجل الحار (HRP) إلى كل بئر من الآبار القياسية وآبار العينات، باستثناء الآبار الفارغة. غطِّ اللوح بفيلم لاصق واحضنه عند 37 °C لمدة 60 min.
  6. تخلص من السائل الموجود في كل بئر بعد الحضن، واقرع اللوح برفق على ورق ماص لإزالة السوائل المتبقية.
  7. أضف محلول الغسيل المنظم إلى كل بئر، واتركه لمدة 1 min، ثم تخلص من المحلول. جفف اللوح بالتربيت. كرر خطوة الغسيل هذه خمس مرات إجمالاً.
  8. أضف 50 µL من محلول الركيزة A و50 µL من محلول الركيزة B بالتتابع إلى كل بئر. اخلط اللوح برفق واحضنه عند 37 °C في الظلام لمدة 15 min للسماح بتطور اللون.
  9. أوقف التفاعل بإضافة 50 µL من محلول الإيقاف إلى كل بئر. قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) خلال 10 min عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.
  10. أنشئ منحنى قياسياً من خلال رسم تركيزات المحاليل القياسية (المحور السيني x) مقابل قيم الكثافة الضوئية (المحور الصادي y)، وقم بمطابقة المنحنى. احسب تركيزات السيتوكينات المستهدفة في العينات عن طريق تعويض قيم OD في معادلة المنحنى القياسي والضرب في عوامل التخفيف المقابلة.
  11. حدد تركيز البروتين الكلي في أنسجة الرئة باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA. قم بمعايرة مستويات السيتوكين النهائية بالنسبة لمحتوى البروتين الكلي، وعبر عن النتائج ككمية السيتوكين المستهدف لكل مليغرام من البروتين الكلي (على سبيل المثال، pg/mg protein).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إجراء التحقق من النموذج من خلال تقييم التغيرات النسيجية المرضية الرئوية، وكمية فيروس SARS-CoV-2، ومستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهاب والإنترفيرونات من النوع الأول في كل من المجموعتين الضابطة والنموذجية.

التحليل الإحصائي

يُعرض البيانات كمتوسط ± الخطأ القياسي (SE). تم استخدام اختبار t للطالب غير المزدوج للمقارنات بين مجموعتي النموذج والسيطرة. تم اختيار هذا الاختبار لأنه مناسب للمقارنة بين متوسطات المتغيرات المستمرة بين مجموعتين مستقلتين. في هذه ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أنشأت هذه الدراسة نموذجاً فؤرِيّاً لإصابة الرئة المرتبطة بـ COVID-19 عبر التقطير الأنفي لـ SARS-CoV-2 وLPS. وأظهرت النتائج أن الإعطاء المشترك عن طريق الأنف لـ SARS-CoV-2 وLPS يحفز استجابة التهابية قوية يصاحبها تثبيط لإشارات IFN-I. وأظهرت الفئران في مجموعة النموذج فقداناً ملحوظاً في وزن الجسم وزيادة في مؤشر الرئة، مما يشير إلى هزال جهازي وتفاقم الإصابة الرئوية. وأكد صبغ HE كذلك أن مجموعة النموذج أظهرت إصابة رئوية منتشرة نموذجية، تميزت بتفكك البنية السنخية وترشيح واسع للخلايا الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت أنسجة الرئة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82374291)؛ برنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2024NSFJQ0059)؛ الموضوع الخاص بالبحث العلمي لإدارة سيتشوان للطب الصيني التقليدي (2024zd005)؛ مشروع مواهب العلوم والتكنولوجيا الرائدة في "خطة تيانفو تشينغ تشنغ" لعام 2022 (Chuan Qingcheng No. 1090)؛ صندوق الابتكار المشترك لهيئة الصحة في تشنغدو وجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (WXLH202403091).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جهاز معالجة الأنسجة الآليDakewe Biotech Co., Ltd.HP300يُستخدم لإزالة الماء من الأنسجة.
جهاز التلوين الآليLeica BiosystemsLEICA ST5010يُستخدم للتلوين بـ HE.
جهاز طرد مركزيDLAB Scientific D3024Rيُستخدم لطرد العينات أو الكواشف مركزياً.
حمام مائي ثابت درجة الحرارةShanghai LICHEN-BX Instrument Techonology Co., Ltd.HH-6يُستخدم كحمام مائي ثابت درجة الحرارة.
نظام PCR الرقميQIAGENQIAcuity Oneيُستخدم لإجراء RT-dPCR.
TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)TransGen Biotech Co.,Ltd.AT341يُستخدم للنسخ العكسي.
محلول الإيوسينBASOBA4024يُستخدم للتلوين النسيجي.
نظام PCR الكمي الفلوريRocgene (Beijing) Technology Co., Ltd.Archimed X6يُستخدم لإجراء RT-qPCR.
محلول الهيماتوكسيلينBASOBA4041يُستخدم للتلوين النسيجي.
برنامج IBM SPSS StatisticsIBM Corp., Armonk, NY, USAversion 22.0يُستخدم للتحليل الإحصائي.
عديدات السكاريد الشحمية من Escherichia coli O55:B5Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.L2880تُستخدم في نمذجة الفئران.
قارئ الصفائح الدقيقةMolecular Devices SpectraMax Plus 384يُستخدم لإجراء مقايسة Elisa.
طقم ELISA الخاص بـ Mouse IFN-αZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37863Wيُستخدم للكشف عن مستويات IFN-α في أنسجة رئة الفئران.
طقم ELISA الخاص بـ Mouse IFN-βZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37887Wيُستخدم للكشف عن مستويات IFN-β في أنسجة رئة الفئران.
طقم ELISA الخاص بـ Mouse IL-1βZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37974Wيُستخدم للكشف عن مستويات IL-1β في أنسجة رئة الفئران.
طقم ELISA الخاص بـ Mouse IL-6ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37988Wيُستخدم للكشف عن مستويات IL-6 في أنسجة رئة الفئران.
طقم ELISA الخاص بـ Mouse TNF-αZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-39024Wيُستخدم للكشف عن مستويات TNF-α في أنسجة رئة الفئران.
طقم RT-PCR ذو الخطوة الواحدة لـ Digital PCRQIAGEN4829104يُستخدم لإجراء PCR الرقمي.
جهاز طمر بالبارافينHubei Aristion Medical Industrial Co., Ltd.ABM-7Lيُستخدم لطمر أنسجة رئة الفئران بالبارافين.
طقم QuantiNova SYBR PCR MixQIAGEN1129280يُستخدم لإجراء RT-qPCR.
طقم RNeasy Plus Universal MiniQIAGEN1062832يُستخدم لاستخلاص RNA الكلي.
جهاز تقطيع الأنسجة (Microtome)Leica BiosystemsLEICA RM2235يُستخدم لعمل مقاطع البارافين.
كرات فولاذية مقاومة للصدأ لجهاز تجانس الأنسجةBeyotime BiotechnologyF6621تُستخدم لتجانس أنسجة الرئة.
مجموعة بادئات XG primer Pool 1.0 لـ Digital PCRQIAGEN4828104تُستخدم لإجراء PCR الرقمي.
Zoletil 50VIRBACBN9VS7Aيُستخدم لتخدير الفئران.

المراجع

  1. Zhang X, et al. SARS-CoV-2 Evolution: Immune Dynamics, Omicron Specificity, and Predictive Modeling in Vaccinated Populations. Adv Sci (Weinh). 2024;11(40):e2402639.
  2. Yu Y, et al. COVID-19 Serum Drives Spike-Mediated SARS-CoV-2 Variation. Viruses. 2024;16(5):763.
  3. Alhamlan FS, Al-Qahtani AA. SARS-CoV-2 Variants: Genetic Insights, Epidemiological Tracking, and Implications for Vaccine Strategies. Int J Mol Sci. 2025;26(3):1263.
  4. Habashi NM, Camporota L, Gatto LA, Nieman G. Functional pathophysiology of SARS-CoV-2-induced acute lung injury and clinical implications. J Appl Physiol (1985). 2021;130(3):877-891.
  5. Nie X, et al. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies. Cell. 2021;184(3):775-791.e14.
  6. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-1045.e9.
  7. Wang J, Li Q, Qiu Y, Lu H. COVID-19: imbalanced cell-mediated immune response drives to immunopathology. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2393-2404.
  8. Sa Ribero M, Jouvenet N, Dreux M, Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16(7):e1008737.
  9. El-Saber Batiha G, Al-Gareeb AI, Saad HM, Al-Kuraishy HM. COVID-19 and corticosteroids: a narrative review. Inflammopharmacology. 2022;30(4):1189-1205.
  10. Ye Q, Wang B, Mao J. The pathogenesis and treatment of the 'Cytokine Storm' in COVID-19. J Infect. 2020;80(6):607-613.
  11. Jiang Y, et al. Cytokine storm in COVID-19: from viral infection to immune responses, diagnosis and therapy. Int J Biol Sci. 2022;18(2):459-472.
  12. Zhang S, Wang L, Cheng G. The battle between host and SARS-CoV-2: Innate immunity and viral evasion strategies. Mol Ther. 2022;30(5):1869-1884.
  13. Beyer DK, Forero A. Mechanisms of Antiviral Immune Evasion of SARS-CoV-2. J Mol Biol. 2022;434(6):167265.
  14. Lei X, et al. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):3810.
  15. Mostafa-Hedeab G, et al. A raising dawn of pentoxifylline in management of inflammatory disorders in Covid-19. Inflammopharmacology. 2022;30(3):799-809.
  16. Chen Z, et al. SARS-CoV-2 immunity in animal models. Cell Mol Immunol. 2024;21(2):119-133.
  17. Johansen MD, et al. Animal and translational models of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Mucosal Immunol. 2020;13(6):877-891.
  18. Zhang Y, et al. SARS-CoV-2 rapidly adapts in aged BALB/c mice and induces typical pneumonia. J Virol. 2021;95(11):e02477-20.
  19. Sun SH, et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.
  20. Muñoz-Fontela C, et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020;586(7830):509-515.
  21. Liu T, et al. Therapeutic potential of inosine in acute lung injury: mechanistic insights into TLR4 suppression and macrophage polarization. Phytomedicine. 2025;143:156854.
  22. Powers JM, et al. Divergent pathogenetic outcomes in BALB/c mice following Omicron subvariant infection. Virus Res. 2024;341:199319.
  23. Fan F, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule's protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  24. Xie N, et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 2022;103:154240.
  25. Jiang S, et al. Generic Diagramming Platform (GDP): a comprehensive database of high-quality biomedical graphics. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D1670-D1676.
  26. Onohuean H, et al. Covid-19 and development of heart failure: mystery and truth. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2021;394(10):2013-2021.
  27. Zarrilli G, et al. The Immunopathological and Histological Landscape of COVID-19-Mediated Lung Injury. Int J Mol Sci. 2021;22(2):974.
  28. Fernandes de Souza WD, et al. Lung Inflammation Induced by Inactivated SARS-CoV-2 in C57BL/6 Female Mice Is Controlled by Intranasal Instillation of Vitamin D. Cells. 2023;12(7):1092.
  29. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021;78(4):1233-1261.
  30. Brandenburg K, et al. A Comparison between SARS-CoV-2 and Gram-Negative Bacteria-Induced Hyperinflammation and Sepsis. Int J Mol Sci. 2023;24(20):15169.
  31. Samsudin F, et al. SARS-CoV-2 spike protein as a bacterial lipopolysaccharide delivery system in an overzealous inflammatory cascade. J Mol Cell Biol. 2023;14(9):mjac058.
  32. Petruk G, et al. SARS-CoV-2 spike protein binds to bacterial lipopolysaccharide and boosts proinflammatory activity. J Mol Cell Biol. 2020;12(12):916-932.
  33. Martin-Sancho L, et al. Functional landscape of SARS-CoV-2 cellular restriction. Mol Cell. 2021;81(12):2656-2668.e8.
  34. Minkoff JM, tenOever B. Innate immune evasion strategies of SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 2023;21(3):178-194.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عدوى SARS-CoV-2إصابة الرئة الناتجة عن كوفيد-19الاستحثاث بليبوبوليسكريدالاستجابة الالتهابية المناعيةالتشريح المرضي النسيجي للرئةالسيتوكينات المحفزة للالتهاباتاستجابة الإنترفيرونتحليل الحمل الفيروسيالوظيفة الرئوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.