مقالة منهجية

الربط الدقيق للشريان التاجي الأيسر النازل الأمامي باستخدام المعالم التشريحية في نموذج احتشاء عضلة القلب في الفئران

55 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72336

⸱

أغسطس 18, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية تحفيز احتشاء عضلة القلب في الفئران عن طريق الربط الدائم للشريان التاجي الأيسر النازل الأمامي، باستخدام الثلم بين البطيني الأمامي كعلامة سطحية يمكن تكرارها لضمان وضع الغرز بدقة. ويتم التحقق من حدوث الاحتشاء عن طريق تخطيط كهربائية القلب، وتصوير القلب بالموجات فوق الصوتية، والتلوين النسيجي، وتحليل المؤشرات الحيوية في المصل.

الملخص

يعد الربط الدائم للشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) الأيسر النهج الأكثر استخداماً لإنشاء نماذج فئران مصابة باحتشاء عضلة القلب (MI) في الأبحاث القلبية الوعائية قبل السريرية. ومع ذلك، في البروتوكولات التقليدية، يتم وضع موقع الربط عادةً على مسافة 1–2 mm أسفل الزائدة الأذينية اليسرى، وهي علامة تشريحية غالباً ما يصعب تحديدها بدقة أثناء الجراحة. وأدى ذلك، بالتزامن مع التباين الملحوظ بين الأفراد في التشريح التاجي للفئران، في كثير من الأحيان إلى تحديد غير دقيق لموقع LAD، وعدم اتساق مواقع الربط، وانخفاض القدرة على إعادة إنتاج النتائج بين المشغلين. ولمعالجة هذه القصور، يقدم هذا البروتوكول الثلم بين البطيني الأمامي (AIS) كعلامة إرشادية لربط LAD. إن AIS عبارة عن أخدود سطحي ضحل مرئي مباشرة تحت المجهر، حيث يمر LAD تحته مباشرة. وبخلاف النهج التقليدية، يوفر هذا الثلم مرجعاً تشريحياً مستقراً يدعم اختياراً أكثر اتساقاً لموقع الربط، كما يسهل على المشغلين غير المتمرسين تحديده. يجمع البروتوكول بين التخدير القياسي باستنشاق isoflurane والتنبيب الرغامي غير الجراحي، ويتحقق من حدوث MI باستخدام تخطيط كهربائية القلب، وتخطيط صدى القلب، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، والتلوين النسيجي المرضي، وتصوير الشرايين التاجية ثلاثي الأبعاد. يوفر هذا البروتوكول طريقة تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار لتحفيز MI في الفئران لدراسة التغيرات الفيزيولوجية المرضية والمناعية التي تلي احتشاء عضلة القلب.

المقدمة

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI)، وهو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات الناجمة عن أمراض القلب والأوعية الدموية في جميع أنحاء العالم، تهديداً كبيراً لصحة الإنسان1. ويتميز احتشاء عضلة القلب ببداية مفاجئة، ومسار سريري حرج، ومعدل وفيات مرتفع، وينتج أساساً عن الانسداد الخثاري للشرايين التاجية، مما قد يؤدي إلى نقص تروية حاد في عضلة القلب، يليه نخر الخلايا العضلية القلبية وسلسلة من المضاعفات، بما في ذلك عدم انتظام ضربات القلب، وفشل القلب، والموت القلبي المفاجئ2. وعلى الرغم من التقدم الملحوظ في طب القلب السريري، فإن محدودية الوصول إلى أنسجة عضلة القلب البشرية لا تزال تعيق دراسة الآليات الفسيولوجية المرضية الكامنة وراء احتشاء عضلة القلب وتطوير استراتيجيات علاجية فعالة3. وبناءً على ذلك، تظل النماذج الحيوانية in vivo الموثوقة والقابلة للتكرار وذات الصلة سريرياً، والتي تحاكي بدقة السمات السريرية وتطور احتشاء عضلة القلب، ضرورية للدراسات الميكانيكية والتقييم العلاجي قبل السريري.

منذ أن وضع Johns و Olson أول نموذج لاحتشاء عضلة القلب (MI) في الفئران عام 1954، خضعت منهجيات تحفيز احتشاء عضلة القلب في الفئران لتحسينات مستمرة4. وأصبح الربط الدائم للشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) تحت الرؤية المجهرية المباشرة التقنية الأكثر اعتماداً لأنها تحاكي السمات المرضية الرئيسية لاحتشاء عضلة القلب لدى البشر، بما في ذلك نقص تروية عضلة القلب الموضعي، ونخر عضلة القلب، وإعادة تشكيل البطين بعد الاحتشاء5. ومع ذلك، يتطلب ربط LAD التقليدي خبرة جراحية مجهرية كبيرة يتم اكتسابها عادةً فقط من خلال تدريب مكثف، مما يحد من اتساق الإجراء وقابلية تكراره بين الجراحين والمختبرات6. علاوة على ذلك، تساهم المضاعفات أثناء العملية وبعدها — بما في ذلك النزيف، أو إصابة أو انهيار الرئة، أو وضع الرباط في مكان خاطئ، والتلف الميكانيكي للأنسجة الناتج عن التهوية غير الكافية — في ارتفاع معدلات الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة نسبياً، مما يقيد بشكل أكبر التطبيق الواسع لهذا النموذج7. واستجابة لهذه القيود، قدم Gao وآخرون تقنية معدلة تتضمن ربط LAD من خلال قلب القلب، والتي تبسط الإجراء الجراحي وتخفض الحاجز التقني لإنشاء النموذج8. كما تم تطوير مناهج تجريبية إضافية، بما في ذلك الإصابة بالتجميد للشرايين التاجية والتحفيز الدوائي لإصابة عضلة القلب، لتطبيقات بحثية محددة9,10. ومع ذلك، يظل ربط LAD الدائم تحت الرؤية المباشرة هو الطريقة المفضلة لأنها تحاكي بدقة أكبر السمات الفيزيولوجية المرضية الرئيسية لاحتشاء عضلة القلب لدى البشر، بينما تسمح بالتحكم في حجم الاحتشاء وموقعه.

على الرغم من استخدامه الواسع، لا يزال ربط الشريان التاجي الأيسر النازل (LAD) التقليدي محدوداً بسبب التباين في تحديد موقع الربط، وعدم اتساق الإجراءات، وارتفاع معدلات الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة نسبياً، والتباين بين المختبرات في قابلية التكرار، وكل ذلك قد يؤثر على موثوقية النتائج التجريبية وقابليتها للمقارنة11. الهدف العام من البروتوكول الحالي هو وضع طريقة أكثر معيارية وقابلية للتكرار للربط الدائم للشريان LAD في الفئران من خلال استخدام الثلم بين البطيني الأمامي (AIS) كعلامة تشريحية خارجية لتحديد موقع الوعاء الدموي. وبدلاً من تقدير موقع الربط على مسافة ثابتة أسفل الزائدة الأذينية اليسرى، يحدد هذا البروتوكول الثلم AIS — وهو أخدود سطحي ضحل يكون مرئياً مباشرة تحت المجهر ويقع فوق الشريان LAD — كمرجع تشريحي مستقر لتوجيه عملية الربط. وبالمقارنة مع التقدير التقليدي القائم على العلامات، يهدف هذا النهج إلى تسهيل اختيار موقع الربط بشكل أكثر اتساقاً، وتقليل التباين المعتمد على المشغل، وتحسين إمكانية الوصول للجراحين الأقل خبرة مع الحفاظ على التوافق مع إجراءات احتشاء عضلة القلب (MI) القياسية في الفئران. لذلك، يعد هذا البروتوكول مناسباً للباحثين الذين يسعون إلى طريقة جراحية قابلة للتكرار لإنشاء نماذج احتشاء عضلة قلب دائم للدراسات المتعلقة بإصابة عضلة القلب، وإعادة تشكيل البطين، والالتهاب، وآليات أمراض القلب والأوعية الدموية ذات الصلة.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب التي شملت الحيوانات بموافقة لجنة الأخلاقيات بمركز التجارب الحيوانية في جامعة جنوب غرب الطبية (رقم الموافقة SWMU20240146). استُخدمت في هذه الدراسة فئران ذكور من سلالة C57BL/6J (خالية من مسببات الأمراض المحددة [SPF])، تتراوح أعمارها بين 8-10 أسابيع وتزن 20.0 ± 3.0 g. يتم تأقلم الفئران لمدة 1 أسبوع تحت ظروف مختبرية قياسية (2°C ± 2°C؛ دورة ضوء 12 ساعة/ظلام 12 ساعة) قبل بدء التجارب.

1. التحضير ما قبل الجراحة

  1. قم بتجهيز وتعقيم جميع الأدوات الجراحية في يوم الجراحة، بما في ذلك الملاقط، ومقصات الرمد، وحامل الإبر، وممسك الشرايين الدقيق (micro-mosquito hemostat)، ومباعد الجفن على شكل V، وخيوط نايلون 7-0 دائرية 3/8 مع إبرة، وخيوط نايلون 6-0، وخيوط نايلون 5-0. قم بتعقيم جميع الأدوات المعدنية في الموصدة (Autoclave) عند 121°C لمدة 20 min قبل الإجراء، وأعد تعقيمها بين الحيوانات باستخدام جهاز التعقيم بالخرز الزجاجي (250°C لمدة 15 s)، متبوعاً بالتبريد على وسادة معقمة. استخدم الخيوط من عبوات معقمة ومحكمة الإغلاق.
  2. قم بإعداد منطقتي عمل منفصلتين للحفاظ على التقنية العقمية. جهز منطقة واحدة بالملاقط، وطقم تنبيب الرغامي للفئران، وجهاز التخدير، وجهز منطقة جراحية معقمة ثانية بالأدوات المعقمة، ومسحات قطنية، وبوفيدون-يود، وشاش معقم.
  3. ضع كريم إزالة الشعر على المنطقة الصدرية لمدة 1 min. قم بإزالة الكريم والشعر بلطف باستخدام شاش معقم مبلل بماء معقم أو محلول ملحي.
    1. إزالة الشعر وحدها لا تشكل تحضيراً جراحياً للجلد. قم بإجراء التطهير العقمي النهائي للجلد والتغطية المعقمة فقط بعد تخدير الفأر وتنبيبه وتثبيته على المنصة الجراحية، مباشرة قبل شق الجلد (الخطوة 2.6).
  4. أعطِ سيفازولين (30 mg/kg) عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل ساعة واحدة من الجراحة. قم بإعادة حل سيفازولين الصوديوم المخصص للحقن في محلول ملحي معقم 0.9% للوصول إلى تركيز تشغيلي قدره 30 mg/mL، وأعطِ حوالي 0.2 mL لكل 20 g من وزن الجسم لتحقيق الجرعة المستهدفة. استمر في الإعطاء مرة واحدة يومياً لمدة 5 أيام متتالية بعد الجراحة.
    ملاحظة: لا تستخدم العوامل المرقئة الدوائية الجهازية أو الموضعية في هذا البروتوكول. حقق الإرقاء أثناء العملية عن طريق تطبيق ضغط خفيف ومستمر باستخدام مسحة قطنية معقمة لمدة 10–30 s، أو حتى يتوقف النزيف.

2. تحريض التخدير والأنبوب الرغامي

  1. ضع الفأر في غرفة الحث (16 × 10 × 11 cm) المتصلة بجهاز التخدير. اضبط معدل تدفق الغاز الحامل على 0.5 L/min وحث التخدير باستخدام isoflurane بنسبة 3.5%–4.0%.
    ملاحظة: تأكد من كفاية التخدير من خلال غياب منعكس سحب القدم. في ظل هذه الإعدادات، يصل الفأر عمومًا إلى مستوى التخدير الجراحي خلال 2–4 min.
  2. ضع الفأر المخدر في وضعية الاستلقاء الظهري على منصة التنبيب الرغامي للفئران. علق الفأر عن طريق تعليق القواطع العلوية بالشريط المطاطي للمنصة بحيث يمتد الرأس والعنق بزاوية 45° تقريبًا. قم بمحاذاة المحاور الفموية والبلعومية والحنجرية لجعل المزمار مرئيًا بشكل مباشر.
  3. قم بإجراء التنبيب الفموي الرغامي
    1. أجرِ التنبيب الفموي الرغامي تحت تنظير الحنجرة المباشر بدون بضع الرغامي لإنشاء تهوية ميكانيكية محكومة. استخدم قسطرة وريدية مقاس 20 G (القطر الخارجي، 0.9 mm تقريبًا؛ الطول، 15 mm تقريبًا) كأنبوب رغامي.
    2. افتح الفم وأزِح اللسان برفق إلى جانب واحد باستخدام الملقط. أدخل شفرة منظار الحنجرة الخاص بالحيوانات الصغيرة على طول ظهر اللسان واضغط على قاعدة اللسان.
    3. ادفع منظار الحنجرة حتى يصبح لسان المزمار مرئيًا. ارفع منظار الحنجرة للأعلى وإلى الأمام على طول محور المقبض لرفع لسان المزمار وكشف فتحة المزمار التي تشبه حرف V والأحبال الصوتية الشاحبة.
    4. مرر القسطرة عبر المزمار المفتوح أثناء الشهيق مع الحفاظ على الرؤية المباشرة للأحبال الصوتية. أخرج منظار الحنجرة بعد مرور القسطرة عبر المزمار.
    5. ادفع القسطرة إلى عمق 5–7 mm تقريبًا. اسحب السلك الموجه ووصل القسطرة بجهاز التنفس الاصطناعي.
      ملاحظة: تأكد من الوضع الصحيح للأنبوب الرغامي عن طريق مراقبة حركة جدار الصدر الثنائية المتماثلة والمتزامنة مع جهاز التنفس الاصطناعي. إذا كانت حركة جدار الصدر ضئيلة وحدثت حركة بطنية إيقاعية بدلاً من ذلك، مصحوبة بخفة تدريجية في التخدير، فأخرج القسطرة من المريء وأعد عملية التنبيب.
    6. إذا تعذر رؤية المزمار، اسحب منظار الحنجرة وأعد وضع الفأر على منصة التنبيب مع تمديد الرأس والعنق بزاوية 45° تقريبًا. أعد محاذاة المحاور الفموية والبلعومية والحنجرية، وأزل أي إفرازات فموية بلعومية باستخدام مسحة قطنية معقمة، وكرر تنظير الحنجرة. إذا ظهرت على الفأر علامات الإفاقة من التخدير، فأعده إلى غرفة الحث، وعمق التخدير، ثم كرر محاولة التنبيب.
    7. أوقف الإجراء إذا أصيب الفأر بالزرقاء، أو حدث نزيف حنجري، أو انقطاع مستمر في التنفس. أوقف إعطاء isoflurane وضع الفأر على وسادة تدفئة يتم التحكم في درجة حرارتها (37°C) حتى يتعافى تمامًا.
    8. لا تشرع في عملية بضع الصدر إذا فشل التنبيب الرغامي. قم بجدولة الإجراء في جلسة لاحقة أو استبعد الحيوان من الدراسة وسجل ذلك كفشل إجرائي.
      ملاحظة: قد تؤدي محاولات التنبيب المتكررة إلى وذمة حنجرية، مما يزيد من خطر الضائقة التنفسية بعد الجراحة. في معظم الحالات، يتم تحقيق التنبيب الناجح خلال أول محاولتين بعد الرؤية المباشرة للمزمار. تتطلب الكفاءة في التنبيب الفموي الرغامي الممارسة والإلمام بالتقنية.
  4. قدم الهواء كغاز حامل بمعدل تدفق 0.5 L/min وحافظ على التخدير باستخدام isoflurane بنسبة 1.5%–2.0%. اضبط جهاز التنفس الاصطناعي على معدل تنفس 130 breaths/min، وحجم مدّي 2 mL، ونسبة شهيق إلى زفير 5:4.
    ملاحظة: يتجاوز الحجم المدّي المضبوط في جهاز التنفس القيمة النظرية المقدرة من وزن الجسم لأنه يعوض الحجم القابل للانضغاط لدائرة جهاز التنفس والمساحة الميتة للأنبوب الرغامي. قم بتقييم التهوية طوال الإجراء عن طريق مراقبة الحيوان بحثًا عن الزرقاء وعلامات الرضح الضغطي، بما في ذلك استرواح الصدر والنفاخ تحت الجلد.
    1. راقب عمق التخدير باستمرار طوال الإجراء. قيم النمط التنفسي ومنعكس سحب القدم كل 2 min. راقب معدل ضربات القلب باستمرار باستخدام تخطيط كهربائية القلب (ECG)، واضبط تركيز isoflurane للحفاظ على معدل ضربات قلب يتراوح بين 40–50 beats/min؛ وعادة ما يكون تركيز isoflurane بنسبة 1.5%–2.0% كافيًا. طوال الإجراء، لاحظ أي مجهود تنفسي تلقائي ضد جهاز التنفس، وحركة الشوارب، وتغيرات في لون الغشاء المخاطي.
    2. زد تركيز isoflurane بزيادات قدرها 0.5%، حتى حد أقصى 3.0%، إذا عاد منعكس سحب القدم للظهور، أو لوحظت حركة في الشوارب، أو حدث مجهود تنفسي تلقائي ضد جهاز التنفس. قلل تركيز isoflurane بإنقاصات قدرها 0.5%، إلى حد أدنى 1.0%، إذا انخفض معدل ضربات القلب عن 350 beats/min. أوقف الإجراء الجراحي مؤقتًا كلما لوحظت هذه العلامات، واستمر في مراقبة معدل ضربات القلب والنمط التنفسي ولون الغشاء المخاطي وحركة الشوارب، ولا تستأنف الإجراء إلا بعد استقرار المعايير الفسيولوجية.
  5. أمل الفأر نحو الجانب الأيمن مع جعل الجانب الأيسر للأعلى لكشف جدار الصدر الأيسر. ثبت الأطراف الأربعة والذيل على المنصة باستخدام شريط لاصق.
  6. طهر موقع الجراحة بثلاث تطبيقات متتالية من povidone–iodine. في كل تطبيق، استخدم مسحة قطنية معقمة جديدة، بدءًا من موقع الشق المخطط له والتحرك للخارج في لولب مركزي إلى حوالي 1 cm خارج الشق المقصود في جميع الاتجاهات. تخلص من المسحة بعد كل تطبيق، ولا تعيد المسحة المستخدمة إلى مركز المجال الجراحي. اترك التطبيق النهائي ليجف تمامًا في الهواء، ثم ضع غطاءً معقمًا، مع كشف المجال الجراحي فقط قبل إجراء شق الجلد.

3. بضع الصدر وكشف القلب

ملاحظة: تم توضيح سير العمل الجراحي العام، بما في ذلك وضعية الحيوان، وبضع الصدر، وكشف القلب، وربط الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD)، وإغلاق الصدر، والتعافي بعد الجراحة، في الشكل 1 والشكل 2.

مخطط لتشريح القلب يوضح نقطة الربط والشرايين التاجية؛ صور لموقع الجراحة.
الشكل 1التحديد التشريحي لموقع ربط الشريان التاجي الأيسر النازل الأمامي باستخدام الثلم بين البطيني الأمامي. (أ) منظر بطني للقلب الفأري المكشوف قبل الربط، يوضح الثلم بين البطيني الأمامي (AIS). (ب) منظر للمنطقة نفسها بعد ربط الشريان التاجي الأمامي النازل الأيسر (LAD)؛ تشير المنطقة المحاطة بدائرة إلى موقع الربط. (ج) مخطط يوضح العلاقة المكانية بين الثلم بين البطيني الأمامي والشرايين التاجية. يسير الشريان التاجي الأمامي النازل الأيسر على طول الثلم بين البطيني الأمامي، وتقع نقطة الربط عند الثلث العلوي من الثلم. RCA، الشريان التاجي الأيمن؛ LCA، الشريان التاجي الأيسر؛ LCX، الشريان التاجي المنعكس الأيسر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تسلسل الإجراء الجراحي على فأر، كشف القلب، البحث التجريبي، مخطط توضيحي خطوة بخطوة.
الشكل ٢الإجراء الجراحي لربط الشريان التاجي الأيسر النازل الأمامي بتوجيه من الثلم بين البطيني الأمامي في الفئران. (أ) ثبّت الفأر المخدر في وضعية تسمح بالوصول إلى المنطقة الصدرية اليسرى التي تمت إزالة الشعر منها. (ب) قم بإجراء شق جلدي فوق الجدار الصدري الأيسر. (ج) باعد بين العضلات الصدرية وحدد المسافة الوربية المناسبة لإجراء عملية بضع الصدر. (د، هـ) أدخل مباعدة الصدر وثبّتها لتوسيع المسافة الوربية وكشف المجال الجراحي. (و) عاين القلب المكشوف وحدد الثلم بين البطين الأمامي (AIS). (ز) مرر خيط خياطة نايلون قياس 7-0 عبر الثلم بين البطين الأمامي وتحت الشريان التاجي الأيسر النازل (LAD). (ح) أحكم ربط الخيط لإحداث ربط دائم للشريان التاجي الأيسر النازل (LAD). (ط) أزل مباعدة الصدر وأغلق الجدار الصدري. (ي، ك) أغلق طبقات العضلات والجلد بالتتابع. (ل) اترك الفأر ليتعافى في بيئة دافئة بعد الجراحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. باستخدام مقصات الرمد، يتم عمل شق جلدي طولي بطول 1 cm في الجدار الصدري الأيسر، موازٍ للمحور الطولي لعظم القص وعلى مسافة 2 mm تقريبًا جانبيًا من الحافة القصية اليسرى. ثم يتم كشف العضلات الصدرية الكامنة تحت الجلد.
  2. باستخدام ملاقط دقيقة، يتم فصل العضلة الصدرية الكبيرة والعضلة الصدرية الصغيرة تفصيلاً غير حاد على طول اتجاه أليافها. يتم إبعاد العضلات جانبيًا لكشف الأضلاع والمساحات الوربية، مع تجنب قطع العضلات لتقليل النزيف.
  3. يتم تحديد المساحة الوربية المناسبة قبل فتح التجويف الصدري. يتم تحديد موقع الشريان الوربي الأمامي، وهو فرع من الشريان الصدري الداخلي الذي يسير داخل مساحة وربية موازٍ للأضلاع، ويتم تحديد المساحة الوربية الثالثة الموجودة مباشرة في الجهة القحفية للشريان الأكثر وضوحًا في المساحة الوربية الرابعة.
  4. في حال عدم وضوح الشريان الوربي الأمامي، يتم جس الضلع الأول والعد في الاتجاه الذيلي لتحديد المساحة بين الضلعين الثالث والرابع. يتم التأكد من أن المساحة الوربية المختارة توفر رؤية مباشرة وغير محجوبة للملحق الأذيني الأيسر والجدار الحر الأمامي للبطين الأيسر قبل المتابعة.
    ملاحظة: يعد التحديد الدقيق للمساحة الوربية الثالثة أمرًا ضروريًا لأن الموقع غير الصحيح لعملية بضع الصدر قد يقلل من رؤية القلب ويؤثر سلبًا على الإجراء.
  5. يتم إجراء عملية بضع الصدر عبر المساحة الوربية الثالثة اليسرى. يتم توسيع المساحة الوربية برفق باستخدام مباعد جفن على شكل حرف V حتى يتم كشف الملحق الأذيني الأيسر والثلث العلوي من البطين الأيسر بوضوح داخل المجال الجراحي.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يظل القلب مغطى بالتامور؛ ولذلك، لا يمكن تحديد الـ AIS بشكل موثوق. يتم تحديد الـ AIS فقط بعد فتح التامور (الخطوة 3.6)، كما هو موضح في الخطوات 4.2-4.3.
  6. يتم الإمساك بالتامور برفق باستخدام زوج من الملاقط الدقيقة ورفعه بعيدًا عن عضلة القلب. يتم استخدام زوج ثانٍ من الملاقط الدقيقة لتمزيق التامور ببطء وكشف القلب بالكامل.

4. ربط الشريان التاجي النازل الأمامي الأيسر الموجه بالعلامات التشريحية

  1. قم بتمرير غرزة نايلون 6-0 عبر جدار الصدر وطبق سحباً لطيفاً لتوسيع المجال الجراحي. اكشف عن الثلم بين البطينيين (AIS) بالكامل قبل تحديد موقع الربط (الشكل 1A).
  2. حدد الثلم بين البطينيين (AIS) باعتباره أخدوداً ضحلاً يمتد مائلاً من قاعدة القلب باتجاه القمة ويمثل الحدود السطحية بين البطين الأيسر والأيمن (الشكل 1C). تحت المجهر، حدده كمنخفض شبه دائري يقع على عمق 1–2 mm تقريباً أسفل الحافة السفلية للملحق الأذيني الأيسر.
  3. إذا كان من الصعب تحديد الثلم بين البطينيين (AIS)، امسح سطح النخاب بلطف بمسحة قطنية مبللة بمحلول ملحي دافئ. أعد فحص المجال الجراحي تحت المجهر لتحديد الأخدود بشكل أكثر وضوحاً.
    ملاحظة: تحت مجهر التشريح، يكون الثلم بين البطينيين (AIS) عبارة عن أخدود ضحل سهل التمييز يحدد تشريحياً الحدود بين البطين، مع مرور الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) تحته مباشرة. إذا ظل الثلم بين البطينيين (AIS) غير واضح بعد المسح، تأكد أولاً من أن عملية بضع الصدر توفر كشفاً كافياً. ثم حدد الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) مباشرةً وفقاً للطرق المذكورة سابقاً: بالنسبة للوريد القلبي المرافق له، يكون الشريان أكثر وردية في اللون، وأصغر في القطر، ونبضه واضح تماماً12.
    1. إذا تعذر تحديد الثلم بين البطينيين (AIS) أو الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD)، تحقق أولاً من أن بضع الصدر قد تم عبر المساحة الوربية الثالثة اليسرى. إذا لزم الأمر، أعد وضع شق بضع الصدر كما هو موضح في الخطوات 3.3–3.5، ثم كرر عملية تحديد الثلم بين البطينيين (AIS) والشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) كما هو موضح في الخطوات 4.1–4.3.
    2. أنهِ الإجراء إذا تعذر تحديد الثلم بين البطينيين (AIS) أو الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) بعد 10 min من الفحص الدقيق، أو في حالة حدوث نزيف لا يمكن السيطرة عليه، أو إذا تجاوز إجمالي وقت إجراء الصدر المفتوح 20 min، أو إذا ظل معدل ضربات القلب أقل من 30 نبضة/دقيقة على الرغم من تعديل عمق التخدير. خدر الفأر تخديراً عميقاً بـ 5% isoflurane، ثم قم بقتله عن طريق خلع الفقرات العنقية، وسجل الحيوان كفشل إجرائي لإدراجه في تحليل النتائج الجراحية.
  4. مرر غرزة نايلون 7-0 عبر الأخدود عند الثلث العلوي من الثلم بين البطينيين (AIS) (الشكل 1B). أدخل الإبرة بشكل عمودي على سطح النخاب إلى عمق 0.5–1 mm تقريباً، بحيث تكون نقاط الدخول والخروج على جانبي الأخدود وبما يغطي أقصى عرض له تقريباً.
  5. ثبت الرباط باستخدام عقدة جراحية. اضبط الرباط حتى يحدث شحوب فوري في عضلة القلب البعيدة عن موقع الربط بعد العقدة الأولى دون حدوث انبعاج ملموس في الأنسجة المحلية.
    ملاحظة: شد الغرزة بما يكفي فقط لسد تدفق الدم التاجي. قد يؤدي الشد المفرط إلى إصابة عضلة القلب المجاورة أو يتسبب في قطع الغرزة للوعاء الدموي والأنسجة المحيطة.
  6. تأكد من نجاح انسداد الشريان التاجي في غضون 1 min من الربط من خلال ملاحظة شحوب نقص تروية بقعي في عضلة القلب البعيدة عن موقع الربط12. أكد الانسداد بشكل إضافي من خلال تحديد ارتفاع قطعة ST في تخطيط كهربائية القلب (ECG).
  7. إذا كانت المنطقة التي تعاني من نقص التروية صغيرة جداً أو كان الشحوب غائباً، فك الرباط وكرر إجراء الربط.

5. الإغلاق والتعافي بعد الجراحة

  1. أزل مباعد الجفن الذي يتخذ شكل حرف V بعناية. أغلق فتحة الصدر باستخدام غرزة نايلون مفردة ومتقطعة مقاس 5-0، وذلك بتمرير الإبرة حول الضلعين الثالث والرابع المتجاورين لإعادة تقريب المسافة الوربية الثالثة. اجعل الإبرة قريبة من سطح الضلع لتجنب إصابة الحزمة الوعائية العصبية الوربية. قبل ربط الغرزة، اضغط برفق على الصدر عند نهاية الزفير لإفراغ الهواء المتبقي داخل الصدر، ثم حافظ على الضغط أثناء تثبيت الغرزة باستخدام عقدة جراحية.
  2. أغلق شق الجلد في طبقات باستخدام غرز نايلون مقاس 5-0. تأكد من التقريب الكامل لحواف الجرح قبل المتابعة.
  3. ضع الفأر على وسادة تدفئة يتم التحكم في درجة حرارتها (37°C)، وأوقف إعطاء الإيزوفلوران، واستمر في التهوية الميكانيكية حتى يستأنف التنفس التلقائي. راقب الحيوان حتى يتعافى من التخدير، بما في ذلك حركة الذيل أو الشوارب واستعادة نمط تنفسي منتظم يبلغ حوالي 150 breaths/min.
  4. تحقق من الجاهزية لنزع الأنبوب الرغامي عن طريق التأكد من التنفس التلقائي المنتظم، وحركة جدار الصدر المرئية والمتزامنة مع دورة جهاز التنفس الاصطناعي، والحركة الهادفة للأطراف أو الشوارب. اسحب الأنبوب الرغامي ببطء خلال مرحلة الزفير، ثم استمر في مراقبة الفأر على وسادة التدفئة لمدة 3–5 min للتأكد من عدم وجود ضيق في التنفس.
    ملاحظة: ينتج ضيق التنفس بعد نزع الأنبوب الرغامي عادةً عن استرواح الصدر الناتج عن الإغلاق غير الكامل للمسافة الوربية. في حالة حدوث ضيق في التنفس، أعد تخدير الفأر وتهويته مؤقتاً، وأعد فتح غرز الجلد، وافحص إغلاق المسافة الوربية، وضع غرزاً إضافية في أي موقع لتسرب الهواء قبل تكرار عملية نزع الأنبوب.
  5. أعد الفأر إلى قفصه بعد التعافي من التخدير. أعطِ البوبرينورفين (0.1 mg/kg، تحت الجلد) فوراً بعد الجراحة وكل 4–6 h خلال أول 48 h.
  6. راقب كل فأر مرتين يومياً على الأقل خلال أول 3 أيام بعد الجراحة ومرة واحدة يومياً بعد ذلك. قيم وزن الجسم، والوضعية، والنشاط، والنمط التنفسي، والجرح الجراحي، وقم بالقتل الرحيم لأي حيوان يستوفي النقاط النهائية الإنسانية المحددة مسبقاً، بما في ذلك التنفس المجهد المستمر، أو عدم القدرة على الوصول إلى الطعام أو الماء، أو اتخاذ وضعية منحنية وغير متحركة لا تستجيب للتحفيز.

6. التقييم بالتخطيط الكهربائي للقلب (ECG)

  1. سجل إشارات تخطيط القلب الكهربائي باستخدام نظام تسجيل فسيولوجي متعدد القنوات مجهز بمضخم تخطيط قلب (ECG amplifier). اغرس ثلاثة أقطاب كهربائية تحت الجلد للأطراف في الفأر، مع توصيل المدخل الموجب (VIN+) بالطرف الخلفي الأيسر، والمدخل السالب (VIN−) بالطرف الأمامي الأيمن، والأرضي (GND) بالطرف الخلفي الأيمن.
  2. قم بتوصيل وحدة مضخم تخطيط القلب بوحدة الحصول على البيانات. اضبط مرشح الثلمة (notch filter) على 50 Hz (أو 60 Hz، وفقاً لتردد التيار الكهربائي المحلي)، ثم افتح برنامج الحصول على البيانات وأضف وحدة مضخم تخطيط قلب جديدة ضمن إعدادات القناة التماثلية.
    1. قم بتكوين المضخم وفق المعايير التالية: gain = 20، والوضع (mode) = normal، ومرشح تمرير منخفض = 150 Hz، ومرشح تمرير مرتفع = 0.05 Hz. افتح إعدادات الحصول على البيانات، واضبط معدل أخذ العينات على 1 kHz، ثم أغلق نافذة الإعدادات.
    2. بعد وضع الأقطاب الكهربائية، انقر فوق Start لبدء التسجيل. اضبط القاعدة الزمنية للعرض على 0.5 s لكل قسم رئيسي والمقياس الرأسي على 0.25 mV لكل قسم رئيسي، ثم سجل تخطيط القلب باستمرار لمدة 30 s على الأقل. اختر مقطعاً مستقراً وخالياً من التشويش للتحليل والعرض التمثيلي.
  3. سجل تخطيط القلب الكهربائي فوراً بعد الربط مع إبقاء الفأر تحت تخدير بـ 1.5% isoflurane والحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية باستخدام وسادة تدفئة. سجل تخطيطات القلب الكهربائية لكل من مجموعة احتشاء عضلة القلب (MI) ومجموعة التحكم الطبيعية (NC) في نفس النقطة الزمنية وتحت ظروف تخدير مماثلة.

7. تخطيط صدى القلب

  1. أزل الشعر من المنطقة الصدرية الأمامية باستخدام كريم إزالة الشعر قبل يوم واحد من التصوير. قم بتخدير الفأر باستخدام 1.5% isoflurane طوال فترة الفحص.
  2. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري على منصة مسخنة، وثبّت الأطراف الأربعة بأقطاب ECG، وضع جل الموجات فوق الصوتية على منطقة ما قبل القلب. اضبط تركيز isoflurane حسب الحاجة للحفاظ على معدل ضربات قلب أكبر من 40 beats/min.
  3. ضع مسبار الموجات فوق الصوتية في المسافة الثالثة إلى الرابعة بين الضلوع على طول الحافة القصية اليسرى. وجه علامة المسبار نحو الطرف الأمامي الأيمن بزاوية 30° تقريباً، وقم بمحاذاة المسبار مع المحور الطولي للقلب.
  4. أجرِ جميع عمليات التصوير باستخدام محول طاقة مصفوفي خطي بتردد إرسال مركزي قدره 30 MHz، وعرض نطاق ترددي يتراوح بين 20–46 MHz، ودقة محورية قدرها 50 μm. اضبط قدرة الإرسال على 100%، وعمق الصورة على 13 mm، وعرض الصورة على 1 mm، والنطاق الديناميكي على 60 dB، والكسب ثنائي الأبعاد على 40 dB. سجل حلقات cine بنمط B-mode بمعدل 210 frames/s.
  5. احفظ معاملات الاستحواذ هذه كإعداد مسبق للنظام. استخدم نفس محول الطاقة، والإعداد المسبق، وقدرة الإرسال، والنطاق الديناميكي، وعمق الصورة، وعرض الصورة لجميع الحيوانات وجميع جلسات التصوير، ولا تقم بتعديل عمق الصورة بين مجموعتي NC و MI.
  6. ضمن نفس عرض المحور الطولي، ضع خط أخذ عينات نمط M-mode عند مستوى منتصف البطين، بحيث يكون عمودياً على الحاجز بين البطينين والجدار الخلفي للبطين الأيسر، مع جعل بوابة أخذ العينات تمتد عبر القطر الأمامي الخلفي الكامل للبطين الأيسر. سجل تتبع M-mode للتحليل اللاحق.
  7. التقط صور B-mode يظهر فيها البطين الأيسر، والأذين الأيسر، وجذر الأبهر بوضوح، وسجل حلقات cine للتحليل اللاحق. التقط صور M-mode المقابلة في نفس مستوى التصوير.
  8. قس القطر الداخلي للبطين الأيسر في نهاية الانبساط (Dd)، والقطر الداخلي للبطين الأيسر في نهاية الانقباض (Ds)، وسماكة الحاجز بين البطين من الصور التي تم الحصول عليها. سجل خمس دورات قلبية متتالية واذكر القيم المتوسطة.
    ملاحظة: احسب حجم نهاية الانبساط للبطين الأيسر (LVEDV) وحجم نهاية الانقباض للبطين الأيسر (LVESV) تلقائياً باستخدام برنامج التصوير. احسب نسبة القصر الجزئي (FS) وفق المعادلة FS = (Dd − Ds) / Dd × 10% وكسر القذف (EF) وفق المعادلة EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 10%.

8. حصاد الأنسجة، والتصبيغ النسيجي، ومقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

  1. حصاد الأنسجة
    1. في اليوم السابع بعد استحثاث احتشاء عضلة القلب (MI)، يتم إجراء تخطيط صدى القلب لكل فأر. يتم تخدير الفأر باستخدام الإيزوفلوران بنسبة 4%، وجمع حوالي 1.5 مل من الدم عن طريق النزف خلف المداري، ثم يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع الفقرات العنقية، واستئصال القلب.
    2. اترك عينات الدم لتتجلط طوال الليل في درجة حرارة 4°Cقم بطرد العينات مركزياً عند 20 × g لمدة 10 دقائق عند 4°C، واجمع المصل، ثم خزنه في درجة حرارة −80°C حتى يتم التحليل.
  2. مقايسة الممتز المنيعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
    1. تقدير كمية الببتيد المدر للصوديوم من النوع B (BNP)، وإنترلوكين-1β (IL-1β)، وعامل نخر الورم-α (TNF-α)، والعامل النووي-κB p65 (NF-κB p65) في المصل باستخدام أطقم مقايسة الممتز المنيعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
      1. اترك جميع الكواشف وعينات المصل لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتحضير المحاليل العاملة وفقاً لتعليمات الطقم. خف عينات المصل بنسبة 1:5 في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، أي حجم واحد من المصل مضافاً إليه أربعة أحجام من محلول PBS.
      2. أضف 50 μL من المعايير، ومحلول PBS، وعينات المصل المخففة إلى آبار المعايير، وآبار الصفر، وآبار العينات، على التوالي، مع ترك البئر الفارغ (blank well) دون إضافات. أضف 100 μL من الأجسام المضادة الكاشفة المقترنة ببيروكسيداز الفجل (HRP) في جميع الآبار باستثناء البئر الفارغ، ثم قم بتغطية اللوحة وإحضانها عند 37°C لمدة 60 دقيقة في الظلام.
      3. تخلص من محتويات كل بئر واغسل اللوحة خمس مرات باستخدام محلول الغسل المنظم، مع ترك المحلول في كل بئر لمدة 20 ثانية خلال كل دورة غسل. جف اللوحة عن طريق التربيت على ورق خالٍ من الوبر.
      4. أضف 100 μL من الركيزة المُحضرة حديثاً (مزيج من المحلولين A و B بنسبة حجمية 1:1) في كل بئر. تُحضن الصفيحة المُغلقة عند 37°C لمدة 15 دقيقة في الظلام، أضف 50 μL من محلول الإيقاف، وقياس الكثافة الضوئية عند 450 نانومتر.
    2. اطرح الكثافة الضوئية للعينة الفارغة (blank) من كل قياس، ثم أنشئ منحنى قياسياً باستخدام نموذج انحدار لوجستي رباعي المعالم (4PL). احسب تركيز كل عينة من المنحنى الملاءم، واضرب القيمة في عامل التخفيف البالغ 5، ثم سجل القيمة المتوسطة من الآبار المكررة.
  3. معالجة الأنسجة وطمرها وتقطيعها
    1. اشطف كل قلب مستأصل لفترة وجيزة بمحلول ملحي منظم بالفوسفات مبرد بالثلج لإزالة الدم المتبقي. ثبّت النسيج في بارافورمالدهيد بنسبة 4% لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بتقليم كل قلب لكشف سطح مستوٍ في المحور القصير، ثم ضعه في كاسيت أنسجة مُسمى. قم بتجفيف النسيج من الماء باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول (إيثانول 75% لمدة 4 ساعات، وإيثانول 85% لمدة ساعتين، وإيثانول 90% لمدة ساعتين، وإيثانول 95% لمدة ساعة واحدة، وتغييران من الإيثانول المطلق لمدة 30 دقيقة لكل منهما). انقُل النسيج عبر خليط من الإيثانول والزايلين لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق، ثم قم بعملية الشفافية باستخدام تغييرين من الزايلين لمدة 10 دقائق لكل منهما، وأخيراً قم بتشريبه باستخدام ثلاثة تغييرات من البارافين المنصهر لمدة ساعة واحدة لكل تغيير.
    3. ثبّت كل قلب بحيث يكون المحور القصير مواجهًا لسطح قالب التثبيت. قم بإجراء قطاعات متسلسلة 3 μm مقاطع عند مستوى منتصف الحلمة، تُطاف المقاطع على 40°C حمام مائي، وتثبيتها على شرائح زجاجية، وتجفيفها عند 60°C.
    4. قم بإزالة البارافين من المقاطع باستخدام تغييرين من الزايلين (لمدة 15 دقيقة لكل منهما)، يتبع ذلك ثلاثة تغييرات من الإيثانول المطلق (لمدة 5 دقائق لكل منها)، ثم إيثانول بتركيز 75% (لمدة 5 دقائق)، ثم مياه التناضح العكسي (RO) (لمدة 5 دقائق).
      تنبيه: يُعد البارافورمالدهيد مادة مسرطنة محتملة ومخرشة للجهاز التنفسي والجلد، كما أن الزيلين مادة قابلة للاشتعال وسامة للأعصاب. يجب التعامل مع هذه الكواشف داخل خزانة استنشاق الغازات الكيميائية مع ارتداء قفازات طبية معقمة، ومعطف مختبر، وواقي للعينين، والتخلص من النفايات وفقاً لإجراءات النفايات الخطرة المعتمدة في المؤسسة. الإيثانول و نـ-بوتانول مواد قابلة للاشتعال؛ لذا يجب إبقاؤها بعيداً عن مصادر الاشتعال.
  4. التصبيغ النسيجي
    1. صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين
      1. اغمر القطاعات التي تمت إزالة البارافين منها وإعادة ترطيبها في الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق، ثم اشطف القطاعات بالماء.
      2. قم بإزالة اللون من المقاطع باستخدام الكحول الحمضي بتركيز 1%، ثم اشطفها بالماء. قم بتلوين المقاطع باللون الأزرق باستخدام محلول الأمونيا المائي بتركيز 0.5%، ثم اشطفها مرة أخرى.
      3. انقل المقاطع بالتتابع عبر إيثانول بتركيز 85%، ثم إيثانول بتركيز 95%، ثم إيثانول مطلق، لمدة 5 دقائق في كل منها. صبغ المقاطع بصبغة إيوسين كصبغة تباينية لمدة 3-5 دقائق.
      4. قم بتجفيف المقاطع من خلال نقلها ثلاث مرات متتالية إلى الإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق في كل مرة، ثم في ن-بوتانول لمدة 5 دقائق. ثم يتم إجراء عملية ترويق للمقاطع باستخدام الزيلين ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة، وتثبيتها باستخدام راتنج متعادل.
        ملاحظة: تظهر النوى باللون الأزرق، بينما يظهر السيتوبلازم والمصفوفة خارج الخلوية باللون الأحمر.
    2. صبغة ماسون ثلاثية الألوان
      1. قم بتثبيت المقاطع منزوعة البرافين والمعاد ترطيبها في محلول بيكرومات البوتاسيوم بتركيز 2.5% طوال الليل لمدة 15 ساعة تقريباً في درجة حرارة الغرفة. اشطف المقاطع تحت مياه جارية لمدة 30 ثانية تقريباً حتى يختفي اللون الأصفر.
      2. اصبغ القطاعات في محلول بونصو-الفوشزين الحمضي لمدة 6 دقائق حتى يظهر النسيج باللون الأحمر الزاهي. قم بتمديد وقت الصبغ إذا ظل اللون باهتًا، واشطف القطاعات تحت ماء جارٍ حتى يصبح الماء المتدفق عديم اللون.
      3. صَفِّ المياه الزائدة دون السماح للمقاطع بالجفاف. ثم قم بتمييز المقاطع في حمض الفسفوموليبديك المائي لمدة تتراوح بين دقيقة إلى دقيقتين حتى يظهر الكولاجين بلون شاحب بينما تظل الألياف العضلية حمراء.
      4. انقل المقاطع مباشرة إلى محلول aniline blue دون شطف. حضّن المقاطع لمدة تتراوح بين 6 و30 ثانية.
      5. قم بإزالة التمييز عن المقاطع من خلال ثلاثة إلى خمسة تغييرات من حمض الأسيتيك بتركيز 1% لمدة 8 ثوانٍ تقريبًا لكل تغيير. ثم قم بتجفيفها بسرعة من خلال ثلاثة تغييرات من الإيثانول المطلق لمدة 3 و5 و5 ثوانٍ تقريبًا على التوالي.
      6. قم بتنظيف الأقسام في ن-بوتانول لمدة 5 دقائق، ثم في الزايلين لمدة 5 دقائق. يتم تثبيت المقاطع باستخدام راتنج متعادل.
        ملاحظة: تظهر ألياف الكولاجين باللون الأزرق، بينما تظهر الألياف العضلية والفيبرين وكريات الدم الحمراء باللون الأحمر.
    3. صبغ السيريوس الأحمر (Sirius Red staining)
      1. قم بحضن المقاطع المزالة البارافين والمعاد ترطيبها في محلول Sirius Red A في 65°C في الفرن لمدة 30 دقيقة. تُغسل المقاطع تحت الماء الجاري حتى تختفي الصبغة الصفراء.
      2. جف السوائل الزائدة، واغمر المقاطع في محلول Sirius Red B لمدة دقيقتين. اغسل المقاطع لفترة وجيزة ثم جف السوائل الزائدة.
      3. اغمر المقاطع في محلول Sirius Red C لمدة 30 دقيقة، ثم اشطفها لفترة وجيزة تتراوح بين 1 إلى 2 ثانية.
      4. يتم تجفيف القطاعات عبر ثلاث غمسات من الإيثانول المطلق لمدة 3 ثوانٍ تقريبًا لكل غمسة. ثم تُشفّف عبر ثلاث غمسات من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل غمسة، وتُثبَّت باستخدام الراتنج المتعادل.
        ملاحظة: تحت إضاءة المجال المضيء، تظهر ألياف الكولاجين باللون الأحمر على خلفية صفراء.
  5. التقاط التصويري والتقدير الكمي
    1. يتم الحصول على جميع الصور النسيجية باستخدام ماسح شرائح رقمي. استخدم إعدادات متطابقة للإضاءة، وتوازن اللون الأبيض، والتعرض، والتكبير لجميع المقاطع من كافة المجموعات، مع إدراج شريط مقياس معايرة في كل صورة.
    2. قم بمعايرة المقياس المكاني قبل تحليل الصور. حمّل صورة مرجعية تحتوي على شريط المقياس التي تم الحصول عليها بنفس الدقة وأبعاد البكسل المستخدمة في صور الدراسة. ضمن قائمة Measure > المعايرة > ضبط النظام، وإنشاء معايرة مكانية جديدة، وتحديد الوحدة كـ μmحدد تحويل البكسل إلى ميكرومتر عن طريق محاذاة نقاط المعايرة مع شريط المقياس، ثم احفظ المعايرة وقم بتطبيقها على جميع الصور.
    3. قم بتحميل مقطع مصبوغ بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome)، وحدد مخطط البطين الأيسر باستخدام أداة منطقة الاهتمام (AOI) غير المنتظمة. استثنِ تجويف البطين، والبطين الأيمن، والشوائب الناتجة عن معالجة الأنسجة، ثم سجل المساحة الإجمالية للبطين الأيسر.
    4. قياس مفتوح > انقر على Count/Size ثم اختر Select Colors لفتح مربع حوار التجزئة. اختر التجزئة القائمة على مكعب الألوان (Color Cube Based segmentation) واضبط المعايير كما يلي: الحساسية = 4، وتوسيع التحديد بمقدار مؤشر لون واحد، وأدنى حجم للون = 1 بكسل، وحجم النواة (kernel size) = 3 × 3. طبق إعدادات التجزئة نفسها على جميع المقاطع.
    5. حدد البكسلات الزرقاء الموجبة للكولاجين باستخدام أداة القطارة كنقاط بذرية. قم بأخذ عينات من المناطق الموجبة للكولاجين بوضوح فقط، وأنشئ صورة معاينة، ثم تحقق من أن القناع يشمل المناطق الموجبة للكولاجين مع استبعاد عضلة القلب المصبوغة باللون الأحمر، والتجويف البطيني، والخلفية. قم بتعديل النقاط البذرية إذا لزم الأمر قبل تطبيق القناع.
      ملاحظة: أعد اختيار بكسلات البذور (seed pixels) لكل مقطع لمراعاة الاختلافات الطفيفة في كثافة الصبغ بين المقاطع. حافظ على ثبات معاملات التجزئة (الحساسية، ودرجة التوسع، والحد الأدنى لحجم اللون، وحجم النواة) لجميع الصور، ولا تقبل التجزئة إلا عندما يظهر العرض المسبق تغطية كاملة للمناطق الموجبة للكولاجين مع استبعاد الهياكل غير الكولاجينية.
    6. طبّق قناع التجزئة وأغلق مربع الحوار. تحت قائمة القياس (Measure) > اختر القياسات (Measurements)، ثم اختر المساحة (Area)، وانقر على العد (Count)، ثم افتح العرض (View) > والإحصاء، وتسجيل مجموع المساحة الموجبة للكولاجين.
    7. احسب كسر حجم الكولاجين (CVF) عن طريق قسمة المنطقة الموجبة للكولاجين على المساحة الكلية للبطين الأيسر، وعبر عن النتيجة كنسبة مئوية.

9. ترويق الأنسجة والتصوير ثلاثي الأبعاد للشرايين التاجية

  1. وسم الأوعية التاجية بالفلورة
    1. احقن 20 µL من محلول Evans Blue بتركيز 2% في الوريد الذيلي الجانبي لوسم الأوعية التاجية. أعد الفأر إلى قفصه لمدة 60 min للسماح بالدوران الجهازى للصبغة.
    2. ضع الفأر في غرفة التحريض (16 × 10 × 1 cm) المتصلة بجهاز التخدير وحفز التخدير باستخدام 4% isoflurane. قم بقتل الفأر عن طريق خلع الفقرات العنقية، وافتح التجويف الصدري، واستأصل القلب السليم، واشطفه في PBS، ثم ثبته في 4% paraformaldehyde (PFA) لمدة 24 h عند 4°C.
      تحذير: مادة PFA مادة مسرطنة محتملة ومخرشة للجهاز التنفسي والجلد. تعامل مع PFA في غطاء دخان كيميائي مع ارتداء قفازات طبية معقمة ومعطف مختبر وحماية للعين، وتخلص من النفايات وفقاً لإجراءات النفايات الخطرة في المؤسسة.
    3. حضّر محلول أغاروز بتركيز 3% في مياه RO وقم بتضمين القلب المثبت بحيث يكون موقع الربط موجهاً بشكل مناسب للتصوير. احقن 1 µL من محلول DAPI في كل موقع من المواقع الثمانية المحيطة بمنطقة الربط باستخدام محقنة ميكرولترية، واترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
  2. تصفية الأنسجة
    1. قم بإجراء تصفية الأنسجة باستخدام طقم تصفية الأنسجة FDISCO (التصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء المصفاة بالمذيبات مع قدرة فائقة على الحفاظ على الفلورة) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يتكون الطقم من ستة كواشف (A–F): تحتوي الكواشف A و B و C و D و E على 50% و 70% و 80% و 10% و 10% من tetrahydrofuran (THF) في الماء على التوالي، والكاشف F هو dibenzyl ether.
      تحذير: مادة THF قابلة للاشتعال بشدة، وتكون بيروكسيدات متفجرة أثناء التخزين، وهي مخرشة للجهاز التنفسي والجلد. مادة Dibenzyl ether مخرشة للجلد والعين. تعامل مع جميع الكواشف في غطاء دخان كيميائي مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات الطبية المعقمة ومعطف المختبر وحماية العين. تخلص من النفايات وفقاً لإجراءات النفايات الخطرة في المؤسسة.
    2. قم بتحضين كل قلب بالتتابع في الكواشف A و B و C و D و E لمدة 6 h لكل كاشف. استخدم 10 mL من كل كاشف لكل قلب، ما يقابل الحد الأدنى لنسبة حجم العينة إلى الكاشف 1:5.
    3. انقل العينة إلى الكاشف F واستمر في التحضين حتى تصبح الأنسجة شفافة بصرياً، وعادة ما يستغرق ذلك حوالي 1 h.
    4. قم بإجراء جميع خطوات التصفية عند 6°C–8°C مع رج خفيف. ضع العينة في وعاء زجاجي ملفوف بورق ألومنيوم واحمهِ من الضوء طوال الإجراء للحفاظ على الفلورة.
  3. التصوير الفلوري بشرائح الضوء
    1. قم بتثبيت العينة المصفاة على حامل العينات. استخدم مجهراً فلورياً بشرائح الضوء مزوداً بعدسة شيئية 4× (الفتحة العددية = 0.28؛ مسافة العمل = 20.0 mm).
    2. اغمر العينة المثبتة في dibenzyl ether داخل غرفة التصوير. قم بإضاءة العينة من كلا الجانبين وقم بإثارة DAPI بالتتابع عند 405 nm و Evans Blue عند 647 nm.
    3. اضبط معلمات الحصول على الصور كما يلي: للقناة 405 nm، استخدم شدة ليزر 3,0 وحدة اعتبارية وزمن تعريض 30 ms؛ للقناة 647 nm، استخدم شدة ليزر 4,0 وحدة اعتبارية وزمن تعريض 30 ms. احصل على جميع الصور باستخدام حجم خطوة z قدره 6 μm ودقة صورة 1,024 × 1,024 بكسل.
    4. اضبط وضع التقاط الكاميرا على XYCZT، حيث يتم التقاط الصور الجانبية (XY) أولاً، يليها التقاط القنوات بالتتابع (C)، والخطوات المحورية (Z)، والتقاط النقاط الزمنية (T)، كما هو مهيأ في برنامج التصوير.
  4. معالجة بيانات الصور وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد
    1. قم بتجميع ملفات صور TIFF الخام باستخدام برنامج معالجة الصور المرفق مع المجهر. حول ملفات الصور المجمعة إلى تنسيق IMS عن طريق اختيار File > Convert to Imaris.
    2. استورد ملفات IMS المحولة إلى برنامج التحليل ثلاثي الأبعاد. قم بإنشاء عمليات إعادة بناء بنمط الرندرة الحجمية (volume-rendered reconstructions) باستخدام إعدادات الرندرة الافتراضية، وصدر الصور التمثيلية باستخدام وحدة Snapshot.
      ملاحظة: يتم إنشاء عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد باستخدام مسار الرندرة الافتراضي للبرنامج دون تعديل. لم يتم تطبيق أي تجزئة للصور أو تحديد عتبة أو إزالة ضجيج أو طرح للخلفية أو أي معالجة أولية أخرى. تُستخدم الصور المعاد بناؤها للتصور النوعي للأوعية التاجية وليست مخصصة للتحليل الكمي.

10. التحليل الإحصائي

  1. عبر عن جميع البيانات في صورة المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). أجِر التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 5.0).
  2. حدد الوحدة التجريبية على أنها الحيوان الفردي. حلل عينات n = 8 من الفئران لكل مجموعة لجميع النهايات الطرفية الوظيفية والمؤشرات الحيوية والقياسات النسيجية الشكلية.
  3. أجرِ عملية جمع البيانات وتحليلها باستخدام معرفات عينات مشفرة مع الحفاظ على تعمية الباحث عن تخصيص المجموعات. اكشف عن تعيينات المجموعات فقط بعد الانتهاء من جميع التحليلات الكمية.
  4. قيم طبيعية توزيع البيانات باستخدام اختبار Shapiro–Wilk وتجانس التباين باستخدام اختبار Levene في برنامج GraphPad Prism (الإصدار 5.0) قبل اختيار الاختبار الإحصائي المناسب.
  5. قارن بين مجموعتين باستخدام اختبار Student's t-test غير المقترن ثنائي الذيل عند تحقق فرضيات الطبيعية وتساوي التباين. وخلاف ذلك، أجِر اختبار Mann–Whitney U.
  6. اعتبر القيمة P < 0.05 دالة إحصائياً. أشر إلى الدلالة الإحصائية كـ P < 0.05 و P < 0.01 و P < 0.01.

النتائج

استُخدم الشريان الوربي الأمامي (AIS) كعلامة تشريحية لتحديد موقع الشريان التاجي النازل الأمامي (LAD) وتحديد موقع الربط (الشكل 1A–C). وبعد تحديد الشريان الوربي الأمامي، نُفذ سير العمل الجراحي المتسلسل لاستحثاث احتشاء عضلة القلب (MI)، بما في ذلك بضع الصدر، وكشف القلب، وربط الشريان التاجي النازل الأمامي، وإغلاق الصدر، والتعافي بعد الجراحة، كما هو موضح في الشكل 2A–L. وقد أتاح هذا البروتوكول المبسط استحثاث احتشاء عضلة القلب في الفئران بشكل سريع وقابل للتكرار. يتطلب هذا البروتوكول فترة تدريب عملي ممتدة قبل أن يمكن تنفيذه بشكل موثوق؛ حيث يُعد التنبيب الرغامي والربط الموجه بالشريان الوربي الأمامي الخطوتين اللتان تتطلبان أطول فترة تعلم. وخلال التدريب المبكر، قد تصل نسبة الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة خلال الأيام السبعة الأولى بعد العملية إلى 50% أو أكثر، وقد تنخفض نسبة نجاح استحثاث النموذج إلى 30% أو أقل. وبمجرد إتقان هذه التقنيات، تتجاوز نسبة النجاح الجراحي باستمرار 90%. وفي الدراسة الحالية، لم تحدث أي وفيات في الفترة المحيطة بالجراحة خلال الأيام السبعة الأولى بعد العملية. وقد أُجريت جميع إجراءات التدريب بموجب نفس بروتوكول استخدام الحيوانات المعتمد مؤسسياً.

عقب ربط الشريان التاجي الأيسر النازل (LAD)، لوحظت تشوهات مميزة في تخطيط كهربائية القلب، شملت تعمقاً ملحوظاً في موجة Q، وارتفاع القطعة ST ذات شكل محدب للأعلى، وذروة حادة جداً في موجة T (والتي تتطور عادةً إلى انقلاب في موجة T خلال المرحلة تحت الحادة)، وزيادة في جهد مركب QRS مع اتساع السعة، وتسارع قلب وضح (الشكل 3A). وأظهر الفحص العياني شحوباً موضعياً في عضلة القلب وتوسعاً في البطين في المنطقة البعيدة عن موقع الربط في مجموعة احشاء عضلة القلب (MI) مقارنة بمجموعة التحكم (NC) (الشكل 3B). كما كشف الفحص النسيجي المرضي عن عدم انتظام في ألياف عضلة القلب، واتساع في المسافات بين الخلايا، وتسلل للخلايا الالتهابية، وترسب الكولاجين، وتمزق في البنية الهيكلية لعضلة القلب في مجموعة MI، كما هو موضح من خلال صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)، وصبغة ماسون ثلاثية الألوان، وصبغة سيروس ريد (الشكل 3C). وأظهر التحليل الكمي للمقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان أن الكسر الحجمي للتليف (CVF) كان أكبر بكثير في مجموعة MI منه في مجموعة NC (18.24% ± 1.67% مقابل 0.05% ± 0.01%؛ P < 0.001؛ الشكل 3D).

تحليل التليف القلبي: مخطط تخطيط كهربائية القلب، صور أنسجة القلب، شرائح نسيجية، مخطط كمي للتليف.
الشكل 3التغيرات في تخطيط كهربائية القلب، والتشريح العياني، وعلم الأمراض النسيجي بعد ربط الشريان التاجي الأيسر النازل الأمامي في الفئران. (أ) مخططات كهربية القلب (ECGs) ممثلة تم تسجيلها فوراً بعد الجراحة في مجموعة الضبط الطبيعية (NC) ومجموعة احتشاء عضلة القلب (MI). (ب) صور عيانية ممثلة لقلوب من مجموعتي NC و MI. أشرطة المقياس = 1 مم. (ج) مقاطع عرضية ممثلة للقلب من مجموعتي NC و MI مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E)&E؛ اليسار)، وصبغة ماسون ثلاثية الألوان (الوسط)، وصبغة سيريس الحمراء (اليمين). في المقاطع المصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان، يظهر الكولاجين باللون الأزرق وعضلة القلب باللون الأحمر؛ وفي المقاطع المصبوغة بصبغة سيريس الحمراء، يظهر الكولاجين باللون الأحمر مقابل خلفية صفراء. أشرطة المقياس = 1,000 µm(د) كسر حجم الكولاجين (CVF)، الذي تم حسابه بقسمة المنطقة الموجبة للكولاجين على إجمالي مساحة البطين الأيسر والتعبير عنه كنسبة مئوية، في مجموعتي NC وMI. تُعرض البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)؛ حيث n = 8 فئران لكل مجموعة. يُشار إلى الدلالة الإحصائية بالنسبة لمجموعة NC بـ **P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تأكيد ضعف الوظيفة القلبية عن طريق تخطيط صدى القلب. وأظهرت صور نمط M الممثلة انخفاضاً في انقباض البطين الأيسر في مجموعة الاحتشاء القلبي MI (الشكل 4A). كما أظهر التحليل الكمي انخفاضاً ملحوظاً في الكسر القذفي EF والتقصير التجزيئي FS للبطين الأيسر في مجموعة MI مقارنة بمجموعة التحكم NC (الشكل 4B,C). وأظهر اختبار ELISA زيادة ملحوظة في تركيزات المصل من BNP وTNF-α وNF-κB p65 وIL-1β في مجموعة MI (الشكل 4D–G)، وهو ما يتوافق مع ضعف الوظيفة القلبية والاستجابة الالتهابية.

صور الموجات فوق الصوتية للقلب مع مخططات بيانية؛ مستويات EF وFS وBNP وTNFα وp65 وIL-1β في مجموعتي NC وMI.
الشكل 4التغيرات الوظيفية القلبية ومستويات المؤشرات الحيوية المصلية بعد ربط الشريان التاجي الأمامي النازل الأيسر. (أ) صور ممثلة لتخطيط صدى القلب بنمط M (M-mode) من مجموعة الضابطة الطبيعية (NC) ومجموعة احتشاء عضلة القلب (MI). (ب) الكسر القذفي للبطين الأيسر (EF). (ج) التقصير الجزئي للبطين الأيسر (FS). (د-ز) تركيزات المصل لكل من (د) الببتيد المدر للصوديوم من النوع ب (BNP)، و(هـ) عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، و(و) العامل النووي كابا ب p65 (NF-κB p65)، و(ز) إنترلوكين-1 بيتا (IL-1β)، والتي قيست بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). يُعبر عن كل من EF وFS بنسب مئوية؛ بينما يُعبر عن BNP وTNF-α وIL-1β بوحدة pg/mL؛ ويُعبر عن NF-κB p65 بوحدة ng/mL. تم عرض البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)؛ حيث n = 8 فئران في كل مجموعة. يُشار إلى الدلالة الإحصائية بالنسبة لمجموعة NC بالرمز *.P < 0.01 و **P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أظهر التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد للقلوب التي خضعت لعملية تصفية الأنسجة مسار الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) أسفل القطاع الشرياني البيني (AIS)، وبين أن الربط في الموقع المحدد تشريحيًا أدى إلى انسداد الشريان التاجي (الشكل 5A–F). وبشكل جماعي، تثبت هذه النتائج النجاح في تحفيز نمط ظاهري لاحتشاء عضلة القلب (MI) في هذه السلسلة الأولية المكونة من ثمانية حيوانات لكل مجموعة، والتي تميزت بخلل في وظيفة البطين الأيسر، وتليف عضلة القلب، والتهاب جهازي. لقد صُممت الدراسة الحالية لتأسيس وإثبات جدوى نموذج احتشاء عضلة القلب الموجه بواسطة الـ AIS بدلاً من تقديم تحقق شامل من حجم العينة، أو استقرار النموذج على المدى الطويل، أو التطابق التشريحي بين الـ AIS والـ LAD. وبناءً على ذلك، يتم الإقرار بهذه الجوانب كقيود للدراسة الحالية ويتم مناقشتها في قسم المناقشة. وتحديداً، اقتصرت التقييمات الوظيفية والكيميائية الحيوية على المرحلة الحادة بعد احتشاء عضلة القلب، كما تم إثبات العلاقة بين الـ AIS والـ LAD نوعياً ولكن لم يتم قياسها كمياً بعد في مجموعة كبيرة بما يكفي.

تصوير فلوري لتشريح القلب؛ صبغ DAPI وEvans Blue؛ المجهرية، تحليل البنية الخلوية.
الشكل 5التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية الإكليلية للفئران المصفاة. تم وسم قلوب كاملة مُصفّاة بصبغة Evans Blue لتصوير الأوعية الدموية التاجية، وبصبغة 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتصوير النوى، تلا ذلك التصوير الفلوري بالشريحة الضوئية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. (أ-ج) عمليات إعادة بناء للقلب الكامل تظهر (أ) قناة DAPI، و(ب) قناة Evans Blue، و(ج) القنوات المدمجة. أشرطة القياس = 1,000 µm(د-و) مناظر مكبرة للمنطقة الوعائية التاجية تظهر (د) قناة DAPI، و(هـ) قناة Evans Blue، و(و) القنوات المدمجة. أشرطة المقياس = 400 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لا تؤدي كل عملية إلى نموذج مثالي، ويعد التعرف على النتائج غير المثالية أمراً هاماً لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. قد يؤدي وضع الربط في مكان قريب جداً أو إدخال الإبرة بعمق زائد إلى إحداث احتشاء كبير جداً يصاحبه فشل قلبي شديد، أو عدم انتظام ضربات القلب، أو تمزق بطيني، مما يؤدي إلى الوفاة المبكرة. وعلى العكس من ذلك، فإن وضع الربط في مكان بعيد جداً أو بشكل سطحي للغاية قد يؤدي إلى إحداث احتشاء صغير فقط أو الفشل في إحداث الاحتشاء. لذا، يجب تقييم نجاح تحريض النموذج باستخدام معايير متعددة. أثناء الجراحة، يوفر شحوب عضلة القلب في المنطقة البعيدة عن موقع الربط مؤشراً فورياً على انسداد الشريان التاجي، على الرغم من أن هذه النتيجة قد لا تكون مرئية دائماً بوضوح. ويوفر تخطيط صدى القلب بعد الجراحة والفحص الهيستوباثولوجي تأكيداً إضافياً على التأسيس الناجح للنموذج. يوضح الشكل التكميلي 1 نموذجاً غير ناجح كمثال، حيث يظهر الفحص الهيستوباثولوجي عدم وجود ارتشاح واضح للخلايا الالتهابية أو تليف.

الشكل التوضيحي الإضافي 1. نتائج نسيجية ممثلة من نموذج غير ناجح لاحتشاء عضلة القلب. مقاطع عرضية ممثلة للقلب من فأر لم ينجح معه تحفيز احتشاء عضلة القلب، مصبوغة بـ (أ) الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&(E)، و(B) صبغة ماسون ثلاثية الألوان (Masson's trichrome)، و(C) صبغة السيريوس الحمراء (Sirius Red). وبالمقارنة مع الحث الناجح لاحتشاء عضلة القلب، لا تظهر هذه المقاطع أي ارتشاح واضح للخلايا الالتهابية أو إعادة تشكيل تليفي في عضلة البطين الأيسر، وهو ما يتفق مع عدم نجاح انسداد الشريان التاجي. أشرطة المقياس = 1,000 µm.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

في السنوات الأخيرة، اكتسبت النماذج السريرية والتجريبية لاحتشاء العضلة القلبية (MI) أهمية متزايدة في أبحاث القلب والأوعية الدموية، ومع ذلك لا تزال العديد من الأسئلة المتعلقة بالإمراض الخاص باحتشاء العضلة القلبية واستراتيجيات علاجه دون حل. تصف هذه المقالة طريقة مطورة لإنشاء نموذج احتشاء عضلة قلبية في الفئران، حيث تتطلب عدة خطوات إجرائية حرجة اهتماماً خاصاً. الخطوة الحرجة الأولى هي التنبيب الرغامي. تعتمد بعض البروتوكولات السابقة في تأمين المجرى التنفسي على عملية بضع الرغامي، والتي تتطلب شق الجلد الرقبي وتشريح الأنسجة للكشف عن الرغامي قبل التنبيب13؛ بينما يستمر البعض الآخر في استخدام التنبيب الفموي الرغامي ولكنهم يوصون بإجراء شق في خط الوسط الرقبي لتحسين الرؤية أثناء العملية14. وعلى عكس كلا النهجين، يستخدم البروتوكول الحالي منظار الحنجرة لإضاءة البلعوم الفموي ويقوم بالتنبيب الفموي الرغامي تحت الرؤية المباشرة لمزمار الحنجرة دون الحاجة إلى شق رقبي. وعلى الرغم من أن هذا النهج يتطلب مهارة تقنية أعلى من المشغل، إلا أنه يتجنب صدمات الأنسجة الرقبية، ويقلل من خطر العدوى وآلام ما بعد الجراحة، ويقصر وقت العملية. الخطأ الأكثر شيوعاً أثناء التنبيب هو وضع الأنبوب عن غير قصد في المريء. إذا لم يرتفع الصدر أثناء التهوية ولم تظهر تكثيفات في الأنبوب الرغامي أثناء الزفير، اسحب الأنبوب فوراً وأعد عملية التنبيب. لا تقم بتوصيل جهاز التنفس الاصطناعي إلا بعد التأكد من وجود حركة متماثلة في كلا جانبي جدار الصدر.

تتمثل الخطوة الثانية، والأكثر أهمية، في تحديد الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) ووضع الرباط بدقة. وتواجه الطرق التقليدية عدة تحديات في هذه المرحلة؛ إذ يبلغ معدل ضربات قلب الفأر في حالة الراحة حوالي 500–600 نبضة/دقيقة، كما يقع الشريان LAD بجوار العديد من الأوردة التاجية المرافقة، مما يجعل التعرف على الشريان أثناء العملية في الوقت الفعلي أمراً صعباً بطبيعته. علاوة على ذلك، وحتى في ظل الظروف المثالية، لا يمكن رؤية جزء كبير من شرايين LAD بوضوح تحت المجهر التشريحي15. وفي هذا السياق، فإن البروتوكولات السابقة التي تقدر موقع الربط بنقطة تبعد 1–2 mm أسفل الزائدة الأذينية اليسرى تكون محدودة بسبب عدم اتساق التعرف على هذا المرجع التشريحي أثناء العملية12,14، في حين أن نمط التفرع المعقد للشريان التاجي الأيسر قد يؤثر سلباً على إمكانية تكرار النتائج16. ولمعالجة هذه التحديات، يستخدم البروتوكول الحالي الثلم interventricular (AIS) كعلامة تشريحية لتحديد موضع الرباط. وتحت المجهر التشريحي، يظهر AIS كأخدود ضحل على السطح البطني للقلب، حيث يمر الشريان LAD تحته مباشرة. وبذلك، فهو يوفر مرجعاً تشريحياً مستقراً نسبياً وأقل اعتماداً على خبرة المشغل. ويوفر وضع الرباط عند الثلث العلوي من AIS هدفاً تشريحياً متسقاً لإغلاق الشريان التاجي. وتظهر النتائج التمثيلية أن هذا النهج نجح في إحداث نمط احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) المتوقع في الحيوانات التي تم فحصها.

لا يعد مَعلم الشريان القمعي السفلي (AIS) موثوقًا في جميع الظروف. عندما يكون التعرض الصدري محدودًا أو يؤدي النزيف فوق النخاب إلى حجب سطح القلب ويجعل تحديد AIS صعبًا، امسح المجال الجراحي برفق باستخدام مسحة قطنية مبللة بالمحلول الملحي وأعد تقييم الأخدود قبل الربط. إذا استمر تعذر تحديد AIS بثقة، فقم بتحديد الشريان النازل الأمامي الأيسر (LAD) مباشرةً كما هو موضح في البروتوكول، وأجرِ عملية الربط تحت الرؤية المباشرة بدلاً من الاعتماد على AIS. وإذا لزم الأمر، تأكد من المساحة الوربية الصحيحة عن طريق العد ذيليًا من الضلع الأول لضمان التعرض الكافي للأذينة اليسرى والجانب الأمامي للبطين الأيسر.

من بين المضاعفات التي تلي الجراحة، يُعد استرواح الصدر (pneumothorax) الأكثر شيوعاً، وعادةً ما يظهر على شكل ضيق في التنفس بعد نزع الأنبوب الرغامي. ويكمن مفتاح الوقاية من استرواح الصدر في الإخلاء الكامل للهواء المتبقي من التجويف الصدري قبل إغلاق المسافة الوربية. وفي حال الاشتباه في حدوث استرواح الصدر، يتم تخدير الفأر وتهويته لفترة وجيزة، ثم إعادة فتح غرز الجلد وفحص إغلاق المسافة الوربية. وإذا تم تحديد موقع واحد أو أكثر من مواقع الإغلاق غير المكتمل، توضع غرز إضافية في موقع تسرب الهواء قبل تكرار إجراء نزع الأنبوب. وهناك مضاعفة محتملة أخرى وهي النزيف أثناء الجراحة، والذي يحدث غالباً عندما تثقب الإبرة وعاءً ملحمياً صغيراً أو وريداً تاجياً مصاحباً أثناء الربط. وبشكل عام، يكون النزيف محدوداً ويمكن السيطرة عليه عادةً عن طريق تطبيق ضغط خفيف باستخدام مسحة قطنية مبللة بمحلول ملحي لعدة ثوانٍ. وقبل إغلاق التجويف الصدري، يجب التأكد من عدم وجود نزيف نشط داخل المجال الجراحي لتقليل مضاعفات ما بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، قد تصاب الفئران باضطرابات في نظم القلب، بما في ذلك الانقباضات البطينية المبتسرة أو الرجفان البطيني العابر، أثناء الإجراء أو بعده مباشرة. وغالباً ما يتم تخفيف هذه الاضطرابات عن طريق الحفاظ على درجة حرارة الجسم، وتثبيت عمق التخدير، والتوقف مؤقتاً عن الإجراء للسماح بالتعافي التلقائي لنظم القلب. وأخيراً، تنتج مضاعفات التخدير في الغالب عن الفشل في خفض تركيز isoflurane بسرعة بعد نجاح التنبيب الرغامي. لذا، يجب خفض تركيز isoflurane إلى مستوى الحفاظ فور توصيل الأنبوب الرغامي بجهاز التهوية، مع المراقبة المستمرة للتنفس ومعدل ضربات القلب طوال فترة الإجراء.

وبشكل عام، تتطلب هذه الطريقة مهارة جراحية مجهرية كبيرة، وكما هو الحال في نماذج ربط الشريان التاجي الأمامي النازل (LAD) الدائمة الأخرى، فإنها تظل عرضة للتفاوت الناتج عن الاختلافات التشريحية للشرايين التاجية وخبرة الجراح. ومع ذلك، فمن خلال التدريب المناسب والتقنية الجراحية المتسقة، يمكن للباحثين إنشاء نموذج احتشاء عضلة القلب (MI) باتساق معقول مع تحسين إمكانية تكرار الإجراء ومعدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة.

يجب الإقرار بعدة قيود لهذا الأسلوب. أولاً، أُجريت التقييمات الوظيفية والكيميائية الحيوية خلال أسبوع واحد بعد تحفيز احتشاء عضلة القلب (MI)، وبالتالي فهي تعكس فقط المرحلة الحادة من الاحتشاء، دون تقييم منهجي للنتائج طويلة المدى مثل إعادة تشكيل البطين بعد 4-8 أسابيع من الجراحة. ثانياً، مثل غيرها من نماذج احتشاء عضلة القلب القائمة على الربط الدائم والتي تستخدم غرزاً غير قابلة للامتصاص، قد يؤدي هذا البروتوكول إلى حدوث التصاقات تأمورية مزمنة. ويمثل هذا خاصية متأصلة في نموذج الربط وليس قيداً خاصاً بنهج التوجيه باستخدام الحاجز الأذيني البطيني (AIS). ومع ذلك، لم يتم قياس شدة هذه الالتصاقات وتأثيراتها على وظائف القلب على المدى الطويل في هذه الدراسة. ويمكن للدراسات المستقبلية استقصاء استخدام الغرز القابلة للامتصاص وتقييم آثارها على تكوين الالتصاقات وأداء النموذج. ثالثاً، على الرغم من أن التصوير التاجي ثلاثي الأبعاد أظهر نوعياً أن الشريان التاجي الأيسر الأمامي النازل (LAD) يمر أسفل الـ AIS، إلا أن التوافق التشريحي بين هذه الهياكل لم يتم قياسه كمياً بعد في مجموعة كبيرة بما يكفي. رابعاً، شملت هذه الدراسة ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J فقط. وعلى الرغم من أنه من المتوقع أن يمثل الـ AIS علامة تشريحية ثابتة، فإن قابليته للتطبيق في إناث الفئران، وسلالات الفئران الأخرى، والأنواع الأخرى تتطلب مزيداً من التحقق. وأخيراً، فإن المزايا المحتملة لهذا البروتوكول فيما يتعلق باتساق موقع الربط وقابلية تكرار الإجراء تعتمد على الخبرة داخل مختبر واحد ولم يتم تقييمها من خلال مقارنة مباشرة مع طرق ربط LAD التقليدية أو عبر عدة مشغلين ومؤسسات. لذا، ستكون هناك حاجة إلى دراسات تحقق إضافية لإثبات قابلية تعميم هذا الأسلوب على نطاق أوسع.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (أرقام 2026NSFSC1823 و2022YFS0618)، ومشروع الإدارة الإقليمية للطب الصيني التقليدي في سيتشوان (مكتب الإدارة الإقليمية للطب الصيني التقليدي في سيتشوان رقم 7 [2024])، ومشروع جمعية سيتشوان للطب المتكامل الصيني والغربي (رقم ZXY2025019)، ومشروع جامعة جنوب غرب الطبية (منح أرقام 2023ZYYQ04 و2023ZYYQ17).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول ملحي معقم 0.9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.–إعادة تشكيل الـ Cefazolin
أجاروز 3%Sigma-AldrichA0169طمر العينات
بارافورمالدهيد 4%Sigma-Aldrich158127تثبيت الأنسجة
إيثانول مطلقChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170Aتجفيف الأنسجة؛ مادة قابلة للاشتعال
فوسين حمضيAladdinA104916-100gتحضير محلول Ponceau–acid fuchsin لصبغة ماسون ثلاثية الألوان
برنامج AcqKnowledgeBIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0تحصيل وتحليل تخطيط كهربائية القلب
محلول أمونيا، مائي 0.5%Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528Aالتزريق أثناء صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين
أزرق أنيلين، قابل للذوبان في الحمضAladdinA111200-100gتحضير محلول أزرق الأنيلين لصبغة ماسون ثلاثية الألوان
قفازات طبية معقمةNanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.–الحماية الكيميائية والبيولوجية
بوبرينورفينQinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181تسكين الآلام بعد الجراحة
سيفازولين الصوديوم للحقنCSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.–الوقاية بالمضادات الحيوية في الفترة المحيطة بالجراحة
مسحات قطنيةShijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.–مسح نخاب القلب والتحضير المعقم
محلول صبغ DAPIThermo FisherD1306وسم النواة
كريم لإزالة الشعرVeet–إزالة شعر الصدر
ماسح شرائح رقمي3DHISTECHPannoramic MIDI IIتصوير الشريحة الكاملة
مضخم ECGBIOPAC SystemsECG100Cتضخيم تخطيط كهربائية القلب
نظام تسجيل تخطيط كهربائية القلبBIOPAC SystemsMP160تسجيل تخطيط كهربائية القلب
طقم ELISA، الببتيد المدر للصوديوم من النوع B للفأرQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726Mتقدير كمية BNP في المصل
طقم ELISA، إنترلوكين-1β للفأرQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063Mتقدير كمية IL-1β في المصل
طقم ELISA، العامل النووي-κB p65 للفأرQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879Mتقدير كمية NF-κB p65 في المصل
طقم ELISA، عامل نخر الورم-α للفأرQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412Mتقدير كمية TNF-α في المصل
كاسيتات طمرJiangsu Shitai22022طمر الأنسجة
قسطرة رغامية، 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103التنبيب الفموي؛ القطر الخارجي حوالي 0.9–1.0 mm؛ يتم قصها إلى حوالي 15 mm قبل الاستخدام
إيوسين Y، قابل للذوبان في الكحولHefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100Gالصبغ المضاد للسيتوبلازم أثناء صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين
أزرق إيفانزJarvisbioA312001وسم الأوعية الدموية التاجية
ملقط دقيقRWD Life ScienceF12011-10مناولة الأنسجة وفتح التأمور
ملقط دقيق، للجراحة المجهريةRWD Life ScienceFC12002T-08مناولة الأنسجة بالجراحة المجهرية
مقصات دقيقةRWD Life ScienceS12000-09مقصات عيون لشق الجلد والتشريح
حمض الخليك الثلجيChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.–تحضير حمض الخليك بتركيز 1% لتمايز صبغة ماسون ثلاثية الألوان
شرائح زجاجيةJiangsu Shitai80312/80302تثبيت المقاطع
معقم بالخرز الزجاجيRWD Life ScienceRS3002تعقيم الأدوات بين الحيوانات
برنامج GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 5.0التحليل الإحصائي
وسادة تدفئةRWD Life Science69020التنظيم الحراري بعد الجراحة
محلول صبغ الهيماتوكسيلينWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004صبغ النواة أثناء صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين
جسم مضاد للكشف مقترن ببيروكسيداز الفجلQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Included with ELISA kitsالكشف بواسطة ELISA
حمض الهيدروكلوريكChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337Aتحضير الكحول الحمضي لتمايز الهيماتوكسيلين
برنامج Image-Pro PlusMedia CyberneticsVersion 6.0تقدير كسر حجم الكولاجين
برنامج ImarisBitplaneVersion 7.2.3إعادة البناء والتحليل ثلاثي الأبعاد
إيزوفلورانRWD Life ScienceR510-22-10مخدر استنشاقي
نظام تخدير بالإيزوفلورانRWD Life ScienceTAIJI-IEإعطاء الإيزوفلوران
منظار حنجرة، للحيوانات الصغيرةShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MRالمعاينة المباشرة أثناء التنبيب
مجهر فلوري ذو ورقة ضوئيةLight Innovation TechnologyLiToneXLالتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد
برنامج LitScanLight Innovation TechnologyVersion 3.31دمج الصور وتحويلها
جهاز تنفس اصطناعيChengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101Eتهوية ميكانيكية؛ 130 نفساً/دقيقة؛ حجم المد والجزر 2 mL
ملقط شرياني مجهري (Micro-mosquito)RWD Life ScienceFC21001R-12إمساك الإبرة أثناء الربط والإغلاق
سرنجة ميكرولترShanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.–حقن DAPI الموضعي
قارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader)Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5قياس الكثافة الضوئية عند 450 nm
مجهر تشريحيMaishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204المعاينة أثناء الجراحة
مجهر ضوئي رأسيLeicaDM500التصوير النسيجي
شفرات ميكروتومEprediaMX35 ULTRAتقطيع البارافين
طقم صبغ Sirius Red المعدلWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078صبغ الكولاجين؛ يتضمن المحاليل A و B و C
n-بيوتانولChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886Aالتجفيف والترويق النسيجي؛ مادة قابلة للاشتعال
راتنج تثبيت محايدShanghai YiyangYSQN41-91تثبيت الشرائح
خيط جراحي نايلون، 3/8 دائرة 7-0 مع إبرةNingbo Medical Needle Co., Ltd.–ربط الشريان التاجي النازل الأيسر
خيط جراحي نايلون، 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–إغلاق الصدر والجلد
خيط جراحي نايلون، 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–كشف جدار الصدر وسحبه
محطة طمر بالبارافينWuhan Junjie ElectronicsJB-L5طمر الأنسجة
شمع البارافينNANAترشيح وطمر الأنسجة
محلول ملحي منظم بالفوسفاتSigma-AldrichP3813غسل الأنسجة وتخفيف الكواشف
حمض الفوسفوموليبديكTianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.–تمايز صبغة ماسون ثلاثية الألوان
بونسو 2RAladdinP104989-25gتحضير محلول Ponceau–acid fuchsin لصبغة ماسون ثلاثية الألوان
ثنائي كرومات البوتاسيومZhengzhou Paini Chemical Reagent Factory7778-50-9مادة مثبتة لصبغة ماسون ثلاثية الألوان
بوفيدون–يودSingleLadyGB26368-2010تطهير الجلد
ماء بالتناضح العكسيLaboratory-purifiedNot applicableتحضير المحاليل
ميكروتوم دوارLeica Instruments (ShanghaiRM2016تقطيع البارافين
محول حامل العيناتLight Innovation TechnologySupplied with LiToneXLتثبيت العينات المروقة للتصوير بالورقة الضوئية
شريط لاصق للجلدQingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.–تثبيت الأطراف والذيل
أغطية شرائح زجاجيةJiangsu Shitai80340-1630تغطية الشرائح
مجفف شرائحShaoxing Luyue101-3Bتجفيف الشرائح
محلول إيقافQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Included with ELISA kitsإنهاء تفاعل ELISA
محاليل الركيزة A و BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Included with ELISA kitsتطوير اللون في ELISA
حمام تطييف الأنسجةWuhan Junjie ElectronicsJK-5/6تطييف المقاطع
معالج أنسجةWuhan Junjie ElectronicsJT-12Sمعالجة الأنسجة الآلية
طقم ترويق الأنسجة، الكواشف A–FJarvisbioJA11012ترويق الأنسجة القائم على المذيبات
منصة التنبيب الرغاميRWD Life ScienceRe20-Mتحديد وضعية التنبيب الفموي
برنامج تحليل الموجات فوق الصوتيةFujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6تحليل بيانات تخطيط صدى القلب
جل الموجات فوق الصوتيةTianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100الاقتران في تخطيط صدى القلب
نظام التصوير بالموجات فوق الصوتيةFujifilm VisualSonicsVevo 3100تخطيط صدى القلب
مبعد جفن على شكل VSuqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009Gإبعاد ما بين الأضلاع والأضلاع
محلول غسيل منظمQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Included with ELISA kitsغسل طبق ELISA
نظام تنقية المياهSichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20Tإنتاج ماء بالتناضح العكسي
زايلينChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586Aترويق الأنسجة وإزالة البارافين؛ مادة قابلة للاشتعال وسامة للأعصاب

المراجع

  1. Thygesen K, et al. Fourth universal definition of myocardial infarction (2018). J Am Coll Cardiol. 2018;72(18):2231-2264.
  2. Lindahl B, Mills NL. A new clinical classification of acute myocardial infarction. Nat Med. 2023;29(9):2200-2205. doi:10.1038/s41591-023-02513-2.
  3. De Villiers C, Riley PR. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Dis Model Mech. 2020;13(11):dmm046565.
  4. Johns TNP, Olson BJ. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Ann Surg. 1954;140(5):675-682.
  5. Christia P, et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Histochem Cytochem. 2013;61(8):555-570.
  6. Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
  7. Kumar M, et al. Animal models of myocardial infarction: mainstay in clinical translation. Regul Toxicol Pharmacol. 2016;76:221-230.
  8. Gao E, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 2010;107(12):1445-1453.
  9. van den Bos EJ, et al. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289(3):H1291-H1300.
  10. Pinelli A, et al. Isoproterenol-induced myocardial infarction in rabbits. Protection by propranolol or labetalol: a proposed non-invasive procedure. Eur J Pharm Sci. 2004;23(3):277-285.
  11. Maruyama K, et al. Surgical protocol for permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice to generate a model of myocardial infarction. STAR Protoc. 2021;2(3):100775.
  12. Johny E, Dutta P. Left coronary artery ligation: a surgical murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2022;(186).
  13. Kolk MVV, et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2009;(32):1438.
  14. Lugrin J, Parapanov R, Krueger T, Liaudet L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. J Vis Exp. 2019;(150).
  15. Chen J, et al. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(2):H275-H282.
  16. Ahn D, et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286(3):H1201-H1207.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.