أظهرت هذه الدراسة أن الموجات فوق الصوتية للرئة (LUS) ومستوى miR-486-3p في المصل كانا مرتفعين لدى حديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS). وقد أدى تقييمهما المشترك إلى تحسين التنبؤ بشدة المرض ومآله، كما وُجد أن miR-486-3p ينظم وظيفة الخلايا في نموذج ARDS من خلال استهداف Delta-Like Canonical Notch Ligand 4.
مقالة بحثية
القيمة الإنذارية لدرجة الموجات فوق الصوتية للرئة ومستوى miR-486-3p في المصل في متلازمة الضائقة التنفسية الحادة لدى حديثي الولادة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هدفت هذه الدراسة إلى تقييم القيمة الإنذارية لدرجة الموجات فوق الصوتية للرئة (LUS) ومستوى miR-486-3p في المصل لدى حديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، واستكشاف الآلية الكامنة وراء ذلك. شملت الدراسة 112 حديث ولادة مصاباً بـ ARDS، و100 رضيع سليم ولدوا خلال الفترة نفسها كمجموعات ضابطة صحية. خضع كل حديث ولادة للفحص بالموجات فوق الصوتية للرئة خلال 6 h من الدخول إلى وحدة العناية المركزة لتقييم LUS. استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Real-time quantitative PCR) لتقدير التعبير الجيني، بينما أُجري تحليل منحنى خصائص التشغيل (ROC) وتحليلات ارتباط بيرسون لتقييم الأداء الإنذاري والارتباطات. علاوة على ذلك، تم إنشاء نموذج ARDS مخبري باستخدام HPMECs للتحقيق في الآلية الكامنة لـ miR-486-3p. وأُجري اختبار مراسل لوسيفيراز المزدوج للتحقق من العلاقة المستهدفة بين miR-486-3p و Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 (DLL4). وأظهرت النتائج أن LUS و miR-486-3p في المصل ارتفعا بشكل ملحوظ لدى حديثي الولادة المصابين بـ ARDS. وأبان تحليل منحنى ROC أن كلاً من miR-486-3p و LUS يمكنهما التنبؤ بإنذار ARDS لدى حديثي الولادة (AUC = 0.883 و 0.873، والحساسية: 96.4% و 89.3%، والنوعية: 77.4% و 73.8% على التوالي)، كما أظهر الجمع بين miR-486-3p و LUS تأثيراً تنبؤياً أفضل (AUC = 0.929، والحساسية: 92.9%، والنوعية: 84.5%). ومن الناحية الميكانيكية، استهدف miR-486-3p جين DLL4 لتنظيم الوظائف البيولوجية لخلايا نموذج ARDS. وبناءً على ذلك، قد يكون التقييم المشترك لـ LUS و miR-486-3p في المصل نهجاً واعداً لتقييم شدة المرض والتنبؤ بالإنذار لدى حديثي الولادة المصابين بـ ARDS. ولا تزال هناك حاجة إلى مزيد من التحقق في مراكز متعددة لتأكيد قابليته للتطبيق العام.
المقدمة
تُعد متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة اضطراباً تنفسياً حرجاً مهدداً للحياة، يتميز بشكل أساسي بخلل في وظيفة السورفاكتنت الحويصلي، مما يشكل مخاطر جسيمة على بقاء حديثي الولادة على قيد الحياة1,2. ورغم تطوير أنماط علاجية متنوعة، لا يزال الإنذار العام للمواليد المصابين غير مرضٍ3. لذا، فإن التحديد المبكر لشدة المرض والتقييم الإنذاري الدقيق أمران ضروريان لتحسين التدخلات السريرية ونتائج المرضى. وبمجرد تطور متلازمة ARDS، تتدهور الوظيفة الرئوية لحديث الولادة بشكل حاد، ويصاحب ذلك اضطراب في التهوية وتبادل الغازات4. ويمكن اعتبار التصوير بالموجات فوق الصوتية للرئة الطريقة التصويرية الأساسية لمراقبة التهوية في حالات ARDS5. وقد أصبحت أداة التصوير المفضلة بجانب السرير لمراقبة الآفات الرئوية في حالات ARDS، كما تم تطبيق درجة الموجات فوق الصوتية للرئة (LUS) على نطاق واسع لتشخيص الأمراض التنفسية الحادة لدى حديثي الولادة وتقييم شدة المرض والإنذار في وحدات الرعاية الحرجة6. ومع ذلك، فإن الاعتماد على تصوير واحد أو اختبار مخبري واحد يتضمن عيوباً متأصلة ولا يمكن أن يلبي بالكامل متطلبات التقييم السريري7. وبناءً على ذلك، فإن استكشاف مؤشرات حيوية جديدة لإنشاء نظام تقييم مشترك يكتسب أهمية سريرية كبيرة.
يمثل الحمض النووي الريبوزي الميكروي (miRNA) فئة جديدة من عوامل تنظيم الجينات التي تلعب دوراً محورياً في إمراضية متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)8. فعلى سبيل المثال، يرتبط انخفاض تعبير miR-141-3p ارتباطاً وثيقاً بشدة المرض في حالات التليف الرئوي وإصابة الرئة9. ويعد miR-124-3p عاملاً وقائياً من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة عن طريق استهداف p6510. وقد أكدت دراسات التسلسل عالي الإنتاجية السابقة أن miR-486-3p يزداد تعبيره بشكل ملحوظ لدى المرضى المصابين بـ ARD11. وسلطت الأبحاث الحديثة الضوء على محور hsa_circ_0006892/miR-486-3p كآلية جزيئية محتملة متورطة في تطور متلازمة الضائقة التنفسية الحادة12. وتشير هذه النتائج إلى أن miR-486-3p يرتبط ارتباطاً وثيقاً بـ ARDS. ومع ذلك، فإن القيمة الإنذارية والتنبؤية لـ miR-486-3p فيما يتعلق بشدة ونتائج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة لدى حديثي الولادة لا تزال بحاجة إلى توضيح كامل.
في الوقت الحالي، تُعد التصوير الشعاعي للصدر، وتحليل غازات الدم، والكشف عن مؤشر حيوي واحد هي الطرق الرئيسية لتقييم متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة. يتضمن تصوير الصدر التعرض للإشعاع ولا يمكنه توفير مراقبة متكررة وفي الوقت الحقيقي. أما تحليل غازات الدم فيعكس الوظيفة التنفسية الحادة فقط ويفتقر إلى القيمة التنبؤية للإنذار طويل الأمد. ويوفر الكشف عن microRNA واحد نتائج كمية موضوعية ولكنه لا يمكنه عكس التغيرات المورفولوجية في الوقت الحقيقي لأنسجة الرئة. ومقارنة بهذه النهج التقليدية، فإن الجمع بين LUS ومستويات miR-486-3p في المصل يدمج مزايا التصوير بجانب السرير والكشف الجزيئي.
ركزت هذه الدراسة على حديثي الولادة الذين استوفوا معايير متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) بدلاً من متلازمة الضائقة التنفسية (RDS) الكلاسيكية الناتجة عن نقص السورفاكتانت. وبناءً على ذلك، تسعى هذه الدراسة إلى تقييم ما إذا كان التصوير بالموجات فوق الصوتية للرئة (LUS) عند الخط الأساسي ومستوى miR-486-3p في المصل يمكنهما التنبؤ بالوفيات قصيرة المدى في حالات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة لدى حديثي الولادة. يهدف هذا البحث إلى توفير بيانات قيمة لتعزيز التقييم السريري لحالات المرض والتقييمات الإنذارية قصيرة المدى في متلازمة الضائقة التنفسية الحادة لدى حديثي الولادة.
البروتوكول
حصلت هذه الدراسة على موافقة أخلاقية من لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى الشعب الأول في يونغكانغ، وذلك التزاماً صارماً بإعلان هلسنكي.
المشاركون
أُجريت هذه الدراسة القائمة على الملاحظة والكوهورت في مركز واحد، مع تضمين مكون تجريبي في المختبر، في الفترة ما بين يناير 2022 وديسمبر 2023. تم إدراج ما مجموعه 112 حديث ولادة متتاليين تم تشخيص إصابتهم بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) في مستشفى الشعب الأول في يونغكانغ. ولأغراض المقارنة، تم استقطاب رضع أصحاء ولدوا خلال نفس الإطار الزمني، وليس لديهم تاريخ من الاختناق أو الضائقة داخل الرحم، ليكونوا بمثابة مجموعة ضابطة.
معايير الاشتمال:
استوفى جميع المشاركين المعايير التشخيصية لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد لدى حديثي الولادة وفقاً لما ورد في إرشادات مونترو (طبعة 2017). وقد تم تأكيد التشخيص من خلال التصوير والتقييمات السريرية: حيث أظهرت فحوصات الأشعة السينية عتامات منتشرة في كلتا الرئتين تتفق مع الوذمة الرئوية، كما لم يظهر تخطيط صدى القلب أي دليل على ارتفاع ضغط الأذين الأيسر، مما استبعد الوذمة الرئوية ذات المنشأ القلبي. وشملت المعايير الإضافية الظهور الحاد للأعراض والحاجة إلى التهوية الميكانيكية لأكثر من 3 أيام، مع عدم وجود عدوى شديدة خارج الرئة. وقد تم الحصول على الموافقة المستنيرة حسب الأصول من عائلات حديثي الولادة.
معايير الاستبعاد:
تم استبعاد حديثي الولادة الذين يعانون من نقص أساسي في السورفاكتانت السنخي، أو أمراض القلب الخلقية، أو الاضطرابات الأيضية، أو غيرها من الحالات المرضية الأساسية الهامة. علاوة على ذلك، تم استبعاد الرضع الذين يعانون من تشوهات في الرئة أو جدار الصدر أو غيرها من التشوهات الخلقية الرئيسية. كما تم استبعاد متلازمة الضائقة التنفسية (RDS) لدى حديثي الولادة.
البيانات السريرية
تم توثيق العمر الحملي، والجنس، ووزن الولادة عند الدخول، والخصائص الأمومية لجميع المشاركين. خضع كل حديث ولادة لتصوير الرئة بالموجات فوق الصوتية خلال 6 h من الدخول إلى وحدة العناية المركزة وتم تقييمه بواسطة LUS. تم تسجيل نقاط LUS على مقياس بحد أقصى 36 نقطة، حيث أشارت الدرجة الأعلى إلى شدة أكبر في الأعراض الرئوية. جُمعت عينات الدم فور الدخول كجزء من التقييم السريري الأولي وقبل أي تدخل علاجي رئيسي (مثل إعادة إعطاء السورفاكتانت، أو تصعيد وضع التهوية، أو بدء استخدام العوامل النشطة وعائياً). تم الحصول على عينات دم من حديثي الولادة الأصحاء وقت تسجيلهم. لعزل المصل، وُضع الدم الكامل في أنابيب فاصلة للمصل وتُركت ساكنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min للسماح بتكوين الجلطة بشكل كامل. بعد ذلك، تم إجراء طرد مركزي للعينات عند 1500 x g لمدة 15 min عند 4 °C. سُحب الطافي المصل الرائق العلوي بعناية، وقُسّم إلى حصص في أنابيب تجميد معقمة، وخُزن فوراً في مجمد فائق انخفاض درجة الحرارة عند -80 °C من أجل التجارب اللاحقة. استُخدمت عينات المصل الرائقة وغير المتحللة فقط في التجارب اللاحقة. تم التخلص من أنابيب جمع الدم المستخدمة وبقايا الدم كنفايات بيولوجية طبية وفقاً للوائح المؤسسية.
التجميع
تم تصنيف جميع حديثي الولادة إلى مجموعتين متميزتين: المجموعة الخفيفة (الدرجتان I-II) والمجموعة الشديدة (الدرجتان III-IV)، وذلك بناءً على نتائج الأشعة السينية الأولية للصدر وشدة الحالة التي تم تقييمها بعد 24 ساعة من دخول المستشفى. وقد كشفت تفسيرات الأشعة السينية للصدر عن الدرجة I، التي تتميز بانخفاض شفافية الرئتين في كلا الجانبين، مع وجود جسيمات صغيرة وظلال شبكية داخل متن الرئة. وأشارت الدرجة II إلى امتداد الآفات إلى المناطق الوسطى والخارجية من الرئة، مع ظهور علامة التصوير الشعاعي للقصبات الهوائية (air bronchogram sign). أما في الدرجة III، فقد كان هناك انخفاض ملحوظ في الشفافية في كلتا الرئتين، مما أدى إلى طمس حدود القلب والحجاب الحاجز. وتميزت الدرجة IV بعلامات بارزة للتصوير الشعاعي للقصبات الهوائية، وصولاً إلى تعتم شبه كامل يشبه مظهر الرئة البيضاء.
تلقى حديثو الولادة الذين تم تشخيص إصابتهم بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) نظامًا علاجيًا شاملاً بعد دخولهم إلى وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة. وقد شمل هذا النظام التهوية الميكانيكية، والتخدير، وإعطاء المادة الخافضة للتوتر السطحي الرئوي، والعلاجات المضادة للالتهابات، والدعم الغذائي، والمساعدة على طرد البلغم، وإجراءات تعويض السوائل. وكان تشخيص إصابة حديثي الولادة بـ ARDS هو نقطة البداية للدراسة. كما حُددت نقاط النهاية إما في تعافي المريض بنجاح وخروجه من المستشفى، أو وفاة المريض نتيجة فشل العلاج. وبناءً على النتائج السريرية، تم تقسيم المشاركين إلى مجموعتين: مجموعة الناجين ومجموعة المتوفين.
زراعة الخلايا ومعالجتها
تم استزراع الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الرئة البشرية (HPMECs) في وسط DMEM المكمل بـ 10% مصل بقري جنيني، و 100 U/mL بنسيلين، و 100 µg/mL ستربتومايسين. تم الحفاظ على الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂. ولإنشاء نموذج خلوي لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، عولجت الخلايا بـ lipopolysaccharide (LPS) بتركيز 1 mg/L13,14. وتم التأكد من نجاح إنشاء النموذج من خلال ملاحظة انكماش خلوي طفيف تحت المجهر المقلوب بعد المعالجة بـ LPS. وبعد الانتهاء من التجارب، تم التخلص من وسط الاستزراع المستهلك والخلايا الميتة ومواد الاستزراع القابلة للتخلص منها كنفايات بيولوجية خطرة.
نقل الجينات إلى الخلايا وتجميعها
تم استنبات خلايا HPMECs في أطباق زراعة وتحضينها حتى وصلت نسبة الاندماج إلى 70% قبل عملية التعداء. تم تحضير معقدات التعداء وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قُسمت الخلايا إلى مجموعات: مجموعة ضابطة فارغة، ومجموعة miR-486-3p mimic، ومجموعة ضابطة سلبية للمحاكي (mimic negative control)، ومجموعة miR-486-3p inhibitor، ومجموعة ضابطة سلبية للمثبط (inhibitor negative control)، ومجموعة miR-486-3p mimic + بلازميد فرط تعبير DLL4 (OE-DLL4)، ومجموعة miR-486-3p mimic + بلازميد فرط تعبير فارغ (OE-NC). أضيفت معقدات التعداء إلى الآبار المقابلة وحُضنت لمدة 4–6 h. استُبدل الوسط بوسط غذائي كامل وطازج، واستمر الاستنبات لمدة 24–48 h لإجراء التجارب اللاحقة. وكان مؤشراً على نجاح التعداء وصول الخلايا إلى حالة اندماج مستقرة دون حدوث موت خلوي مفرط.
تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي
تم استخلاص الـ RNA الكلي من عينات المصل والخلايا المستزرعة باستخدام كاشف لاستخلاص الـ RNA. وقِيست تركيزات الـ RNA ونقاوته باستخدام جهاز المطياف الضوئي، واعتُبرت العينات التي تتراوح نسبة A260/A280 فيها بين 1.8–2.1 مناسبة للتحليلات اللاحقة. ثم تم تخليق الـ DNA المكمل (cDNA) باستخدام طقم النسخ العكسي. بعد ذلك، أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي وفق ظروف الدورات التالية: مسخ أولي عند 95 °C لمدة 3 min، يليه 40 دورة من 95 °C لمدة 10 s و60 °C لمدة 30 s. وللكشف عن الـ microRNA، حُسب التعبير النسبي لـ miR-486-3p باستخدام طريقة 2-ΔΔCt مع استخدام U6 snRNA كمرجع داخلي. أما بالنسبة لتقدير كمية الـ mRNA، فقد تم تطبيع تعبير DLL4 بالنسبة لـ GAPDH mRNA باستخدام خوارزمية 2-ΔΔCt ذاتها. وقد أُدرجت تتابعات البادئات كما يلي: بادئ miR-486-3p الأمامي: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' وبادئ miR-486-3p العكسي: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'، وبادئ U6 الأمامي: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' وبادئ U6 العكسي: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. وبادئ DLL4 الأمامي: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' وبادئ DLL4 العكسي: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3'، وبادئ GAPDH الأمامي: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' وبادئ GAPDH العكسي: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
مقايسة CCK-8 لتكاثر الخلايا
تم استزراع الخلايا المنقولة في أطباق ذات 96 بئر بكثافة 1 × 103 خلية لكل بئر، وحُضنت لمدة 24 و48 و72 ساعة. بعد ذلك، تم سحب وسط الزرع، وغُسلت الخلايا مرتين باستخدام 1× PBS. تلا ذلك إضافة 100 µL من 1× PBS الطازج و10 µL من محلول CCK-8 إلى كل بئر، وحُضنت الأطباق عند 37 °C لمدة ساعتين. قيست الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة، وقُيم تكاثر الخلايا بناءً على قيم الامتصاصية. وقد دلّ نجاح أداء المقايسة على وجود تغيرات تعتمد على الوقت في الامتصاصية بين المجموعات التجريبية.
مقايسة موت الخلايا المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي
هُضمت الخلايا باستخدام trypsin بنسبة 0.25%، ثم جُمع معلق الخلايا الناتج وجرى طرده مركزياً عند 1500 × g لمدة 5 min عند 4 °C. تخلصنا من الطافي، وغُسلت كرات الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1× PBS مبرد مسبقاً. بعد ذلك، أُعيد تعليق الخلايا في 500 µL من 1x Binding Buffer، متبوعاً بإضافة 5 µL من Annexin V-FITC و 5 µL من propidium iodide (PI). وبعد المزج بلطف، حُضنت العينات لمدة 40 min في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. قيس موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي، وحُللت البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب. وقد استُدل على نجاح أداء المقايسة من خلال انخفاض معدل موت الخلايا المبرمج في مجموعة الضبط الطبيعية وزيادة ملحوظة في موت الخلايا المبرمج في مجموعة نموذج ARDS.
مقايسة لوسيفيريز المراسلة
تم تحديد الجينات المستهدفة المحتملة لـ miR-486-3p باستخدام قاعدة بيانات TargetScan المتاحة عبر الإنترنت (http://www.targetscan.org/vert_72/). وبعد تحديد مواقع الارتباط المتوقعة، تم بناء بلازميدات تقرير لوسيفيريز من النوع البري (DLL4-WT) والنوع الطافر (DLL4-MUT) تحتوي على تسلسلات الارتباط المقابلة. ثم تم إجراء ترنسفكشن مشترك لناقلات DLL4-WT وDLL4-MUT في خلايا HPMECs مع محاكيات (mimics) أو مثبطات miR-486-3p، على التوالي. وعقب ذلك، تم قياس نشاط اللوسيفيريز النسبي باستخدام طقم مقايسة تقرير لوسيفيريز المزدوج. وكُشفت إشارات التلألؤ البيولوجي باستخدام مقياس اللومينومتر وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وقد استُدل على نجاح التحقق من الهدف من خلال انخفاض ملحوظ في نشاط اللوسيفيريز في مجموعة DLL4-WT عقب الإفراط في تعبير miR-486-3p.
تم توفير معلومات مفصلة حول جميع الكواشف والمستهلكات والمعدات المختبرية المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد المرفق.
الطرق الإحصائية
أُجريت التحليلات الإحصائية والتمثيلات المرئية للبيانات باستخدام برنامج SPSS الإصدار 26.0 وبرنامج GraphPad Prism الإصدار 9.0. وعُرضت بيانات القياس في شكل متوسط حسابي ± الانحراف المعياري، مع تقييم المقارنات بين متوسطات عينتين مستقلتين باستخدام اختبار t لعينات مستقلة. أما بالنسبة للمقارنات بين ثلاث مجموعات أو أكثر， اعتُمد تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) وتحليل التباين للقياسات المتكررة (repeated-measures ANOVA)، يليهما اختبار توكي للمقارنات المتعددة البعدية (Tukey’s post-hoc multiple comparison test) لتحديد الفروق بين المجموعات. عُبر عن البيانات الفئوية في شكل أعداد (نسب مئوية)، وحُللت المقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار كا تربيع (chi-square test). كما طُبق اختبار ويلكوكسون مان-ويتني (Wilcoxon Mann-Whitney test) للبيانات غير المعلمية. بالإضافة إلى ذلك، تم رسم منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC curve) لتقييم القيمة التنبؤية لمستويات تعبير miR-486-3p في المصل وفحص الموجات فوق الصوتية للرئة (LUS) في تحديد معدل الوفيات لدى الأطفال المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS). واستُخدم تحليل ارتباط بيرسون لفحص الارتباطات. تضمنت جميع المجموعات التجريبية ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة ومكررات تقنية. عُرِفت الوحدة الإحصائية على أنها تجربة مستقلة، بحيث تمثل كل مكررة بيولوجية دفعة منفصلة من المزارع الخلوية المشتقة من ممرات مختلفة، بينما استُخدمت المكررات التقنية لتقليل التباين داخل التجربة الواحدة. حُسب متوسط البيانات من المكررات التقنية أولاً، ثم أُجري التحليل الإحصائي بناءً على القيم المتوسطة للمكررات البيولوجية. حُددت الدلالة الإحصائية عند p < 0.05.
النتائج
بيانات أساسية قابلة للمقارنة بين المجموعات
تظهر الخصائص العامة للرضع المشمولين في الدراسة في الجدول 1. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في الخصائص الديموغرافية الأساسية بين المجموعتين: العمر الجنيني (36.07 ± 2.71 مقابل 35.72 ± 2.64 weeks، p = 0.347)، ونسبة الذكور (59.0% مقابل 66.1%، p = 0.290)، ووزن الولادة (3.39 ± 0.57 مقابل 3.33 ± 0.55 kg، p = 0.437)، وعمر الأم (29.18 ± 4.00 مقابل 29.66 ± 4.05 years، p = 0.387)، وطريقة الولادة (طبيعية: 54.0% مقابل 58.0%؛ قيصرية: 46.0% مقابل 42.0%، p = 0.554)، مما يشير إلى أن هذه المجموعات كانت متكافئة. وبناءً على تقييم الأشعة السينية للصدر، تم تصنيف 72 حالة (64.3%) في مجموعة ARDS على أنها خفيفة (الدرجة I-II)، بينما تم تصنيف 40 حالة (35.7%) على أنها شديدة (الدرجة III-IV).
تترابط شدة متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) مع مآل المريض
يتم عرض التحليل المقارن لنتائج البقاء بين مجموعة الأطفال المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) الذين نجوا وأولئك الذين توفوا في الجدول 2. ومن بين 112 مولوداً حديث الولادة تم تشخيص إصابتهم بـ ARDS، نجت 84 حالة (75%) بينما أدت 28 حالة (25%) إلى الوفاة. ومن الملاحظ عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في عمر الرضيع، أو الجنس، أو وزن الولادة، أو عمر الأم، أو طريقة الولادة، أو خصائص السائل السلوي، أو المسببات، أو أي متغيرات أخرى بين المجموعتين (p > 0.05). ومع ذلك، لوحظ فرق معنوي في شدة الإصابة بـ ARDS (p < 0.01)، مما يسلط الضوء على عامل إنذاري حاسم.
ارتفاع مستويات miR-486-3p و LUS في حالات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS). كشف تحليل RT-qPCR أن مستويات miR-486-3p في المصل كانت مرتفعة بشكل ملحوظ لدى حديثي الولادة المصابين بـ ARDS مقارنة بمجموعة الضبط السليمة. علاوة على ذلك، وضمن مجموعة مرضى ARDS، أظهرت المجموعة المصابة بحالات شديدة مستويات أعلى بشكل صارخ من المجموعة المصابة بحالات خفيفة (P < 0.001) (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، كانت قيم LUS أعلى في مجموعة ARDS الشديدة منها في مجموعة ARDS الخفيفة (p < 0.001) (الشكل 1B). وعند تقسيم مرضى ARDS حسب النتيجة السريرية، أظهرت مجموعة الوفيات مستويات أعلى بكثير من LUS و miR-486-3p مقارنة بمجموعة الناجين (الشكل 1C,D). ووُجد ارتباط إيجابي قوي بين LUS و miR-486-3p في المصل لدى المرضى غير الناجين (r = 0.832, p <0.001) (الشكل 1E).
الكشف المشترك يحسن التنبؤ بالإنذار المرضي
بناءً على بروتوكول تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC)، قمنا بتقييم الأداء الإنذاري للمؤشرات الفردية والمجتمعة. وكانت قيم المساحة تحت المنحنى (AUC) لكل من LUS و miR-486-3p للتنبؤ بالوفيات على المدى القصير هي 0.873 (فاصل ثقة 95%: 0.809-0.936) و 0.883 (فاصل ثقة 95%: 0.822-0.944)، على التوالي. وكانت قيم الحساسية 89.3% و 96.4%، بينما كانت قيم النوعية 73.8% و 77.4%، على التوالي. وكانت قيم القطع المثلى لـ LUS و miR-486-3p هي 15.500 و 1.465، على التوالي. علاوة على ذلك، بلغت قيمة AUC لنموذج التنبؤ المشترك 0.929 (فاصل ثقة 95%: 0.883-0.975)، مما أظهر حساسية بنسبة 92.9% ونوعية بنسبة 84.5% مع قيمة قطع مثلى تبلغ 1.659 (الشكل 1F).
زيادة تنظيم miR-486-3p تضعف وظيفة الخلية
بعد اتباع بروتوكول زراعة الخلايا والتدخل باستخدام LPS، قمنا بإنشاء نموذج خلوي لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) في المختبر باستخدام HPMECs. وأظهرت نتائج qPCR أن تعبير miR-486-3p ازداد تدريجياً بمرور الوقت بعد التحفيز بواسطة LPS (الشكل 2A). تم زيادة تعبير miR-486-3p أو تثبيطه لبحث تأثيراته على خلايا نموذج ARDS (الشكل 2B). وبما يتماشى مع بروتوكولات مقايسة CCK-8 وقياس التدفق الخلوي، تم الكشف عن تكاثر الخلايا وموتها المبرمج. أدى الإفراط في تعبير miR-486-3p إلى تثبيط تكاثر الخلايا بشكل ملحوظ وتعزيز الموت الخلوي المبرمج. وعلى العكس من ذلك، أدى تثبيط miR-486-3p إلى تخفيف التلف الخلوي الناجم عن LPS (الشكل 2C,D).
يعمل miR-486-3p على خفض تنظيم تعبير DLL4
وفقاً لبروتوكول بناء البلازميد ومقايسة مراسل لوسيفيراز المزدوج، تحققنا من التفاعل بين miR-486-3p و DLL4. وأكد التنبؤ بالمعلوماتية الحيوية وجود موقع ارتباط محفوظ بين miR-486-3p والمنطقة غير المترجمة 3’UTR لـ DLL4 (الشكل 3A). وقد انخفض نشاط اللوسيفيراز في مجموعة DLL4 البرية (wild-type) بشكل ملحوظ بعد الإفراط في تعبير miR-486-3p، بينما لم يُلاحظ أي تغيير واضح في المجموعة الطافرة (الشكل 3B)، مما يثبت أن DLL4 هو جين مستهدف مباشر لـ miR-486-3p. وفي النماذج الخلوية، انخفض تعبير DLL4 بطريقة تعتمد على الوقت بعد المعالجة بـ LPS (الشكل 3C). كما أدى التحكم في تعبير miR-486-3p إلى تنظيم مستويات DLL4 بشكل سلبي (الشكل 3D).
في العينات السريرية، كان تعبير DLL4 أقل في حديثي الولادة المصابين بـ ARDS مقارنة بمجموعات الضبط السليمة، وانخفض بشكل أكبر في مجموعة الوفيات (الشكل 3E–F). لوحظ وجود ارتباط سلبي بين miR-486-3p و DLL4 لدى المرضى الذين لم ينجوا (r = -0.795, P < 0.001) (الشكل 3G). تم إجراء جميع اختبارات qPCR لـ DLL4 باستخدام ثلاث مكررات تقنية، وكانت النتائج مستقرة.
يعمل DLL4 على عكس إصابة الخلايا التي يتوسطها miR-486-3p
بعد اتباع بروتوكول التحويل المشترك باستخدام محاكي miR-486-3p وبلازميد الإفراط في تعبير DLL4، أجرينا تجارب الإنقاذ. وأكد تحليل qPCR أن تعبير DLL4 قد استعيد بفعالية بعد عملية تحويل OE-DLL4 (الشكل 4A). وأظهرت الاختبارات الوظيفية أن الإفراط في تعبير DLL4 قد عكس جزئياً التأثير المثبط لـ miR-486-3p على تكاثر الخلايا وتأثيره المحفز لموت الخلايا المبرمج (الشكل 4B،C). أشارت هذه النتائج إلى أن miR-486-3p ينظم نشاط الخلايا جزئياً من خلال استهداف DLL4.
توافر البيانات:
جميع البيانات التي تم إنتاجها أو تحليلها خلال هذه الدراسة متوفرة كـ الملف التكميلي 1.
الشكل 1: مقارنة بين LUS ومستوى miR-486-3p في المصل بين المجموعات. (A) مستويات miR-486-3p في مصل حديثي الولادة الأصحاء وحديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة ARDS. (B) قيم LUS في حديثي الولادة الأصحاء وحديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة ARDS. (C) مستويات miR-486-3p في مصل مجموعة الناجين ومجموعة الوفيات. (D) قيم LUS في مجموعة الناجين ومجموعة الوفيات. (E) تحليل الارتباط بين miR-486-3p في المصل و LUS في حديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة ARDS الذين لم ينجوا. (F) منحنيات ROC لـ LUS المنفرد، و miR-486-3p المنفرد، والكشف المدمج للتنبؤ بإنذار متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ARDS لدى حديثي الولادة. يتم تقديم جميع البيانات الكمية في شكل المتوسط ± الانحراف المعياري؛ وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. *** = p <0.001، مقارنة بالمجموعة السليمة؛ ### = p <0.001، مقارنة بمجموعة متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ARDS الخفيفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تأثير miR-486-3p على خلايا نموذج ARDS. (A) التغيرات المعتمدة على الوقت في تعبير miR-486-3p في خلايا HPMECs بعد المعالجة بـ LPS. (B) التعبير النسبي لـ miR-486-3p بعد تدخلات الإفراط في التعبير والتعطيل الجيني. (C) نشاط تكاثر الخلايا الذي تم الكشف عنه بواسطة مقايسة CCK-8 بعد تغيير تعبير miR-486-3p. (D) معدل موت الخلايا المبرمج الذي تم الكشف عنه بواسطة قياس التدفق الخلوي بعد تغيير تعبير miR-486-3p. جميع البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري؛ وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. العلامات الإحصائية: * = p <0.05، ** = p <0.01، *** = p <0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التحقق من علاقة الاستهداف بين miR-486-3p وDLL4. (أ) مخطط تخطيطي لموقع الارتباط المتوقع بين miR-486-3p والمنطقة 3’UTR لـ DLL4. (ب) أكد اختبار الجين المراسل لـ لوسيفريداز المزدوج علاقة الاستهداف بين miR-486-3p وDLL4. (ج) التغيرات الديناميكية في تعبير DLL4 في خلايا HPMECs بعد المعالجة بـ LPS. (د) تعبير DLL4 بعد الإفراط في تعبير miR-486-3p أو تثبيطه. (هـ) مستويات DLL4 في المصل لدى حديثي الولادة الأصحاء وحديثي الولادة المصابين بـ ARDS. (و) مستويات DLL4 في مجموعة الناجين ومجموعة الوفيات من حديثي الولادة المصابين بـ ARDS. (ز) تحليل الارتباط بين miR-486-3p وDLL4 في المصل لدى حديثي الولادة المصابين بـ ARDS غير الناجين. جميع البيانات الكمية معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري؛ تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. العلامات الإحصائية: * = p <0.05، ** = p <0.01، *** = p <0.001 مقابل المجموعة السليمة، ### = p <0.001 مقابل مجموعة ARDS الخفيفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تأثير استهداف miR-486-3p لـ DLL4 على خلايا نموذج ARDS. (A) الكشف عن تعبير DLL4 بعد التعداء المشترك لمحاكي miR-486-3p وبلازميد الإفراط في تعبير DLL4. (B) التغيرات في نشاط تكاثر الخلايا بعد استعادة DLL4. (C) التغيرات في معدل موت الخلايا المبرمج بعد استعادة DLL4. جميع البيانات معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري؛ وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. العلامات الإحصائية: * = p <0.05، ** = p <0.01، *** = p <0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| المتغير | أصحاء (n=100) | متلازمة الضائقة التنفسية لدى حديثي الولادة (n=112) | القيمة p |
| العمر الحملي (أسابيع) | 36.07 ± 2.71 | 35.72 ± 2.64 | 0.347 |
| الجنس (ذكر، %) | 59 (59.0 %) | 74 (66.1 %) | 0.29 |
| وزن الولادة (kg) | 3.39 ± 0.57 | 3.33 ± 0.55 | 0.437 |
| عمر الأم (سنوات) | 29.18 ± 4.00 | 29.66 ± 4.05 | 0.387 |
| طريقة الولادة | 0.439 | ||
| مهبلية | 54 (54.0 %) | 65 (58.0 %) | |
| قيصرية | 46 (46.0 %) | 47 (42.0 %) | |
| درجات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64.3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35.7 %) |
الجدول 1: الخصائص الأساسية للرضع المشمولين. يلخص هذا الجدول المعلومات الديموغرافية الأساسية لحديثي الولادة الأصحاء وحديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة. تُعرض البيانات في شكل المتوسط ± الانحراف المعياري للمتغيرات المستمرة، والعدد (النسبة المئوية) للمتغيرات الفئوية. تشير قيم P إلى الفروق الإحصائية بين المجموعات. الاختصارات: ARDS = متلازمة الضائقة التنفسية الحادة.
| المتغير | البقاء على قيد الحياة (n=84) | الوفاة (n=28) | قيمة p |
| عمر الحمل (أسبوع) | 35.95 ± 2.58 | 35.04 ± 2.76 | 0.112 |
| الجنس (ذكر، %) | 53 (63.1 %) | 21 (75.0%) | 0.253 |
| وزن الولادة (kg) | 3.37 ± 0.58 | 3.23 ± 0.42 | 0.248 |
| عمر الأم (سنة) | 29.49 ± 3.82 | 30.18 ± 4.74 | 0.438 |
| طريقة الولادة | 0.444 | ||
| مهبلية | 47 (56.0 %) | 18 (64.3 %) | |
| قيصرية | 37 (44.0 %) | 10 (35.7 %) | |
| سائل أمنيوسي غير طبيعي | 6 (9.5 %) | 4 (14.3 %) | 0.485 |
| درجات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) | 0.001** | ||
| I-II | 61 (72.6 %) | 11 (39.3 %) | |
| III-IV | 23 (27.4 %) | 17 (60.7%) | |
| المسبب | 0.827 | ||
| الشرق/الاختناق | 33 (39.3 %) | 12 (42.9 %) | |
| الالتهاب الرئوي | 17 (20.2 %) | 6 (21.4 %) | |
| إنتان الدم | 12 (14.3 %) | 2 (7.1 %) | |
| متلازمة استنشاق العقي | 22 (26.2 %) | 8 (28.6 %) |
الجدول 2: مقارنة البيانات السريرية بين مجموعة الناجين ومجموعة الوفيات في حديثي الولادة المصابين بمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS). يقارن هذا الجدول المؤشرات السريرية بين حديثي الولادة الناجين وغير الناجين من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة. تُعرض البيانات المستمرة كمتوسط ± انحراف معياري، وتُعبر البيانات الفئوية كعدد (نسبة مئوية). تشير قيم p إلى الدلالة الإحصائية بين المجموعتين. ** = p<0.01. الاختصارات: ARDS = متلازمة الضائقة التنفسية الحادة.
الملف التكميلي 1: مجموعات البيانات السريرية والتجريبية الخام التي تدعم نتائج هذه الدراسة، بما في ذلك القياسات على المستوى الفردي لدرجة الموجات فوق الصوتية للرئة (LUS)، وتعبير miR-486-3p في المصل، وتعبير DLL4، ونتائج المقايسة القائمة على الخلايا.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
تعد متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة أحد الأسباب الرئيسية للفشل التنفسي والوفاة المبكرة بين المواليد الذين يعانون من حالات حرجة15. ويعد التقييم المبكر والدقيق لشدة المرض والإنذار شرطاً أساسياً للتدخل الفردي وتقليل معدلات الوفيات. وتؤكد مجموعة متزايدة من الأدلة أن الأحماض النووية الريبوزية الميكروية (microRNAs) تشارك في التطور المرضي لمتلازمة ARDS وتعمل كعلامات بيولوجية واعدة في الدورة الدموية16. وتشير الأبحاث إلى أن miR-155 يرتفع بشكل ملحوظ لدى المرضى المصابين بتعفن الدم الذين يعانون من إصابة رئوية حادة أو ARDS17. بالإضافة إلى ذلك، كشفت الدراسات عن زيادة في مستويات miR-629-5p في المصل لدى الأطفال الذين تم تشخيص إصابتهم بـ ARDS18. ويرتبط miR-34a في المصل ارتباطاً وثيقاً بشدة وإنذار متلازمة الضائقة التنفسية (RDS) لدى حديثي الولادة19. وتظهر دراسات جديدة أن miR-375 يعمل كعلامة بيولوجية تشخيصية وإنذارية لـ ARDS لدى حديثي الولادة20. وعلى غرار هذه الجزيئات المبلغ عنها، يمكن الكشف عن miR-486-3p في المصل بشكل مستقر في الدم المحيطي عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR)، وهو مناسب للفحص السريع في وحدات العناية المركزة لحديثي الولادة (NICUs). وبالمقارنة مع miR-375 و miR-34a، اللذين يعكسان بشكل أساسي بداية المرض المبكرة، فإن تعبير miR-486-3p يرتبط بشكل أوثق بشدة الآفات الرئوية ويتغير ديناميكياً مع تطور الإصابة الرئوية. وعند دمجه مع الموجات فوق الصوتية للرئة (LUS)، فإنه يحقق دقة إنذارية أعلى للوفيات قصيرة المدى. ومع ذلك، يظهر miR-486-3p خصوصية منخفضة نسبياً للمرض، ولا تزال الأدلة البحثية السريرية ذات الصلة محدودة مقارنة بالعلامات البيولوجية miRNA الراسخة. وبشكل عام، يمتلك miR-486-3p القدرة على العمل كعلامة للتشخيص المساعد أو التنبؤ الإنذاري بمتلازمة ARDS لدى حديثي الولادة.
يُعد التصوير بالموجات فوق الصوتية للرئة (LUS) مؤشراً ناضجاً للتصوير بجانب السرير، حيث يتم من خلاله تقييم تهوية الرئة بناءً على الخصائص فوق الصوتية لأنسجة الرئة21. ومن الجدير بالذكر أن LUS يعمل كمقياس كمي فعال لتقدير مدى التهوية الحويصلية22. وقد أكدت الأبحاث فائدته في تقييم كل من شدة وإنذار متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة23. وتماشياً مع الدراسات السابقة، كشفت دراستنا السريرية أن قياسات LUS لدى حديثي الولادة المصابين بـ ARDS كانت مرتفعة بشكل ملحوظ مقارنة بحديثي الولادة الأصحاء. علاوة على ذلك، أظهرت المجموعة الفرعية المصابة بحالات شديدة من بين المواليد المتأثرين قيم LUS أعلى بكثير من المجموعة الفرعية المصابة بحالات خفيفة، مما يؤكد وجود علاقة مباشرة بين ارتفاع قراءات LUS وشدة انخماص الرئة، والوذمة الرئوية، وتصلب الرئة24. وأشارت نتائجنا كذلك إلى أن المرضى الذين توفوا في النهاية أظهروا أيضاً قيم LUS أعلى بشكل ملحوظ من الناجين. ولوحظ وجود ارتباط إيجابي قوي بين LUS ومستوى miR-486-3p في المصل لدى حديثي الولادة غير الناجين، مما يدعم القيمة التآزرية لهذين المؤشرين. وتتميز كل طريقة بخصائص ذاتية: فتقنية LUS خالية من الإشعاع، ومحمولة، ومناسبة للمراقبة الفورية بجانب السرير، إلا أن تفسير نتائجها يعتمد بشكل كبير على خبرة المشغل ويخضع للانحياز الشخصي. أما الكشف عن miR-486-3p في المصل فيوفر نتائج كمية موضوعية وقابلة للتكرار، ولكنه لا يمكن أن يعكس التغيرات المورفولوجية اللحظية في أنسجة الرئة. وفي الممارسة السريرية، يُوصى بهذا النهج المدمج للاستخدام الروتيني في وحدات العناية المركزة لحديثي الولادة؛ فهو مناسب للتصنيف المبكر للمخاطر لدى حديثي الولادة المشتبه بإصابتهم أو المؤكد إصابتهم بـ ARDS، وللتقييم الديناميكي الدوري لتطور المرض، وللمساعدة في تقدير الإنذار السريري على المدى القصير. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا تهدف إلى استبدال التصوير النهائي أو الفحوصات المسببة للمرض؛ حيث تظهر خصوصية محدودة عند تطبيقها على حديثي الولادة الذين يعانون من أمراض رئوية التهابية أخرى. بالإضافة إلى ذلك، وبما أن بحثنا قد أُجري في مركز واحد، فإن مدى قابليته للتطبيق على مجموعات سكانية من مناطق مختلفة لا يزال بحاجة إلى تحقق.
سريريًا، لاحظنا أن ارتفاع قيم LUS، مقترنًا بارتفاع مستويات miR-486-3p في المصل، ارتبط بإنذار سيئ في حالات متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة، مما يشير إلى أن miR-486-3p قد يكون مرتبطًا ارتباطًا وثيقًا بإصابة الأوعية الرئوية الشديدة وضعف قدرة الإصلاح الوعائي في الرئة غير الناضجة. وقد استكملت تجاربنا الخلوية في المختبر هذه الملاحظة السريرية من خلال إثبات أن miR-486-3p ينظم بشكل مباشر تكاثر الخلايا البطانية وموتها المبرمج، وهي عمليات أساسية تحكم سلامة الأوعية الدموية وإصلاحها في رئة حديثي الولادة. علاوة على ذلك، أظهرت الأبحاث أن جزيئات miRNA تلعب أدوارًا حاسمة في عمليات خلوية متنوعة25,26. ومن المعروف أن جزيئات miRNA تمارس تأثيراتها بشكل أساسي من خلال التنظيم ما بعد النسخي للجينات المستهدفة، وهو ما يشمل في الغالب ربط miRNA وكبح ترجمة البروتين27. ويلعب جين DLL4 دورًا هامًا في التطور الوعائي وتكون الأوعية الدموية28. وقد أشارت الأبحاث إلى أن عائلة microRNA-30 تستهدف DLL4 لتنظيم سلوك الخلايا البطانية أثناء عملية تكوين الأوعية الدموية29. وتشير هذه النتائج إلى أن تنظيم DLL4 البطاني قد يكون مرتبطًا بإصابة الأوعية الرئوية في حالات ARDS لدى حديثي الولادة. وفي دراستنا، حددنا وأثبتنا علاقة الاستهداف بين miR-486-3p وDLL4. وكشفت التحليلات اللاحقة أن ارتفاع تعبير miR-486-3p أدى إلى تثبيط تكاثر خلايا HPMECs المحفزة بـ LPS بشكل ملحوظ مع تعزيز الموت المبرمج. ومن المهم الإشارة إلى أن تعبير DLL4 استطاع عكس التأثيرات التي يتوسطها miR-486-3p جزئيًا. وهذا يشير إلى أن miR-486-3p يستهدف DLL4 للتأثير على وظيفة HPMECs وتنظيم تطور ARDS لدى حديثي الولادة. ومع ذلك، فإن ما إذا كان يؤثر مباشرة على خلل الوظائف الوعائية الرئوية ويساهم في ARDS لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحقق. ومن الملاحظ أن DLL4 عكس التغيرات الخلوية التي حثها miR-486-3p جزئيًا فقط. وباعتباره جزيء miRNA نموذجي، فإن miR-486-3p ينظم العديد من الجينات المستهدفة في المصب. وستركز الدراسات المستقبلية على تحديد المزيد من الجينات المستهدفة لتوضيح الآلية الكاملة لعمل miR-486-3p في ARDS لدى حديثي الولادة.
أخيرًا، تجدر الإشارة إلى أن التقييس الصارم لخطوات البروتوكول الرئيسية يضمن الحصول على بيانات موثوقة وقابلة للتكرار. لقد وحدنا إجراءات جمع العينات، واتبعنا بروتوكولات قياسية لزراعة الخلايا والترانسفكشن، وأدرجنا مكررات مستقلة لتقليل الخطأ التجريبي. وفيما يلي ملخص للمشكلات التشغيلية الشائعة وحلولها: بالنسبة لتقييم LUS، يجب توحيد بروتوكول المسح المكون من 12 منطقة وقواعد التقييم الموحدة، وتعديل وضعية حديث الولادة للحصول على صور واضحة. وبالنسبة للكشف عن miRNA في المصل، يجب تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة، والتحقق من نقاء RNA (A260/A280 = 1.8–2.1)، وإدراج مكررات تقنية. أما بالنسبة لنماذج الخلايا المحفزة بـ LPS، فيجب استخدام 1 mg/L من LPS المحضر حديثًا وظروف زراعة مستقرة. كما يجب تحسين تلاقي الخلايا ونسبة الكاشف أثناء الترانسفكشن، واستبدال الوسط لتقليل السمية الخلوية. وأخيرًا، يجب ضمان التحلل الخلوي الكامل والتشغيل القياسي لمقايسات لوسيفيراز المزدوجة.
بشكل جماعي، وبالمقارنة مع الطرق التقليدية بما في ذلك تصوير الصدر، وتحليل غازات الدم، واختبار المؤشرات الحيوية المفردة، فإن استراتيجية الجمع بين LUS و miR-486-3p خالية من الإشعاع، ومنخفضة التكلفة، وسهلة التنفيذ، مع أداء تنبؤي محسّن. وهي تعمل كأداة إنذارية تكميلية موثوقة لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة. وسريرياً، يمكن تطبيق هذه الطريقة للتصنيف المبكر للمخاطر والمراقبة الديناميكية للحالة في وحدات العناية المركزة لحديثي الولادة. كما يمكن أن تعمل كمؤشر تقييم موحد للدراسات متعددة المراكز. أما من الناحية الآلية، فإن محور miR-486-3p/DLL4 الذي تم التحقق من صحته يفتح آفاقاً جديدة لاستكشاف الآليات المرضية والعلاج الموجه. ومع ذلك، فإن هذا النهج المشترك لديه أيضاً قيود تقنية متأصلة؛ حيث تختلف نتائج LUS بين الفاحصين، كما يفتقر miR-486-3p إلى النوعية المرضية لأمراض الرئة الالتهابية. وتدعم هذه الطريقة الكشف في نقطة زمنية واحدة فقط، ولا يمكنها أن تحل محل التصوير القطعي أو الفحوصات المسببة للمرض.
على الرغم من النتائج الواعدة، إلا أن هناك عدة قيود تستحق الاهتمام. أولاً، يحد تصميم الدراسة القائم على مؤسسة واحدة من إمكانية تعميم استنتاجاتنا. ثانياً، افتقرنا إلى مجموعة تحقق خارجية للتحقق من قوة الأداء التنبؤي للوحة LUS/miR-486-3p. ثالثاً، تم قياس miR-486-3p في المصل في نقطة زمنية واحدة فقط، مما أدى إلى عدم رصد ارتباطه الديناميكي بتطور المرض. رابعاً، فإن غياب التحليلات البروتينية التكميلية والتحقق في المختبر (in vitro) أو في الجسم الحي (in vivo) يحد من قوة استنتاجاتنا الآلية. وأخيراً، لا يزال الدور المحدد لـ miR-486-3p في الفسيولوجيا المرضية لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) لدى حديثي الولادة غير موضح بالكامل ويتطلب مزيداً من الاستقصاء. وفي الختام، فإن زيادة LUS وارتفاع مستويات miR-486-3p في مصل حديثي الولادة الذين تم تشخيصهم بـ ARDS يعملان كنقاط مرجعية هامة في الممارسة السريرية. وقد يسهل التقييم التآزري لهذين المؤشرين الحيويين التنبؤ الدقيق بكل من شدة وإنذار ARDS لدى حديثي الولادة، مما يثبت قيمة تطبيقية سريرية معينة.
الإفصاحات
تم استخدام Grammarly لتحسين التعبير باللغة الإنجليزية، ومراجعة القواعد اللغوية، وتوحيد التنسيق. وتعد جميع الأفكار البحثية والتجارب والبيانات والاستنتاجات عملاً أصلياً للمؤلفين.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب PCR سعة 0.2 ملل* *(أو أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 0.2 ملل)* | Axygen | PCR-02-C | |
| محلول تريبسين-إيديتات الكالسيوم والصوديوم (Trypsin-EDTA) بتركيز 0.25% | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل | Axygen | MCT-150-C | |
| حضانة زراعة خلايا مرطبة بنسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) | Thermo Fisher | 3111 | |
| أطباق زراعة الخلايا ذات الـ 6 آبار | Corning | 3516 | |
| أطباق زراعة الخلايا ذات 96 بئراً | Corning | 3599 | |
| إيثانول مطلق | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| طقم كشف الموت الخلوي المبرمج بواسطة Annexin V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| جهاز طرد مركزي مكتبي | Eppendorf | 5810R | |
| كابينة السلامة البيولوجية | Thermo Fisher | سلسلة 1300 A2 | |
| طقم عد الخلايا CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| أنابيب جمع الدم المعقمة ذات الاستخدام الواحد | BD Vacutainer | 367815 | |
| بلازميد فرط التعبير عن DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| بلازميد لوسيفيراز المراسل DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| بلازميد مراسل لوسيفيراز DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| وسط DMEM عالي الجلوكوز | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| طقم مقايسة مراسل لوسيفيراز المزدوج | المختبر الحيوي | BL101A | |
| جهاز قراءة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| مصل جنين البقر (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| رؤوس الماصات ذات المرشحات (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| جهاز قياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| أنابيب قياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | 352054 | |
| جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة | Eppendorf | 5424R | |
| عديد السكاريد الشحمي (LPS) المستخلص من بكتيريا E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية للرئة | مايندراي (Mindray) | M9 | |
| مقياس الطيف الضوئي للأحجام الدقيقة | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| مثبط miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| محاكي miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486 | |
| مجموعة بادئات qPCR لـ miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| مثبط الضابط السلبي (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| محاكي الضبط السلبي (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| بلازميد فرط التعبير للضابط السلبي (OE-NC) | GenePharma | سالب-التحكم (EX-NEG) | |
| محلول البنسلين-ستريبتومايسين (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| طقم ماصات (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | أبحاث بلس (Research Plus) | |
| محلول صبغ يوديد البروبيديوم (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| ماء خالٍ من RNase | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| مزيج رئيسي سريع لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (RT-PCR Quick Master Mix) | Toyobo | FSQ-101 | |
| ماصات معقمة للاستخدام مرة واحدة | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| مزيج رئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام صبغة SYBR Green | Toyobo | QPK-201 | |
| كاشف Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| مجموعة بادئات qPCR لـ U6 snRNA | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| خلاط دوامي | الصناعات العلمية | Vortex-Genie 2 |
المراجع
- Chi M, Mei YB, Feng ZC. A review on neonatal acute respiratory distress syndrome. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2018;20(9):724-728.
- Garcia MJ, Amarelle L, Malacrida L, Briva A. Novel opportunities from bioimaging to understand the trafficking and maturation of intracellular pulmonary surfactant and its role in lung diseases. Front Immunol. 2023;14:1250350.
- Wu H, et al. The value of oxygen index and base excess in predicting the outcome of neonatal acute respiratory distress syndrome. J Pediatr (Rio J). 2021;97(4):409-413.
- Coppola S, et al. Respiratory mechanics, lung recruitability, and gas exchange in pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2019;47(6):792-799.
- Bello G, Blanco P. Lung ultrasonography for assessing lung aeration in acute respiratory distress syndrome: a narrative review. J Ultrasound Med. 2019;38(1):27-37.
- Wu HL, et al. Lung ultrasound score for monitoring the withdrawal of extracorporeal membrane oxygenation on neonatal acute respiratory distress syndrome. Heart Lung. 2024;63:9-12.
- King A, Blank D, Bhatia R, Marzbanrad F, Malhotra A. Tools to assess lung aeration in neonates with respiratory distress syndrome. Acta Paediatr. 2020;109(4):667-678.
- Zhu Z, et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017;5(1):38.
- Long G, Zhang Q, Yang X, Sun H, Ji C. Diagnostic and predictive significance of serum miR-141-3p in acute respiratory distress syndrome patients with pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 2024;262(3):157-162.
- Liang Y, et al. MiR-124-3p helps to protect against acute respiratory distress syndrome by targeting p65. Biosci Rep. 2020;40(5).
- Najafipour R, et al. Screening for differentially expressed microRNAs in BALF and blood samples of infected COVID-19 ARDS patients by small RNA deep sequencing. J Clin Lab Anal. 2022;36(11):e24672.
- Zhang S, et al. Clinical significance and potential mechanism of hsa_circ_0006892 in acute respiratory distress syndrome complicated with pulmonary fibrosis. Mol Biol Rep. 2024;51(1):1120.
- Yao MY, et al. Long non-coding RNA MALAT1 exacerbates acute respiratory distress syndrome by upregulating ICAM-1 expression via microRNA-150-5p downregulation. Aging (Albany NY). 2020;12(8):6570-6585.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-338-3p is a biomarker in neonatal acute respiratory distress syndrome and has roles in the inflammatory response of ARDS cell models. Acta Med Okayama. 2022;76(6):635-643.
- Shi S, et al. Evaluation of the neonatal sequential organ failure assessment and mortality risk in neonates with respiratory distress syndrome: a retrospective cohort study. Front Pediatr. 2022;10:911444.
- Martucci G, et al. Identification of a circulating miRNA signature to stratify acute respiratory distress syndrome patients. J Pers Med. 2020;11(1).
- Wang ZF, Yang YM, Fan H. Diagnostic value of miR-155 for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome in patients with sepsis. J Int Med Res. 2020;48(7):300060520943070.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-629-5p may serve as a biomarker for pediatric acute respiratory distress syndrome and can regulate the inflammatory response. Pediatr Neonatol. 2024. doi:10.1016/j.pedneo.2024.05.003.
- Li Q, Chen Y, Lin L. Value of serum miR-34a and Ang-1 in severity evaluation and prognosis of neonatal respiratory distress syndrome. Emerg Med Int. 2022;2022:5480026.
- Deng Y, Zhang R, Jiang X. Association of umbilical cord blood miR-375 with neonatal respiratory distress syndrome and adverse neonatal outcomes in premature infants. Acta Biochim Pol. 2022;69(3):605-611.
- Ostras O, Shponka I, Pinton G. Ultrasound imaging of lung disease and its relationship to histopathology: an experimentally validated simulation approach. J Acoust Soc Am. 2023;154(4):2410-2425.
- Soliman RM, et al. Prediction of extubation readiness using lung ultrasound in preterm infants. Pediatr Pulmonol. 2021;56(7):2073-2080.
- Huang L, Ye D, Wang J. Analysis of diagnosing neonatal respiratory distress syndrome with lung ultrasound score. Pak J Med Sci. 2022;38(5):1101-1106.
- Chardoli M, et al. Lung ultrasound in predicting COVID-19 clinical outcomes: a prospective observational study. J Am Coll Emerg Physicians Open. 2021;2(6):e12575.
- Jafari N, Abediankenari S. Role of microRNAs in immunoregulatory functions of epithelial cells. BMC Immunol. 2024;25(1):84.
- Sun LL, Li WD, Lei FR, Li XQ. The regulatory role of microRNAs in angiogenesis-related diseases. J Cell Mol Med. 2018;22(10):4568-4587.
- Hynes C, Kakumani PK. Regulatory role of RNA-binding proteins in microRNA biogenesis. Front Mol Biosci. 2024;11:1374843.
- Chowdhury TA, Li K, Ramchandran R. Lessons learned from a lncRNA odyssey for two genes with vascular functions, DLL4 and TIE1. Vascul Pharmacol. 2019;114:103-109.
- Bridge G, et al. The microRNA-30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis. Blood. 2012;120(25):5063-5072.