مقالة منهجية

نموذج جرح استئصالي في الجرذان لاستقصاء العلاجات في جروح الجلد ذات الحجم الحرج

0 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72315

⸱

سبتمبر 25, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Plastic Surgery and Burns, Linkoping University, 2Center for Biomedical Resources, Linkoping University, 3Basic Medical Sciences Department, College of Medicine, Ajman University, 4Medical Laboratory Science Department, College of Health Sciences, University of Sharjah

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذجاً لجرح استئصالي في جلد الجرذان باستخدام غرفة رطبة. يتيح هذا النظام تقييم التركيبات السائلة الموضعية، والمعلقات الخلوية، والمواد الحيوية، وغيرها من العلاجات المستخدمة للجروح.

الملخص

تمثل جروح الجلد تحدياً رئيساً في الرعاية الصحية العالمية، مما يتسبب في معدلات مراضة كبيرة وأعباء اقتصادية ملموسة. وتعد النماذج الحيوانية الموثوقة وذات الصلة سريرياً ضرورية لاستقصاء آليات إصلاح الأنسجة وتقييم الاستراتيجيات العلاجية الناشئة. ومع ذلك، تعاني نماذج جروح الاستئصال التقليدية في القوارض من محدودية بسبب التقلص السريع للجرح الناتج عن وجود العضلة الجلدية (panniculus carnosus)، وهو ما يختلف اختلافاً كبيراً عن التئام الجروح لدى البشر؛ حيث يحدث الأخير   بشكل أساسي من خلال تكوين النسيج الحبيبي وإعادة التظهير. تصف هذه الدراسة نموذجاً لجرح استئصال في الجرذان مصمماً للحد من تقلص الجرح مع توفير بيئة محمية لاختبار التدخلات العلاجية الحساسة. تم إجراء جروح استئصال ظهرية بكامل السماكة وبقطر 10-mm في جرذان Sprague Dawley، وتم تثبيتها باستخدام حلقة دائرية (O-ring) من مطاط النتريل بوتادين (NBR) مثبتة بغرز متقطعة. وللحفاظ على بيئة جرح رطبة، تم تطبيق سدادة Eakin المتماسكة وفيلم لاصق شفاف لتشكيل غرفة مناسبة للإعطاء الموضعي للخلايا أو المواد الحيوية أو المركبات الصيدلانية. واستُخدمت طبقات حماية إضافية تتكون من ضمادة رغوية، وشريط لاصق، وضمادة أنبوبية، ونظام تثبيت مزدوج الكتف لمنع الحيوانات من إزالة الضمادة. تمت مراقبة التئام الجروح على مدار 14 يوماً عن طريق قياس المساحة الرقمي (digital planimetry) والتقييم النسيجي باستخدام صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين. استغرق الإجراء حوالي 30 min لكل حيوان وأعطى نتائج متسقة في التئام الجروح. استُخدمت حلقة NBR O-ring كجبيرة للحد من تقلص الجرح. وحدث الالتئام بشكل أساسي من خلال تكوين النسيج الحبيبي وإعادة التظهير. وظلت الضمادات سليمة لمدة تصل إلى سبعة أيام دون وجود دليل على حدوث عدوى. وأظهر التحليل النسيجي إصلاحاً نشطاً للأنسجة يتميز بتجدد البشرة وتسلل الخلايا الالتهابية. يوفر هذا النموذج منصة للتقييم قبل السريري لعلاجات الجروح والعلاجات التجددية المتقدمة.

المقدمة

تؤثر جروح الجلد، بما في ذلك الجروح التي يصعب شفاؤها، على أكثر من 40 مليون مريض في جميع أنحاء العالم وتفرض عبئاً كبيراً على أنظمة الرعاية الصحية، حيث تصل التكاليف السنوية إلى 22 مليار دولار بحلول عام 2024. وفي أوروبا وحدها، يعاني 4 ملايين مريض سنوياً من جروح يصعب شفاؤها، مما يشغل ما يصل إلى نصف حالات الإدخال الحاد المتاحة1. وعلى الرغم من التقدم في التقنيات الجراحية، والممارسات أثناء العمليات، وتوفر ضمادات الجروح المتقدمة، تظل بعض الجروح مستعصية، بينما تتطور المضاعفات في نهاية المطاف. لذلك، من الضروري تطوير نهج علاجية جديدة تتطلب نموذجاً حيوانياً تجريبياً لجروح الجلد لاختبار مجموعة واسعة من المواد الموضعية.

من بين النماذج الحيوانية التجريبية لجروح الجلد، يعد استئصال الجلد التقنية الأكثر قابلية للتطبيق لإنشاء نموذج لالتئام الجروح2. ويمكن لهذا النموذج أن يساعد في دراسة النزيف، والتفاعلات الالتهابية، وتكون النسيج الحبيبي، وإعادة التظهير، وتكون الأوعية الدموية، وإعادة تشكيل الأنسجة3. يتم إنشاء الجروح الاستئصالية بشكل أساسي على ظهر الحيوان عن طريق الإزالة الجراحية لمنطقة محددة من الجلد. ويجب أن يكون الجرح بحجم حرج لتجنب الالتئام التلقائي. يوفر هذا الجرح الاستئصالي ذو الحجم الحرج وصولاً مباشراً لبحث التطبيق الموضعي لمختلف المواد الكيميائية أو الخلايا أو المواد الحيوية ومدى مشاركتها في عملية الالتئام4,5.

تتشارك القوارض وبشرة الإنسان في أوجه تشابه في  المراحل الخلوية والجزيئية لالتئام الجروح، بما في ذلك وقف النزيف، والالتهاب، والتكاثر، وإعادة التشكل. وتعد الجرذان والفئران أكثر الأنواع استخداماً في نماذج الجروح نظراً لتوافرها، وصغر حجمها، والسهولة النسبية للتعديل الوراثي، وسهولة التعامل معها. وتوفر الجرذان عدة مزايا عملية مقارنة بالفئران، بما في ذلك حجم الجسم الأكبر والجلد الأكثر سمكاً، والذي يتكون من طبقات من الخلايا الكيراتينية أكثر مما هي عليه في الفئران. وعادة ما تلتئم الجروح في الفئران خلال 7 أيام، بينما يمكن تقييم عملية الالتئام في الجرذان على مدار 12–14 يوماً تقريباً6.

يتمثل التحدي الرئيسي المرتبط باستخدام القوارض ذات الجلد الرخو في انكماش الجرح3. إذ يمتلك جلد القوارض طبقة panniculus carnosus، والتي تنكمش بعد الإصابة لتقليل المساحة المكشوفة. وفي المقابل، تمتلك الجروح البشرية قدرة محدودة على الانكماش وتعتمد في التئامها على تكوين النسيج الحبيبي وإعادة الظهارة7. ومن الطرق المتبعة للتغلب على قيود النماذج الحيوانية إجراء تثبيت فيزيائي أو وضع جبيرة للجلد المحيط بمنطقة الجرح8. وكانت غرف الجروح المصنوعة من التيتانيوم من بين الأجهزة التي تم تطويرها بنجاح لمنع انكماش الجروح9، ولكن كان لها عيوب تشمل زيادة إجهاد الحيوان بسبب وزن الغرفة، وتعقيد التثبيت الجراحي، واحتمالية تحرك الجهاز من مكانه، واحتمالية حدوث عدوى، والتكلفة العالية. وقد قدم Galiano وزملاؤه10 مفهوم نموذج الجرح المجبّر في عام 2004 عن طريق خياطة حلقة سيليكون صلبة حول حافة الجرح. يقلل هذا النهج بشكل ملحوظ من انكماش الجرح11، ولكنه ينطوي على عدة عيوب وقيود، تتركز أساساً في احتمالية تلف الأنسجة الرخوة، وارتفاع معدل إزاحة الجبيرة، وعدم اتساق التئام الجرح. إذ يمكن أن تتسبب الجبائر (مثل حلقات السيليكون الصلبة) في ضغط مفرط على الجلد المحيط، مما يؤدي إلى نقص التروية والتهيج والنخر، خاصة إذا تم تطبيقها بشكل غير صحيح. كما تتعرض جبائر السيليكون بشكل متكرر للتلف أو الكسر أو الإزاحة بسبب حركة الحيوان أو تنظيفه لنفسه 8,11. وغالباً ما تؤدي الغرز غير المتساوية إلى خلق شد غير منتظم حول الجرح، مما يؤدي إلى التئام غير متسق. في النموذج المقدم هنا، يتم خياطة حلقة دائرية من مطاط النيتريل بوتادين (NBR) على حافة جرح الجلد عن طريق وضع من 8 إلى 12 غرزة بولي أميد بسيطة ومتقطعة بشكل متساوٍ حول الحلقة. ومن المتوقع أن يقلل هذا النهج من المخاطر المذكورة سابقاً ويحد بشكل كافٍ من انكماش الجرح، مما يسمح للجرح بالالتئام من خلال تكوين النسيج الحبيبي وإعادة الظهارة، بشكل مشابه لعملية التئام الجروح البشرية. ومن شأن آلية الالتئام هذه أن تسهل نقل النتائج من النماذج الحيوانية إلى التطبيقات السريرية.

قُدمت نظرية التئام الجروح الرطبة بواسطة جورج د. وينتر في عام 1962 كمفهوم لتصميم منتجات العناية بالجروح12. وبناءً على هذه النظرية، تم تطوير ضمادات جروح متنوعة على مدى العقود الماضية، مثل الشاش والأفلام الشفافة والرغاوي والهيدروجيل13. ومن ناحية أخرى، تم تصميم وتطوير حلقة ختم حاجزة لفتحة الإخراج من الهيدروكولويد القابل للتشكيل في عام 1974 لمنع التسربات والحماية منها. ويمكن تشكيل هذه الحلقات وقالبها بسهولة لتناسب حدود الجرح، لا سيما في تطبيقات العناية بالفغرة. وفي هذا النموذج، يتم وضع ختم متماسك على الجزء الخارجي من الجرح، وبالتكامل مع الأفلام الشفافة المعقمة، فإنه يشكل حجرة رطبة تحاكي الحالة السريرية للمرضى الذين يعانون من جروح جلدية تخضع للعلاج، مما يعزز من عملية تكوين الظهارة في الجرح ويحمي العوامل الموضعية (مثل الخلايا، والمواد الحيوية، والمركبات) من التسرب.

تعد ضمادات الجروح أمراً حيوياً لحماية سرير الجرح من الصدمات الفيزيائية والعدوى الميكروبية. لطالما كان وضع ضمادات الجروح في الجرذان تحدياً نظراً لضعف تحملها لها؛ حيث تقوم الجرذان غالباً بإزالة أو إتلاف الضمادات عن طريق عضها وتمزيقها فور تعافيها من التخدير تقريباً. وهذا يجعل من الصعب جداً الاحتفاظ بالعوامل الموضعية مثل الخلايا والمستحضرات الصيدلانية، ويجعل حماية الجروح من المسببات المرضية والملوثات الخارجية أمراً مستحيلاً. ويمثل هذا تحدياً آخر يجب معالجته في نموذج القوارض، خاصة في الدراسات التي تتطلب بيئة معقمة، مثل اختبارات المواد البيولوجية، والعلاج القائم على الخلايا، والمنتجات الطبية العلاجية المتقدمة. في النموذج المقدم هنا، استُخدمت ضمادة رغوية وشريط لاصق لتغطية الغرفة الرطبة. ثم استُخدمت الضمادة الأنبوبية المرنة، وضمادة التثبيت، والشريط الجراحي المسامي (micropore) لتطبيق ضمادة متقاطعة مزدوجة على الكتف لمنع الجرذان من إزالة الضمادات أو إتلافها.

يجمع النموذج المذكور هنا عدة عناصر من بروتوكولات مختلفة وقد تم تطويره على مدى عدة سنوات. وكان الهدف هو إنشاء نموذج لجرح استئصالي في الجرذان باستخدام غرفة رطبة يتحملها الحيوان جيداً، ولتسهيل اختبار المواد الموضعية الحساسة، خاصة تلك التي تكون في شكل سائل.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل لجنة أخلاقيات لينشوبينج (Dnr 5163-2023)، السويد. وتظهر الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

١. تجربة​الحيوانات العاقلة

  1. استخدم ذكور جرذان Sprague Dawley البالغة التي تتراوح أعمارها بين 8–14 أسبوعاً.
  2. قبل بدء التجربة، قم بأقلمة الجرذان لمدة أسبوع واحد على الأقل في دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة مع تقديم نظام غذائي قياسي.

2. التحضير لما قبل الجراحة

  1. قم بتخدير الحيوان باستخدام isoflurane بتركيز 1.5%–2.5% (و4.5% للتحريض) ممزوجاً بـ 1.0–1.5 L/min من الأكسجين. ضع الحيوان في وضعية الانكباط على منصة تدفئة للحفاظ على حرارته. ضع مرطباً للعين لحمايتها، وأعطِ 0.05 mg/kg من Buprenorphine بناءً على وزن الجسم مخففة في محلول ملحي تحت الجلد في ظهر الحيوان لتسكين الآلام بعد الجراحة.
    ملاحظة: من المهم وضع طبقة رقيقة من البطانة العازلة القابلة للتخلص منها بين الحيوان والمنصة.
    تنبيه: يُعد isoflurane مثبطاً للجهاز العصبي المركزي ومخرشاً للجهاز التنفسي. استخدم مبخراً معايراً مع نظام نشط لسحب الغازات العادمة لمنع التعرض للأبخرة.
  2. احلق منطقة الظهر باستخدام مقص كهربائي من قاعدة الرقبة نزولاً لمسافة 10 cm تقريباً. نظف المنطقة المحلوقة جيداً مرتين باستخدام الكلورهيكسيدين و70% ethanol، ثم غطِّ الحيوان بغطاء جراحي مثقوب يكشف فقط المنطقة التي تم تنظيفها.

3. إنشاء جرح استئصالي

  1. استخدم أدوات جراحية معقمة مناسبة، مثل المقصات والملاقط.
  2. ارسم دائرة بقطر 10 mm باستخدام قالب وبقلم تحديد جراحي دائم، على بعد 4 cm تقريباً من الجهة الذيلية لقاعدة الرقبة.
  3. أمسك مركز الجلد المحدد بالملقط واستأصل نسيج الجلد المحدد باستخدام المقص. يجب أن يمتد عمق الجرح وصولاً إلى اللفافة السطحية، ويمكن تحديد ذلك من خلال تحرير كامل سمك الجلد ومعاينة اللفافة شبه الشفافة التي تغطي العضلة.
  4. ضع حلقة NBR O-ring على حافة جرح الجلد وثبتها في موضعها عن طريق خياطة 8-12 غرزة. الهدف من تثبيت الحلقة هو منع انكماش الجلد. تأكد من وضع الغرز الأولية عند موضع الساعة 12، تليها الساعة 6، ثم الساعة 3، ثم موضع الساعة 9. في حالة استخدام 8 غرز، قم بخياطة كل غرزة في منتصف المسافة بين كل غرزتين من الغرز الأولية (الشكل 1A).
  5. ضع مانع تسرب متماسك خارج حلقة NBR O-ring، مستفيداً من خصائصه اللاصقة، لبناء غرفة رطبة مع غشاء شفاف ولاصق ومعقم (الشكل 1B). في هذه المرحلة، يتم تثبيت الجرح بواسطة حلقة NBR O-ring، وتتشكل الجدران الجانبية لغرفة التطبيق من كل من حافة الجلد ومانع التسرب المتماسك؛ بينما تشكل سطح الجرح المفتوح أرضية الغرفة، ويشكل الغشاء الشفاف سقفها.
  6. غطِّ الجرح بطبقة واحدة من الغشاء، ثم قم بإعطاء محلول العلاج (سواء كان محلول خلايا أو محلول مركب) عبر الغشاء إلى سطح الجرح. يمكن لغرفة بهذا الحجم أن تستوعب 100 µL بسهولة.
  7. غطِّ موقع الحقن بطبقة أخرى من الغشاء لمنع تسرب العلاج (الشكل 1C).
  8. غطِّ الغشاء بضمادة سيليكون ناعمة لحماية الغشاء (الشكل 1D).
  9. ضع أشرطة لاصقة (الشكل 1E)، ثم ضمادة أنبوبية مرنة، بتكوين مزدوج الكتف حول الجرذ مع ضمادة تثبيت وأشرطة ميكروبور جراحية (الشكل 1F–H).
  10. قص مخالب الجرذان لمنع تمزيق الضمادة من قبل الجرذان.
  11. أعطِ دواء carprofen بجرعة (5 mg/kg من وزن الجسم)، مخففاً في محلول ملحي، تحت الجلد للحيوان قبل إفاقته من التخدير.

4. الإجراءات التالية للجراحة

  1. يُترك الحيوان على وسادة التدفئة، مغطى ببطانية، حتى يفيق من التخدير. تُوضع الحيوانات في أقفاص منفصلة أو في قفص واحد مزود بفاصل لمنع الحيوانات من عض بعضها البعض أو إزالة الضمادة.
  2. يُعطى عقار carprofen بجرعة 5 mg/kg من وزن الجسم مُخففاً في محلول ملحي، عن طريق الحقن تحت الجلد في صباح اليوم التالي للسيطرة على آلام ما بعد الجراحة. يجب مراقبة الجرذان يومياً لرصد أي آلام بعد الجراحة أو فقدان في الوزن، ويمكن إعطاء جرعة إضافية من المسكن إذا لزم الأمر.

5. قياسات الجروح وتغيير الضمادات

  1. افحص كل حيوان يومياً خلال الأسبوع الأول بعد جراحة الجرح. يجب فحص الضمادة وتعديلها إذا واجهت الحيوانات صعوبة في الحركة أو ظهر عليها عدم الارتياح.
  2. قم بتغيير الضمادة في اليوم السابع بينما يكون الحيوان تحت التخدير كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  3. أزل غطاء الضمادة برفق من الجلد. يتم التقاط صور للجرح مع استخدام مسطرة لتحديد المقياس. تم تحليل الصور باستخدام برنامج Fiji/ImageJ لتقييم مساحة سطح الجرح.
  4. أجرِ القياسات أو الإجراءات الأخرى حسبما يراه الباحث ضرورياً.
  5. ضع ضمادة نظيفة كما في الخطوات 3.8-3.11 واترك الحيوان حتى يتعافى كما هو موضح في الخطوة 4.1.

6. جمع الجروح والقتل الرحيم

  1. قم بتطبيق التخدير كما هو مذكور في النقطة 2.1 في اليوم 14، أو وفقاً للخطة التجريبية المحددة. قم بإزالة الضمادة والتقاط صور لمواقع الجروح.
  2. قم بإزالة الضمادة والتقاط صور لمواقع الجروح.
  3. اجمع أنسجة الجلد من الجرح. باستخدام المشرط، قم باستئصال الجلد المحيط بالجرح، بما في ذلك بعض الأنسجة السليمة.
  4. ضع العينة المستأصلة في أنبوب سعة 2 mL وقم بتجميدها سريعاً في النيتروجين السائل لإجراء التحليل الجزيئي لاحقاً، أو احفظها في فورمالديهايد منظم بتركيز 4% في درجة حرارة الغرفة للفحص النسيجي. بدلاً من ذلك، يمكن قطع العينة المستأصلة إلى قطعتين لإجراء كلا التحليلين.
  5. بعد إزالة أنسجة الجرح، قم بقتل الحيوان عن طريق استنشاق CO2 أو طريقة بديلة وفقاً للموافقة الأخلاقية.
    تنبيه: يسبب CO2 الألم والضيق وتحمضاً سريعاً للأغشية المخاطية قبل فقدان الوعي. استخدم مقياس تدفق منظم لإزاحة هواء الغرفة.

7. الصبغ الكيميائي النسيجي: تثبيت الجرح، والصب، والتقطيع

  1. ثبّت خزعات أنسجة الجروح في محلول فورمالديهيد بتركيز 4% لمدة 3 h في درجة حرارة الغرفة، ثم احفظها عند 4 °C طوال الليل.
    تنبيه: يعتبر الفورمالديهيد مادة سامة، ومادة محسسة قوية، ومسرطناً بشرياً معروفاً. يجب التعامل مع المحلول في خزانة استخلاص كيميائية مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية.
  2. اغسل الخزعات مرتين باستخدام PBS لمدة 30 min في كل مرة.
  3. استبدل PBS بالإيثانول (70%) واحفظها عند 4 °C.
  4. احتفظ بالخزعات لمدة أقصاها 24–48 h قبل المعالجة لتجنب فقدان المستضدات، أو لمدة 1–2 weeks للتوصيف النسيجي البسيط.
  5. اغسل الخزعات جيداً تحت مياه الصنبور الجارية لإزالة الفورمالديهيد المتبقي.
  6. قم بتجفيف الأنسجة في حمامات إيثانول وفق الترتيب التالي: إيثانول 70% لمدة 20 min؛ وتغيير الإيثانول بتركيز 95% مرتين لمدة 20 min في كل مرة؛ وتغيير الإيثانول بتركيز 100% مرتين لمدة 20 min في كل مرة.
  7. احتفظ بالخزعات عند 65 °C في حمام البارافين.
  8. صب البارافين المذاب في القالب المخصص، مع وضع الخزعات في المركز، واتركه ليبرد ويتصلب. يجب توجيه الخزعات بشكل عمودي على سطح القالب للسماح برؤية جميع طبقات الجلد عند التقطيع.
  9. قم بتقطيع كتلة الأنسجة المغمورة في البارافين بسمك 5 μm باستخدام الميكروتوم، ثم قم بتعويمها في حمام مائي بدرجة حرارة 39 °C يحتوي على ماء منزوع الأيونات.
  10. انقل المقاطع إلى الشرائح وقم بتجفيفها، مما يسمح للأنسجة بالالتصاق بسطح الشريحة. يمكن تخزين الشرائح عند 4 °C لاستخدامها لاحقاً أو معالجتها فوراً للتصبيغ الكيميائي النسيجي.

8. صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE)

  1. قم بإزالة الشمع من الشرائح على لوحات تسخين عند 60 °C لمدة 30 min، ثم في 3 تغييرات من xylene (أو أي بديل) لمدة 5 min لكل تغيير، يليه تغيير واحد من PBS لمدة 2 min.
    تنبيه: مادة Xylene سامة وسريعة الاشتعال للغاية. تعامل مع المحلول داخل خزانة سحب الأدخنة، مع تطبيق تدابير الوقاية الشخصية القياسية.
  2. أجرِ عملية إعادة الترطيب في ethanol بتركيز 100%، ثم ethanol بتركيز 96%، ثم dH2O لمدة 5 min لكل مرحلة.
  3. ضع صبغة hematoxylin لمدة 5 min، ثم اغسل الشرائح تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 5 min.
  4. أجرِ عملية التمايز باستخدام كحول حمضي بتركيز 0.3% (0.3% حمض الهيدروكلوريك في 70% ethanol) عن طريق غمس الشرائح لبضع مرات، ثم اغسلها بمياه الصنبور الجارية لمدة 5 min.
  5. اصبغ الشرائح بـ Eosin Y بتركيز (0.2%) لمدة 30 s، ثم اغسلها بمياه الصنبور الجارية لمدة 5 min.
  6. قم بإزالة الماء باستخدام ethanol بتركيز 96% لمدة 1 min، ثم ethanol بتركيز 100% لمدة 1 min.
  7. ضع بضع قطرات من وسط التثبيت، ثم ضع غطاء الشريحة.
  8. افحص الشرائح تحت المجهر الضوئي والتقط صوراً رقمية.

النتائج

استغرقت جراحة نموذج جرح الاستئصال في الجرذ حوالي 30 min لكل حيوان عند تنفيذها بكفاءة. وتظهر الخطوات المختلفة لإنشاء النموذج، وتثبيت الحلقة الدائرية (O-ring)، والضماد في الشكل 1.

يوضح الشكل 2 تقدم التئام الجروح في اليومين 7 و14. تم قياس نصف قطر الجرح بـ mm، وحُسبت مساحة السطح باستخدام الصيغة (area = πr2) حيث r = 5 mm في اليوم 0. ومُثِّل تقدم إغلاق الجرح كنسبة مئوية للمساحة غير المغطاة إلى مساحة الجرح المستحث في اليوم 14. وباستخدام برنامج Fiji/ImageJ، تم تحليل صورة رقمية لمنطقة الجرح، مع معايرة المقياس إلى 10 mm باستخدام مسطرة مدرجة في الصورة (الشكل 2D). وبمجرد تحديد محيط منطقة الجرح وقياسها، عُرِضت المساحة بـ mm2. وتظهر مساحة الجرح المتبقية في اليوم 14 (29.4% ± 10.1%؛ n = 7) في الشكل 3.

يظهر صبغ HE لجرح الجلد في اليوم 14 في الشكل 4. وأظهرت المقاطع أن الخزعات اتبعت المسار الطبيعي لالتئام جروح الجلد، من المحيط باتجاه المركز. وظل التئام الجرح غير مكتمل، حيث خلى المركز من الترتيب الصفائحي المتعدد التقليدي الطبيعي مع وجود طبقة بشرة رقيقة. وأظهرت الأدمة ارتشاحاً وفيراً للخلايا الالتهابية، وهو أمر مهم لعملية الالتئام الفسيولوجي. وبشكل عام، تحملت الحيوانات النموذج بشكل جيد، مع تثبيط انكماش الجلد والتئام فسيولوجي ولكنه غير مكتمل.

figure-results-1
الشكل 1: إجراء إنشاء الجرح الاستئصالي وتضميده. (A) جرح استئصالي تم إنشاؤه على السطح الظهري للجرذ، مع خياطة حلقة دائرية (O-ring) حول حافة الجرح. (B) وضع حلقة حاجز من الهيدروكولويد القابل للتشكيل حول الحلقة الدائرية. (C) وضع طبقتين من ضمادة الغشاء اللاصق الشفاف فوق حلقة حاجز الهيدروكولويد. (D) وضع ضمادة رغوية فوق ضمادة الغشاء اللاصق الشفاف. (E) تطبيق شريط لاصق مرن لتثبيت الضمادة. (F–H) وضع ضمادة تثبيت أنبوبية حول الجرذ، تليها ضمادة تثبيت وشريط جراحي مرتب وفق تكوين الكتف المزدوج لتأمين الضمادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2صور تمثيلية لالتئام الجروح. (A) صورة تمثيلية للجرح تم الحصول عليها في اليوم السابع. (ب–دصور تمثيلية للجروح تم الحصول عليها في اليوم 14، تظهر الجرح مع وجود الحلقة الدائرية (O-ring) في مكانها (B) وبعد إزالة الحلقة الدائرية (ج، د). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تقدير كمي لمساحة الجرح في اليوم 14. النسبة المئوية لمساحة الجرح المتبقية في اليوم 14، مما يوضح انخفاض حجم الجرح. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) (n = 7). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التقييم النسيجي لالتئام الجروح في اليوم 14. مقاطع ممثلة من نسيج الجرح مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (HE) بتكبيرات 10× و20× و40×. أظهر مركز الجرح إعادة تكوين غير مكتملة للبشرة، بينما أظهرت حواف الجرح التئاماً فسيولوجياً للبشرة. واحتوت الأدمة على خلايا التهابية وفيرة تتماشى مع الاستجابة الطبيعية لالتئام الجروح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تُعد جروح الجلد التي يصعب التئامها تلك الجروح التي لا تتقدم عبر مراحل الشفاء الطبيعية ضمن الإطار الزمني المتوقع، ويمكن أن تكون نتيجة لإجراءات جراحية، أو إصابات رضحية، أو تفاعلات تحسسية، بالإضافة إلى كونها ثانوية للعديد من المشكلات الصحية الأخرى، بما في ذلك القصور الوعائي، وداء السكري، والسمنة14. ورغم توفر العديد من طرق الإدارة العلاجية، فإن الكثير من المرضى لا يتماثلون للشفاء بشكل صحيح. لذا، فإن استقصاء سبل علاجية جديدة، مثل العلاجات الخلوية، والمواد الكيميائية، والمستخلصات النباتية، والمركبات المكتشفة حديثاً، يعد أمراً بالغ الأهمية لتحديد استراتيجيات إدارة جديدة. ويمكن تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع من دراسات التئام الجروح. كما أن وضع بروتوكول موحد لاختبار الأدوية والخلايا والعلاجات البيولوجية من شأنه أن يسهل أبحاث التئام الجروح في المرحلة قبل السريرية. ويعالج نموذج الجرح الاستئصالي والبروتوكول الموصوف هنا القيود الرئيسية لنموذج جروح جلد الجرذ في الأبحاث، وهي: انكماش الجلد وضمادات الجروح.

تُستخدم الجبائر التيتانيومية بشكل شائع للحد من انكماش الجروح في نماذج جروح الاستئصال لدى الفئران؛ إلا أن استخدامها لا يخلو من القيود. إذ تؤدي صلابة الجبيرة إلى تغيير البيئة الميكانيكية للجرح والأنسجة المحيطة به، مما قد يؤثر على الاستجابات الخلوية، والالتهاب، وإعادة تشكيل المصفوفة. ونتيجة لذلك، تحدث عملية الالتئام في ظروف تختلف عن تلك الموجودة في جلد القوارض غير المعالجة. وبينما يعمل الحد من الانكماش على تحسين قابلية المقارنة مع إغلاق الجروح البشرية، فإن القيود الميكانيكية التي تفرضها الجبيرة قد تؤدي أيضاً إلى ظهور آثار اصطناعية تؤثر على عملية الالتئام، وهو أمر يجب أخذه في الاعتبار عند تفسير النتائج التجريبية15.

لهذا الغرض، استُخدمت حلقات دائرية (O-rings) من مطاط النيتريل (NBR) في النموذج للحد من انكماش الجلد، وثُبتت عند حافة الجرح الأصلية. وقد تقبلت الحيوانات هذه الحلقات بشكل جيد وبقيت ثابتة في موضعها طوال فترة التجربة التي استمرت 14 يوماً. وعلى الرغم من عدم ملاحظة انكماش ملموس في الجرح نوعياً في أي من الحيوانات، فإن استخدام الوشم عند حافة الجرح أو غيره من الطرق الكمية من شأنه أن يعزز تقييم انكماش الجرح في الدراسات المستقبلية. وبناءً على ذلك، يمكن اعتبار الوشم خطوة اختيارية في هذا البروتوكول.

يساهم تطبيق الضمادات في حماية الجروح من التلوث والعدوى مع الحفاظ على العلاج في موقع الجرح، وهو أمر بالغ الأهمية لنماذج التئام جروح الجلد. ومع ذلك، فمن الشائع أن تقوم بعض الحيوانات بإزالة أنواع مختلفة من الضمادات؛ إذ تقوم الجرذان بتنظيف ومنادلة منطقة الجرح بشكل متكرر، مما قد يؤدي إلى إزاحة الضمادة أو إزالتها بالكامل على الرغم من استخدام الرقائق اللاصقة أو طرق التثبيت الثانوية. ومن شأن فقدان تغطية الضمادة أن يغير بيئة الجرح، ويؤثر على إيصال العلاج، ويزيد من التباين بين الحيوانات16. وفي النموذج المعروض هنا، ظلت الضمادة سليمة لمدة تصل إلى 7 أيام، دون أن يتم إزالتها أو إتلافها من قبل الحيوانات. ولم تظهر أي علامة على وجود عدوى في جروح الجلد لدى أي من الحيوانات التجريبية. ويُنصح باستبدال الضمادات أسبوعياً لأن مقاسها يصبح أكثر ضيقاً مع نمو الحيوانات وزيادة وزنها. كما يجب توخي الحذر لتحقيق التوازن بين التثبيت المحكم وحرية حركة الحيوان، مع ضمان ألا تكون الضمادة فضفاضة للغاية بحيث يمكن للحيوانات نزعها.

يتميز هذا البروتوكول بالمرونة والقابلية للتعديل. وبينما نوصي باستنشاق isoflurane لسرعة التعافي وارتفاع مستوى الأمان، يمكن للباحثين بدلاً من ذلك استخدام التخدير عن طريق الحقن، مثل ketamine/xylazine، في حال عدم توفر جهاز تبخير isoflurane. وعلى الرغم من استخدام ذكور الجرذان فقط في هذه الدراسة، إلا أن البروتوكول قابل للتطبيق بنفس القدر على إناث الجرذان.

نوصي بإعطاء مسكنات الألم باستخدام buprenorphine بالتزامن مع carprofen، مما يعزز من تخفيف الألم. وقد يوفر buprenorphine وحده تسكيناً كافياً للألم بعد الجراحة نظراً لطول مدة تأثيره النسبية. ولهذا الدواء تأثير ضئيل على الوظيفة المناعية مقارنة بالأفيونيات الأخرى، مما يوفر ميزة لالتئام الجروح بما يتوافق مع العملية الالتهابية17. وينبغي تجنب استخدام الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية، التي تثبط الالتهاب وتقلل الألم، عند دراسة الالتهاب. وعلى الرغم من إنشاء جرح واحد لكل حيوان في هذه الدراسة، يمكن للباحثين إنشاء جروح إضافية باستخدام البروتوكول نفسه، وفقاً للموافقة الأخلاقية والتصميم التجريبي الخاص بهم. ويجب مراعاة اعتبارات رعاية الحيوان ومبادئ الـ 3Rs بعناية؛ إذ يجب على الباحثين الامتثال لمبادئ الـ 3Rs (الاستبدال، والتقليل، والتحسين) واحترام رعاية الحيوان عند استخدام النماذج الحيوانية. كما يجب أن تتماشى الإجراءات الجراحية مع الإرشادات وأن تتبع بدقة بروتوكول الحيوان المعتمد. وفي هذه الدراسة، تم تقييم التئام الجروح عن طريق قياسات مساحة الجرح والتقييم النسيجي، حيث يمثل إعادة التظهير أحد مكونات استجابة الالتئام. وقد يؤثر وجود الغرز بالنسبة لتثبيت الحلقة على الالتئام الموضعي، لذا يجب أن يكون عدد الغرز ثابتاً بين جميع الحيوانات. كما ينبغي أن يشمل تقييم مساحة الجرح جميع المناطق الخام، بما في ذلك مواقع الخياطة18. ويمكن تطوير هذا النموذج ليشمل حالات مرضية كامنة مختلفة مرتبطة بجروح الجلد، مثل نقص التروية، والسكري، والشيخوخة. وتمثلت القيود الرئيسية لهذه الدراسة في غياب مجموعة ضابطة غير مثبتة بجبيرة، ونقص التقييم الكمي لانكماش الجرح، ومحدودية مقاييس النتائج البيولوجية الكمية بما يتجاوز تقييم مساحة الجرح والوصف النسيجي. وقد ظهرت تحديات تقنية متنوعة وعمليات استكشاف للأخطاء وإصلاحها أثناء تطوير هذا النموذج؛ حيث يعد التركيب الصحيح للسترة الواقية/الضمادة أمراً ضرورياً لرعاية الحيوان ونجاح التئام الجروح. فالضمادة الرخوة قد يزيلها الحيوان بعد الإفاقة من التخدير، بينما يمكن للضمادة الضيقة للغاية أن تقيد الحركة، أو تضعف الدورة الدموية، أو تؤثر على التنفس. ويجب أن تترك الضمادة مساحة كافية لإصبع واحد (أو الإصبع الصغير بالنسبة للجرذان الأصغر حجماً) بين الضمادة والجلد. كما ينبغي مراقبة الحيوانات يومياً، وتعديل الضمادة في حال ملاحظة علامات عدم الارتياح، أو ضعف القدرة على الحركة، أو وضعية جسم غير طبيعية. وقد تختلف إدارة الألم بعد الجراحة بين الحيوانات الفردية بسبب الاختلافات في الحساسية للمسكنات، لذا يجب تقييم الحيوانات بانتظام للبحث عن علامات مرتبطة بالألم، بما في ذلك انحناء الظهر، وانخفاض النشاط، ونقص الشهية، وفقدان الوزن، مع توفير مسكنات إضافية عند الضرورة وفقاً للإرشادات المؤسسية. ويعد التثبيت المتسق للحلقة أمراً حاسماً لمنع انكماش الجرح، لذا يجب توزيع الـ 8–12 غرزة بسيطة متقطعة بشكل متساوٍ حول الحلقة لتوزيع الشد بانتظام ومنع الرفع أو التشوه. ويجب تأمين كل غرزة بعقدة جراحية لتقليل احتمالية الارتخاء أثناء فترة التعافي. وأخيراً، نوصي باستخدام جرذان من نفس السلالة، والعمر، ووزن الجسم، والجنس ضمن دراسة معينة لتقليل التباين. كما يمكن لباحث خبير واحد إجراء جميع الإجراءات الجراحية، ولتجنب الانحياز، نوصي باستخدام التعمية المزدوجة في التحليلات النسيجية والجزيئية.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يتقدموا بالشكر إلى منطقة Östergötland لتمويل هذا البحث. ويشكر المؤلفون السيد Anders Delleskog في مركز CBR بجامعة Linköping على مقترحاته ودعمه ومساعدته في إنشاء النموذج الحيواني. كما يشكر المؤلفون الدكتورة Maria Ntzouni في المرفق المركزي بجامعة Linköping على دعمها وإرشادها في عمليات طمر أنسجة الجلد وتقطيعها وصبغها بصبغة HE. وشكر خاص لـ Sallam Abdallah في الـ R&وحدة #38;D للجلد والخلايا المستزرعة، جامعة Linköping، لتحضير عينة الجلد وتصبيغ HE.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بوبرينورفينسالفارم اسكندنافيا (Salfarm Scandinavia)451790              التركيز 0.3 مجم/مل
كاربروفينZoetis لصحة الحيوان191380              Rimadyl 50 ملغم/مل
سدادة إيكينسويميد (Swemed)2076152              السُمك 3 مم
محطة التضمين Leica BiosystemsEG1150 H&سي              
إيوزين هيستولاب (Histolab)1650              محلول تلوين بتركيز 0.2%
إيثانول مطلقSolveco1015              درجة تحليلية
ضمادة تثبيتسويميد (Swemed)2048934              4 سم × 4 م بولي أميد/فيسكوز
فورمالدهيدهيستولاب (Histolab)2176              4% في محلول PBS، وبدرجة حموضة (pH) تتراوح بين 7.2 و7.4
ماكينة قص الشعرسويفيتF95000              طول القطع: 0.5 مم
هيماتوكسيلينهيستولاب1800              Harris HTX
هيستولاب-كلير (Histolab-Clear)هستولاب (Histolab)14250              بديل الزايلين
إيزوفلورانفي إم فارما (VM Pharma)448210              أتاني فيت 1000 ملجم/جم
LekotapeSwemed2056774
MepilexSwemed2059125              7.5x8.5 سم 
غشاء Meporeسويميد (Swemed)2057753               ٦×٧ سم مع الإطار
شريط جراحي مسامي دقيق سويميد (Swemed)2063856               1.2 سم × 9.1 م 
الميكروتوم (جهاز التقطيع الدقيق)Thermo Fisher Scientific387861               Microm HM355S
وسط التثبيت هيستولاب00840-05               بيرتكس
حلقة دائرية (O-ring)رويلوغودB0B1TRQBRT               قطر داخلي 11 مم وعرض 1 مم
غرزة جراحية (ethilon 4-0)Scandivet21274-أ               بولي أميد غير قابل للامتصاص     
تجفيف الأنسجة Leica Biosystems Leica TP1020               
Tubifast قابل للتمدد في اتجاهينسويميد (Swemed)2069292               7.5 سم × 10 م PES/PA

المراجع

  1. Europe advanced wound care market size & share 2025-2034: market size by product, by application, by end use, regional forecast. Global Market Insights. Available from: https://www.gminsights.com/industry-analysis/europe-advanced-wound-care-market.
  2. Nauta AC, Gurtner GC, Longaker MT. Adult stem cells in small animal wound healing models. In: Gourdie RG, Myers TA, editors. Wound Regeneration and Repair Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2013. p. 81-98.
  3. Masson-Meyers DS, et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. Int J Exp Pathol. 2020;101(1-2):21-37.
  4. Wong VW, et al. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:969618.
  5. Shahin H, et al. MicroRNA-155 mediates multiple gene regulations pertinent to the role of human adipose-derived mesenchymal stem cells in skin regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 2024;12:1328504.
  6. Ojeh N, et al. The Wound Reporting in Animal and Human Preclinical Studies (WRAHPS) guidelines. Wound Repair Regen. 2024;33(1):e13232.
  7. Flynn K, et al. Chronic wound healing models. ACS Pharmacol Transl Sci. 2023;6(5):783-801.
  8. Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
  9. Nuutila K, et al. Titanium wound chambers for wound healing research. Wound Repair Regen. 2016;24(6):1097-1102.
  10. Galiano RD, Michaels J, Dobryansky M, Levine JP, Gurtner GC. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 2004;12(4):485-492.
  11. Miller AW, Anderson AR, Suarez-Arnedo A, Segura T. Wound healing splinting devices for faster access and use. JID Innov. 2024;5(2):100332.
  12. Winter GD. Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of young domestic pig. Nature. 1962;193:293-294.
  13. Laurano R, Boffito M, Ciardelli G, Chiono V. Wound dressing products: a translational investigation from the bench to the market. Eng Regen. 2022;3(2):182-200.
  14. Rhea L, Dunnwald M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. 2020;(162):61616.
  15. Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
  16. Bae SH, Bae YC, Nam SB, Choi SJ. A skin fixation method for decreasing the influence of wound contraction on wound healing in a rat model. Arch Plast Surg. 2012;39(5):457-462.
  17. DeMarco GJ, Nunamaker EA. A review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies. Comp Med. 2019;69(6):520-534.
  18. Jorgensen LB, Sorensen JA, Jemec GBE, Yderstraede KB. Methods to assess area and volume of wounds: a systematic review. Int Wound J. 2016;13(4):540-553.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج جروح الجرذانالتئام جروح الجلدالنسيج الحبيبيانكماش الجرحإعادة الظهارةالتقييم النسيجيقياس المساحات الرقميعلاجات الجروح قبل السريريةتجدد البشرة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.